CN108383960A - 一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于Cyanine 5(Cy5)的近红外荧光聚合物的制备方法，其关键在于，从生物相容性良好的环糊精出发，以原子转移自由基(ATRP)聚合反应为主，合成两亲性星形聚合物，进一步将Cyanine 5琥珀酰亚胺酯(Cy5‑NHS)键连制备出具有用荧光性能的两亲性聚合物。实验表明该聚合物体系合成成本低、反应可控、水溶性良好、毒副作用小，具有作为荧光探针实现肿瘤前期诊断的潜能。

Description

一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法
技术领域
本发明涉及荧光探针领域，具体涉及一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法及其性能。
背景技术
目前，生物光学技术成像由于具有灵敏度高、对组织损伤小、实时性等优点而被广泛应用于临床医学诊断与生物研究中，近红外光学成像，与磁共振成像等成像技术相比，具有操作简便、成本低、可有效减少生物体自发荧光的干扰、对人体没有损伤等独特的优势，使近红外光学成像成为生物光学成像的重要研究方向。CN 101899306公开了一种在核壳结构的稀土离子掺杂的稀土无机盐纳米粒子的外表面包覆有有机配体形成的具有近红外荧光性质的核壳结构的纳米粒子，该纳米粒子可作为活性物质，用于生物荧光标记物质。CN103013520公开了一种使用单一前体二乙基二硫代氨基甲酸锌对CdTeSe 进行包壳，并进一步采用咪唑类聚合物水化修饰，得到水溶性CdTeSe/ZnS量子点，其具有650nm-850nm 的近红外荧光发射波长，由于该体系容易标记、稳定性好，可用于生物标记等领域。
基于荧光聚合物纳米颗粒具有结构明确、易修饰等优良特性，目前一系列荧光聚合物已经合成并应用于光学成像。花氰染料Cyanine 5（Cy5）是一种近红外染料，常应用于生物分子标记、荧光成像及其他荧光生物分析，其最大发射波长与激发波长分别为670nm、649nm，结构如下所示：
由于Cy5的水溶性差、毒副作用大，使其应用受到限制，本文从生物相容性良好的β-环糊精出发、以乙二醇甲基丙烯酸酯（OEGMA）为亲水嵌段，构建出两亲性星形聚合物，进一步将近红外染料Cy5键连，得到具有近红外发射的荧光聚合物，该体系具有光稳定性好、水溶性好、结构可设计、毒副作用小等特性，对生物光学技术成像的发展有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，该制备方法合成简单，产率高。目的之二是使用所述制备方法制备的近红外聚合物荧光探针具有光稳定性及水溶性好、毒副作用小等优点。为实现上述目的，采用以下技术方案：
基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，包含以下制备步骤：
(1) ß-CD-Br的制备,其反应式如下所示，包含以下步骤：在冰浴（温度≤0℃）氩气(Ar，2-10Pa)条件下，β-环糊精（β-CD）溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）后，在剧烈搅拌条件下再逐滴加入含有2-溴代异丁酰溴（BIBB）的DMF溶液，接着在冰浴中搅拌0.5h后恢复至室温反应24h，纯化后得到星形原子转移自由基聚合反应引发剂β-CD-Br；
(2) tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，二碳酸二叔丁酯溶于25mL MeCN，加入乙醇胺溶于15mL MeCN所形成的混合液，室温搅拌0.5h，用旋转蒸发仪浓缩得到tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate；
(3) MA-NHBOC的制备,其反应式如下所示，包含以下步骤：在冰浴（温度≤0℃）和氩气(Ar，2-10Pa)条件下，N,N-二异丙基乙胺(EDIA)与步骤（2）所制备的tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate 溶于二氯甲烷后，搅拌0.5h,往溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯,继续在冰浴下搅拌0.5h, 待恢复至室温后过夜，浓缩处理后，用体积比为1:10的二氯甲烷与正己烷洗去杂质，真空干燥后得到2-((tert-butoxycarbonyl) amino)ethylmethacrylate（简写为MA-NHBOC）;
(4)ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，以ß-CD-Br为原子转移自由基聚合(ATRP)反应的大分子引发剂，将ß-CD-Br、乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)和步骤(3)所制备的MA-NHBOC一并溶于等体积的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与二甲亚砜(DMSO)形成的混合液中，加入溴化亚铜(CuBr)后，进行冷冻－解冻循环三次,再加入三-( N , N-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN) 配体，进行冷冻解冻一次，然后在室温下避光反应24h，用二氯甲烷稀释后过三氧化二铝柱，浓缩二氯甲烷后得到的混合物在乙醚中沉淀，用少量二氯甲烷溶解后再次在乙醚中沉淀，真空干燥后得到ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y；其中x表示MA-NHBOC的聚合度(DP)，它的范围为0~70，y表示OEGMA的聚合度，它的范围为0~120；
