CN108383910B - 一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，重链编码区的核酸序列信息为SEQ 1所示的DNA序列所编码；重链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 2所示的氨基酸序列编码；轻链编码区的核酸序列信息为SEQ 9所示的DNA序列所编码；轻链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 10所示的氨基酸序列编码。本发明所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，能够检测人体体液中的单羟酚化合物，通过单羟酚化合物的含量多少可以反映被测试者体内的细胞活跃程度和机体的免疫力状态，从而有助于肿瘤的早期诊断。本发明所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，能够有效的检测出胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、胰腺癌等消化道肿瘤。

Description

一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体领域，具体来说涉及一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症目前已成为全球人类死亡的主要原因，大多数肿瘤患者在癌症确诊时都处于病情晚期，且伴随着肿瘤恶化程度的提高，患者总是伴随有营养状态的严重失衡，这可能会严重影响癌症患者的高发病率和死亡率。目前常用的肿瘤诱发因素包括吸烟、饮酒等，但是这些风险因素并不能为肿瘤早期进展的生物学表征提供任何科学的解读。肿瘤流行病学调查数据显示45％的癌症患者体重下降幅度超过10％以上，25％的肿瘤患者体重下降了20％以上。在食管癌和结直肠癌患者中，术前体重下降超过15％至20％与术后发病率和死亡率显着高于体重减少程度较轻患者。癌症的发展和进展与患者全身代谢改变密切相关，对150例经病理诊断确诊的恶性肿瘤及50例非肿瘤疾病患者的尿液单羟酚检测结果进行比较，结果显示以尿液单羟酚确定的肿瘤患者与常规病理诊断确诊的肿瘤患者具有中等程度的一致性，提示尿液单羟酚对恶性肿瘤诊断有一定的临床价值。虽然不同类型的肿瘤细胞在自身新陈代谢或对宿主生物化学的影响方面可能彼此不同，但它们具有许多共同的代谢特性，肿瘤患者的尿液中单羟酚化合物检测阳性率达71.2％，特别是消化道肿瘤患者中的阳性率可高达86.5％，因此通过对潜在人群进行尿液单羟酚的筛查，将有助于肿瘤的早期诊断，经尿液单羟酚初筛阳性的患者可以按临床常用的肿病患者五级分类诊断进行影像及病理检测即可获得明确诊断。当人体有癌细胞活动时，细胞的异常增殖引发应激反应使人体肾上腺皮质激素单羟酚类物质分泌增多，肾上腺皮质激素单羟酚类物质的增加会抑制人体的免疫功能，从而导致抗癌免疫力下降，同时体内特异氨基酸代谢异常升高，尿液中的单羟酚代谢物浓度远远超过健康者。胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、胰腺癌等消化道肿瘤的尿液单羟酚阳性率达80％以上。采用单克隆抗体检测患者尿液中单羟酚代谢物，可以反映被测试者体内细胞的活跃程度和机体免疫力状态。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单克隆抗体，该抗体可以特异性的识别人体体液中的单羟酚类化合物，本发明同时提供了这种单克隆抗体的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链编码区的核酸序列信息为SEQ 1所示的DNA序列所编码；所述单克隆抗体的重链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 2所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的轻链编码区的核酸序列信息为SEQ 9所示的DNA序列所编码；所述单克隆抗体的轻链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 10所示的氨基酸序列编码；
其中：
所述单克隆抗体的重链的CDR区氨基酸序列信息分别为SEQ3(HCDR1)、SEQ4(HCDR2)和SEQ5(HCDR3)所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的重链的CDR区核酸序列信息分别为SEQ6(HCDR1)、SEQ7(HCDR2)和SEQS(HCDR3)所示的DNA序列所编码；
所述单克隆抗体的轻链的CDR区氨基酸序列信息分别为SEQ11(LCDR1)、SEQ12(LCDR2)和SEQ13(LCDR3)所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的轻链的CDR区核酸序列信息分别为SEQ14(LCDR1)、SEQ15(LCDR2)和SEQ16(LCDR3)所示的DNA序列所编码。
