CN108339158A - 一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物相容性微胶囊的制备及应用技术领域，具体涉及一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。以具有生物相容性的两相磷酸钙颗粒为自组装基元，以骨形成蛋白水溶液为分散相，玉米油为连续相制备稳定的油包水型微胶囊。固体粒子不需要预修饰，在乳液形成过程中玉米油中的脂肪酸可以同步修饰颗粒，实现了一步构建油包水型微胶囊。该微胶囊材料在骨形成蛋白的作用下，利用β‑磷酸三钙的降解产物原位生物矿化，来进行骨质的修复。此方法制备微胶囊过程简单，所用油相可适用于基于玉米油系列的其他植物油，具有普适性。利用自组装技术制备具有生物活性的人造无机原细胞，为自组装技术在生命科学领域的应用提供了广阔的前景。

Description

一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用
技术领域
本发明涉及生物相容性微胶囊的制备及应用技术领域，具体涉及一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。
背景技术
Pickering乳液是以固体粒子代替传统化学乳化剂分散在两互不相溶的液体中，通过界面自组装形成的热力学和动力学均稳定的分散体系。相比于传统表面活性剂稳定的乳液，Pickering乳液由于其成本低、无毒和环保等特性，在食品、化妆品、医药和材料科学等领域具有重要的应用价值，近年来受到了许多国内外研究者的广泛关注。固体颗粒能够有效稳定乳液，一个重要条件是颗粒能被乳液中的两种液体不同程度地润湿，即固体颗粒要有一定润湿性。固体粒子润湿性的大小通常用固体粒子在油/水界面的三相接触角θ来表征。当θ<90°时，固体粒子亲水性较强，有利于形成O/W型乳液；当θ＝90°时，固体粒子可以在油/水界面形成结构比较稳定的薄膜，有较好的乳化性能；当θ>90°时，固体粒子的亲油性较强，有利于形成W/O型乳液。
微小粒子有巨大的表面能容易团聚，为了得到稳定的乳液，研究者多采用经表面修饰后的粒子或者是固体粒子与表面活性剂/聚合物协同稳定乳液。如(1)C.Huo,M.Li,X.Huang,H.Yang,S.Mann,Langmuir 2014,30,15047；(2)Y.Iwasaki,Y.Takahata,S.Fujii,Colloids Surf.B.Biointerfaces 2015,126,394.但是对粒子的表面预修饰处理使得合成过程比较繁琐。利用亲水性固体粒子(无需表面修饰)制备稳定的油包水型Pickering乳液的方法尚未见报道。
两相磷酸钙(BCP)是由羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)以一定的比例组合而成的复合材料，具有良好的生物相容性和生物活性，作为骨组织替代材料的研究已有报道，但是该材料直接暴露于环境中易耗散且释放过程不易控制。而微胶囊具有保护物质免受环境影响，控制可持续释放等多种功能，因而使用无需表面修饰的两相磷酸钙颗粒为自组装基元，一步法构建含有骨形成蛋白的微反应胶囊，保证骨形成蛋白的局部定位和缓慢释放将解决现在医疗中存在的问题，这也是本发明需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法及其在骨修复中的应用。具体是通过以亲水性两相磷酸钙颗粒(无需表面预修饰处理)为自组装基元，以玉米油为油相，一步法构建具有生物活性的人造原细胞(油包水型Pickering乳液)并用于骨修复。玉米油中含有大量的脂肪酸，在乳液形成过程中作为油相的同时可以同步修饰颗粒使其具有一定的疏水性，从而实现一步形成包载有骨形成蛋白水溶液的油包水型微胶囊，通过其缓慢释放骨形成蛋白，以可生物降解无机细胞壁的矿物质为原料，实现骨缺损处的原位矿化与修复。其成骨量相当于单独使用等量骨形成蛋白的25倍，减少了骨形成蛋白的使用，降低了骨形成蛋白大量应用的副作用。
实现本发明目的所采用的技术方案是：
