CN108383880B

CN108383880B - 靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(ii)配合物及其合成方法与应用

Info

Publication number: CN108383880B
Application number: CN201810424389.0A
Authority: CN
Inventors: 覃其品; 谭明雄; 王书龙; 王振凤; 李佳雅; 罗冬妹; 黄小玲; 石贝贝
Original assignee: Yulin Normal University
Current assignee: Yulin Normal University
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN108383880A

Abstract

本发明公开了一种靶向于卵巢癌耐药株的香豆素‑铂(II)配合物及其合成方法与应用，所述的配合物化学结构式如式1‑式2所示：

本发明以3‑(2ˊ‑苯并咪唑基)‑7‑甲氧基香豆素为活性配体，与不同物质的量的二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)配位反应合成了一种具有抗肿瘤活性的配合物，研究发现配合物1‑2表现出靶向于抑制卵巢癌耐药细胞SK‑OV‑3/DDP的生长，其IC₅₀值分别为10.25±0.33μM和0.51±0.23μM，其体外抗肿瘤活性远远大于配体和经典的金属基抗癌药物顺铂。

Description

靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物及其合成方法与应用

技术领域

本发明涉及铂(II)配合物及其合成方法与应用，尤其是一种靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物及其合成方法与应用。

背景技术

癌症是目前危害人类健康一类较为严重的疾病之一，其发病率和病死率极高，其对家庭和社会造成较大的经济负担。世界卫生组织的国际癌症研究机构在2013年出版的《世界癌症报告》中指出，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人，因而对于癌症治疗问题的研究是十分必要的。

目前，已经批准上市的柏类抗癌药物包括在世界范围内顺铂、卡铂、奥沙利铂及其在部分国家获得批准的奈达铂、洛铂和庚铂等。这些铂类药物临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤。虽然顺铂类作为化疗效果最好抗癌药物之一，并得到广泛应用，但是其肾毒性、胃肠毒性、神经毒性、骨髓毒性和耳毒性等毒副作用以及肿瘤细胞的耐药性限制了其进一步的应用。因此，研发新型高效、低毒、靶向性的铂类抗肿瘤化疗药物迫在眉睫。

卵巢癌占全世界女性癌症死亡的第五位，比其他生殖系统肿瘤的死亡率均高，且化疗是目前治疗卵巢癌的重要手段之一，以顺铂类药物为主的化疗方案提高了卵巢癌患者的总体反应率、临床完全消失率和中位生存期。但是，卵巢癌耐药的产生常使化疗难以奏效，并最终使治疗失败。有资料表明，以顺铂类药物为主的化疗方案对卵巢癌患者的总体生存率并无明显改善。因此，研究卵巢癌耐药的机理并加以临床逆转是目前卵巢癌化疗中亟待解决的课题之一。

此外，香豆素类化合物是自然界很重要的一大类天然有机活性化合物，近年来研究发现香豆素类化合物具有抗HIV、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多方面生物学活性。从结构分析看，其母环结构具有较好的芳香平面性，是一种优良的有机活性天然配体。

目前尚未见3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素)的铂(II)配合物及其合成方法与应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种两种结构新颖的靶向于卵巢癌耐药株的3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物。

本发明的目的之二是提供上述3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物的合成方法。

本发明的目的之三是提供上述3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物的应用。

本发明的目的之一通过下述方法实现：一种靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物，其化学结构式如式1-2所示：

本发明的目的之二通过下述方法实现：一种如上所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素混合并溶于极性溶剂中，得到混合溶液；

步骤2：将所述的混合溶液进行配位反应，得反应液；

步骤3：将所述的反应液经过滤，洗涤，干燥，即得。

其中，所述步骤1中的二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素的物质的量比例为：1～2:1。

其中，所述步骤1中的极性溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、二甲基亚砜、丙酮和水中的一种或几种组合。

其中，所述步骤1的极性溶剂的用量为：每1mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)使用35～150mL。

其中，所述步骤2中的反应温度为45～120℃，反应时间为12～72h。

其中，所述步骤3的洗涤步骤采用水、甲醇和乙醚依次进行洗涤。

其中，所述步骤3的干燥条件为：50～75℃，真空干燥。

本发明的目的之三通过下述方法实现：一种如上所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物应用于制备端粒酶抑制剂。

