CN108300768B - 一种检测食品中雌二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品中激素残留检测领域，具体涉及一种基于核酸外切酶辅助的靶向循环扩增使用微流控芯片仪检测食品中雌二醇的方法。本发明提供一种利用核酸适配体设计成R形识别探针特异性捕获目标物，核酸外切酶辅助靶标循环实现信号放大，微流控芯片仪检测雌二醇的方法。该检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测特异性好、灵敏度高，且不需要复杂的样品前处理过程，操作简单，检测快速。
Description
技术领域
本发明属于食品中激素残留检测领域，具体涉及一种基于核酸外切酶辅助的靶向循环扩增使用微流控芯片仪检测食品中雌二醇的方法。
背景技术
雌二醇(Estradiol，E2)雌二醇属于环境内分泌干扰物，是一种自然产生的雌激素，在饮用水或者动物源性食品中残留从而进入人体，因为性质和功能与生物体内雌激素相似，因此会干扰正常雌激素作用，影响机体的代谢分泌过程，雌二醇在环境中的危害极大，较低的浓度即可对人身体健康造成明显的影响。迄今为止，许多国家和组织就已经通过立法来限制或禁止在食品动物中使用甾类同化激素，制定了针对欧盟国家内部流通及外部输入的动物源性食品的一整套严格的监管措施。我国也已经建立国家兽药残留监控体系和兽药安全评价系统。
当前检测方法包括为化学发光法、色谱-质谱法，以及一些生物方法包括酶联免疫分析(ELISA)、传感器方面包括电化学传感器、酶热传感器和表面等离子共振免疫传感器等，样品预处理复杂耗时，衍生化会造成目标类固醇的损失或降解等弊端，因此在实践中难以做到快速检测大量样品，不能满足现场检测要求。因此，针对食品中雌二醇残留检测，迫切需要开发一种对于雌二醇具有专一识别能力、新型高效、简便有效的现场检测方法。
本发明使用的微流控芯片仪作为一种新型的DNA/RNA分析检测平台，可以获得不同长度的DNA片段信息，具有微型化、自动化、集成化、便捷和快速等优点。核酸适配体是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与各种靶标结合的单链寡核苷酸。然而，利用核酸适配体特异性识别雌二醇使用微流控芯片进行快速和在线检测，通过不同长度DNA或RNA链产生的光信号变化来特异性获取待测雌激素的种类和浓度信息，目前在应用领域尚未有实质性的突破。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用核酸适配体设计成R形识别探针特异性捕获目标物，核酸外切酶辅助靶标循环实现信号放大，微流控芯片仪检测雌二醇的方法。它具有特异性强、操作便捷、检测快速等优势，可广泛应用于食品中雌二醇残留的快速检测。
本发明的基本原理是：本发明采用的试剂主要包括功能性单链适配体序列(以下简称，适配体)，发夹链和核酸外切酶I(exonuclease I)。核酸外切酶I是一类从多核苷酸链的3’端开始按序催化水解3，5-磷酸二酯键，获得单个的核苷酸为最终产物(DNA为d NMP，RNA为NMP)的酶。首先将适配体与发夹链按照一定的比例杂交形成具有R形结构的特异性识别探针，识别探针中适配体以及发夹链的3’端被封闭以防止核酸外切酶I的消解，且发夹链设计成发夹结构从而形成一定的空间位阻提高识别探针的取代效率。该探针在雌二醇的作用下，适配体包裹目标物且3’端裸露出来，核酸外切酶I将包裹目标物的适配体不断消解以释放目标物，释放出来的目标物结合更多的适配体从而实现大量的发夹链从识别探针中释放到溶液中从而实现信号放大。由于溶液中存在的两种杂交链序列长度不同，故可在微流控芯片中不同位置出现不同峰值，随着发夹链的量增加，识别探针的量降低，两者浓度之比与靶标浓度成线性关系从而实现对靶标的定量分析。
即，一种检测食品中雌二醇的方法，包括如下步骤：
(1)雌二醇标准曲线的绘制：包括步骤(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)，
(1-a)识别探针溶液A的制备：将适配体溶液与发夹链溶液在磷酸二氢钠缓冲溶液中混合，所述适配体溶液的浓度为5～50μM，发夹链溶液的浓度为1～5μM，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01～1M，反应制备得到识别探针溶液A，反应温度为15～45℃，反应时间为5～45分钟；
