CN108310075A - 一种治疗糖尿病周围神经病变的芪芍活血药物及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中医药领域，公开了一种治疗糖尿病神经病变的药物，发明名称为一种治疗糖尿病周围神经病变的芪芍活血药物及其制法，该药物是由以下重量份的药味原料制成：黄芪5～7重量份，白芍3～5重量份，川芎3～5重量份，当归3～5重量份，地龙2～4重量份。本发明提供了该药物的制法，本发明提供的药物可有效治疗糖尿病神经病变，疗效高、配伍简单、成本低；方法活性成分提取效率高、有效成分含量高、杂质含量低、疗效可靠、安全性高。本发明还提供了采用高效液相色谱法和气相色谱法测定活性成分含量的方法。

Description

一种治疗糖尿病周围神经病变的芪芍活血药物及其制法
技术领域
本发明属于中医药技术领域，涉及一种治疗糖尿病神经病变的药物及其制法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
黑龙江中医药大学邹国良、仲维莉于2009年在《中国医科大学学报》上发表论文《缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响》(邹国良，仲维莉，胡健.缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].中国医科大学学报，2009，38(10)：745-748.)中提出，探讨缺血后处理(IPost)对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及其作用机制，通过尾静脉注射2％链脲佐菌素溶液(STZ)45mg/kg的方法建立糖尿病大鼠模型，并将建立模型后的糖尿病大鼠随机分为4组，每组8只：(1)缺血再灌注组(IR组)：结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h；(2)缺血再灌注+渥曼青霉素组(IR+Wort组)：结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注前5min，经尾静脉注射渥曼青霉素(15μg/kg)，再灌注2h；(3)缺血后处理组(IPost组)：结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注30s，阻断30s，重复3次，再灌注2h；(4)缺血后处理+渥曼青霉素组(IPost+Wort组)：结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注前5min，经尾静脉注射渥曼青霉素(15μg/kg)，余处理同缺血后处理组。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Westernblot检测心肌细胞p-Ak(tser473)、Akt、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与IR组比较，IPost组心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白表达明显减少(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达、p-Akt/Akt的比值增高，而渥曼青霉素能够部分消除IPost的心脏保护作用。研究证实了缺血后处理能够减少糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生，PI3K/Akt信号转导通路参与了缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞的保护作用。
黑龙江中医药大学邹国良于2010年在博士毕业论文《缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞的影响及机制研究》(邹国良.缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞的影响及机制研究[D].中国医科大学，2010.)中提出急性心肌梗死是严重危害人类健康的常见疾病，其根本解决方法就是尽快恢复心肌的血液供应。随着静脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术等技术的广泛应用，缺血心肌能够重新获得血液供应，明显减轻了缺血性心肌损伤。但是，再灌注过程往往加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏，引起致命性损伤，即缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)。近年来，缺血后处理的心脏保护作用逐渐被人们重视，尽管作用机制仍在探讨之中，但其减轻I/RI的作用已经被广泛关注。作为一种内源性心脏保护机制，目前多个种系的动物实验已经证明
PI3K/Akt信号通路参与了缺血后处理的心脏保护作用。现今，糖尿病已成为严重危害人类健康的全球流行性疾病，其持续增长的流行病学趋势已成为严重的公共卫生问题，其慢性并发症是患者致残、致死的主要原因。与非糖尿病人群相比，糖尿病人群中动脉粥样硬化性疾病的患病率高、发病年龄轻、病情进展较快，多脏器同时受累较多。糖尿病人群心脑血管病患病率为非糖尿病人群的2～3倍。本研究通过观察缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数的变化，系统评价其对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响；采用分子生物学的方法，观察缺血后处理对PI3K/Akt信号通路中的关键酶Akt及其下游调控的eNOS表达的影响，以探讨缺血后处理的心血管保护效应及其可能的分子机制，为缺血后处理广泛应用于临床提供理论依据。本研究证明，缺血后处理可以减轻糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的梗死面积，减小凋亡指数，同时上调p-Akt、p-eNOS的表达，应用PI3K/Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素后大鼠心肌p-Akt、p-eNOS的表达减少，同时缺血后处理的上述心脏保护作用消失，说明PI3K/Akt信号通路参与了缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用。
黑龙江中医药大学仲维莉于2011年在《中国糖尿病杂志》发表《甘精胰岛素和预混胰岛素用于老年2型糖尿病患者的疗效和不良反应对比分析》(闫晓光，张锦，仲维莉，魏倩，王震静，丁丽，王雪鹰.甘精胰岛素和预混胰岛素用于老年2型糖尿病患者的疗效和不良反应对比分析[J].中国糖尿病杂志，2011，19(07)：513-515.)的论文中提出，为了评价甘精胰岛素和预混胰岛素在老年T2DM治疗中的优越性，将68例老年T2DM患者随机分为甘精胰岛素组(G1a组)和预混胰岛素组(Pre组)，比较两组治疗前后FBG、2hBG、HbA1c、空腹C肽FC-P)及75g OGTT后2hC肽(2hC-P)水平、体重变化、低血糖发生率及患者满意度。结果治疗后两组FBG、2hBC、HbA1c水平均较治疗前显著降低(P<0.01)，Gla组FBC、HbA1c水平较Pre组显著降低(P<0.05)，Pre组2hC-P水平较治疗前显著增加(P<0.05)。Gla组体重增加、低血糖发生率显著低于Pre组(P<0.05或P<0.01)。研究证实了老年T2DM患者应用甘精胰岛素是有益的治疗方案。
黑龙江中医药大学邹国良、仲维莉于2012年在《中国医科大学学报》中发表《缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用》(邹国良，仲维莉，刘莉，胡健.缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用[J].中国医科大学学报，2012，41(10)：886-888+891.)，论文中提出，为了探讨缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用。通过尾静脉注射2％链脲佐菌素溶液(45mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，并将大鼠随机分为4组(每组12只)：正常组：正常大鼠自由饲食水，不做任何手术处理；假手术组：糖尿病大鼠开胸后在冠状动脉左前降支(LAD)下穿线，不结扎；缺血再灌注(IR)组：结扎糖尿病大鼠LAD造成缺血30min，再灌注2h；缺血后处理(IPostC)组：结扎糖尿病大鼠LAD 30min，再灌注30s，阻断30s，重复3次，再灌注2h。采用TTC法检测心肌梗死面积，TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果与IR组比较，IPostC组大鼠心肌梗死面积及凋亡指数明显减小，差异有统计学意义(P<0.05)。研究证实了缺血后处理能够减小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌具有保护作用。
