CN108299366B

CN108299366B - 一种扁柏双黄酮衍生物的制备方法和抗黑色素瘤的应用

Info

Publication number: CN108299366B
Application number: CN201810194625.4A
Authority: CN
Inventors: 王刚; 李新民; 杨家强; 黎丹; 夏雯; 李晓飞
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2038-03-09
Also published as: CN108299366A

Abstract

本发明属于医药领域，提供了一种扁柏双黄酮衍生物WG020及制备方法和在抗黑色素瘤中的应用。本发明经过细胞毒性实验(MTT法)、Hoechst33258染色实验、黑色素瘤细胞克隆形成结合反应实验、流式分析(FCM)黑色素瘤细胞凋亡实验、蛋白免疫印迹(WB)分析凋亡机制实验、周期阻滞实验和肿瘤细胞转移抑制实验，表明WG020对黑色素瘤细胞的克隆形成具有良好的抑制作用，并且可诱导黑色素瘤细胞发生凋亡，通过数据推断WG020影响黑色素瘤是发生在细胞周期的S期，对黑色素瘤细胞的转移有着很好的抑制作用。因此，本发明的扁柏双黄酮衍生物WG020可作为研制新的抗黑色素瘤药物的先导化合物，为寻求抗黑色素瘤药物提供了一种新的来源。

Description

一种扁柏双黄酮衍生物的制备方法和抗黑色素瘤的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种扁柏双黄酮衍生物及其制备方法和抗黑色素瘤药物中的应用。

背景技术

目前，从天然产物或其衍生物中寻找抗肿瘤药物仍然是人类获得抗肿瘤药物的主要手段。据Demain等报道，在1981～2002年间，74％的抗肿瘤药物来源于天然产物、半合成品或以天然产物为模型的全合成品。紫杉醇、羟基喜树碱、秋水仙碱、奥沙利铂、长春新碱和长春地辛等都是从植物中提取得到的抗癌一线治疗药物。因此，从天然植物中寻找高效、特异性强、无毒或低毒的结构新颖的抗癌化合物，或以其为先导化合物来创制新的抗癌药物具有重要意义。

来源于中药深绿卷柏提取分离得到的扁柏双黄酮，具有抗肿瘤、抗HIV-1逆转录酶、抗流感病毒唾液酸酶及抗氧化等生物活性。由于扁柏双黄酮难溶于水、体外活性较低、体内循环时间短、口服剂量高、生物利用度低的缺点限制了它在临床上的应用。因此以扁柏双黄酮为先导化合物，对其结构修饰得到新化合物WG020，并探讨其抑制黑色素瘤的细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制迁移和侵袭等分子机制，具有重大意义。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种扁柏双黄酮衍生物WG020，其次提供了扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法和关于其在抗黑色素瘤药物中的应用。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种扁柏双黄酮衍生物WG020，结构式为式I：

在扁柏双黄酮的基础上与TBDPSCl反应选择性保护酚羟基得叔丁基二苯基扁柏双黄酮，叔丁基二苯基扁柏双黄酮再经醋酐乙酰化得四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，然后脱除硅基保护得四乙酰扁柏双黄酮，四乙酰扁柏双黄酮在吡啶作用下与环丁二酸酐反应得四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，经EDCl,NHS作用得中间体6，化合物6与氨基糖反应得酰胺7，经甲醇钠作用脱除乙酰基保护得到目标产物WG020；合成路线如下：

具体步骤为：

(1)精密称取扁柏双黄酮，加入乙腈溶解，待完全溶解后加入TBSCl和咪唑，室温反应1h，用饱和氯化铵溶液猝灭反应。用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析(氯仿：丙酮＝10:1)，得黄色固体产物叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用。

(2)取步骤(1)中的黄色固体产物，加入乙酸酐和吡啶，加热回流1h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用。

(3)室温下，取步骤(2)中的黄色固体产物，溶于THF中，再滴加TBAF，反应3h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮，干燥备用。

(4)将四乙酰扁柏双黄酮溶于有机溶剂中，加入吡啶和环丁二酸酐，加热回流24h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，干燥备用。