(1-b)8组雌二醇标准品溶液的制备：雌二醇标准品溶解于浓度为1％～10％甲醇溶液和浓度为0.01～1μM的磷酸二氢钠缓冲溶液的混合溶液中得到雌二醇标准品溶液，甲醇溶液与磷酸二氢钠缓冲溶液添加量的体积比为1∶10，8组雌二醇标准品溶液中，雌二醇的浓度分别为0.005ng mL-1、0.05ng mL-1、0.25ng mL-1、0.5ng mL-1、2.5ng mL-1、5ng mL-1、25ng mL-1和50ng mL-1；
(1-c)8组标准品孵育溶液B的制备：在识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(1-b)中制备得到的8组雌二醇标准品溶液，分别进行孵育得到8组标准品孵育溶液B，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液的添加量为1～10μL，8组雌二醇标准品溶液的添加量为5～50μL，孵育时间10min～120min，孵育温度10～60℃；
(1-d)用微流控芯片仪分别测定上述8组标准品孵育溶液B中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(1-e)根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，绘制标准曲线；
(2)待测样品溶液C的制备：取10～100ml食品样品溶液，去除脂肪，加入2～4ml硝普钠溶液和1～10ml硫酸锌溶液，充分混合，离心得到待测样品溶液C，其中硝普钠溶液的浓度为0.1～10M，硫酸锌溶液的浓度为0.1～10M；
(3)待测样品孵育溶液D的制备：在步骤(1-a)得到的识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(2)中制备得到的待测样品溶液C，进行孵育得到待测样品孵育溶液D，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液为1～10μL，待测样品溶液C的的添加量为5～50μL，孵育时间为10min～120min，孵育温度为10～60℃；
(4)用微流控芯片仪分别测定上述待测样品孵育溶液D中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(5)将步骤(4)所得发夹链和识别探针的浓度比值与步骤(1)所得的雌二醇标准曲线对比，得到待测样品溶液C中雌二醇的浓度。
本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测特异性性好灵敏度高，且不需要复杂的样品前处理过程操作简单，检测快速，且可以用来检测非荧光及非电活性物质，不需要进行衍生化。所使用的比例法可以避免假阳性读数，提高检测的准确性。因而可以广泛应用于食品中雌二醇残留的快速同时检测。
附图说明
图1雌二醇的浓度与对应发夹链与识别探针的浓度比值的标准曲线
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。应当指出的是：对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些变形和改进都属于本发明的保护范围。
一种检测食品中雌二醇的方法，包括如下步骤：
(1)雌二醇标准曲线的绘制：包括步骤(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)，
(1-a)识别探针溶液A的制备：将适配体溶液与发夹链溶液在磷酸二氢钠缓冲溶液中混合，所述适配体溶液的浓度为5～50μM，发夹链溶液的浓度为1～5μM，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01～1M，反应制备得到识别探针溶液A，反应温度为15～45℃，反应时间为5～45分钟；
(1-b)8组雌二醇标准品溶液的制备：雌二醇标准品溶解于浓度为1％～10％甲醇溶液和浓度为0.01～1μM的磷酸二氢钠缓冲溶液的混合溶液中得到雌二醇标准品溶液，甲醇溶液与磷酸二氢钠缓冲溶液添加量的体积比为1∶10，8组雌二醇标准品溶液中，雌二醇的浓度分别为0.005ng mL-1、0.05ng mL-1、0.25ng mL-1、0.5ng mL-1、2.5ng mL-1、5ng mL-1、25ng mL-1和50ng mL-1；
(1-c)8组标准品孵育溶液B的制备：在识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(1-b)中制备得到的8组雌二醇标准品溶液，分别进行孵育得到8组标准品孵育溶液B，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液的添加量为1～10μL，8组雌二醇标准品溶液的添加量为5～50μL，孵育时间10min～120min，孵育温度10～60℃；