所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体的制备方法，采用4-羟苯基丙酮酸为半抗原，通过引入羟基使半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原，通过小鼠免疫实验，收集小鼠的脾脏进行脾细胞分离和骨髓瘤融合，然后进行杂交瘤的筛选和ELISA克隆鉴定，将ELISA克隆鉴定检测阳性的孔内杂交瘤细胞进行杂交瘤细胞亚克隆，得到所述单克隆抗体。
所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体的制备方法，由以下步骤制备而成：
第一步、抗原制备：
采用4-羟苯基丙酮酸作为待用的半抗原，通过分离、纯化，偶联得到免疫原；
从sigma公司购买4-羟苯基丙酮酸作为待用的半抗原，分别用15g 2，2，2-三氯乙醇(2，2，2-trichloroethanol)，12g琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml三乙基胺(triethylamime)用100ml乙酰乙酯溶解后，按照如下步骤进行羟基半抗原偶联：
1)加热回流1小时，减压蒸馏去溶剂，残余物用5％NaHCO3水溶液溶解。
2)将溶解物用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化(pH到2.0)，得到三氯乙基半琥珀酸酯固形物。
3)用水洗涤三氯乙基半琥珀酸酯固形物两次，用氯仿己烷使其结晶，得到半琥珀酸酯(产量约75％，熔点88-89℃)。
4)取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65℃加热30分钟，减压蒸发，高度真空条件下干燥1小时，得到2，2，2-三氯乙基琥珀酰氯。
5)将上述2，2，2-三氯乙基琥珀酰氯产物溶于15ml N，N-二甲基-乙酸乙酰胺(N，N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
6)65℃真空蒸发后，用异丙醇使步骤5)中得到得盐酸化结晶产物析出来(产量约84％，熔点160℃)。
7)用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离步骤6)产物中的三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基用碳化二亚胺化与载体蛋白偶联。
8)取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用10mmol/L PBS(pH8.0)液2.5ml使之充分溶解，得到I液。
9)取步骤6)中获取的结晶产物，用0.2mol/L NaOH溶液2ml溶解，得到II液。
10)取25mg血蓝蛋白(lemocyanin)溶于10mmol/L PBS(pH8.0)液中，得到III液。
11)II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)，室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液；4℃搅拌12小时，保温静置10小时，用蒸馏水使之充分透析(约48小时)，得免疫原。
12)免疫原冷冻干燥后备用。
第二步、小鼠免疫：将第一步中纯化的免疫原加入完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化后的抗原多点注射至Balb/c小鼠背部皮下，进行初次免疫；将步骤1)中纯化的免疫原加入不完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化后的抗原多点注射至Balb/c小鼠背部皮下，进行第二次免疫和第三次免疫；将第一步中纯化的免疫原通过Balb/c小鼠尾静脉输注至外周血中，进行第四次冲击免疫；
1)动物饲养
取6-8周龄Balb/c小鼠(体重18-22g)5只，饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20-26℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒5只动物，笼卡上标明实验编号、实验开始时间、课题负责人、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳号进行标记。小鼠适应性饲养1周后进行免疫。
2)小鼠初次免疫
将第一步中得到的纯化免疫原使用无菌的生理盐水完全溶解后，吸入一个2ml的玻璃注射器中；取另一个新的无菌玻璃注射器，吸入相同体积的完全弗氏佐剂；将两个注射器通过三通阀门进行连接后，将两管注射器中的液体进行充分乳化，直至乳化后的抗原滴到水面上1分钟内不会自由扩散开为止。将乳化后的抗原多点注射至小鼠背部皮下，进行初次免疫。
3)小鼠第二次免疫
初次免疫结束2周后，将第一步中得到的纯化免疫原使用无菌的生理盐水完全溶解后，吸入一个2ml的玻璃注射器中；取另一个新的无菌玻璃注射器，吸入相同体积的不完全弗氏佐剂；将两个注射器通过三通阀门进行连接后，将两管注射器中的液体进行充分乳化，直至乳化后的抗原滴到水面上1分钟内不会自由扩散开为止。将乳化后的抗原多点注射至小鼠背部皮下，进行第二次免疫。
