CN106399519A - 一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用,包括上下游引物设计,发卡结构形成,上游引物扩增产物消化、纯化,及下游引物富集扩增过程。本发明仅有上游引物3’端扩增的产物能与上游引物5’端形成发卡结构的区域被捕获,因而特异性强;形成的发卡结构序列特殊,使得下游引物组可以对目标捕获区域进行指数扩增,因而极少量基因组即可达到后续检测需要,灵敏度高;用于本方法的引物组可以通过DNA芯片技术合成引物池,因而可以同时检测数千个目标区域,实现高、低通量的兼容;本发明的方法设计简单,仅需设计目标捕获区域的上下游引物,避免固相或液相捕获方法的设计大量全区域捕获探针的麻烦;检测成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种目标区域的捕获方法,尤其涉及一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用。
背景技术
基于二代测序的目标区域捕获方法为生命科学研究及精准医学带来了强有力的技术手段。与全基因组测序相比,目标区域的捕获富集测序极大的降低了成本,提高了对目标基因检测的质量,减轻了冗余的数据分析过程。目前已开发了多种目标区域的捕获策略,主要有多重PCR捕获、固相芯片捕获、液相探针捕获及分子倒置探针捕获等。
多重PCR捕获技术是应用较为广泛的一种捕获技术。该技术应用多对引物同时扩增多个目标区域进行测序。设计思路简单,成本低廉,便于操作,灵敏度高。但是,大量引物对的相互干扰,往往产生大量非特异扩增,同时会出现某些捕获区域扩增失败的可能。
固相芯片捕获技术是将捕获探针原位合成在DNA芯片上,通过与构建完成的文库杂交,洗去非特异杂交文库,保留捕获区域后进行测序的技术。通常一个样本需要一块捕获芯片,捕获探针长度为60-90个碱基,捕获区域为3-5Mb。该方法探针获得简单,捕获区域大;但是操作复杂,实验时间长,通量低,灵敏度低,需要大量样本进行文库构建后再捕获。
液相探针捕获技术是基于固相探针合成方法的改进。该方法通过体外转录固相探针产生生物素标记的RNA探针,在溶液中进行杂交富集,获得捕获的目标区域。液相捕获技术可以实现高通量样本操作,捕获特异性高;但是探针制作复杂,价格昂贵,RNA探针本身的易降解问题对操作要求高。
分子倒置探针捕获技术是基于酶学方法的改进。分子倒置探针由捕获区域两端特异性靶向序列和连接臂构成,由一种DNA聚合酶填补2条特异性靶向序列间的间隙从而环化,获得目标捕获区域。该方法无需将样本事先机械打断构建文库,特异性高,操作简便。但是分子倒置探针的获得成本昂贵,且设计复杂。
发明内容
解决的技术问题:为了克服现有技术的不足,获得一种特异性强、灵敏度高,且能够兼容高、低通量,成本低廉的目标区域捕获方法,本发明提供了一种基于发卡结构的目标区域捕获方法及其应用。
技术方案:一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,包括以下步骤:
第1步、向包含目标捕获区域的基因组试样中,加入至少一条上游引物,进行单向扩增反应并形成发卡结构;扩增体系中还包括dNTPs、Taq酶和缓冲液;
第2步、将第1步的单向扩增产物置于冰上,冷却;
第3步、采用单链DNA外切酶对第2步的非特异性扩增产物进行消化,并利用磁珠富集法进一步纯化,收集具有发卡结构的目标捕获序列;
第4步、向具有发卡结构的目标捕获序列中加入至少一条下游引物,进行富集扩增,扩增体系中还包括dNTPs、Taq酶和缓冲液。
优选的,所述上游引物5’端为目标捕获区域下游的反向互补序列,用于与单向扩增得到的目标捕获区域下游退火形成发卡结构;上游引物3’端为目标捕获区域上游特异性扩增序列,用于扩增目标捕获区域;其中,上游引物5’端反向互补区域的Tm值大于55℃。
优选的,所述上游引物5’端反向互补区域的Tm值为70~80℃,且大于3’端特异性扩增序列的Tm值。
优选的,所述单链DNA外切酶具有3’-5’核酸外切酶活性或5’-3’核酸外切酶活性。
优选的,所述单链DNA外切酶为核酸外切酶I、核酸外切酶T或核酸外切酶RecJ。
优选的,所述下游引物为上游引物中5’端互补序列的部分序列。
优选的,所述下游引物为上游引物5’端互补序列中靠近3’端的序列。
所述方法在核酸检测领域中的应用。
优选的,所述方法用于检测人BRCA1/2基因全部外显子。
进一步的,所述方法用于检测人BRCA1/2基因全部外显子采用的上游引物为SEQID NO:1~41,下游引物为SEQ ID NO:42~82。
表1检测人BRCA1/2基因全部外显子的上游引物
其中,引物5’端单下划线的序列为下游捕获区域反向互补序列,引物3’端双下划线的序列为上游捕获区域特异性扩增序列。
表2检测人BRCA1/2基因全部外显子的下游引物
有益效果:(1)仅有上游引物3’端扩增的产物能与上游引物5’端形成发卡结构的捕获区域,因而特异性强;(2)形成的发卡结构序列特殊,使得下游引物组可以对目标捕获区域进行指数扩增,因而极少量基因组即可达到后续检测需要,灵敏度高;(3)用于本方法的引物组可以通过DNA芯片技术合成引物池,因而可以同时检测数千个目标区域,实现高、低通量的兼容;(4)本发明的方法设计简单,仅需设计目标捕获区域的上下游引物,避免固相或液相捕获方法的设计大量全区域捕获探针的麻烦;(5)所述方法无需采用生物素等物质标记引物,从而降低了检测成本。