(1-d)用微流控芯片仪分别测定上述8组标准品孵育溶液B中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(1-e)根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，绘制标准曲线；
(2)待测样品溶液C的制备：取10～100ml食品样品溶液，去除脂肪，加入2～4ml硝普钠溶液和1～10ml硫酸锌溶液，充分混合，离心得到待测样品溶液C，其中硝普钠溶液的浓度为0.1～10M，硫酸锌溶液的浓度为0.1～10M；
(3)待测样品孵育溶液D的制备：在步骤(1-a)得到的识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(2)中制备得到的待测样品溶液C，进行孵育得到待测样品孵育溶液D，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液为1～10μL，待测样品溶液C的的添加量为5～50μL，孵育时间为10min～120min，孵育温度为10～60℃；
(4)用微流控芯片仪分别测定上述待测样品孵育溶液D中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(5)将步骤(4)所得发夹链和识别探针的浓度比值与步骤(1)所得的雌二醇标准曲线对比，得到待测样品溶液C中雌二醇的浓度。
[(1-a)识别探针溶液A的制备]
具体操作可如下：
首先将发夹链溶液在50～100℃的水浴条件下，保持5～30分钟，然后冷却至室温1～4小时，这有利于在使用前形成预先设计的发夹结构。
将5～20μL适配体溶液和1～10μL发夹链溶液混合，然后在1～20μL磷酸氢二钠缓冲液中孵育反应形成识别探针溶液A，反应温度为15～45℃，反应时间为5～45分钟。
所述适配体溶液的浓度为5～50μM，发夹链溶液的浓度为1～5μM，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01～1M。
所述雌二醇适配体序列组成可以为：TGGGCCCTTTACGGACCGCGTGATGGTT；发夹链的序列组成可以为：AACCATCACGCGGTCCGTAACGATGGACTC GGCATCGAGTCCATCGTTAC。
[(1-b)8组雌二醇标准品溶液的制备]
雌二醇标准品可以为商业化标准品，没有特别限定。
雌二醇标准品溶解于浓度为1％～10％甲醇溶液和浓度为0.01～1μM的磷酸二氢钠缓冲溶液的混合溶液中得到8组雌二醇标准品溶液，甲醇溶液与磷酸二氢钠缓冲溶液添加量的体积比为1∶10。8组雌二醇标准品溶液中雌二醇的浓度分别为0.005ng mL-1、0.05ngmL-1、0.25ng mL-1、0.5ng mL-1、2.5ng mL-1、5ng mL-1、25ng mL-1和50ng mL-1。雌二醇的浓度在此范围内，可满足常规食品样品溶液的测试要求。
[(1-c)标准品孵育溶液B的制备]
在识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(1-b)中制备得到的8组雌二醇标准品溶液，分别进行孵育得到8组标准品孵育溶液B，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液的添加量为1～10μL，8组雌二醇标准品溶液的添加量为5～50μL，孵育时间10min～120min，孵育温度10～60℃。
所述exonuclease I酶缓冲液通常为商业化缓冲液，由于Glycine-KOH(pH 9.5)，DTT，MgCl2组成的缓冲液使得exonuclease I酶活性较高，因此优选，例如，ThermoScientific(USA)公司的exonuclease I酶缓冲液。
[(1-d)用微流控芯片仪分别测定上述8组标准品孵育溶液B中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值]
具体操作可如下：取上述孵育溶液B 20～100μL注入微流控芯片仪，根据微流控芯片仪程序设定，在每次测试之前，清洗液将自动注入芯片通道自动冲洗1～10分钟。微流控芯片仪自动注入样品后，荧光染料作为信号标签在流动相中嵌入到发夹链和识别探针链中，两者在电流作用下迁移到检测区域，微流控芯片系统记录其发光信号。2～10分钟后，发夹链和识别探针被分离并检测定量。根据上述过程记录8组标准品孵育溶液B相应的识别探针和发夹链的浓度值，得到发夹链和识别探针的浓度比值。
