CN108309848A - 小球藻提取液的制备方法及其抗衰老组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小球藻提取液的制备方法，其包括如下步骤：S1：将小球藻粉碎后，用水分散均匀、灭菌，得到分散液；S2：将所述分散液进行精制后，与保湿剂混匀，得到所述小球藻提取液。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、以小球藻提取液作为主要有效成分，利用小球藻生长因子的排毒、抗氧化、修复受损细胞的功效，达到抗污染、抗衰老的效果，相对已有工艺，本方案得到的小球藻提取液活性成分含量提高，排毒效果好，稳定性好。

Description

小球藻提取液的制备方法及其抗衰老组合物
技术领域
本发明涉及一种小球藻提取液的制备方法及其抗衰老组合物，属于天然产物提取及应用技术领域。
背景技术
随着我国经济的不断发展，污染成为我们日常生活中不可避免的一个话题，光线污染导致皮肤胶原蛋白减少、过早老化甚至皮肤癌；空气污染导致皮肤色泽暗沉、色斑增加。抗污染原料成为抗衰老系列化妆品中不可缺少一部分。
现在市场上抗衰老化妆品主要基于增加胶蛋白、抗炎、抗氧化等抗衰老机理，不能很好的解决PM2.5带来的皮肤危害问题。现有的小球藻专利只是提供了小球藻的提取方法，或者将小球藻用作营养食品开发，未能就小球藻活性成分和活性成分的护肤功效进行研究。已有的小球藻化妆品专利功效成分单一，未能将小球藻和当前一些机理明确、安全性好的抗衰老原料结合在一起开发，以此实现抗污染和抗衰老的有效结合。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种小球藻提取液的制备方法及其抗衰老组合物。结合小球藻提取液和当今安全性好、机理明确、稳定性好的抗衰老原料，实现抗污染和抗衰老效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种小球藻提取液的制备方法，其包括如下步骤：
S1：将小球藻粉碎后，用水分散均匀、灭菌，得到分散液；
S2：将所述分散液进行精制后，与保湿剂混匀，得到所述小球藻提取液。
作为优选方案，所述小球藻选自蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、埃氏小球藻和凯氏小球藻中的至少一种。
作为优选方案，步骤S1中，水的用量为小球藻重量的8～12倍，灭菌的温度为121℃，时间为40min，灭菌后冷却至不超过50℃。
作为优选方案，步骤S2中的精制具体操作为：
将所述分散液进行离心分离后，取上清液，用硅藻土进行第一次过滤；
在不超过4℃的低温下冷藏不低于36h后用硅藻土进行第二次过滤，调节pH值为5.0～6.5后，用活性炭脱色，最后用微孔滤膜进行过滤。
作为优选方案，所述脱色的温度为45～65℃，脱色时间为15～30min，所述活性炭的孔径为200目，活性炭的添加量为待脱色滤液重量的0.3～1％，所述微孔滤膜的孔径为0.1μm或0.22μm，两次硅藻土添加总量为上清液(滤液)重量的0.3％。
作为优选方案，所述微孔滤膜为水相滤膜，优选为混合纤维素酯膜、尼龙膜。
作为优选方案，所述保湿剂的添加量为小球藻提取液总重量的10～20％。
作为优选方案，所述保湿剂为甘油、丙二醇和1，3-丁二醇中的至少一种。
第二方面，本发明还提供了一种抗衰老组合物，其包括按重量百分数计的如下组分：
其中，所述小球藻提取物由前述方法制备而得，其他组分均为市售化妆品原料。
第三方面，本发明还提供了一种如前述的抗衰老组合物的制备方法，其包括如下步骤：
将小球藻提取液、藻提取物、生物糖胶-1、β-葡聚糖、燕麦多肽、积雪草苷、乙酰羟脯氨酸、花榈木树皮提取物和勿忘我提取物在80～85℃下，以50～80rpm的转速搅拌均匀；
加入神经酰胺-2和大豆异黄酮，在3000rpm的转速下均质5min；
冷却50℃下，出料。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、以小球藻提取液作为主要有效成分，利用小球藻生长因子的排毒、抗氧化、修复受损细胞的功效，达到抗污染、抗衰老的效果，相对已有工艺，本方案得到的小球藻提取液活性成分含量提高，排毒效果好，稳定性好；