附图说明
图1是本发明目标区域捕获方法的流程图;
图2是实施例1中BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子的捕获电泳图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
分别捕获BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子。为了完全覆盖外显子区域,分别设计了长度为510bp、1476bp和5100bp的捕获区域,完全覆盖了BRCA2基因的第8、第10、第11全外显子。
根据BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子序列,分别设计上游扩增引物和下游扩增引物:
第8外显子上游扩增引物序列为SEQ ID NO:83(5’-3’):
AACAGAGAGACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTAACAGCATCATCTGACTTTCCAACT
引物5’端下划线部分为下游捕获区域反向互补序列,Tm值为69.8℃;引物3’端波浪线部分为上游捕获区域特异性扩增序列,Tm值为59.8℃;
第10外显子上游扩增引物序列为SEQ ID NO:84(5’-3’):
CCATGTTTGAGTGACCTGATTCTAAACACTGGGAAGAACAGGAGAAGGGGTGACT
引物5’端下划线部分为下游捕获区域反向互补序列,Tm值为71.2℃;引物3’端波浪线部分为上游捕获区域特异性扩增序列,Tm值为60.6℃;
第11外显子上游扩增引物序列为SEQ ID NO:85(5’-3’):
ACTCTTAATTGTTAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACACCACTGTGCCCAAACACTACCTT
引物5’端下划线部分为下游捕获区域反向互补序列,Tm值为69.2℃;引物3’端波浪线部分为上游捕获区域特异性扩增序列,Tm值为59.3℃。
第8外显子下游扩增引物序列为SEQ ID NO:86(5’-3’):
GACAGCAGAGTTTCACAGGAAGTTA;Tm值为60℃;
第10外显子下游扩增引物序列为SEQ ID NO:87(5’-3’):
TGAGTGACCTGATTCTAAACACTGG;Tm值为60.4℃;
第11外显子下游扩增引物序列为SEQ ID NO:88(5’-3’):
TAGCATACCAAGTCTACTGAATAAACAC;Tm值为58.6℃;
捕获BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子的方法,包括以下步骤:
第1步、向包含BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子的基因组试样中,加入上游引物SEQ ID NO:83~85,进行单向扩增反应,形成发卡结构;扩增体系和程序分别如表3、4所示:
表3
反应组分 | 体积(μL) |
2X Ex Taq Hot Start Master Mix | 12.5 |
上游引物(10μM) | 0.5 |
模板DNA(10ng) | 1 |
sdH2O | 11 |
总体积 | 25 |
表4
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 1 | 98℃ | 2min |
变性 | 2 | 98℃ | 10s |
退火 | 3 | 60℃ | 2min |
延伸 | 4 | 72℃ | 3min |
变性 | 5 | 98℃ | 2min |
退火 | 6 | 70℃ | 3min |
第2步、将第1步的单向扩增产物置于冰上,冷却5min;
第3步、采用单链DNA外切酶对第2步的非特异性扩增产物进行消化,消化的体系及条件如表5、6所示;并利用磁珠富集法进一步纯化,收集具有发卡结构的目标捕获序列;
表5
表6
步骤 | 温度 | 时间 | |
温浴 | 1 | 37℃ | 30min |
第4步、向磁珠富集纯化后的扩增产物中加入下游引物SEQ ID NO:86~88,进行富集扩增,扩增体系和程序如表7、8所示。
表7
反应组分 | 体积(μL) |
2X Ex Taq Hot Start Master Mix | 12.5 |
下游引物(10μM) | 1 |
纯化产物 | 11.5 |
总体积 | 25 |
表8
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 1 | 98℃ | 2min |
变性 | 2 | 98℃ | 10s |
退火 | 3 | 60℃ | 1min |
延伸 | 4 | 72℃ | 3min |
返回步骤2循环30次 | 5 | ||
延伸 | 6 | 72℃ | 10min |
保持 | 7 | 4℃ | 10min |
将下游引物富集扩增后的目标片段进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示,BRCA2基因的第8、第10和第11全外显子均被捕获。
实施例2