黑龙江中医药大学仲维莉、邹国良于2014年在《慢性病学杂志》发表《2型糖尿病患者干预方式与胰岛β细胞功能的关系》(仲维莉，张春玲，任那，邹国良.2型糖尿病患者干预方式与胰岛β细胞功能的关系[J].慢性病学杂志，2014，15(05)：324-327.)的论文中提出，为了分析2型糖尿病患者不同干预方式与胰岛β细胞功能的关系。将2型糖尿病住院患者710例，出院空腹血糖水平均<7.0mmol/L，根据不同干预方式分为3组，即口服药组232例、胰岛素组174例、胰岛素加口服药组304例，比较各组年龄、病程、体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、血压、血脂、糖化血红蛋白(HbA1C)、糖化血清蛋白(Gsp)、OGTT试验等，用Homa-IR评估胰岛素抵抗，用校正Homa-β与△I30/△G30(去除IR的影响)、胰岛素曲线下面积、C肽曲线下面积、处置指数(DI)评估胰岛β细胞功能。采用SPSS16.0统计软件进行方差分析、协方差分析。结果口服药组Homa-IR低于胰岛素加口服药组及胰岛素组(P均<0.05)，校正△I30/△G30、胰岛素曲线下面积及C肽曲线下面积高于胰岛素组及胰岛素加口服药组(P均<0.01)。3组间校正Homa-β、DI比较差异均有统计学意义(P均<0.01)，均呈现口服药组>胰岛素组>胰岛素加口服药组趋势。研究证实了可以根据2型糖尿病患者胰岛β细胞分泌功能及个体组织胰岛素敏感性胰岛β细胞功能的代偿程度，选择最佳干预方式控制血糖。
黑龙江中医药大学邹国良于2015年在《中西医结合心脑血管病杂志》发表《梓醇对糖尿病及其并发症作用的研究进展》(许瑞，刘莉，毕艳平，邹国良.梓醇对糖尿病及其并发症作用的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2015，13(09)：1082-1085.)的论文中提出，梓醇是从地黄根部分离出来的一种环烯醚萜类化合物，具有降血糖、抗氧化、抗炎等药理作用。本研究对其在糖尿病其并发症的作用、机制、疗效研究进展作一综述。对梓醇功能作进一步研究，为糖尿病及其并发症的治疗提供新的选择。
黑龙江中医药大学邹国良、仲维莉于2016年在《中西医结合心脑血管病杂志》发表的论文《梓醇对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用》(邹国良，仲维莉，许瑞，史成坤，赵双，韩宇博，刘莉.梓醇对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(15)：1727-1729.)中提出，探讨梓醇对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及作用机制，可将8周龄雄性Wistar大鼠，随机分为正常组10只，实验组90只。实验组以高脂高糖饮食饲养8周，之后腹腔注射链脲佐菌素(STZ，15mg/kg)，以空腹血糖≥16.7mmol/L作为2型糖尿病成模标准，将符合2型糖尿病成模标准的60只大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、梓醇低剂量组、梓醇中剂量组、梓醇高剂量组。正常组和模型组灌胃蒸馏水[5mL/(kg·d)]，二甲双胍组灌胃二甲双胍[90mg/(kg·d)]，梓醇低、中、高剂量组分别灌胃梓醇2.5mg/(kg·d)、5mg/(kg·d)、10mg/(kg·d)。各组大鼠干预12周后，测定空腹血糖、空腹血清胰岛素(FINS)，并计算胰岛素分泌指数(HOMA-β)，HE染色检测大鼠胰岛细胞形态。结果与模型组比较，各药物干预组大鼠胰岛素分泌指数均有所增加；与模型组比较，HE染色结果显示二甲双胍组，梓醇低、中、高剂量组胰岛细胞结构相对完整。研究证实了梓醇可保护胰岛细胞，促进胰岛素分泌。
据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病，常见的有糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、与糖尿病相关的葡萄膜炎、糖尿病性白内障、糖尿病足、糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病神经病变等等。糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。因糖尿病截肢的患者是非糖尿病的10～20倍。临床数据显示，糖尿病发病后10年左右，将有30％～40％的患者至少会发生一种并发症，且并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，因此强调尽早预防糖尿病并发症。糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病的慢性并发症之一，随着病程的延长，发病率可达90％以上。DPN的发病机制较为复杂，目前缺乏安全有效的治疗方法及药物。由于本病的反复迁延的病理特点，目前单纯西医临床诊治有一定的局限性。中医中药治疗DPN的研究报道正日益被医学界所重视。本专利的发明人是黑龙江中医药大学一线的科研人员与临床医生，在经过数年潜心研究后，得到的了本发明的创新技术。本发明的技术还得到了黑龙江省自然科学基金项目的重点支持，项目名称：抗高糖加速的内皮细胞衰老的作用及机制研究，项目编号：H201325。同时，本专利的创新技术已经与黑龙江省和江苏省的几家制药企业达成意向性合作协议，已经为本专利的创新技术开发出新药做好了前期的准备工作。据不完全统计，我国治疗糖尿病周围神经病变药物的市场容量，每年约25亿元，本发明的创新技术开发新药成功后，初步预测每年的市场销售额在2亿元以上，对促进我国中药实体经济的发展，将起到非常大的推动作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种有效治疗糖尿病神经病变、疗效高、配伍简单、成本低的药物；
进一步地，本发明提供了该药物的制法，本发明提供制备方法，活性成分提取效率高、含量高、疗效确认、安全性高。
本发明还提供了该治疗糖尿病神经病变药物的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种治疗糖尿病神经病变的药物，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪5～7重量份，白芍3～5重量份，川芎3～5重量份，当归3～5重量份，地龙2～4重量份。
上述的药物优选由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份。
一种治疗糖尿病神经病变的药物制备方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪5～7重量份，白芍3～5重量份，川芎3～5重量份，当归3～5重量份，地龙2～4重量份，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得。
上述的药物制备方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其优选的制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得。
上述的药物制备方法，可采用中药药剂学中常规的制药方法制成口服制剂。
所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、散剂或口服液。
一种治疗糖尿病神经病变的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
采用高效液相色谱法同时测定药物中芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：10～2.0mL·min-1；检测波长：285～290nm；柱温：35～40℃；进样量：5～20μL；
(2)混合对照品溶液的制备：