所述微流控芯片仪没有特别限定，可以为商业化芯片仪。MCE-202MultiNA微芯片电泳系统，该系统对DNA/RNA样品的分子量大小确认以及定量分析具有较高的效率，因此优选。
所述清洗液，并无特别限定，由于娃哈哈纯净水无毒、无害、无污染且价格便宜等符合绿色安全的实验理念这一原因，优选娃哈哈纯净水作为清洗液。
所述荧光染料为商业化染料，通过我们研究发现，SYBR Gold与双链DNA、单链DNA及RNA有较强的结合作用，因此优选。
[(1-e)根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，绘制标准曲线]
根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，以雌二醇的浓度的对数值为横坐标，发夹链与识别探针的浓度比值为纵坐标，绘制标准曲线。
[(2)待测样品溶液C的制备]
取10～100ml食品样品溶液，去除脂肪，加入2～4ml硝普钠溶液和1～10ml硫酸锌溶液，充分混合，离心得到待测样品溶液C，其中硝普钠溶液的浓度为0.1～10M，硫酸锌溶液的浓度为0.1～10M。
去除脂肪的方法，并无特别限定，比如可以将上述食品样品溶液进行离心去除脂肪，离心速度可以为4000r/min(1790.4g)，离心时间可以为5～30分钟。
[(3)待测样品孵育溶液D的制备]
在步骤(1-a)得到的识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonucleaseI酶缓冲溶液和步骤(2)中制备得到的待测样品溶液C，进行孵育得到待测样品孵育溶液D，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液为1～10μL，待测样品溶液C的的添加量为5～50μL，孵育时间为10min～120min，孵育温度为10～60℃。
所述exonuclease I酶缓冲液通常为商业化缓冲液，由于Glycine-KOH(pH 9.5)，DTT，MgCl2组成的缓冲液使得exonuclease I酶活性较高，因此优选，例如，ThermoScientific(USA)公司的exonuclease I酶缓冲液。
[(4)用微流控芯片仪分别测定上述待测样品孵育溶液D中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值。]
具体操作可如下：取上述待测样品孵育溶液D 20～100μL注入微流控芯片仪，根据微流控芯片仪程序设定，在每次测试之前，清洗液将自动注入芯片通道自动冲洗1～10分钟。微流控芯片仪自动注入样品后，荧光染料作为信号标签在流动相中嵌入到发夹链和识别探针链中，两者在电流作用下迁移到检测区域，微流控芯片系统记录其发光信号。2～10分钟后，发夹链和识别探针被分离并检测定量。根据上述过程记录的识别探针和发夹链的浓度值，得到发夹链和识别探针的浓度比值。
所述微流控芯片仪没有特别限定，可以为商业化芯片仪。MCE-202MultiNA微芯片电泳系统，该系统对DNA/RNA样品的分子量大小确认以及定量分析具有较高的效率，因此优选。
所述清洗液，并无特别限定，由于娃哈哈纯净水无毒、无害、无污染且价格便宜等符合绿色安全的实验理念这一原因，优选娃哈哈纯净水作为清洗液。
所述荧光染料为商业化染料，通过我们研究发现，SYBR Gold与双链DNA、单链DNA及RNA有较强的结合作用，因此优选。
[(5)]将步骤(4)所得发夹链和识别探针的浓度比值与步骤(1)所得的雌二醇标准曲线对比，得到待测样品溶液C中雌二醇的浓度。
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
(1)雌二醇标准曲线的绘制：包括步骤(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)，
(1-a)识别探针溶液A的制备：
具体操作如下：首先将发夹链溶液在95℃的水浴条件下，保持10分钟，然后冷却至室温2小时。
将5μL适配体溶液和5μL发夹链溶液混合，在20μL磷酸氢二钠缓冲液中孵育形成识别探针溶液A，反应温度在37℃，反应时间为15分钟。
所述适配体溶液的浓度为10μM，发夹链溶液的浓度为2.5μM，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.1M。
所述雌二醇适配体序列组成为：TGGGCCCTTTACGGACCGCGTGATGGTT；发夹链的序列组成为：AACCATCACGCGGTCCGTAACGATGGACTCGGCATCGAGTCCATCGTTAC。