本发明还涉及所述的香豆素-铂(II)配合物应用于制备靶向于端粒酶的抗肿瘤药物。

本发明与传统方法相比，具有以下优点：

本发明以3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素为活性配体，与不同物质的量的二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)配位反应合成了一种具有抗肿瘤活性的配合物1-2，研究发现配合物1-2表现出靶向于抑制卵巢癌耐药细胞SK-OV-3/DDP的生长，其IC₅₀值分别为10.25±0.33μM和0.51±0.23μM，其体外抗肿瘤活性远远大于配体和经典的金属基抗癌药物顺铂；此外，配合物1-2对正常细胞HL-7702的毒性很小，IC₅₀>100μM。研究还发现，配合物2是一种良好的端粒酶抑制剂，抑制率大于56％，有望成为一种靶向于端粒酶的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明制得的配体H-OMe的核磁共振氢谱图；

图2为本发明制得的配体H-OMe的核磁共振碳谱图；

图3为本发明制得的配体H-OMe的电喷雾质谱图；

图4为本发明制得的配体H-OMe的X-射线单晶衍射谱图；

图5为本发明实施例1制得的配合物1的红外谱图；

图6为本发明实施例1制得的配合物1的核磁共振氢谱图；

图7为本发明实施例1制得的配合物1的电喷雾质谱图；

图8为本发明实施例2制得的配合物2的红外谱图；

图9为本发明实施例2制得的配合物2的核磁共振氢谱图；

图10为本发明实施例2制得的配合物2的电喷雾质谱图；

图11为本发明实施例2制得的配合物2的X-射线单晶衍射谱图；

图12为本发明制得的铂(II)配合物1-2抑制SK-OV-3/DDP的端粒酶活性图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明的权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

以下各实施例中所涉及的配体H-OMe为3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素的简称，配体H-OMe按下述步骤进行合成：

配体H-OMe的合成步骤：

称取0.01mol 2-氰基甲基苯并咪唑与0.01mol 4-甲氧基水杨醛置于100mL的圆底烧瓶中，加入到30mL乙醇中，加入0.1mL哌啶，在室温下搅拌12h，过滤得到黄色沉淀，往黄色沉淀加入100mL 2％的稀盐酸，回流6h，冷却后加入0.5g CH₃COONa，过滤沉淀，用水洗，干燥并用无水乙醇重结晶，最终得到黄色固体—配体H-OMe，产率42.50％。

(1)核磁共振氢谱谱图，其谱图如图1所示。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.47(s,1H),9.08(s,1H),7.92(d,J＝8.7Hz,1H),7.69–7.63(m,2H),7.24–7.18(m,2H),7.13(d,J＝2.4Hz,1H),7.05(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),3.90(s,3H).

(2)核磁共振碳谱谱图，其谱图如图2所示。

¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ164.00,160.02,155.84,146.74,143.16,131.25,122.66,113.84,113.39,113.14,100.95,56.63,40.62,40.41,40.20,39.99,39.78,39.57,39.36.

(3)电喷雾质谱，其谱图如图3所示。

ESI-MS m/z:314.9[M+Na]⁺，其中M为配体H-OMe的分子量。

(4)配体H-OMe的X-射线单晶衍射谱，其谱图如图4所示。

(5)元素分析结果，如下述表1所示。

因此，可以确定所得黄色配体H-OMe，其结构式如下：

实施例1

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和1.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，将固体溶解于55mL的乙醇和DMSO(二甲基亚砜)的混合溶液中，乙醇和DMSO的体积比为100:1，在80℃下反应24小时，冷却至室温静置，析出黄色固体，抽滤，固体经依次用水、甲醇和乙醚进行洗涤，分离出黄色固体，真空干燥后得到配合物1，产率91.5％。

对所得配合物1进行鉴定：

(1)红外光谱，其谱图如图5所示。

IR(KBr):3287,1717,1604,1566,1318,1448,1368,1240,1135,1023,772,739,513,443cm^-1.

(2)核磁共振氢谱谱图，其谱图如图6所示。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ13.79(d,J＝84.7Hz,1H),9.94(d,J＝248.5Hz,1H),8.22(t,J＝7.2Hz,1H),8.00–7.90(m,1H),7.77–7.69(m,1H),7.52–7.43(m,2H),7.23(dd,J＝4.3,2.1Hz,1H),7.14(dd,J＝4.0,1.9Hz,1H),3.95(s,3H),3.44(s,3H),2.54(d,J＝1.2Hz,5H).

(3)电喷雾质谱，其谱图如图7所示。

ESI-MS m/z:599.0[M－Cl]^-，其中M为配合物1的分子量。

(4)元素分析结果，如下述表1所示。

因此，可以确定所得配合物1的结构式如下所示：

实施例2

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和2.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，溶解于80mL的甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为15:1，在90℃下反应36小时，冷却至室温，静置，析出红棕色固体或晶体，分离出固体，经依次用水、甲醇和乙醚进行洗涤，干燥，得到红棕色固体产物-配合物2，产率98.9％。

对所得配合物2进行鉴定：

(1)红外光谱，其谱图如图8所示。

IR(KBr):3449,3214,3116,3005,2916,1653,1597,1460,1285,1235,1128,1023,826,748,696,551,445cm^-1.