一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法，步骤如下：
(1)羟基磷灰石/β-磷酸三钙复合材料颗粒的制备：55℃搅拌下将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Ca(NO3)2水溶液中，其中，钙和磷元素的初始摩尔比Ca/P＝1.5，用氨水控制整个滴加过程溶液的pH＝7.0-8.0，滴加完毕后继续反应1-2h，得到的悬浮液在室温下静置30-40h后，将白色沉淀水洗、离心，75-85℃干燥10-15h，最后在1100℃下煅烧2-4h，得到两相磷酸钙颗粒。
(2)一步法构建油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊
将步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒置于容器中，加入A相，充分分散，然后将B相加入，剧烈震荡，即得油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊；
所述A相为油相，所述B相为水相；
所述油相为可被生物体自然吸收的液态植物油脂，优选自玉米油、葵花油、大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油和芝麻油中的任意一种；
所述水相为具有生物相容性的骨形成蛋白溶液，优选为骨形成蛋白BMP2溶液；
步骤(2)中，所述两相磷酸钙颗粒与A相的比例为15-20mg:2mL；
步骤(2)中，所述两相磷酸钙颗粒与B相的比例为15-20mg:100μL；
进一步，所述骨形成蛋白BMP2溶液的浓度范围为20-100μg·mL-1。
上述一步法制备的具有生物活性的两相磷酸钙微胶囊生物材料通过包埋骨形成蛋白的方式，在骨骼破损处进行骨质的修复。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
本发明的两相磷酸钙微胶囊制备过程简单，所用油相易得，成本较低，实现了骨质的高效修复生长，为自组装技术在生命科学领域的应用提供了广阔的前景。
附图说明
图1为本发明制备方法的步骤(2)一步构建油包水型两相磷酸钙颗粒微胶囊的方法的模式图。灰色不规则形状代表亲水性的两相磷酸钙颗粒(BCP颗粒)；黑色代表油相(玉米油)，即A相；内部带有螺旋状的白色球形代表骨形成蛋白水溶液，即B相。最右边是形成的微胶囊的3D图。所用两相磷酸钙颗粒无需表面修饰，直接在水油相混合环境中发生自组装，形成稳定的油包水型微胶囊。
图2为本发明制备方法的步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒的扫描电镜图片。
图3为本发明制备方法的步骤(1)得到的两相磷酸钙颗粒的XRD谱图。
图4为实施例1制备的微胶囊的光学显微镜图片。
图5为实施例2制备的微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图片。
图6为实施例2制备的微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜3D图片。
图7为实施例3经玉米油处理前及处理后的两相磷酸钙颗粒的傅里叶变换红外光谱图谱(FTIR)。
图8为实施例3经玉米油处理前(左图)及处理后(右图)的两相磷酸钙颗粒的接触角测量值示意图。
图9-图14为实施例4制备的各微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图片。
图15为实施例5实验组和各对照组的micro-CT扫描图。
图16为实施例5实验组和各对照组micro-CT扫描相对骨体积分数定量分析柱状图。
图17为对比例1制备的微胶囊的荧光显微镜图片。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
以下实施例中，所用骨形成蛋白BMP2为杭州九源基因工程有限公司生产，生物纯，置于0-4℃的冰箱中保存，使用时先将A mg BMP2加入到B mL 1v/v％的醋酸溶液中(A:B＝1:1)，后加水稀释至所需浓度；或者，当BMP2实验浓度为1mg·mL-1时直接使用。