3)小鼠第三次免疫
第二次免疫结束3周后，将第一步中得到的纯化免疫原使用无菌的生理盐水完全溶解后，吸入一个2ml的玻璃注射器中；取另一个新的无菌玻璃注射器，吸入相同体积的不完全弗氏佐剂；将两个注射器通过三通阀门进行连接后，将两管注射器中的液体进行充分乳化，直至乳化后的抗原滴到水面上1分钟内不会自由扩散开为止。将乳化后的抗原多点注射至小鼠背部皮下，进行第三次免疫。
4)免疫效价测试
第三次免疫结束后，从小鼠尾静脉采集200ul外周血，至于离心管中4℃过夜静置后，12000xg、4℃离心15分钟，分离血清和淋巴细胞；离心结束后，将上层黄色血浆转移至一个新的无菌离心管中，进行ELISA测定免疫效价。
5)小鼠第四次冲击免疫
第三次免疫结束2周后，将第一步中得到的纯化免疫原使用无菌的生理盐水完全溶解后，吸入一个1ml的玻璃注射器中通过尾静脉输注至小鼠外周血中，进行冲击免疫。免疫后第三天，收集小鼠的脾脏进行脾细胞分离和骨髓瘤融合步骤。
第三步、脾细胞、骨髓瘤细胞融合：
将第二步中的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合、筛选，得到杂交瘤细胞；
1)进行融合前一周，复苏骨髓瘤细胞并使用含有20ug/ml 8-氮鸟嘌呤的培养基连续传代培养，每天按照1∶1的比例传代，直至骨髓瘤细胞达到对数生长期。
2)融合当天，先摘除小鼠眼球取血，并制备血清备用；然后脱颈处死小鼠，放入75％酒精中浸泡5分钟；在超净工作台中，将酒精浸泡过的小鼠置于解剖盘内的泡沫上，用一套新的器械将小鼠的脾脏取下，然后转移至无菌的50ml离心管中，加入5-10ml DMEM培养基并旋紧离心管盖。将脾脏转移至层流净化空间中进行下一步操作。
3)在生物安全柜内，用DMEM洗涤完整的脾脏；准备一个10cm无菌培养皿，并加入5ml DMEM培养基，将脾脏从离心管中取出置于培养皿内，用眼科剪和镊子小心的去除脾脏表面的脂肪组织和结缔组织；准备另一个10cm无菌培养皿，并加入5ml DMEM培养基，将脾脏置于其中，准备一个20ml或50ml一次性注射器，小心取出注射器的活塞轴，用活塞轴轻轻的将脾脏碾碎。
4)取一个无菌的70μm的细胞筛网，置于50ml离心管中，用移液器将碾碎的脾脏转移至细胞筛网中进行过滤，在碾碎脾脏的培养皿中加入10ml DMEM培养基，然后用移液器将培养皿内的DMEM培养基转移至细胞筛网中进行过滤，重复这个步骤，直至50ml离心管内的DMEM与脾细胞的混悬液总体积达到45ml。
5)在800xg、室温下离心5分钟，并用10ml DMEM洗涤脾细胞沉淀一次；用10-25mlDMEM重悬脾细胞，并置于冰上备用，使用台盼兰染色后，细胞计数板进行计数，调整细胞密度为1×107个细胞/ml。
6)250xg离心5分钟，收集骨髓瘤细胞，用无血清的DMEM洗涤骨髓瘤细胞一次，以去除残留的FBS。
7)用DMEM重悬SP2/0细胞，并调整细胞密度为1×107细胞/ml，放在4℃下等待融合。
8)将SP2/0细胞和脾细胞按照1∶5的比例混合，并加入DMEM，轻轻吹打混匀后，250xg离心10分钟。小心的将上清吸出，轻弹离心管底部，使细胞团松散，将37℃水浴锅放在生物安全柜内，将离心管置于水浴锅中，在1分钟的时间内，匀速逐滴加入1ml PEG1450溶液后，在37℃水浴锅中孵育1分钟，前30s继续轻微搅动，后30s静置。
9)在水浴锅中，用37℃预温的10％FBS培养液终止PEG作用：2min内匀速滴加2mlFBS培养液，再于4min内匀速滴加8mlFBS培养液，滴加前4mlFBS培养液时边加边轻微搅动细胞液，滴加后6mlFBS培养液时边加边轻微摇动离心管，使细胞融合。
10)融合后的细胞在37℃水浴中先静置5min，然后离心，250g/min，10min，弃上清，细胞沉淀用含20％FBS的DMEM完全培养基轻轻重悬，以生成杂交瘤细胞。
11)将新生成的杂交瘤细胞重悬在适当的体积的DMEM完全培养基中，计数，使新生成的杂交瘤细胞重悬后的浓度为6.7×105个细胞/ml，以便铺板后每孔150μl中约含细胞1×105个细胞，培养于37℃，5％CO2培养箱中过夜。
12)细胞融合后第二天，每孔加50μl的含20％FBS的DMEM完全培养基(含1×HAT)。接种后第二天，显微镜下观察是否发生污染。细胞融合后第五天开始，细胞培养板一周要换液三次，采用半量换液法，再补入100μl含1×HAT+20％FBS的DMEM完全培养基。
13)细胞融合后第14天，用多通道移液器从96孔板中移出100ul培养基上清，然后加入新鲜的HT培养基【DMEM、25％FBS、1×P/S、1×HT】，改为HT培养基，培养两天后，取上清检测特异性抗体。杂交瘤细胞一般在融合后的第七天开始增殖，当培养基开始变黄或者显微镜下观察细胞汇合度接近100％，开始准备杂交瘤细胞筛选。一般在融合后的第10天至第14天开始筛选。
14)从孔板中取出120ul培养基上清，进行ELISA鉴定。同时向每个孔内补充新鲜的HT培养基。
第四步、ELISA克隆鉴定：
采用ELISA克隆鉴定检测第三步中的孔内杂交瘤细胞；
1)将偶联的抗原包被至96孔板上，包被液中目标抗原的浓度为1ug/ml。每孔加入100ul抗原溶液后，密封孔板后，至于4℃包被过夜。