(5)将四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸溶于无水四氢呋喃中,搅拌并加入N-羟基琥珀酰亚胺和EDCl,氮气保护下室温反应12h。收集滤液并旋干,二氯甲烷萃取并用饱和食盐水洗涤3次,有机相用无水硫酸镁干燥浓缩得到粗产物,粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：丙酮＝10:1)。得到黄色固体中间体6，干燥备用。

(6)将中间体6溶于DMF，加入2-氨基葡萄糖，室温反应过夜，抽滤，得中间体7，干燥备用。

(7)取步骤(6)中的黄色固体产物，溶于甲醇，并加入金属钠，在室温下反应2h，抽滤，得WG020，干燥备用。

扁柏双黄酮的制备是通过下列方法制备得到：采用工业化逆流色谱仪(英国Dynamic Extract公司)应用于深绿卷柏粗提物分离纯化扁柏双黄酮，溶剂体系由正戊烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的两相体系，以600mL/min的速率注入柱中，最终从深绿卷柏粗提物中获得扁柏双黄酮单体，克服了逆流色谱技术分离时间长、分离效率低的技术难点，实现了逆流色谱快速、大规模制备高经济价值单体化合物的技术。

WG020对黑色素瘤细胞活性影响具有浓度依赖性和时间依赖性。同时，WG020对正常细胞的毒性明显不如黑色素瘤细胞。由于WG020对正常细胞的IC₅₀值大于黑色素瘤细胞,说明WG020的毒性具有选择性。WG020对黑色素瘤细胞的克隆形成具有良好的抑制作用，并且这种作用具有浓度依赖性。WG020可以诱导黑色素瘤细胞发生凋亡，且这种凋亡诱导具有一定的浓度依赖性。这说明WG020对黑色素瘤细胞有着强烈的凋亡诱导作用，而且这种作用具有浓度依赖性。WG020可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进促凋亡蛋白Bax的表达，引发凋亡后又激活pro-caspase3完成凋亡过程。这进一步说明了WG020通过诱导凋亡而抑制黑色素瘤细胞。

本发明提供的扁柏双黄酮衍生物WG020，经活性测试证明其具有一定的抗黑色素瘤效果，可作为一种高效低毒的抗黑色素瘤药物。本发明的合成工艺选择性好，原料易得，成本低廉，合成路线简单，便于操作实施，并且合成所得产物毒性小，得率高，产物纯度高，因而该工艺具有高效、便捷、低成本的特点。

说明书附图

图1为本发明的扁柏双黄酮衍生物WG020结构式。

图2为本发明的扁柏双黄酮衍生物WG020抑制黑色素瘤细胞MTT实验结果。

图3为本发明的柏双黄酮衍生物WG020抑制黑色素瘤细胞凋亡结果。

图4为本发明的柏双黄酮衍生物WG020电位和活性氧的检测图。

图5为本发明的柏双黄酮衍生物WG020黑色素瘤细胞周期阻滞实验图。

图6为本发明的柏双黄酮衍生物WG020黑色素瘤细胞的转移抑制实验图。

具体实施方式

实施例1扁柏双黄酮的分离

采用工业化逆流色谱仪(英国Dynamic Extract公司)应用于深绿卷柏粗提物分离纯化扁柏双黄酮，溶剂体系由8:8:9:7的正戊烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的两相体系，按此比例将两相溶剂体系分别经不同的泵以600mL/min的速率注入柱中，转速为600r/min，每次深绿卷柏粗提物的上样量为80g，最终获得扁柏双黄酮单体10g，整个分离时间仅30min，首次突破了逆流色谱技术分离时间长、分离效率低的技术难点，实现了逆流色谱快速、大规模制备高经济价值单体化合物的技术。