(5) ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，将步骤(4)得到的ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y溶于等体积的三氟乙酸(TFA)与二氯甲烷(DCM)形成的混合溶剂中，室温下搅拌0.5h,用旋转蒸发仪除去溶剂，加入甲苯溶剂再次旋蒸以除去残留的三氟乙酸，再用乙醚洗两次后旋干得到ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y;其中x表示MA-NH2的聚合度(DP)，它的范围为0~70，y表示OEGMA的聚合度，它的范围为0~120；
(6) 基于Cy5的近红外荧光聚合物ß-CD-P(Cy5-co-OEGMA)的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：将步骤(5)得到的ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y溶于含三乙胺的DMF溶液中搅拌2h，加入Cy5-NHS后避光搅拌72h,加3~5mL甲醇稀释，用截留分子量(MWCO)为3500Da的透析袋在甲醇中透析24h,浓缩后得到ß-CD-P(Cy5-co-OEGMA)；
(7) 基于Cy5近红外荧光聚合物纳米颗粒的制备，包含以下步骤：称量 5mg步骤(6)所制备的星形聚合物ß-CD-P (Cy5-co-OEGMA)，溶于DMF溶液中，搅拌0.5h，用200µL移液枪逐滴加至二次水中搅拌0.5h后,用MWCO为3500Da的透析袋在水中透析24h，可得到基于Cy5的近红外荧光聚合物纳米颗粒的水溶液。
进一步，所述步骤（1）中β-环糊精（β-CD）与溴代异丁酰溴（BIBB）的摩尔浓度范围比为1:(20～60)。
进一步，所述步骤（2）中二碳酸二叔丁酯与乙醇胺的摩尔浓度范围比为1：(0.7～1.3)。
进一步，所述步骤（3）中N,N-二异丙基乙胺、tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl)carbamate 、甲基丙烯酰氯的摩尔浓度范围比为1：(0.3～0.8)： (0.5～0.9)；二氯甲烷与THF的体积比范围为1:(8～12)。
进一步，所述步骤(4)中ß-CD-Br、OEGMA、MA-NHBOC、CuBr、Me6TREN的摩尔比范围为1: (160～187) ：(75～83) :(30～50) :(30～50)；DMF、DMSO的体积比范围为1:(0.9～1.1)。
进一步，所述步骤(5)中三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷(DCM)、甲苯、乙醚的体积比范围为1:(0.98～1.02):(1～5) :(1～5)。
进一步，所述步骤(6)中ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y与Cy5-NHS的摩尔比范围为1:(0.01～0.1)；三乙胺、N,N-二甲基甲胺的体积比范围为1:(80～110)。
进一步，所述步骤（7）中DMF和水的体积比范围为1：(6～500); 所述步骤（7）中透析后所得的基于Cy5的近红外荧光聚合物纳米颗粒的粒径范围为1~1000nm
主要优点：
针对Cy5的水溶性差，毒副作用大等问题，本项目提出一类基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法及其应用，该体系具有制备方法简单、水溶性良好、毒副作用小、发射范围介于近红外区等优良特性，从而实现体内外生物成像。
附图说明
为了更加清楚的展现本发明的目的及其技术方案，本发明提供如下附图：
图1为本发明实施例1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备流程示意图。
图2、图3、图4为本发明实施例1中的近红外荧光聚合物制备中间产物MA-NHBOC、ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y及终产物ß-CD-P(Cy5-co-OEGMA)的核磁示意图。
图5为本发明实施例1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的红外示意图。
图6为本发明实施例 1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的DLS和TEM示意图。
图7为本发明实施例1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的紫外荧光示意图。
图8为本发明实施例1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的光稳定性示意图。
图9为本发明实施例1中的基于Cy5的近红外荧光聚合物的毒性示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的实施例进行详细的描述
实施例1