(2)核磁共振氢谱谱图，其谱图如图9所示。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.09(s,1H),8.52(d,J＝7.2Hz,1H),8.23(s,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.75(d,J＝7.0Hz,1H),7.47(s,1H),7.39(s,1H),7.30(s,1H),4.07–3.88(m,6H),2.54(s,9H).

(3)电喷雾质谱，其谱图如图10所示。

ESI-MS m/z:776.3[M－DMSO－Cl+CH₃OH]⁺，其中M为配合物2的分子量。

(4)元素分析结果，如下述表1所示。

表1配体H-OMe和实施例中配合物1-2的元素分析结果

因此，可以确定所得配合物2，其结构式如下：

实施例3

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和1.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，溶解于35mL的无水甲醇中，在45℃下反应72小时，冷却至室温静置，抽滤，黄色固体经依次用水、甲醇和乙醚进行洗涤，干燥，得到配合物1，产率80.0％。

实施例4

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和1.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，溶解于150mL的丙酮和水的混合液中，丙酮和水的体积比为35:1，在120℃下反应12小时，冷却至室温静置，抽滤，黄色固体经依次用水、甲醇和乙醚进行洗涤，真空干燥后得到配合物1，产率85.6％。

实施例5

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和2.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，将其溶解于60mL的丙酮中，在65℃条件下回流反应48小时，反应后得到红棕色目标产物，冷却，过滤，依次以水、甲醇和乙醚洗涤，过滤，干燥，最终得到配合物2，产率85.8％。

实施例6

准确称量1.0mmol的配体H-OMe和2.0mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，混合均匀后，将其溶解于乙氰和水的混合液中，乙氰和水的体积比为50：1，在50℃下反应58小时，冷却至室温，静置，析出红棕色固体，分离出固体，干燥，得到配合物2，产率为95.1％。

下面对配合物1和配合物2进行了抗肿瘤活性实验和毒性实验研究。

一、抗肿瘤活性实验和毒性实验

1.细胞株与细胞培养

本实验选用人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞Hep-G2、人卵巢癌SK-OV-3及其耐药株SK-OV-3/DDP、人胃癌细胞MGC80-3以及人正常肝细胞HL-7702 6种人类细胞株。

所有人源细胞株均培养在含100U/mL青霉素、10wt％小牛血、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养。

2.待测化合物的配制

所用的配体H-OMe和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物1-2的纯度均需≥95％，将它们的DMSO储液用生理缓冲液稀释成20μmol/L的终溶液(DMSO的终浓度≤1％)，测试该浓度下配体H-OMe和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物1-2对正常细胞或所选的肿瘤细胞生长的抑制程度。

3.MTT法检测细胞生长抑制实验

(1)取对数生长期的正常细胞或肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔。

(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

(4)每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值。

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)、对照孔(细胞、培养液、MTT、相同浓度的药物溶解介质、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值，即OD值，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：

计算配体H-OMe和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物1-2对所选细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对所选的各个细胞株的IC₅₀值。其结果如以下表2所示：

表2.配体H-OMe和配合物1-2对各种细胞株的IC₅₀值(μM)

从IC₅₀活性筛选结果来看，3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物1-2对所选的癌细胞均表现出一定的增殖抑制活性，均高于相应的配体H-OMe活性。其中配合物铂(II)配合物1-2则靶向性抑制人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP的增殖，其IC₅₀值分别为10.25±0.33和0.52±0.33μM，其活性比顺铂药物的活性分别提高了6.85和137.76倍。

另一方面，配合物1-2对人正常肝细胞HL-7702细胞毒性很小，IC₅₀均大于100μM，这是一个有积极意义的结果，表明配合物1-2靶向抑制人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP的生长，同时还具有较低的肝脏毒性，即配合物配合物1-2具有一定的细胞毒性选择性。

综上所述，本发明所述的两种新型的3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素-铂(II)配合物1-2，总体表现出了明显的体外抗肿瘤活性和毒性选择性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

二、配合物1-2抑制SK-OV-3/DDP细胞的端粒酶活性：

1.细胞培养和加药方式

本实验选用人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP为优选肿瘤细胞株。

取对数期生长的SK-OV-3/DDP细胞，分别加入0.0μM配合物1和0.5μM配合物2，作用24小时后，收集细胞。

2.端粒酶提取和抑制实验

端粒酶提取盒购于北京中西远大公司，货号NKJ15DLM，-80℃长期保存。

2.1端粒酶提取

以含1.0％DMSO溶液为空白对照组，10.0μM配合物1和0.5μM配合物2作用人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP细胞24小时后，进行如下实验：