(1-b)8组雌二醇标准品溶液的制备：雌二醇标准品溶解于5ml浓度为5％甲醇溶液和50ml浓度为0.1μM的磷酸二氢钠缓冲溶液的混合溶液中得到8组雌二醇标准品溶液。8组雌二醇标准品溶液中雌二醇的浓度分别为0.005ng mL-1、0.05ng mL-1、0.25ng mL-1、0.5ngmL-1、2.5ng mL-1、5ng mL-1、25ng mL-1和50ng mL-1；
(1-c)标准品孵育溶液B的制备：在识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和上述步骤中制备得到的8组雌二醇标准品溶液，进行孵育得到8组标准品孵育溶液B，其中，识别探针溶液A为10μL，exonuclease I酶溶液的添加量为5μL，exonuclease I酶溶液的浓度为5UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液为5μL、exonuclease I酶缓冲溶液为Thermo Scientific(USA)公司的商用产品，8组雌二醇标准品溶液的添加量为10μL，另外加入20μL磷酸二氢钠缓冲溶液，得到8组标准品孵育溶液B，其体积均为50μL。8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度分别为0.001ng mL-1、0.01ng mL-1、0.05ng mL-1、0.1ngmL-1、0.5ng mL-1、1ng mL-1、5ng mL-1和10ng mL-1，孵育时间为20min，孵育温度为37℃。(1-d)用微流控芯片仪(MCE-202MultiNA微芯片电泳系统)分别测定上述8组标准品孵育溶液B中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值：取上述标准品孵育溶液B30μL注入微流控芯片仪，根据微流控芯片仪程序设定，在每次测试之前，娃哈哈纯净水将自动注入芯片通道自动冲洗3分钟。微流控芯片仪自动注入样品后，荧光染料(SYBR Gold)作为信号标签在流动相中嵌入到发夹链和识别探针链中，两者在电流作用下迁移到检测区域，微流控芯片系统记录其发光信号。5分钟后，发夹链和识别探针被分离并检测定量，重复实验，分别记录8组标准品孵育溶液B相应的识别探针和发夹链的浓度值，得到8组发夹链和识别探针的浓度比值。
(1-e)根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，以雌二醇的浓度的对数值为横坐标，发夹链与识别探针的浓度比值为纵坐标，绘制标准曲线(如图1所示，IH表示发夹链溶液的浓度值，IR表示识别探针的浓度值，IH/IR表示发夹链和识别探针的浓度比值，x表示雌二醇浓度的对数值，E2为雌二醇名称的英文缩写)。
如图1所示，得到线性范围为0.001-10ng mL-1，其对应的回归方程为y＝8.159+2.84x。
(2)待测样品溶液C的制备：取20ml牛奶样品溶液，离心去除脂肪(4000r/min，10min)，再分别加入2ml硝普钠溶液和2ml硫酸锌溶液，充分混合，离心(4000r/min，10min)得到上清液，上清液即为待测样品溶液C。
(3)待测样品孵育溶液D的制备：在上述步骤(1-a)得到的10μL识别探针溶液A中，加入5μL exonuclease I酶溶液，exonuclease I酶溶液的浓度为5UμL-1，5μL exonucleaseI酶缓冲溶液(Thermo Scientific(USA)公司的商用产品)和10μL待测样品溶液C，再加入20μL磷酸二氢钠缓冲溶液，进行孵育得到待测样品孵育溶液D，待测样品孵育溶液D的体积为50μL，孵育时间为20min，孵育温度为37℃。
(4)用微流控芯片仪分别测定上述待测样品孵育溶液D中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值：
重复上述步骤(4)3次，得到3组发夹链和识别探针的浓度比值然后取平均值，其平均值为8.613。然后对照标准曲线，求得样品孵育溶液D中雌二醇的含量为0.16ng mL-1，然后计算得到牛奶样品溶液中雌二醇的含量为0.80ng mL-1。
实际样本检测效果验证：用本发明方法分别测定随机购买取得的牛奶1、牛奶2和牛奶3，分别往样品中加入浓度为1.0ng mL-1、0.3ng mL-1和0.3ng mL-1的雌二醇，得到牛奶样品的回收率分别为94.0％，95.9％，101％；证明本发明可靠性，如表1所示。
本发明方法可以测定浓度范围为0.001—10ng mL-1的雌二醇。
表1
ND：not detected.