基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备流程图如图1所示，具体步骤为：
1)MA-NHBOC的制备：在冰浴（温度≤0℃）和氩气(Ar，2-10Pa)条件下，N,N-二异丙基乙胺与tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate 溶于二氯甲烷后，搅拌0.5h,逐滴加入甲基丙烯酰氯(MA), 继续在冰浴下搅拌0.5h, 待恢复至室温后过夜，浓缩溶剂，用体积比为1:10的二氯甲烷与正己烷洗去杂质，真空干燥后取适量以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂测氢谱其结果如图2所示，双键氢（标为5,6）与甲基氢（标为1）的同时出现，表明MA-NHBOC单体的成功合成。
2)ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y的制备：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，以ß-CD-Br为原子转移自由基聚合(ATRP)反应的大分子引发剂，与乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)、MA-NHBOC一并溶于等体积的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与二甲亚砜(DMSO)形成的混合液中，加入溴化亚铜(CuBr)后，冷冻－解冻循环三次,加入三-( N , N-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN)配体，冷冻解冻一次，在室温下避光反应24h，用二氯甲烷稀释后过三氧化二铝柱，浓缩，在乙醚中沉淀，用少量二氯甲烷溶解后再次沉淀，真空干燥后取适量以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂测氢谱其结果如图3所示，OEGMA上的甲基氢（标为5）与叔丁氧羰基上甲基氢（标为1）的同出现表明OEGMA与MA-NHBOC的成功共聚。
3)ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y的制备,包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，将ß-CD-P(MA-NHBOC)-POEGMA溶于等体积的三氟乙酸(TFA)与二氯甲烷(DCM)的混合溶剂中，室温下搅拌0.5h,用旋转蒸发仪除去溶剂，加入甲苯溶剂再次旋蒸以除去残留的三氟乙酸，重复此操作，用乙醚洗两次后旋干。
4)CD-P(Cy5-co-OEGMA)的制备,包含以下步骤：ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y溶于含三乙胺的N,N-二甲基甲胺的混合溶剂中，搅拌2h，加入NHS-Cy5后避光搅拌72h,加3~5mL甲醇稀释，用截留分子量(MWCO)为3500Da的透析袋在甲醇中透析24h,浓缩后取适量以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂测氢谱其结果如图4所示,7.5-8.5ppm Cy5上苯环氢的出现表明Cy5与近红外荧光聚合物的成功键连。
5)基于Cy5的近红外荧光聚合物纳米颗粒的制备：称量 5mg星形聚合物CD-P(Cy5-co-OEGMA)，即PCy5，溶于DMF溶液中，搅拌0.5h，用200uL移液枪逐滴加至二次水中搅拌0.5h后,用MWCO为3500Da的透析袋在水中透析24h，即得到纳米颗粒水溶液；如图6所示，PCy5纳米胶束为大小均匀的球状，水合粒径为29.2nm，表明所制胶束易进入细胞；由荧光聚合物PCy5纳米颗粒的紫外（图7A）荧光（图7B）的最大激发波长约为650nm，发射范围处于近红外区；光稳定性如图8所示，经过470nm的可见光持续照射PCy5胶束12小时，PCy5胶束的相对荧光强度未发生明显变化，表明该近红外荧光聚合物纳米胶束具有良好的光稳定性。体外毒性如图9所示，50ug/mL的PCy5胶束与宫颈癌细胞(Hela)或正常细胞的(L929)作用72h后，细胞存活率达到80%以上，说明所制备的近红外荧光聚合物纳米颗粒毒副作用小。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1) ß-CD-Br的制备,其反应式如下所示，包含以下步骤：在冰浴（温度≤0℃）氩气(Ar，2-10Pa)条件下，β-环糊精（β-CD）溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）后，在剧烈搅拌条件下再逐滴加入含有2-溴代异丁酰溴（BIBB）的DMF溶液，接着在冰浴中搅拌0.5h后恢复至室温反应24h，纯化后得到星形原子转移自由基聚合反应引发剂β-CD-Br；
(2) tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，二碳酸二叔丁酯溶于25mL MeCN，加入乙醇胺溶于15mL MeCN所形成的混合液，室温搅拌0.5h，用旋转蒸发仪浓缩得到tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate；