①精密称取芒柄花苷对照品0.60～0.70mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.060～0.070mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液；
②精密称取芍药内酯苷对照品4.0～5.0mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.400～0.500mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液；
③精密称取次黄嘌呤对照品12.00～12.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.200～1.250mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液；
④分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各0.5～1.5mL，置10mL量瓶中，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0060～0.0070mg·mL-1，芍药内酯苷0.0400～0.0500mg·mL-1，次黄嘌呤0.1200～0.1250mg·mL-1混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密量取待测药物0.5～2.0mg，置25～100mL锥形瓶中，加入甲醇10～30mL，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，再离心20～30min，取全部上清液蒸至3～8mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
上述的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
采用高效液相色谱法同时测定药物中芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量，优选的步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，规格：150mm×4.6mm，3.5μm；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：1.5mL·min-1；检测波长：288nm；柱温：38℃；进样量：10μL；
(2)混合对照品溶液的制备：
①精密称取芒柄花苷对照品0.65mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.065mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液；
②精密称取芍药内酯苷对照品4.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芍药内酯苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.450mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液；
③精密称取次黄嘌呤对照品12.25mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使次黄嘌呤对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.225mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液；
④分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0065mg·mL-1，芍药内酯苷0.0450mg·mL-1，次黄嘌呤0.1225mg·mL-1混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密量取待测药物1.0mg，置50mL锥形瓶中，加入甲醇20mL，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，再离心25min，取全部上清液蒸至5mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
一种治疗糖尿病神经病变的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
采用气相色谱法测定药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：毛细管柱，流动相：N2；进样量：5～15μL；空气压缩机压力：60～80kpa，氢气发生器压力：70～90kpa，N2压力：270～290kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：230～250℃；检测器温度：210～230℃；色谱柱温度：190～210℃；程序升温，初始温度60～80℃，以10℃·min-1的速度升温至190～210℃，保持10～20min；进样方式：分流进样，分流比为1～3：9～7；
(2)对照品溶液的制备：
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.00～5.00mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液；
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.00～5.00mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测样品，研细，称取细粉9.00～10.00，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取5～7h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5～15μL，注入气相色谱仪，进行测定。
所述的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
采用气相色谱法测定药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量，优选步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm，流动相：N2；进样量：10μL；空气压缩机压力：70kpa，氢气发生器压力：80kpa，N2压力：280kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：240℃；检测器温度：220℃；色谱柱温度：200℃；程序升温，初始温度70℃，以10℃·min-1的速度升温至200℃，保持15min；进样方式：分流进样，分流比为2：8；
(2)对照品溶液的制备：
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液；
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.60mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测样品，研细，称取细粉9.500g，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取6h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行测定。
为使本发明实现的技术手段、技术特征、达成目的与功效易于明白了解，下面的实验或试验研究用于进一步阐述本发明。
实验一：治疗糖尿病周围神经病变的药物筛选实验研究
1仪器与试药
1.1仪器
RM6240B/C生物信号采集处理系统2.0d版(成都医疗仪器厂)；
1.2试药
1.2.1受试药物W：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加15倍量的水，煎煮2次，每次1h，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物W。
1.2.2受试药物X：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物X；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液。