2)取出96孔板，去掉孔内的抗原包被液，用PBS洗涤3次后，加入200ul浓度为5％的脱脂奶粉，室温孵育1小时，对孔板进行封闭操作。
3)去掉封闭液后，分别加入杂交瘤克隆孔内的培养基上清，室温孵育1小时；
4)去掉含有杂交瘤培养基的上清，用PBS洗涤孔板3次后，加入1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗，室温孵育30分钟。
5)去掉含有二抗的孔内液体，PBS洗涤三次后，加入TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)进行显色，室温显色15分钟。加入稀释的浓硫酸，终止反应，使用Thermo MK3酶标仪读取孔内的O.D值。
第五步、杂交瘤亚克隆：
将第四步中ELISA克隆鉴定检测筛选的阳性孔内杂交瘤细胞进行亚克隆；
1)将ELISA检测呈阳性的孔内杂交瘤细胞转移至24孔板内进行扩大培养。
2)待细胞密度达到80％左右时，采用有限稀释的方法，进行杂交瘤细胞亚克隆。即用杂交瘤完全培养基将细胞密度调整为10个细胞/ml，取一块新的96孔板，每孔加入100ul的杂交瘤细胞悬液，然后添加100ul完全培养基，将孔内的培养基体积补足至200ul。将96孔板置于37℃、5％CO2的培养箱内过夜培养。
3)第二天在倒置显微镜下观察并标记单细胞孔。待单克隆细胞克隆生长至汇合度70％左右时，取孔内的培养基上清进行ELISA鉴定。
第六步、杂交瘤测序：
将第五步中收集的杂交瘤细胞分离mRNA，mRNA进行逆转录反应得到cDNA，cDNA加polyA尾反应，循环进行PCR反应扩增重链及轻链可变区后，分离扩增的重链和轻链可变区片段，回收纯化DNA片段并进行TA克隆，将扩增的重链和轻链可变区克隆至pMD-19T载体中，对扩增的重链和轻链可变区片段进行序列分析，确定其中的抗体框架区和CDR区。
1)离心收集5×106个杂交瘤细胞；并采用mRNA抽提试剂盒，分离mRNA。
2)取1ug mRNA在65℃条件下变性5分钟，迅速将管子置于冰上，然后加入5ul 5X的逆转录缓冲液、10ul RNA酶蛋白抑制剂、10pmol的cDNA合成引物(见表2)、250uM的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dGTP，dTTP，dCTP)以及10U的小鼠白血病病毒逆转录酶，终体积定容至25ul。
3)按照如下程序进行逆转录反应：42℃孵育60分钟；52℃孵育30分钟；95℃孵育5分钟。
4)cDNA加polyA尾反应：加入4uL 5X加A尾反应缓冲液，4uL 1mM的dATP，10U末端脱氧核苷酰转移酶，混匀后，37℃孵育5分钟；然后65℃孵育5分钟，加入TE缓冲液调整终体积为500ul。
5)PCR反应扩增重链及轻链可变区
按照表1配置PCR反应体系：
表1 PCR反应体系
Figure BSA0000159356230000111
表2 逆转录及PCR克隆引物序列
Figure BSA0000159356230000112
Figure BSA0000159356230000121
6)按照如下循环进行PCR反应：95℃预变性5分钟，60℃、5分钟，72℃、40分钟，进行一个循环；95℃预变性1分钟，60℃、1分钟，72℃、3分钟，进行40个循环。
7)PCR反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳分离扩增的重链和轻链可变区片段，120V电泳40分钟。
8)在紫外灯操作台下，将重链和轻链可变区条带切下后，使用凝胶回收试剂盒分离纯化DNA片段，并进行TA克隆，将重链和轻链可变区片段克隆至pMD-19T载体中。
9)将连接产物转化至大肠杆菌感受台DH5a中，涂布氨苄抗性的LB平板后，挑取单克隆菌落进行摇菌扩增。
10)使用质粒小抽试剂盒抽提质粒进行测序。
11)对获取到的抗体重链和轻链可变区进行序列分析，确定其中的抗体框架区和CDR区。
所述的单克隆抗体能够特异性识别人体体液中的单羟酚类化合物，用于检测人体体液中单羟酚类化合物的含量。
本发明的有益效果在于：
本发明所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，能够检测人体体液中的单羟酚化合物，通过单羟酚化合物的含量多少可以反映被测试者体内的细胞活跃程度和机体的免疫力状态，从而有助于肿瘤的早期诊断。通过化验人体体液中单羟酚化合物，化验结果呈阳性的患者可以按临床常用的肿病患者五级分类诊断进行影像及病理检测，即可获得明确诊断。本发明所述的识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，能够有效的检测出胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、胰腺癌等消化道肿瘤组织，在检测和诊断肿瘤细胞方面具有广泛的应用，能够准确高效的诊断出各种肿瘤类型。
附图说明
图1为PCR克隆重链及轻链琼脂糖凝胶电泳结果示意图；