2、组合中其他原料功效如下：生物糖胶-1促进胶原蛋白生成、保湿；β-葡聚糖促进伤口愈合、抗炎、助渗透；神经酰胺-2修复皮肤屏障；燕麦多肽增加胶原蛋白含量；积雪草苷促进伤口愈合、表皮再生；大豆异黄酮增加皮肤角质层含水量；乙酰羟脯氨酸中的羟脯氨酸为胶原蛋白的组成成分，用于化妆品有抗老、保湿功效；花榈木树皮提取物为强天然抗氧化剂，可降低过氧自由基对皮肤细胞的伤害；勿忘我提取物富含黄酮类物质，具有一定的抗氧化功效，可以间接的缓解外界环境对皮肤的伤害而引起的皮肤老化，以上原料从保湿、抗氧化、提高细胞活力、抗炎多靶点实现抗衰老效果；
3、将小球藻和藻提取物的抗污染功效和其余抗衰老原料完美结合，实现全方位保护皮肤的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
制备方法如下：
工艺步骤：
1、提取：称取小球藻粉100g，加入1000g纯水，搅拌均匀，121℃灭菌40min，冷却得混合液。
2、离心：将混合液10000rpm离心10min，取上清液。
3、硅藻土过滤：上清液中加入3g硅藻土搅拌均匀，用硅藻土过滤，取滤液
4、冷藏：滤液在4℃低温冷藏36h。
5、硅藻土过滤：取出冷藏的提取液重复步骤3。
6、脱色：柠檬酸调节pH值为5.0，加入活性炭3g，45℃搅拌15min，用0.22μm微孔滤膜过滤取澄清液。
7、配置：澄清液中加入100g的1,3-丁二醇，用纯水定容至1000g，即为小球藻提取液。
实施例2
制备方法如下：
工艺步骤：
1、提取：称取小球藻粉100g，加入1000g纯水，搅拌均匀，121℃灭菌40min，冷却得混合液。
2、离心：将混合液10000rpm离心10min，取上清液。
3、硅藻土过滤：上清液中加入3g硅藻土搅拌均匀，用硅藻土过滤，取滤液
4、冷藏：滤液在4℃低温冷藏36h。
5、硅藻土过滤：取出冷藏的提取液重复步骤3。
6、脱色：柠檬酸调节pH值为5.5，加入活性炭5g，65℃搅拌20min，用0.22μm微孔滤膜过滤取澄清液。
7、配置：澄清液中加入100g的甘油，用纯水定容至1000g，即为小球藻提取液。
实施例3
制备方法如下：
工艺步骤：
1、提取：称取小球藻粉100g，加入1000g纯水，搅拌均匀，121℃灭菌40min，冷却得混合液。
2、离心：将混合液10000rpm离心10min，取上清液。
3、硅藻土过滤：上清液中加入3g硅藻土搅拌均匀，用硅藻土过滤，取滤液
4、冷藏：滤液在4℃低温冷藏36h。
5、硅藻土过滤：取出冷藏的提取液重复步骤3。
6、脱色：柠檬酸调节pH值为6.0，加入活性炭4g，55℃搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤取澄清液。
7、配置：澄清液中加入100g的丙二醇，用纯水定容至1000g，即为小球藻提取液。
对比例1
工艺步骤：
1、提取：称取小球藻粉100g，加入1000g纯水，搅拌均匀，121℃灭菌40min，冷却得混合液。
2、离心：将混合液10000rpm离心10min，取上清液。
3、硅藻土过滤：上清液中加入3g硅藻土搅拌均匀，用硅藻土过滤，取滤液
4、冷藏：滤液在4℃低温冷藏36h。
5、硅藻土过滤：取出冷藏的提取液重复步骤3得澄清液900g。
6、酒沉：在上述得到的澄清液中加入100mL无水乙醇，使最终乙醇浓度在10％，边加边搅拌，冷藏36h。
7、挥醇：冷藏后的提取液，加入硅藻土过滤后，去掉乙醇(可用减压浓缩法或常温挥发法)。
8、配置：挥醇后的提取液用柠檬酸调节pH值5.0，0.22μm微孔滤膜过滤，澄清液中加入100g的甘油，用纯水定容至1000g，即为小球藻提取液。
对比例2
工艺步骤：
1、提取：称取小球藻粉100g，加入1000g纯水，搅拌均匀，121℃灭菌40min，冷却得混合液。
2、离心：将混合液10000rpm离心10min，取上清液。
3、硅藻土过滤：上清液中加入3g硅藻土搅拌均匀，用硅藻土过滤，取滤液
4、冷藏：滤液在4℃低温冷藏36h。
5、硅藻土过滤：取出冷藏的提取液重复步骤3得澄清液。
8、配置：将澄清液用柠檬酸调节pH值5.0，0.22μm微孔滤膜过滤，澄清液中加入100g的甘油，用纯水定容至1000g，即为小球藻提取液。
测试方法
1、总多糖含量测试方法
1.1试剂和仪器：去离子水、浓硫酸、苯酚、无水葡萄糖、紫外分光光度计