扁柏双黄酮，黄色粉末，易溶于DMSO。ESI-MSm/z：537[M+H]^-，mp 256～258℃，¹HNMR(d-DMSO，400MHz)，δ：6.84(IH，s，H-3)，5.95(1H，s，H-6)，6.18(IH，s，H-8)，7.83(1H，dd，J＝8.4Hz，H-2’)，6.93(1H，dd，J＝8.4Hz，H-3’)，6.93(1H，dd，J＝8.4Hz，H-5’)，7.83(1H，dd，J＝8.4Hz，H-6’)，6.84(IH，s，H-3”)，6.28(IH，s，H-8”)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-2”’)，6.94(1H，d，J＝8.4Hz，H-3”’)，6.94(1H，d，J＝8.4Hz，H-5”’)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-6”’)。¹³CNMR(d-DMSO，400MHz)，δ：182.2(C-4”)，181.9(C-4)，164.2(C-2”)，163.2(C-2)，164.4(C-7)，153.9(C-7”)，161.5(C-5)，153.2(C-5”)，157.4(C-9)，157.4(C-9”)，124.8(C-6”)，99.7(C-6)，103.9(C-3)，102.6(C-3”)，94.0(C-8)，94.7(C-8”)，104.1(C-10)，104.0(C-10”)，121.2(C-l”’)，124.3(C-l’)，128.7(C-2”’)，128.4(C-2’)，115.4(C-3’)，116.1(C-3”’)，160.7(C-4’)，161.4(C-4”’)，115.4(C-5’)，116.1(C-5”’)，128.4(C-6’)，128.7(C-6”’)。

实施例2扁柏双黄酮衍生物WG020的合成

(1)精密称取扁柏双黄酮10g，加入干燥的乙腈50ml溶解，待完全溶解后加入咪唑2ml，室温下滴加TBSCl 5.5g，滴加完毕后于室温下反应1h。反应完毕后加入二氯甲烷100ml和水100ml，分层，水层用二氯甲烷萃取3次(50ml一次)，合并萃取液，用水100ml洗涤，饱和食盐水100ml洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析(氯仿：丙酮＝10:1)，得黄色固体产物叔丁基二苯基扁柏双黄酮7.8g，干燥备用。

上述实施例中用于溶解扁柏双黄酮的有机溶剂除了乙腈外，还可用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的任一种代替；所述反应温度可在20℃～35℃之间。

(2)取步骤(1)中的黄色固体产物叔丁基二苯基扁柏双黄酮5.0g，加入吡啶50ml，于室温下滴入乙酸酐3ml，室温反应2h。反应完毕后加入乙酸乙酯100ml和水50ml，分层，有机层分别用水(50ml*3)和饱和食盐水(50ml*3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得黄色固体产物四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮5.4g。

(3)取步骤(2)中的黄色固体四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮扁柏双黄酮5g，溶于THF 50ml和醋酸10ml中，于室温下加入TBAF 6.9g，继续反应3h。反应完毕后加入乙酸乙酯100ml和水50ml，分层，有机层分别用水(50ml*3)和饱和食盐水(50ml*3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮3.4g。

(4)将四乙酰扁柏双黄酮5.0g溶于吡啶50ml中，于室温下滴入丁二酸酐1.0g，升温回流反应4h。反应完毕后加入乙酸乙酯100ml和水50ml，分层，有机层分别用水(50ml*2)和饱和食盐水(50ml*3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸5.1g。

(5)将四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸5.0g溶于无水THF 50ml中,搅拌并加入N-羟基琥珀酰亚胺0.8g和EDCl 1.3g,氮气保护下室温反应12h。过滤，收集滤液并旋干,加入二氯甲烷100ml，用饱和食盐水洗涤(50ml*3),有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为氯仿：丙酮＝10:1)，得到黄色固体中间体6 4.5g，干燥备用。

(6)将中间体6 4.5g溶于DMF 20ml中，加入2-氨基葡萄糖1.0g，室温反应过夜，抽滤，用水(20ml*3)和乙醚(20ml*2)分别洗涤，烘干得中间体7 4.4g。

(7)取步骤(6)中的黄色固体产物4.0g，溶于甲醇30ml中，用1M的甲醇钠甲醇溶液调节pH8～9，在室温下反应1h。再加入少量阳离子树脂，使体系pH为7，抽滤，将滤液浓缩至干，得WG020 3.0g。