其中，Lane M：DNA marker；Lane 1：VL；Lane 2：VH。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链编码区的核酸序列信息为SEQ 1所示的DNA序列所编码；所述单克隆抗体的重链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 2所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的轻链编码区的核酸序列信息为SEQ 9所示的DNA序列所编码；所述单克隆抗体的轻链编码区的氨基酸序列信息为SEQ 10所示的氨基酸序列编码；
其中：
所述单克隆抗体的重链的CDR区氨基酸序列信息分别为SEQ3(HCDR1)、SEQ4(HCDR2)和SEQ5(HCDR3)所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的重链的CDR区核酸序列信息分别为SEQ6(HCDR1)、SEQ7(HCDR2)和SEQ8(HCDR3)所示的DNA序列所编码；
所述单克隆抗体的轻链的CDR区氨基酸序列信息分别为SEQ11(LCDR1)、SEQ12(LCDR2)和SEQ13(LCDR3)所示的氨基酸序列编码；
所述单克隆抗体的轻链的CDR区核酸序列信息分别为SEQ14(LCDR1)、SEQ15(LCDR2)和SEQ16(LCDR3)所示的DNA序列所编码。
采用4-羟苯基丙酮酸为半抗原，通过引入羟基使半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原，通过小鼠免疫实验，收集小鼠的脾脏进行脾细胞分离和骨髓瘤融合，然后进行杂交瘤的筛选和ELISA克隆鉴定，将ELISA克隆鉴定检测阳性的孔内杂交瘤细胞进行杂交瘤细胞亚克隆，得到所述单克隆抗体。
由以下步骤制备而成：
1)抗原制备：采用4-羟苯基丙酮酸作为待用的半抗原，通过分离、纯化，偶联得到免疫原；
2)小鼠免疫：将步骤1)中纯化的免疫原加入完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化后的抗原多点注射至Balb/c小鼠背部皮下，进行初次免疫；将步骤1)中纯化的免疫原加入不完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化后的抗原多点注射至Balb/c小鼠背部皮下，进行第二次免疫和第三次免疫；将步骤1)中纯化的免疫原通过Balb/c小鼠尾静脉输注至外周血中，进行第四次冲击免疫；
3)脾细胞、骨髓瘤细胞融合：将步骤2)中的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合、筛选，得到杂交瘤细胞；
4)ELISA克隆鉴定：采用ELISA克隆鉴定检测步骤3)中的孔内杂交瘤细胞；
5)杂交瘤亚克隆：将步骤4)中ELISA克隆鉴定检测筛选的阳性孔内杂交瘤细胞进行亚克隆；
6)杂交瘤测序：将步骤5)中收集的杂交瘤细胞分离mRNA，mRNA进行逆转录反应得到cDNA，cDNA加polyA尾反应，循环进行PCR反应扩增重链及轻链可变区后，分离扩增的重链和轻链可变区片段，回收纯化DNA片段并进行TA克隆，将扩增的重链和轻链可变区克隆至pMD-19T载体中，对扩增的重链和轻链可变区片段进行序列分析，确定其中的抗体框架区和CDR区。
所述的单克隆抗体能够特异性识别人体体液中的单羟酚类化合物，用于检测人体体液中单羟酚类化合物的含量。
实验结果：
1、小鼠免疫效价检测
分别使用偶联的多肽免疫小鼠，三次免疫后，从尾静脉取样，进行ELISA检测免疫效价，结果如下：
表3 小鼠免疫效价检测表
Figure BSA0000159356230000151
Figure BSA0000159356230000161
2、融合效价检测
分别取融合板孔内的杂交瘤培养基上清，进行ELISA检测，确定O.D值较高的孔进行亚克隆。
表4 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.632 0.533 0.617 0.559 0.576 0.582 0.509 0.568 0.608 0.62 0.535 0.564
B 1.82 0.6 0.53 0.815 0.714 0.654 0.989 0.906 1.67 0.934 0.926 0.726
C 0.625 0.761 0.704 1.098 1.041 1.112 0.961 1.005 0.92 1.137 0.965 0.967
D 0.602 2.691 0.799 1.832 1.037 1.045 0.817 0.663 1.296 1.277 1.687 1.352
E 0.961 0.632 0.899 0.764 0.937 1.011 0.937 2.399 1.239 1.233 1.405 1.107
F 0.7 0.813 0.827 2.101 1.066 1.074 0.901 0.967 1.114 2.334 1.197 0.812
G 0.894 1.164 0.908 0.86 1.129 1.175 0.98 1.009 1.025 1.226 0.604 0.723
H 2.858 0.314 0.894 1.01 0.867 0.771 0.696 0.554 0.6 0.887 1.031 0.079