1.2.3受试药物Y：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加15倍量的水，煎煮2次，每次1h，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅰ；
(2)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物Y。
1.2.4受试药物Z：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，得到受试药物Z。
1.2.5阳性药物：甲钴胺片，由华北制药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20031126，规格：0.5mg，批号20151203。
2方法
2.1实验模型的建立
选用雄性健康Wistar大鼠，体重(220±20)g，合格证号为P00102013，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。实验前适应性喂养1周，温度为(22±2)℃，12h光照，湿度40％，自由进食，单笼饲养，排除饮食及环境等所有可能对实验动物产生的影响。
大鼠饲养6天后，禁食8h，将浓度为2％链脲佐菌素溶液注射进大鼠的左下腹腔内，注射剂量为50mg·Kg-1，注射一次，72h后取大鼠尾血，测定血糖，血糖值大于17.5mmoL·L-1的大鼠，作为糖尿病实验用大鼠。
上述糖尿病实验用大鼠，喂养3d后，随机分为6组，即模型组、甲钴胺组、受试药物W组、受试药物X、组受试药物Y组、受试药物Z组，每组12只。另外取体重、鼠龄与糖尿病实验用大鼠相匹配，但血糖值在正常范围内大鼠12只，作为正常对照组。
对糖尿病实验用大鼠进行药物治疗，受试药物W组大鼠按照8mg·kg-1的剂量灌胃给受试药物W，受试药物X组大鼠按照8mg·kg-1的剂量灌胃给受试药物X，受试药物Y组大鼠按照8mg·kg-1的剂量灌胃给受试药物Y，受试药物Z组大鼠按照8mg·kg-1的剂量灌胃给受试药物Z，阳性药物组大鼠按照0.2mg·kg-1的剂量灌胃给要甲钴胺片。正常对照组与模型对照组分别给予等体积的生理盐水，每日1次，连续观察6周。6周后进行检测。
2.2血液流变学检测
对大鼠腹主动脉采血，进行血液流变学检测。
2.3电生理检测
大鼠腹腔注射浓度为15％乌拉坦，注射剂量为8.0mL·Kg-1，将大鼠被麻醉后，俯卧固定，将大鼠右侧的坐骨神经分离出来，采用RM6240B/C生物信号采集处理系统2.0d版测定坐骨神经MNCV。将坐骨结下作为刺激点，在位于离刺激点2cm处设置记录电极，从小量开始刺激，刺激逐渐增强，直至增强到到超强刺激。神经传导速度以复合动作电位出现的潜伏期与复合动作电位传导的距离比值来表示：单位为m·s-1。
2.4统计学处理
选用SPSS12.0统计软件进行统计分析，各项实验数据以均数±标准差(x±s)表示。
3结果
3.1各组大鼠血液流变学变化
实验结果见表1。
表1 各组大鼠血液流变学变化
注：与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01。
3.2各组大鼠坐骨神经外周运动神经传导速度(MNCV)变化的比较
治疗6周后，与正常对照组相比，模型组、受试药物Z组、甲钴胺组大鼠坐骨神经MNCV明显减慢；受试药物Z组及甲钴胺组均能延缓糖尿病大鼠坐骨神经MNCV的减慢，与糖尿病模型组相比差异显著；受试药物Z组的疗效优于甲钴胺组，二者相比差异显著，结果见表2。
表2 各组大鼠坐骨神经MNCV变化的比较
注：与正常对照组比较：*P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；
4结论
实验结果显示，受试药物Z对糖尿病大鼠血液流变学、坐骨神经传导速度等方面的改善优于甲钴胺，可能由于甲钴胺治疗仅针对糖尿病周围神经病变发病的单一因素，而受试药物Z能起到整体调节作用，充分发挥中医药多环节、多靶点、辨证论治的优势和特色有关。
实验二：本发明药物治疗糖尿病周围神经病变的临床疗效观察
应用本发明药物治疗糖尿病周围神经病变共24例，因技术法规的限制，本发明药物还不可以做大规模的临床试验研究，仅以黑龙江中医药大学附属第一医院收治的24例自愿者的小样本做了初步的临床试验研究。24例患者均签署了《知情同意书》，自愿接受临床试验。研究如下。
1资料与方法
1.1诊断标准
1.1.1西医诊断标准
糖尿病的诊断，按照WHO糖尿病的诊断标准。
糖尿病周围神经病变(DPN)的诊断标准：(1)四肢对称性或者单侧性麻木，手部或者足部有明显的束缚感；(2)腱反射明显减弱；(3)肌电图检查显示，感觉神经(SNCV)和运动神经(MNCV)传导速度明显减慢；(4)足背部的动脉搏动未见异常。
1.1.2中医诊断标准
消渴症见四肢麻木、四肢疼痛、神疲乏力；自汗畏风，舌质暗，脉细涩或者无力，属气虚血瘀、脉络瘀阻证。
1.2排除标准
(1)年龄小于30岁或者大于70岁的；
(2)恶性高血压患者、有足部溃疡或坏疽的；
(3)心竭者，合并有肝、肾和造血系统等严重原发性疾病，妊娠或哺乳期妇女。
1.3一般资料
24例病例均为黑龙江中医药大学附属第一医院住院患者，随机分为治疗组12例(男性6例，女性6例)和对照组12例(男性5例，女性7例)。两组患者的年龄、性别、病情、病程等统计学处理均无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。
1.4方法
1.4.1治疗方法
两组均采用基础治疗措施，包括控制饮食、适量运动。
对照组：肌肉注射甲钴胺注射液，每次500μg，每天1次；
治疗组：在对照组用药的基础上，加用本发明药物胶囊，每次3粒，每日2次。
本发明药物胶囊的处方和制备方法如下：
处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，加入适量的淀粉、糊精，搅拌均匀，制粒，整粒，装入胶囊，制成胶囊1000粒。
两组均治疗30d。
1.4.2疗效判定
显效：自觉症状明显好转，深浅感觉改善或恢复正常，腱反射明显好转或恢复，MNCV、SNCV较前增加3m/s以上或恢复正常；
有效：自觉症状改善，深浅感觉稍有好转，腱反射有好转，MNCV、SNCV较前增加<3m/s；
无效：症状无减轻，深浅感觉，腱反射无改善，MNCV、SNCV无变化。
1.4.3观察项目
肌电图检查腓总神经和正中神经的运动神经传导速度(MNCV)及感觉神经传导速度(SNCV)；进行膝反射、腱反射检查；询问并记录患者自觉症状。
1.5统计学方法
所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，数据采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料用配对t检验及重复测量方差分析，临床疗效比较用χ2检验。
2结果
2.1临床疗效
治疗组，显效5例，有效6例，总有效率为91.67％；对照组，显效2例，有效6例，总有效率为66.67％。治疗组与对照组进行组间疗效比较，有显著性差异(P<0.05)，治疗组的疗效明显优于对照组。试验结果见表3。
表3 治疗组与对照组治疗效果比较(例，％)
注：与对照组比较，#P<0.05
2.2神经电生理检查
两组治疗前后神经传导速度均有显著性差异(P<0.05)，治疗组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，试验结果见表4。
表4 两组治疗前后神经传导速度比较(m/s，)
注：本组治疗前后比较，#P<0.05；治疗组与对照组比较，*P>0.05。
2.3不良反应
治疗组仅有2例患者出现口干，症状轻微，未中断治疗。检查尿常规、血常规，未见异常，肝功能、肾功能也未见异常。
3结论
临床试验结果显示，本发明药物治疗糖尿病周围神经病变，能显著改善患者四肢麻木、疼痛的症状、有效提高糖尿病周围神经病变患者的生活质量，对糖尿病周围神经病变具有较好的疗效。
实验三：HPLC法同时测定本发明药物中芒柄花苷、芍药内酯苷和次黄嘌呤的含量
经前期研究表明，黄芪中所含的芒柄花苷、白芍中所含的芍药内酯苷、地龙中含有的次黄嘌呤是本发明药物治疗糖尿病周围神经病变的主要活性成分，发明人经过反复实验，建立了通过高效液相色谱法一次性同时测定芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤含量的检测方法，研究如下。
1仪器和试药
1.1仪器