1.2标准曲线制作：精密称取无水葡萄糖适量，加水配置成0.85mg/mL的储备液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分别置于50mL量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。再分别精密量取上述各稀释液2mL置具塞试管中，各管分别加5％苯酚溶液1mL，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0mL，立即摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5min。以上述2.0mL水所制得的空白溶液做参比，于489nm波长处测定各溶液吸光度，以葡萄糖稀释液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3样品测定：取供试品溶液2.0mL置具塞试管中，按标准曲线项下同法加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸光度。根据样品吸光度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算出样品中总多糖的含量。
2、总多肽含量测试方法
2.1试剂和仪器：蛋白质标准溶液(1mg/mL)，紫外分光光度计
2.2标准曲线绘制：精密量取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0mL蛋白质标准溶液置于8支试管中，再分别加4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0mL蒸馏水混匀。在280nm处测定各管溶液的吸光度值。以0号试管调零，以蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出蛋白质标准曲线。
2.3样品测定：在280nm处测得吸光度值，从标准曲线上查出其浓度。
3、提取液稳定性测试方法
各取小球藻提取液30mL分别装入5个的样品中，分别测试4℃、48℃、紫外光照、避光、-18～48℃条件下在一个月内是否出现沉淀和变色。
表1小球藻提取液活性成分含量测试结果和稳定性结果
由表1可知，小球藻提取液不经过精制，虽然活性成分含量较高，但会出现稳定性问题，分析原因是小球藻提取液中含有较多叶绿色，影响稳定性。
实施例4～6所涉及的抗衰老组合物的制备方法为：
1、按重量称取小球藻提取液、藻提取物、生物糖胶-1、β-葡聚糖、燕麦多肽、积雪草苷、乙酰羟脯氨酸、花榈木树皮提取物、勿忘我提取物在80～85℃下，以50～80rpm的转速搅拌均匀；
2、加入神经酰胺-2和大豆异黄酮，在3000rpm的转速下均质5min；
3、搅拌均匀后后，出料。
表2实施例抗衰老组合物配方
对比例3～12所涉及的抗衰老组合物配方如表3所示
表3对比例抗衰老组合物配方
效果验证
一、组合物降低K2Cr2O7离子对HaCaT细胞的毒性测试
实验步骤：
1、将人表皮细胞(HaCaT细胞)培养至对数期，用胰岛蛋白酶分散细胞，获得细胞悬浮液，计数。
2、配制1μM的K2Cr2O7，加入实施例和对比例待测样品，制成样品混合物，震荡、混匀后置于二氧化碳培养箱中静置2h，空白对照不加待测样品。
3、按照1×104个/mL接种于96孔板，每孔加入100μL，培养24h后，分别加入100μL的样品混合物，继续培养24h后，用MTT法检测细胞活性。
实验结果见表4所示：
表4组合物对HaCaT细胞活力
样品 HaCaT细胞活力
空白对照 100
实施例4 448
实施例5 336
实施例6 392
对比例3 106
对比例4 112
对比例5 225
对比例6 392
对比例7 436
对比例8 560
对比例9 672
对比例10 896
对比例11 952
对比例12 1000
由表4可知，不添加小球藻提取液的组合物对含有重金属的HaCaT细胞的活力没有提高，组合物中随着小球藻浓度的增加，HaCaT细胞的活力也随着提高，说明小球藻提取液能明显降低K2Cr2O7离子对HaCaT细胞的毒性。
二、原胶原蛋白和对金属蛋白酶MMP-1的表达测试
实验步骤：