表5 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.509 0.541 0.621 0.628 0.524 0.658 0.705 0.535 0.539 0.615 0.465 0.453
B 0.612 0.863 0.92 0.984 1.223 1.048 1.009 1.019 0.799 0.794 1.129 0.995
C 0.992 0.906 1.252 1.115 1.145 0.838 0.987 1.15 0.748 0.965 0.974 1.038
D 0.733 0.728 0.993 0.923 0.715 1.094 0.936 1.169 0.947 0.856 1.454 0.696
E 0.873 1.014 1.062 2.274 0.913 1.04 1.061 1.016 1.264 1.117 1.326 1.306
F 1.088 1.42 1.464 1.42 0.947 0.945 1.246 1.228 0.966 1.104 0.767 0.721
G 0.657 1.114 1.857 1.468 1.055 1.621 1.19 1.19 1.291 1.374 1.086 0.762
H 2.796 0.995 1.128 0.984 1.361 0.702 0.759 1.502 0.851 0.704 0.937 0.068
表6 融合效价检测
Figure BSA0000159356230000162
Figure BSA0000159356230000171
表7 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.787 0.627 1.022 0.846 0.766 1.036 0.871 1.218 0.683 0.702 0.071 0.067
B 0.879 0.966 1.155 1.444 1.176 1.133 1.989 1.144 1.378 1.48 0.072 0.071
C 1.227 1.133 1.102 0.997 1.295 1.528 0.963 2.323 2.327 1.214 0.07 0.062
D 1.552 1.238 1.394 1.99 0.897 1.059 1.146 1.447 1.22 0.989 0.057 0.058
E 1.376 2.149 1.859 1.322 1.409 1.178 1.553 1.547 1.655 1.448 0.074 0.071
F 0.937 1.544 0.96 1.675 1.866 1.722 1.268 1.503 1.966 1.32 0.071 0.082
G 1.069 1.386 1.573 1.458 1.281 1.151 1.749 1.676 0.977 1.699 0.073 0.075
H 2.766 1.164 0.79 0.816 0.885 1.025 1.002 0.745 1.143 1.202 0.058 0.051
表8 融合效价检测
Figure BSA0000159356230000172
表9 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.336 0.648 0.529 0.567 0.752 0.72 0.582 0.58 0.911 0.633 0.712 0.651
B 1.101 0.955 1.12 1.949 0.753 1.395 1.266 2.068 1.474 1.733 1.926 1.085
C 0.332 1.059 2.05 1.376 0.908 1.223 0.699 1.36 1.744 0.882 1.201 1.276
D 0.669 1.013 0.815 1.163 0.484 1.009 0.89 0.655 1.67 1.178 1.308 1.308
E 0.676 0.956 1.351 1.04 1.909 1.07 1.27 1.178 0.834 1.086 1.605 0.801
F 0.441 1.379 0.734 0.691 2.266 0.998 1.629 0.926 1.061 1.085 1.18 1.281
G 0.661 0.859 0.643 1.176 1.212 0.748 0.593 1.106 0.906 1.085 1.176 0.802
H 2.796 0.72 0.396 0.602 0.341 2.137 0.533 0.662 1.63 1.259 0.664 0.076
表10 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.319 0.433 0.561 0.414 0.365 0.362 0.483 0.604 0.447 0.486 0.65 0.385
B 0.266 0.639 0.939 0.949 0.617 0.833 0.848 0.784 0.782 0.722 0.952 0.563
C 0.483 1.029 0.886 0.852 1.072 0.633 0.657 1.547 1.048 1.148 0.961 2.581