高效液相色谱仪，包括在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、四元泵；电子分析天平(上海月梓电子科技有限公司)；超声波清洗器(温州鸿润超声波清洗科技有限公司)；实验室离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。
1.2试药
芒柄花苷对照品，来源于上海远慕生物科技有限公司，批号120225－201601；芍药内酯苷对照品，来源于武汉天植生物技术有限公司，批号100315－201603；次黄嘌呤对照品，来源于上海研生生化试剂有限公司，批号110230－201601。甲醇，分析纯，来源于山东佰鸿新材料有限公司；乙腈，色谱纯，湖北杜克化学科技有限公司；乙酸，分析纯，开封市盛源化工有限公司；超纯水为实验室自制。
本发明药物：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；
制备方法：(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1混合对照品溶液的制备
精密称取芒柄花苷对照品0.65mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.065mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液。
精密称取芍药内酯苷对照品4.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芍药内酯苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.450mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液。
精密称取次黄嘌呤对照品12.25mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使次黄嘌呤对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.225mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液。
分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0065mg·mL-1，芍药内酯苷0.0450mg·mL-1，次黄嘌呤0.1225mg·mL-1混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
精密量取本发明药物1.0mg，置50mL锥形瓶中，加入甲醇20mL，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，再离心25min，取全部上清液蒸至5mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.1.3阴性缺部分药味原件的对照溶液的制备
按照处方比例，按本发明提供的制备工艺，分别制备成缺黄芪、缺白芍及缺地龙的阴性样品，按本发明提供的供试品溶液的制备方法，分别制成缺黄芪的阴性对照溶液，缺白芍的阴性对照溶液，缺地龙的阴性对照溶液。
2.2色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，规格：150mm×4.6mm，3.5μm；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：1.5mL·min-1；检测波长：288nm；柱温：38℃；进样量：10μL。
2.3专属性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性缺部分药味原件的对照溶液各10μL进样，记录色谱图。结果表明其他组分对芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量测定无干扰，说明该方法可行。色谱图见说明书附图1、附图2、附图3、附图4、附图5。
2.4方法学验证
2.4.1线性范围考察
分别精密吸取混合对照品溶液1.0μL、2.0μL、4.0μL、8μL、16μL、32μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
芒柄花苷的回归方程：Y＝4.268×106X－8.262×102，r＝0.9995，线性范围分别为0.0032～0.1258μg。
芍药内酯苷的回归方程：Y＝4.128×105X－2.106×104，r＝0.9992，线性范围分别为0.088～2.874μg。
次黄嘌呤的回归方程：Y＝2.358×106X+2.154×105，r＝0.9997，线性范围分别为0.375～18.256μg。
结果表明，各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
2.4.2精密度考察
分别精密吸取混合对照品溶液10μL，连续进样6次，以峰面积指标计算RSD(n＝6)，考察方法的精密度。结果显示，芒柄花苷峰面积的RSD为1.8％，芍药内酯苷峰面积的RSD为2.2％，次黄嘌呤峰面积的RSD为1.3％，表明本法精密度良好。
2.4.3重复性考察
按本发明提供的方法平行制备6份样品的供试品溶液，在本发明提供的色谱条件下，同时测定芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤3种成分的含量。结果显示，芒柄花苷的平均含量为0.018mg·g-1，RSD为1.2％；芍药内酯苷的平均含量为0.225mg·g-1，RSD为1.6％；次黄嘌呤的平均含量为1.856mg·g-1，RSD为1.7％；表明本法重复性良好。
2.4.4稳定性考察
取供试品溶液分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h进样分析，测定芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤3种成分色谱峰面积，结果芒柄花苷峰面积的RSD为1.8％、芍药内酯苷峰面积的RSD为1.5％、次黄嘌呤峰面积的RSD为2.1％。表明本法稳定性良好。
2.4.5加样回收率试验
精密量取已知含量(芒柄花苷的含量为0.019mg·g-1、芍药内酯苷的含量为0.227mg·g-1、次黄嘌呤的含量为的含量为1.862mg·g-1)的本发明药物5.0g，共称取6份，分别加入芒柄花苷对照品储备液5mL，芍药内酯苷对照品储备液5mL，次黄嘌呤对照品储备液5mL，按照本发明提供的方法平行制备供试溶液6份，进样测定。
结果显示，芒柄花苷的平均回收率为99.8％、RSD为1.2％；芍药内酯苷的平均回收率为98.6％、RSD为1.8％；次黄嘌呤的平均回收率为101.2％、RSD为2.1％。表明本法有良好的加样回收率。
2.5样品含量测定
将供试品溶液，按本发明提供的色谱条件进行测定，建立标准曲线，分别计算6个批次本发明药物的芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤3种有效成分的含量，结果见表5。
表5 6批样品含量测定结果(mg·g-1，n＝3)
3结论
本发明采用的检测方法可以对黄芪、白芍、地龙中重要的活性成分进行定量检测，本发明的检测方法精密度高，重复性好，稳定性，且操作简便，结果可靠，可以用于本品的质量检测。
实验四：气相色谱法测定本发明药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯与丁烯基苯酞的含量
经前期研究表明，川芎中所含的2-羟基-苯乙酸异丁酯、当归中所含的丁烯基苯酞是本发明药物治疗糖尿病周围神经病变的主要活性成分，发明人经过反复实验，建立了通过气相色谱法一次性同时测定2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞含量的检测方法，研究如下。
1仪器与试药
1.1仪器
气相色谱仪，FID检测器(日本岛津)；YH-300氢气发生器(上海凌析仪器有限公司)。
1.2试药
2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品(上海麦克林生化科技有限公司，批号：101203-20160203)；丁烯基苯酞对照品(深圳子科生物科技有限公司，批号：100326-201601)；甲醇(色谱纯，北京世纪拓鑫精细化工有限公司，批号：20151224)。
待测样品：