(1)收集不少于1×10⁶个细胞，约为6孔板的1-2孔细胞量，离心2000rpm，5min，离心收集细胞，预冷的PBS洗涤后于冰浴上研磨匀浆。

(2)加入1.0mL Wash buffer，即1.0mL PBS中加入1μL的1mol/L DTT(二硫苏糖醇)，重悬上述收集的细胞，置于冰上5min，4℃下离心5min，3000rpm，弃上清液。

(3)加入40μL Lysis buffer，即40μL PBS中加入0.02μL苯甲基磺酰氟和0.0.2μL的β-巯基乙醇，悬浮细胞，涡旋振荡10s，置冰上45min，4℃，13000rpm下离心30min，取上清液。

(4)将步骤(3)的上清液转移至新的EP管中用Lysis buffer调浓度至10μg/μL，于-20℃保存备用。

2.2PCR扩增

(1)在PCR管中分别加入5μL 10×TRAP buffer、1μL dNTPs(三磷酸碱基脱氧核苷酸)，1μL Taq-DNA polymerase(耐热性DNA聚合酶)、1μL TS primer(TS引物)和2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，室温下保温30min；

(2)加入1μL CX primer混匀，在扩增仪上进行30个循环，94℃预热5min，设置循环参数如下：94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸90s；72℃延伸5min，4℃保存产物。

2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)制备10mL 12％非变性聚丙烯酰胺凝胶：4mL 30％Acr-Bis(丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis,30％,29:1))、4.92mL H₂O、1mL 5×TBE(54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/L EDTA采用无菌水溶解混匀，NaOH调pH至8.0，溶液体积1L)、70μL 10％APS(过硫酸铵)和10μL的TEMED(四甲基乙二胺)。

(2)取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，于电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑45min，在电压220V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳2h。

2.4硝酸银染色

(1)将凝胶置10％乙酸固定30min，去离子水漂洗3次，每次5min；

(2)将凝胶置于0.2g/L硫代硫酸钠浸泡1min，去离子水漂洗3次，每次30s；

(3)将凝胶置于硝酸银染液染色30min，去离子水漂洗30s；

(4)将凝胶置于显色液中显色10-15min左右直到条带显色完全为止；

(5)最后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。

2.5结果判断与数据处理：

PCR扩增产物以硝酸银染色，出现6bp或间隔6bp整数倍的梯形条带为阳性结果，以凝胶成像软件测定条带，得出各标本的相对吸光度IOD值代表端粒酶活性。阳性条带以Gelpro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD(integrated optical density)累积光密度，每次均设有空白对照组。计算公式如下：

计算出化合物抑制Hep-G2肿瘤细胞的端粒酶活性，其实验结果如图8所示。

端粒酶实验结果详见图12，10.0μM配合物1和0.5μM配合物2对人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP中端粒酶的抑制作用分别为35.07％和56.57％，实验结果说明了配合物2对端粒酶具有了更高的靶向作用，是一种较好的端粒酶抑制剂。

综上所述，本发明所述的配合物1-2表现出优异的体外抗肿瘤活性和选择性抑制人卵巢癌耐药株SK-OV-3/DDP，对肿瘤细胞的细胞毒性优于顺铂和配体H-OMe，具有良好的潜在药用价值；此外，配合物2是一种较好的端粒酶抑制剂。

Claims

1.一种靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物，其特征在于，其化学结构式如式2所示：

2.一种如权利要求1所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2：将所述的混合溶液进行配位反应，得反应液；

步骤3：将所述的反应液经过滤，洗涤，干燥，即得。

3.根据权利要求2所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)和3-(2ˊ-苯并咪唑基)-7-甲氧基香豆素的物质的量比例为2:1。

4.根据权利要求2所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的极性溶剂为甲醇、乙腈、乙醇、二甲基亚砜、丙酮和水中的一种或几种组合；所述步骤1的极性溶剂的用量为：每1mmol二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)使用35～150mL。

5.根据权利要求2所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的反应温度为45～120℃，反应时间为12～72h。

6.根据权利要求2所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3的洗涤步骤采用水、甲醇和乙醚依次进行洗涤；所述步骤3的干燥条件为：50～75℃，真空干燥。

7.如权利要求1所述的靶向于卵巢癌耐药株的香豆素-铂(II)配合物应用于制备抗肿瘤药物。

8.如权利要求1所述的香豆素-铂(II)配合物应用于制备端粒酶抑制剂。

9.如权利要求1所述的香豆素-铂(II)配合物应用于制备靶向于端粒酶的抗肿瘤药物。