Claims (2)
1.一种检测食品中雌二醇的方法，包括如下步骤：
(1)雌二醇标准曲线的绘制：包括步骤(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)，
(1-a)识别探针溶液A的制备：将适配体溶液与发夹链溶液在磷酸二氢钠缓冲溶液中混合，所述适配体溶液的浓度为5～50μM，发夹链溶液的浓度为1～5μM，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.01～1M，反应制备得到识别探针溶液A，反应温度为15～45℃，反应时间为5～45分钟；所述适配体，其序列为TGGGCCCTTTACGGACCGCGTGATGGTT；所述发夹链，其序列为AACCATCACGCGGTCCGTAACGATGGACTCGGCATCGAGTCCATCGTTAC，且发夹链的3’端被封闭；
(1-b)8组雌二醇标准品溶液的制备：雌二醇标准品溶解于浓度为1％～10％甲醇溶液和浓度为0.01～1μM的磷酸二氢钠缓冲溶液的混合溶液中得到雌二醇标准品溶液，甲醇溶液与磷酸二氢钠缓冲溶液添加量的体积比为1∶10，8组雌二醇标准品溶液中，雌二醇的浓度分别为0.005ng mL-1、0.05ng mL-1、0.25ng mL-1、0.5ng mL-1、2.5ng mL-1、5ng mL-1、25ngmL-1和50ng mL-1；
(1-c)8组标准品孵育溶液B的制备：在识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(1-b)中制备得到的8组雌二醇标准品溶液，分别进行孵育得到8组标准品孵育溶液B，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10UμL-1，exonuclease I酶缓冲溶液的添加量为1～10μL，8组雌二醇标准品溶液的添加量为5～50μL，孵育时间10min～120min，孵育温度10～60℃；
(1-d)用微流控芯片仪分别测定上述8组标准品孵育溶液B中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(1-e)根据8组标准品孵育溶液B中雌二醇的浓度和对应的发夹链和识别探针的浓度比值，绘制标准曲线；
(2)待测样品溶液C的制备：取10～100ml食品样品溶液，去除脂肪，加入2～4ml硝普钠溶液和1～10ml硫酸锌溶液，充分混合，离心得到待测样品溶液C，其中硝普钠溶液的浓度为0.1～10M，硫酸锌溶液的浓度为0.1～10M；
(3)待测样品孵育溶液D的制备：在步骤(1-a)得到的识别探针溶液A中，加入exonuclease I酶溶液、exonuclease I酶缓冲溶液和步骤(2)中制备得到的待测样品溶液C，进行孵育得到待测样品孵育溶液D，其中，识别探针溶液A的添加量为10～30μL，exonuclease I酶溶液的添加量为1～10μL，exonuclease I酶溶液的浓度为1～10U μL-1，exonuclease I酶缓冲溶液为1～10μL，待测样品溶液C的的添加量为5～50μL，孵育时间为10min～120min，孵育温度为10～60℃；
(4)用微流控芯片仪分别测定上述待测样品孵育溶液D中识别探针和发夹链的浓度，得到发夹链和识别探针的浓度比值；
(5)将步骤(4)所得发夹链和识别探针的浓度比值与步骤(1)所得的雌二醇标准曲线对比，得到待测样品溶液C中雌二醇的浓度。
2.权利要求1所述的检测食品中雌二醇的方法，其中，步骤(1-d)和步骤4中的微流控芯片仪为MCE-202 MultiNA微芯片电泳系统。
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