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm，流动相：N2；进样量：10μL；空气压缩机压力：70kpa，氢气发生器压力：80kpa，N2压力：280kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：240℃；检测器温度：220℃；色谱柱温度：200℃；程序升温，初始温度70℃，以10℃·min-1的速度升温至200℃，保持15min；进样方式：分流进样，分流比为2：8；理论板数按2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞计算应不低于4000；2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞峰与相邻峰之间的分离度大于1.5，分离度良好；
2.2对照品溶液的制备
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液。
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.60mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
取待测样品，研细，称取细粉9.500g，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取6h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液。
2.4阴性供试品溶液的制备
以相同的处方比例，制得不含川芎和当归的阴性样品，按本发明提供的供试品溶液的制备方法制成阴性供试品溶液。
2.5空白干扰试验
分别精密吸取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液、丁烯基苯酞对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μL，注入气相色谱仪分析，结果表明阴性供试品无干扰，见说明书附图6、附图7、附图8、附图9。
2.6重复性试验
取同一批号的待测样品6份，按本发明提供的供试品溶液的制备方法制备溶液并依法测定，2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的RSD分别为1.2％(n＝6)和1.4％(n＝6)。实验结果表明，本发明提供的方法重复性良好。
2.7精密度试验
精密吸取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液、丁烯基苯酞对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的RSD分别为0.8％和0.6％(n＝6)。实验结果表明，本发明提供的方法精密度良好。
2.8线性关系
取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液、丁烯基苯酞对照品溶液，分别精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0mL，分别置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10μL注入气相色谱仪分析。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得回归方程如下：
2-羟基-苯乙酸异丁酯：Y＝1.26×106X+286.73，r＝0.9998；
丁烯基苯酞：Y＝1.84×106X+752.16，r＝0.9997。
实验结果表明，2-羟基-苯乙酸异丁酯在0.01652～1.6382mg·mL-1、丁烯基苯酞在0.01565～1.8346mg·mL-1的范围内，具有良好的线性关系。
2.9稳定性试验
取同一供试品溶液，按本发明提供的色谱条件，每间隔2h测定一次，测定6次。统计结果表明，2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞峰面积的RSD分别为1.21％和1.32％。实验结果表明，供试品溶液在12h内稳定。
2.10加样回收率试验
精密吸取已测得含量的样品6份，每份10g，分别精密加入一定量的2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液和丁烯基苯酞对照品溶液，测定并计算回收率。实验结果表明，本发明提供的方法准确性良好。结果见表6。
表6 2-羟基-苯乙酸异丁酯与丁烯基苯酞加样回收率试验数据表(n＝6)
2.9样品含量测定
按供试品溶液项下制备方法和色谱条件对6批样品进行分析，计算含量，结果见表7。
表7 样品含量测定结果(n＝6，mg·g-1)
3结论
本发明采用的检测方法可以对川芎中、当归中重要的活性成分进行定量检测，本发明的检测方法精密度高，重复性好，稳定性，且操作简便，结果可靠，可以用于本品的质量检测。
实验五：测定不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量的比较实验
1不同制备方法下制备的受试药物
1.1受试药物W：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加15倍量的水，煎煮2次，每次1h，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物W。
1.2受试药物X：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物X；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液。
1.3受试药物Y：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取黄芪，白芍，川芎，当归，地龙，加15倍量的水，煎煮2次，每次1h，合并水煎液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅰ；
(2)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，干燥得到受试药物Y。
1.4受试药物Z：处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，得到受试药物Z。
2测定
采用本发明提供的高效液相色谱法和气相色谱法测定药物中活性成分的含量。
3测定结果
测定结果见表8。
表8 不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量(mg·g-1)
4结论
由实验结果可见，采用本发明提供的制备方法制备得到的受试药物Z，其含有的芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤、2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量明显高于其他制备方法下制备所得的药物，这也可能是受试药物Z(本发明药物)在治疗糖尿病周围神经病变的疗效优于其他药物的原因。
附图说明：
图1为混合对照品溶液HPLC色谱图，其中：1号峰为芒柄花苷；2号峰为芍药内酯苷；3号峰为次黄嘌呤；
图2为供试品溶液HPLC色谱图，其中：1号峰为芒柄花苷；2号峰为芍药内酯苷；3号峰为次黄嘌呤；
图3为缺黄芪的阴性样品溶液HPLC色谱图，其中：1号峰为芒柄花苷；2号峰为芍药内酯苷；3号峰为次黄嘌呤；
图4为缺白芍的阴性样品溶液HPLC色谱图，其中：1号峰为芒柄花苷；2号峰为芍药内酯苷；3号峰为次黄嘌呤；
图5为缺地龙的阴性样品溶液HPLC色谱图，其中：1号峰为芒柄花苷；2号峰为芍药内酯苷；3号峰为次黄嘌呤；
图6为2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液气相色谱图，其中：1号峰为2-羟基-苯乙酸异丁酯；
图7为丁烯基苯酞对照品溶液气相色谱图，其中：2号峰为丁烯基苯酞；
图8为供试品溶液气相色谱图，其中：1号峰为2-羟基-苯乙酸异丁酯，2号峰为丁烯基苯酞；
图9为阴性供试品溶液气相色谱图；
具体实施方式
实施例1：
处方：黄芪300g，白芍200g，川芎200g，当归200g，地龙150g；制备方法：(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
采用高效液相色谱法同时测定药物中芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，规格：150mm×4.6mm，3.5μm；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：1.5mL·min-1；检测波长：288nm；柱温：38℃；进样量：10μL；