WG020，黄色粉末，¹H NMR(400MHz,d-DMSO)δ9.72(t,J＝9.2,1H,H-5””),8.05(d,J＝5.2Hz,1H,H-3””),7.98(dd,J＝19.0,8.1Hz,4H,H-3',4',5',6'),6.99(dd,J＝38.1,7.9Hz,4H,H-2”',3”',5,”',6”'),6.72(s,2H,H-6,8),6.48(s,1H,H-7),6.20(s,1H,H-5),4.53(t,2H,J＝7.2Hz,H-4””),4.14(t,1H,J＝7.8Hz,H-6””),3.30(t,2H,J＝7.8Hz,H-7””),3.25(t,2H,J＝7.8Hz,H-8””),3.10(t,2H,J＝7.8Hz,H-9””)。¹³C NMR(400MHz，d-DMSO)，δ：207.7(C-6””),202.2(C-4),193.0(C-4”),180.2(C-1),178.9(C-4””),173.0(C-7),163.4(C-1”),163.2(C-1),162.2(C-5),160.5(C-6”),160.4(C-7”),159.7(C-2),157.4(C-4””),141.2(C-4'),127.7(C-2”),126.4(C-6”),122.8(C-3”'),121.3(C-5”),119.1(C-8”),117.1(C-3'),114.4(C-5')，105.1(C-3”),99.5,94.7(C-6),94.1(C-8),72.5(C-9””),71.2(C-8””),69.2(C-8””),66.2(C-8””),64.2(C-10””)29.9(C-2””).29.0(C-3””).

实施例3扁柏双黄酮衍生物WG020抑制黑色素瘤细胞增殖影响

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020，浅黄色粉末，98％纯度，DMSO溶解，过滤除菌保存,用前以细胞培养液稀释。

试剂人源性的黑色素瘤细胞A375和CHL-1，鼠源性的黑色素瘤细胞B16-F10，培养基，胰酶，优级胎牛血清,四甲基偶氮锉蓝粉(MTT粉)。

二、实验仪器微量可调移液器，细胞计数仪，CO₂培养箱，Millipore公司纯水仪，低温离心机，酶标检测仪，-80℃超低温冰箱，恒温混合器，倒置显微镜。

三、实验过程待细胞生长活力趋于稳定时，将上述3种细胞均匀地铺在96孔板中，每孔加100μL含有一定数量细胞的培养基，细胞个数根据细胞生长速度的快慢以及药物作用时间的不同进行调整。并且设置一系列扁柏双黄酮的工作浓度，每个浓度设置6个复孔。将96孔板置于孵箱中24h后，加入相应浓度的扁柏双黄酮衍生物WG020。药物作用24h，48h，72h后每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，孵育4h后吸走上清液，加150μL/孔DMSO溶解产生的甲瓒，在570nm下测定OD值以间接反应细胞活力。

将A375，B16，CHL-1细胞按照一定的数量(500-1000个/孔)种在6孔板中，24h后加入一系列浓度的扁柏双黄酮衍生物WG020工作液，每个浓度3个复孔。以后每隔3天都吸走上清液，进行同样的加药处理。待细胞形成明显的克隆时，吸走上清液，用预冷PBS洗2次，加预冷甲醇固定15min，再用预冷的PBS洗2次，最后加入结晶紫(质量浓度为0.5％)染料避光孵育2h，用PBS清洗至背景很干净后进行计数。

四、实验结果(图2a和b)表明，WG020对黑色素瘤细胞活性影响具有浓度依赖性和时间依赖性。WG020作用24h后，A375，B16，CHL-1三种细胞的IC₅₀分别是23μM，24μM，25μM；作用48h后IC₅₀分别是10μM，10μM，12μM；作用72h后分别是8μM，7μM，11μM。48h和72h的IC₅₀差别不大，说明WG020在48h可能已经达到最大作用效果，48h后延长作用时间对细胞活性影响不大。同时。WG020对正常细胞的毒性明显不如黑色素瘤细胞。在作用24小时后，对VERO和LO2细胞的IC₅₀分别是45μM，75μM；作用48h后IC₅₀分别是29μM，24μM；72h后分别是24μM，25μM。由于WG020对正常细胞的IC₅₀值大于黑色素瘤细胞,说明WG020的毒性具有选择性。