(3) MA-NHBOC的制备,其反应式如下所示，包含以下步骤：在冰浴（温度≤0℃）和氩气(Ar，2-10Pa)条件下，N,N-二异丙基乙胺(EDIA)与步骤（2）所制备的tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate 溶于二氯甲烷后，搅拌0.5h,往溶液中逐滴加入甲基丙烯酰氯,继续在冰浴下搅拌0.5h, 待恢复至室温后过夜，浓缩处理后，用体积比为1:10的二氯甲烷与正己烷洗去杂质，真空干燥后得到2-((tert-butoxycarbonyl) amino)ethylmethacrylate（简写为MA-NHBOC）;
(4) ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，以ß-CD-Br为原子转移自由基聚合(ATRP)反应的大分子引发剂，将ß-CD-Br、乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)和步骤(3)所制备的MA-NHBOC一并溶于等体积的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与二甲亚砜(DMSO)形成的混合液中，加入溴化亚铜(CuBr)后，进行冷冻－解冻循环三次,再加入三-( N , N-二甲氨基乙基)胺(Me6TREN) 配体，进行冷冻解冻一次，然后在室温下避光反应24h，用二氯甲烷稀释后过三氧化二铝柱，浓缩二氯甲烷后得到的混合物在乙醚中沉淀，用少量二氯甲烷溶解后再次在乙醚中沉淀，真空干燥后得到ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y；其中x表示MA-NHBOC的聚合度(DP)，它的范围为0~70，y表示OEGMA的聚合度，它的范围为0~120；
(5) ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：在氩气(Ar，2-10Pa)条件下，将步骤(4)得到的ß-CD-P(MA-NHBOC)x-P(OEGMA)y溶于等体积的三氟乙酸(TFA)与二氯甲烷(DCM)形成的混合溶剂中，室温下搅拌0.5h,用旋转蒸发仪除去溶剂，加入甲苯溶剂再次旋蒸以除去残留的三氟乙酸，再用乙醚洗两次后旋干得到ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y;其中x表示MA-NH2的聚合度(DP)，它的范围为0~70，y表示OEGMA的聚合度，它的范围为0~120；
(6) 基于Cy5的近红外荧光聚合物ß-CD-P(Cy5-co-OEGMA)的制备, 其反应式如下所示，包含以下步骤：将步骤(5)得到的ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y溶于含三乙胺的DMF溶液中搅拌2h，加入Cy5-NHS后避光搅拌72h,加3~5mL甲醇稀释，用截留分子量(MWCO)为3500Da的透析袋在甲醇中透析24h,浓缩后得到ß-CD-P(Cy5-co-OEGMA)；
(7) 基于Cy5近红外荧光聚合物纳米颗粒的制备，包含以下步骤：称量 5mg步骤(6)所制备的星形聚合物ß-CD-P (Cy5-co-OEGMA)，溶于DMF溶液中，搅拌0.5h，用200µL移液枪逐滴加至二次水中搅拌0.5h后,用MWCO为3500Da的透析袋在水中透析24h，可得到基于Cy5的近红外荧光聚合物纳米颗粒的水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中β-环糊精（β-CD）与溴代异丁酰溴（BIBB）的摩尔浓度范围比为1:(20～60)。
3.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中二碳酸二叔丁酯与乙醇胺的摩尔浓度范围比为1：(0.7～1.3)。
4.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中N,N-二异丙基乙胺、tert-butyl-N-(2-hydroxyethyl) carbamate 、甲基丙烯酰氯的摩尔浓度范围比为1：(0.3～0.8)： (0.5～0.9)；二氯甲烷与THF的体积比范围为1:(8～12)。
5.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中ß-CD-Br、OEGMA、MA-NHBOC、CuBr、Me6TREN的摩尔比范围为1: (160～187) ：(75～83) :(30～50) :(30～50)；DMF、DMSO的体积比范围为1:(0.9～1.1)。
6.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷(DCM)、甲苯、乙醚的体积比范围为1:(0.98～1.02):(1～5) :(1～5)。
7.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中ß-CD-P(MA-NH2)x-P(OEGMA)y与Cy5-NHS的摩尔比范围为1:(0.01～0.1)；三乙胺、N,N-二甲基甲胺的体积比范围为1:(80～110)。
8.根据权利要求1所述的一种基于Cy5的近红外荧光聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（7）中DMF和水的体积比范围为1：(6～500); 所述步骤（7）中透析后所得的基于Cy5的近红外荧光聚合物纳米颗粒的粒径范围为1~1000nm。
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