(2)混合对照品溶液的制备：
①精密称取芒柄花苷对照品0.65mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.065mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液；
②精密称取芍药内酯苷对照品4.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芍药内酯苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.450mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液；
③精密称取次黄嘌呤对照品12.25mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使次黄嘌呤对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.225mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液；
④分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0065mg·mL-1，芍药内酯苷0.0450mg·mL-1，次黄嘌呤0.1225mg·mL-1混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密量取待测药物1.0mg，置50mL锥形瓶中，加入甲醇20mL，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，再离心25min，取全部上清液蒸至5mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
(5)测定结果：药物中芒柄花苷含量为0.0185mg·g-1，芍药内酯苷含量为0.2264mg·g-1，次黄嘌呤含量为1.8605mg·g-1。
采用气相色谱法测定药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm，流动相：N2；进样量：10μL；空气压缩机压力：70kpa，氢气发生器压力：80kpa，N2压力：280kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：240℃；检测器温度：220℃；色谱柱温度：200℃；程序升温，初始温度70℃，以10℃·min-1的速度升温至200℃，保持15min；进样方式：分流进样，分流比为2：8；
(2)对照品溶液的制备：
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液；
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.60mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测样品，研细，称取细粉9.500g，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取6h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行测定；
(5)测定结果：药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯含量为0.5029mg·g-1，丁烯基苯酞含量为0.5537mg·g-1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种治疗糖尿病神经病变的药物，其特征在于，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪5～7重量份，白芍3～5重量份，川芎3～5重量份，当归3～5重量份，地龙2～4重量份。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份。
3.一种治疗糖尿病神经病变的药物制备方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪5～7重量份，白芍3～5重量份，川芎3～5重量份，当归3～5重量份，地龙2～4重量份，其特征在于，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的药物制备方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其特征在于，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得。
5.根据权利要求3或4所述的药物制备方法，其特征在于，该药物采用中药药剂学中常规的制药方法制成口服制剂。
6.根据权利要求5所述的药物制备方法，其特征在于，所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、散剂或口服液。
7.一种治疗糖尿病神经病变的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定药物中芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L- 1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L- 1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L- 1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：10～2.0mL·min-1；检测波长：285～290nm；柱温：35～40℃；进样量：5～20μL；
(2)混合对照品溶液的制备：
①精密称取芒柄花苷对照品0.60～0.70mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.060～0.070mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液；
②精密称取芍药内酯苷对照品4.0～5.0mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.400～0.500mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液；
③精密称取次黄嘌呤对照品12.00～12.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.200～1.250mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液；
④分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各0.5～1.5mL，置10mL量瓶中，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0060～0.0070mg·mL-1，芍药内酯苷0.0400～0.0500mg·mL-1，次黄嘌呤0.1200～0.1250mg·mL-1混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密量取待测药物0.5～2.0mg，置25～100mL锥形瓶中，加入甲醇10～30mL，在功率240～260W，频率35～45kHz的条件下，超声处理25～35min，再离心20～30min，取全部上清液蒸至3～8mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