1、将成纤维细胞培养至对数期，用胰蛋白酶分散细胞，获得细胞悬液，计数
2、按照1×105个/mL接种于12孔板，每孔加入2000μL，培养24h后，分别加入100μg/mL的实施例和对比例样品，空白对照组不加样品。
3、培养24h后用ELISA方法检测Pro-Coll和MMP-1的表达水平。
实验结果见表5和表6所示：
表5 Pro-Coll的分析结果
样品 Pro-Coll相对值
空白对照 1
实施例4 1.62
实施例5 1.36
实施例6 1.41
对比例3 1.25
对比例4 1.28
对比例5 1.32
对比例6 1.26
对比例7 1.29
对比例8 1.22
对比例9 1.24
对比例10 1.19
对比例11 1.15
对比例12 1.12
由表5可知，实施例组合物能明显促进成纤维细胞中原胶原蛋白的表达，相对对比例效果有差异，说明组合物间不同组分协同作用，抗衰老效果更明显。
表6 MMP-1的定量分析结果
由表6可知，实施例组合物对MMP-1表达具有明显抑制作用，并且相对对比例抑制效果有差异。
综合以上分析：以上结果表明，本发明通过抗污染活性物和抗衰老活性物的组合，实现排出细胞中重金属、清除细胞中氧自由基、促进成纤维细胞原胶原蛋白的表达、减少胶原蛋白降解、修复皮肤屏障，来延缓皮肤的衰老。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种小球藻提取液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将小球藻粉碎后，用水分散均匀、灭菌，得到分散液；
S2：将所述分散液进行精制后，与保湿剂混匀，得到所述小球藻提取液。
2.如权利要求1所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，所述小球藻选自蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、埃氏小球藻和凯氏小球藻中的至少一种。
3.如权利要求1所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，步骤S1中，水的用量为小球藻重量的8～12倍，灭菌的温度为121℃，时间为40min，灭菌后冷却至不超过50℃。
4.如权利要求1所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，步骤S2中的精制具体操作为：
将所述分散液进行离心分离后，取上清液，用硅藻土进行第一次过滤；
在不超过4℃的低温下冷藏不低于36h后用硅藻土进行第二次过滤，调节pH值为5.0～6.5后，用活性炭脱色，最后用微孔滤膜进行过滤。
5.如权利要求4所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，所述脱色的温度为45～65℃，脱色时间为15～30min，所述活性炭的孔径为200目，活性炭的添加量为待脱色滤液重量的0.3～1％，所述微孔滤膜的孔径为0.1μm或0.22μm。
6.如权利要求5所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜为水相滤膜。
7.如权利要求1所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，所述保湿剂的添加量为小球藻提取液总重量的10～20％。
8.如权利要求1或7所述的小球藻提取液的制备方法，其特征在于，所述保湿剂为甘油、丙二醇和1，3-丁二醇中的至少一种。
9.一种抗衰老组合物，其特征在于，包括按重量百分数计的如下组分：
其中，所述小球藻提取物由权利要求1所述的方法制备而得。
10.一种如权利要求9所述的抗衰老组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将小球藻提取液、藻提取物、生物糖胶-1、β-葡聚糖、燕麦多肽、积雪草苷、乙酰羟脯氨酸、花榈木树皮提取物和勿忘我提取物在80～85℃下，以50～80rpm的转速搅拌均匀；
加入神经酰胺-2和大豆异黄酮，在3000rpm的转速下均质5min；
冷却50℃下，出料。
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