D 0.362 0.45 2.038 0.45 1.328 0.965 1.658 1.607 0.954 0.776 1.006 0.301
E 0.539 0.611 0.873 0.806 0.611 1.091 0.92 0.917 1.208 0.788 0.796 1.121
F 0.478 0.865 1.366 0.496 0.851 1.062 1.169 0.847 0.782 1.343 0.898 0.725
G 0.389 0.935 0.515 0.827 0.892 0.581 0.877 0.725 1.43 0.568 0.784 2.157
H 2.693 2.465 0.442 0.426 0.687 0.589 0.472 0.481 0.501 0.296 0.543 0.069
表11 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.266 0.503 0.87 0.624 0.593 1.346 0.945 0.76 0.809 1.49 1.444 0.808
B 0.507 0.841 1.313 1.805 0.965 1.691 1.115 1.298 1.403 0.963 0.81 0.732
C 0.953 0.923 1.773 1.106 1.019 0.96 0.89 1.783 1.15 0.933 1.558 1.426
D 0.872 0.864 1.122 1.284 1.168 1.342 0.789 0.747 1.224 0.734 0.871 0.828
E 0.89 1.118 1.648 1.224 1.69 1.463 1.132 1.312 1.971 1.369 1.235 1.25
F 2.346 2.191 1.262 1.185 1.026 2.405 1.95 0.946 1.092 1.203 1.034 1.166
G 0.542 1.596 0.99 0.962 1.444 1.086 0.671 1.552 1.151 0.804 0.776 1.139
H 2.765 0.327 0.701 0.57 0.562 0.522 0.66 0.496 0.479 0.684 1.717 0.086
表12 融合效价检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.431 0.728 1.145 1.016 0.974 0.743 0.705 1.078 0.823 0.747 0.929 0.633
B 0.937 1.15 0.996 0.747 0.864 0.978 0.873 1.231 1.416 1.928 0.609 0.677
C 0.631 1.399 1.592 1.01 1.31 0.973 1.729 1.139 1.528 1.368 2.725 1.576
D 0.657 1.365 2.083 1.15 1.026 1.895 0.753 1.171 2.023 0.977 1.361 0.934
E 0.847 1.497 1.528 0.906 1.791 1.192 2.953 0.609 1.976 1.354 1.348 0.984
F 0.885 0.939 1.483 1.186 2.799 1.353 2.453 2.878 1.541 1.304 2.019 0.709
G 0.776 0.95 2.108 0.894 2.062 0.805 0.763 1.249 0.573 1.11 1.236 0.924
H 2.84 0.641 0.619 0.328 1.081 0.515 0.461 0.478 0.697 0.562 0.913 0.11
表13 融合效价检测
Figure BSA0000159356230000181
Figure BSA0000159356230000191
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure ISA0000159356250000011
Figure ISA0000159356250000021

Claims (1)

1.一种识别单羟酚类化合物的单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
编码所述单克隆抗体的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
其中：
所述单克隆抗体的重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
编码所述单克隆抗体的重链的CDR1-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
所述单克隆抗体的轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；
编码所述单克隆抗体的轻链的CDR1-3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
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