8.如权利要求7所述的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定药物中芒柄花苷、芍药内酯苷、次黄嘌呤的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，规格：150mm×4.6mm，3.5μm；流动相：乙腈-0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min至20min，乙腈的比例从0％线性上升至30％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从100％线性下降至70％；从21min至30min，乙腈的比例从30％线性上升至40％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从70％线性下降至60％；从31min至40min，乙腈的比例从40％线性上升至55％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从60％线性下降至45％；从41min至65min，乙腈的比例从55％线性上升至70％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从45％线性下降至30％；从66min至80min，乙腈的比例从70％线性上升至80％，0.25moL·L-1磷酸二氢钠水溶液的比例从30％线性下降至20％；流速：1.5mL·min-1；检测波长：288nm；柱温：38℃；进样量：10μL；
(2)混合对照品溶液的制备：
①精密称取芒柄花苷对照品0.65mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.065mg·mL-1的芒柄花苷对照品储备液；
②精密称取芍药内酯苷对照品4.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芍药内酯苷对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为0.450mg·mL-1的芍药内酯苷对照品储备液；
③精密称取次黄嘌呤对照品12.25mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使次黄嘌呤对照品溶解，再定容至刻度，制成浓度为1.225mg·mL-1的次黄嘌呤对照品储备液；
④分别精密量取芒柄花苷对照品储备液、芍药内酯苷对照品储备液、次黄嘌呤对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，使芒柄花苷对照品、芍药内酯苷对照品、次黄嘌呤对照品均充分溶解，并定容至刻度，作为分别含芒柄花苷0.0065mg·mL-1，芍药内酯苷0.0450mg·mL-1，次黄嘌呤0.1225mg·mL-1混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密量取待测药物1.0mg，置50mL锥形瓶中，加入甲醇20mL，在功率250W，频率40kHz的条件下，超声处理30min，再离心25min，取全部上清液蒸至5mL，将其转移到10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
9.一种治疗糖尿病神经病变的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份，其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入10～20倍量的酶提取液，40～44℃水浴加热，搅拌提取4～6h，离心30～40min，离心速度3000～3500r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶、0.2％～0.4％果胶酶及0.2％～0.4％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗8～10个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗5～7个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗16～20个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
其特征在于，采用气相色谱法测定药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：毛细管柱，流动相：N2；进样量：5～15μL；空气压缩机压力：60～80kpa，氢气发生器压力：70～90kpa，N2压力：270～290kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：230～250℃；检测器温度：210～230℃；色谱柱温度：190～210℃；程序升温，初始温度60～80℃，以10℃·min-1的速度升温至190～210℃，保持10～20min；进样方式：分流进样，分流比为1～3：9～7；
(2)对照品溶液的制备：
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.00～5.00mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液；
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.00～5.00mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测样品，研细，称取细粉9.00～10.00，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取5～7h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5～15μL，注入气相色谱仪，进行测定。
10.如权利要求9所述的药物的检测方法，该药物由以下重量份的药味原料制成：黄芪6重量份，白芍4重量份，川芎4重量份，当归4重量份，地龙3重量份；其制备方法为：
(1)取川芎、当归，进行水蒸气蒸馏提取，收集得到挥发油，备用；水蒸气蒸馏提取后提取液，滤过，浓缩，得浸膏Ⅰ；水蒸气蒸馏提取后的药渣Ⅱ保留，备用；
(2)取步骤(1)所得的药渣Ⅱ与黄芪、白芍、地龙混合，加入15倍量的酶提取液，42℃水浴加热，搅拌提取5h，离心35min，离心速度3300r·min-1，收集上清液，上清液滤过，浓缩，得浸膏Ⅲ；上述酶提取液是由0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶、0.3％果胶酶及0.3％半纤维素酶配制成的溶液；
(3)将步骤(1)所得的浸膏Ⅰ与步骤(2)所得的浸膏Ⅲ混合，用纯化水分散后，过XDA-1型大孔吸附树脂柱，用纯化水洗9个柱体积，洗脱液弃去，再用体积比例为80:20的乙酸乙酯：甲醇溶液洗6个柱体积，洗脱液再弃去，再用体积比例为70:30的环己烷：乙酸乙酯溶液洗18个柱体积，收集洗脱液，滤过，滤液浓缩，得到浸膏Ⅳ；
(4)取步骤(3)所得的浸膏Ⅳ与步骤(1)所得的挥发油合并，混匀，冷冻干燥，即得；
其特征在于，采用气相色谱法测定药物中2-羟基-苯乙酸异丁酯、丁烯基苯酞的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm，流动相：N2；进样量：10μL；空气压缩机压力：70kpa，氢气发生器压力：80kpa，N2压力：280kpa；检测器：氢火焰离子化检测器；进样口温度：240℃；检测器温度：220℃；色谱柱温度：200℃；程序升温，初始温度70℃，以10℃·min-1的速度升温至200℃，保持15min；进样方式：分流进样，分流比为2：8；
(2)对照品溶液的制备：
①精密称取2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品4.50mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2-羟基-苯乙酸异丁酯对照品溶液；
②精密称取丁烯基苯酞对照品4.60mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得丁烯基苯酞对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取待测样品，研细，称取细粉9.500g，索氏提取器提取，加入环己烷，回流提取6h，提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，再转移至5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行测定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111012849A (zh) * 2020-01-13 2020-04-17 贾典荣 一种治疗糖尿病性麻痹疼痛的中药组合物及其制备方法

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