以下实施例和对比例中，原料两相磷酸钙复合材料(简称“BCP颗粒”)为申请人自制，制备方法如下：55℃搅拌下将300mL、含0.24mol(NH4)2HPO4的(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到300mL、含0.36molCa(NO3)2的Ca(NO3)2水溶液中，用28wt％氨水控制整个滴加过程中溶液的pH＝7.5，滴加完毕后继续反应2h。得到的悬浮液在室温下静置36h后，将白色沉淀水洗、离心，于80℃下干燥12h，最后在1100℃下煅烧3h，得到两相磷酸钙颗粒(以下简称“BCP颗粒”)。其扫描电镜图见图2，颗粒粒径为0.5-1.5μm。图3为BCP颗粒的XRD谱图，XRD谱图显示所得颗粒为β-磷酸三钙(JCPDS09-0432)和羟基磷灰石(JCPDS09-0169)的混合相，其中两者的质量比β-TCP/HA＝70/30。
实施例1：
一步法制备两相磷酸钙颗粒微胶囊，其制备过程如下：将20mgBCP颗粒置于试管中，加入2ml玉米油充分超声分散；然后向试管中加入100μl的40μg·mL-1骨形成蛋白BMP2溶液，剧烈震荡5min，形成乳状液。以光学显微镜观察，见图4，可见所得胶囊为多分散性，粒径分布在15-105μm。
实施例2：
为了检验实施例1中所得到的是油包水型微胶囊，将实施例1中的骨形成蛋白溶液换为含100μmol·L-1钙黄绿素(水溶性荧光染料)的40μg·mL-1骨形成蛋白BMP2溶液，其余操作均与实施例1完全相同，得到乳状液。以激光扫描共聚焦显微镜观察，可见微胶囊内钙黄绿素溶液被光激发，发射出显著的绿色荧光，外相无荧光激发现象，证明得到了油包水型微胶囊，见图5及图6。
实施例3：
为了检验实施例1玉米油中的脂肪酸在微胶囊形成过程中同步修饰了BCP颗粒从而使其具有两亲性，进行了下面的实验。实验过程：取0.5g BCP颗粒充分超声分散在35mL玉米油中并震荡6h使其与玉米油充分作用，后离心除去未与BCP颗粒作用的玉米油。随即加入35mL丙酮剧烈震荡后，离心，将得到的沉淀在80℃下干燥12h，得到了玉米油处理过的BCP颗粒，所得样品记为BCP-oil，通过红外光谱、接触角等表征手段对玉米油处理前后的粉末样品进行分析。
图7为修饰前(虚线)的BCP颗粒和实施例3中经玉米油处理后(实线)的BCP颗粒(BCP-oil)的傅里叶变换红外光谱图谱(FTIR)，观察可见玉米油处理后的BCP颗粒在2850-2950cm-1的振动强度明显增强并且在3435cm-1处的峰强度有所减弱，说明了玉米油处理后的BCP颗粒表面的有机基团数目增多且羟基数目减少，即证明了有机基团已被成功修饰至两相磷酸钙表面。
图8为实施例3中修饰前(左图)及修饰后(右图)的两相磷酸钙颗粒的接触角测量值示意图，可以看出被玉米油处理过的BCP颗粒的接触角从31°增至106°，进一步证明了玉米油中的脂肪酸成功修饰了BCP颗粒表面。
实施例4：
为了检验实施例1中所用植物油具有普适性，进行了下面系列实验。除将玉米油分别换为葵花油、大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油和芝麻油外，其余操作均与实施例2完全相同，得到乳状液。以激光扫描共聚焦显微镜观察(图9-图14)依次为以葵花油、大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油和芝麻油为油相制备的微胶囊的激光扫描共聚焦显微镜图片)，可见微胶囊内钙黄绿素溶液被光激发，发射出显著的绿色荧光，而外相均无荧光激发现象，证明得到了油包水型微胶囊。也进一步说明本发明中以两相磷酸钙为自组装基元，一步制备油包水型微胶囊的方法适用于其他植物油。
实施例5：
为了探究两相磷酸钙微胶囊在动物体内的成骨能力情况，进行了一系列实验。具体实验过程如下：使用2mL的玉米油作为油相，加入15mg两相磷酸钙颗粒，使用超声波将其充分分散于油相中，然后加入100μL的40μg·mL-1BMP2溶液，剧烈震荡，形成乳状液。静置过夜，弃去上层油相，作为实验组(图15-d)。另设置如下六个对照组：