同时捕获BRCA1/2基因的全部外显子,根据BRCA1/2基因的全部外显子序列设计引物,上游引物序列为SEQ ID NO:1~41,下游引物序列为SEQ ID NO:42~82。
一种捕获BRCA1/2基因的全部外显子的方法,包括以下步骤:
第1步、向包含目标捕获区域的基因组试样中,加入上游引物,进行单向扩增反应,形成发卡结构;扩增体系和程序如表9、10所示;
表9
反应组分 | 体积(μL) |
2 X Ex Taq Hot Start Master Mix | 12.5 |
上游引物组(每组分1μM) | 2.5 |
模板DNA(10 ng) | 1 |
sdH2O | 9 |
总体积 | 25 |
表10
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 1 | 98℃ | 2min |
变性 | 2 | 98℃ | 10s |
退火 | 3 | 60℃ | 2min |
延伸 | 4 | 72℃ | 3min |
变性 | 5 | 98℃ | 2min |
退火 | 6 | 70℃ | 3min |
第2步、将第1步的单向扩增产物置于冰上,冷却5 min;
第3步、采用单链DNA外切酶对第2步的非特异性扩增产物进行消化,消化体系及条件如表11、12所示;并利用磁珠富集法进一步纯化,收集具有发卡结构的目标捕获序列;
表11
反应组分 | 体积(μL) |
上述反应组分 | 25 |
10 X Reaction Buffer | 5 |
Exonuclease I(20 U/μL) | 1 |
sdH2O | 19 |
总体积 | 50 |
表12
步骤 | 温度 | 时间 | |
温浴 | 1 | 37℃ | 30min |
第4步、向具有发卡结构的目标捕获序列中加入至少一条下游引物,进行富集扩增,扩增体系和程序如表13、14所示。
表13
反应组分 | 体积(μL) |
2X Ex Taq Hot Start Master Mix | 25 |
下游引物组(每组分1μM) | 5 |
纯化产物 | 20 |
总体积 | 50 |
表14
步骤 | 温度 | 时间 | |
预变性 | 1 | 98℃ | 2min |
变性 | 2 | 98℃ | 10s |
退火 | 3 | 60℃ | 1min |
延伸 | 4 | 72℃ | 3min |
返回步骤2循环15次 | 5 | ||
延伸 | 6 | 72℃ | 10min |
保持 | 7 | 4℃ | 10min |
将下游引物富集扩增后的目标片段采用illumina公司Nextera DNA LibraryPrep Kit进行文库构建,并测序分析。结果如表15所示,一组样本检测结果中,目标基因的30X捕获覆盖度所占比例均大于99%,显示基本能够完全捕获目标区域。
表15目标基因捕获的覆盖度统计
Claims (10)
1.一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,包括以下步骤:
第1步、向包含目标捕获区域的基因组试样中,加入至少一条上游引物,进行单向扩增反应并形成发卡结构;
第2步、将第1步的单向扩增产物置于冰上,冷却;
第3步、采用单链DNA外切酶对第2步的非特异性扩增产物进行消化,并利用磁珠富集法进一步纯化,收集具有发卡结构的目标捕获序列;
第4步、向具有发卡结构的目标捕获序列中加入至少一条下游引物,进行富集扩增。
2.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述上游引物5’端为目标捕获区域下游的反向互补序列,3’端为目标捕获区域上游特异性扩增序列;其中,上游引物5’端反向互补区域的Tm值大于55℃。
3.根据权利要求2所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述上游引物5’端反向互补区域的Tm值为70~80℃,且大于3’端特异性扩增序列的Tm值。
4.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述单链DNA外切酶具有3’-5’核酸外切酶活性或5’-3’核酸外切酶活性。
5.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述单链DNA外切酶为核酸外切酶I、核酸外切酶T或核酸外切酶RecJ。
6.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述下游引物为上游引物中5’端互补序列的部分序列。
7.根据权利要求1所述的一种基于发卡结构的目标区域捕获方法,其特征在于,所述下游引物为上游引物5’端互补序列中靠近3’端的序列。
8.权利要求1~7任一所述方法在核酸检测领域中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述方法用于检测人BRCA1/2基因全部外显子。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述方法中采用的上游引物为SEQ IDNO:1~41,下游引物为SEQ ID NO:42~82。
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