图15-a将15mg BCP颗粒分散于100μL双蒸水中；
图15-b将实验组中100μL的40μg·mL-1BMP2溶液换为100μL双蒸水，其余操作与实验组一致；
图15-c将15mg BCP颗粒分散于100μL BMP2溶液(40μg·mL-1)中；
图15-e 100μL浓度为200μg·mL-1的BMP2溶液；
图15-f 100μL浓度为500μg·mL-1的BMP2溶液；
图15-g 100μL浓度为1mg·mL-1的BMP2溶液。
将上述7组材料/蛋白分别注入8周龄昆明小鼠股四头肌肌袋中，3周后将老鼠的股骨、胫骨和肌肉取出，用多聚甲醛固定，micro-CT扫描，分析BV/TV成骨指标。结果见图15-图16及表1，从实验结果可以看出，使用两相磷酸钙微胶囊包载4μg BMP2(d)的成骨量等同于单独使用100μg BMP2(g)的成骨量，且远远高于其他对照。结果表明使用两相磷酸钙包载蛋白效率更高，能够大幅度减少BMP2用量，促进成骨，同时局限BMP2的扩散，起到原位、定位骨诱导的作用。
表1实施例5实验组和各对照组micro-CT扫描相对骨体积分数定量分析结果
对比例1
为了检验BCP颗粒在十二烷中的胶囊形成情况，以十二烷为油相构建两相磷酸钙颗粒微胶囊。选择使用含100μmol·L-1尼罗红(油溶性荧光染料)的十二烷作为油相，蒸馏水为水相。实验过程如下：将20mg BCP颗粒置于试管中，加入2mL含100μmol·L-1尼罗红的十二烷作为油相，充分超声分散；然后向试管中加入100μL的蒸馏水，剧烈震荡5min，形成乳状液。以荧光显微镜观察，可见微胶囊内的尼罗红溶液被光激发，发射出红色荧光，外相则无荧光激发现象，见图17，证明BCP颗粒在十二烷中形成了水包油型微胶囊。
这也印证了亲水性粒子在一般的油相中通常得到的是水包油型微胶囊，目前现有技术中的磷酸钙颗粒均需表面修饰以后才能进一步形成油包水型Pickering乳液，而我们用BCP颗粒在植物油中却可以一步得到油包水型微胶囊，为自组装技术在生命科学领域的应用提供了广阔的前景。

Claims (7)

1.一种一步构建两相磷酸钙微胶囊的方法，步骤如下：
（1）两相磷酸钙颗粒的制备：
55℃搅拌下将(NH4)2HPO4水溶液逐滴滴加到Ca(NO3)2水溶液中，钙和磷元素的摩尔比Ca/P=1.5，用氨水控制整个滴加过程溶液的pH=7.0-8.0，滴加完毕后继续反应1-2h，得到的悬浮液在室温下静置30-40h后，将白色沉淀水洗、离心，75-85℃干燥10-15h，最后在1100℃下煅烧2-4h，得到两相磷酸钙颗粒；
（2）一步法构建油包水型两相磷酸钙微胶囊
将步骤（1）得到的两相磷酸钙颗粒置于容器中，加入A相，充分分散，然后将B相加入，剧烈震荡，即得油包水型两相磷酸钙微胶囊；
所述A相为油相，所述B相为水相；
所述油相为可被生物体自然吸收的液态植物油脂；
所述水相为具有生物相容性的骨形成蛋白溶液；
所述两相磷酸钙颗粒与A相的比例为15-20mg: 2mL；
所述两相磷酸钙颗粒与B相的比例为15-20mg: 100 µL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油相选自玉米油、葵花油、大豆油、花生油、橄榄油、菜籽油或者芝麻油中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述骨形成蛋白溶液为骨形成蛋白BMP2溶液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述油相为玉米油。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述骨形成蛋白BMP2溶液的浓度为20-100μg•mL-1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述骨形成蛋白BMP2溶液的浓度为40μg•mL-1。
7.根据权利要求5或6所述的方法制备的油包水型两相磷酸钙微胶囊在制备骨缺损处的原位矿化与修复药物中的应用。
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