统计克隆形成结果(图2c和d)可知，黑色素瘤细胞经过WG020处理后，产生的克隆数目相对空白对照组大大减少，说明扁柏双黄酮WG020对黑色素瘤单个细胞的增殖和细胞活力产生了很强的抑制作用，而且这种抑制作用随着药物浓度的增加而增强。当扁柏双黄酮WG020浓度为40μM时，三种黑色素瘤细胞均没有明显的细胞克隆形成。这表明：扁柏双黄酮WG020对黑色素瘤细胞的克隆形成具有良好的抑制作用，并且这种作用具有浓度依赖性。

实施例4扁柏双黄酮衍生物WG020对黑色素瘤细胞凋亡影响

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020保存稀释方法同实施例3。

三、实验过程将一定密度的A375和B16细胞接种在6孔板内置的载玻片(作用同细胞爬片)中，24h后加入一系列浓度的WG020工作液，每个浓度设置3个复孔。药物作用24h后吸走上清液，预冷PBS洗2次后用预冷的甲醇固定15min，预冷PBS洗2次，加入100μL/孔的Hoechst33258染料避光染色10min，回收染料，用预冷PBS洗掉背景色，将载玻片翘起，避光下自然晾干，用甘油封片后在荧光显微镜下观察凋亡小体。

为了进一步证明WG020可以诱导黑色素瘤细胞发生凋亡，我们对WG020作用后的黑色素瘤细胞进行了流式(FCM)分析。A375和B16细胞接种在6孔板中，24h后加一系列WG020的工作液，每个浓度设置3个复孔。药物作用24h后吸走上清液，用预冷PBS洗2次后用胰酶将细胞消化下来，最后将细胞收集到对应的流式管中离心(2500rpm，5min)，用预冷的PBS洗两次。加入300μL的buffer溶液到每管中，将AnnexinV-FITC染液加入到每一管中(5μL/管)，避光染色15min后再加入碘化丙啶(PI)染料(5μL/管)，避光染色10min上机检测。

四、实验结果如图2a所示，用WG020处理后，在荧光显微镜下可以看到明显的凋亡小体。且凋亡小体的比例基本随着药物浓度的增加而增加。这说明了WG020可以诱导黑色素瘤细胞发生凋亡，且这种凋亡诱导具有一定的浓度依赖性。

流式分析结果(图2b)表明，WG020作用后的黑色素瘤细胞出现了明显的凋亡。在低浓度的WG020作用下凋亡率(早期凋亡率和晚期凋亡率之和)相对空白对照组没有明显的增加，但是随着浓度的增加，凋亡率也随之大幅度地增加。重复3次实验后，我们由结果可知：当WG020浓度为40μM时，A375细胞的平均凋亡率达到32％，B16细胞的平均凋亡率高达49％。这说明WG020对黑色素瘤细胞有着强烈的凋亡诱导作用，而且这种作用具有浓度依赖性。

实施例5扁柏双黄酮衍生物WG020对黑色素瘤细胞诱导凋亡机制探索

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020保存稀释方法同实施例3。

试剂人源性的黑色素瘤细胞A375和CHL-1，鼠源性的黑色素瘤细胞B16-F10，培养基，胰酶，优级胎牛血清，三羟甲基氨基甲烷盐酸TrisHCl、牛血清白蛋白BSA、苯甲基磺酞氟PMSF、蛋白酶抑制剂PI、聚丙烯酰胺溶液、四乙基乙二胺TDMED、过硫酸铵，蛋白预染Marker，内参β-actin一抗。

二、实验仪器微量可调移液器，细胞计数仪，CO₂培养箱，Millipore公司纯水仪，低温离心机，酶标检测仪，-80℃超低温冰箱，恒温混合器，倒置显微镜，流式细胞仪，SDS-PAGE垂直电泳槽及电泳转膜装置，荧光呈像系统，图像分析软件Imagetool2.0分析软件，激光共聚焦显微镜。

三、实验过程将A375细胞和B16细胞传代扩大培养，设置三个WG020浓度梯度，每个浓度3皿细胞，即每种细胞加上空白对照组共4个组，12皿细胞。当细胞生长到一定密度时，加入对应浓度的WG020工作液(培养基配置)。作用24h后，将每个浓度的上清液收集到对应的BD管中，用预冷的PBS洗2次，用胰酶消化细胞后收集到对应的BD管中，预冷PBS洗3次。将BD管中的细胞转移到相应的EP管中，预冷PBS洗1次，充分吸走上清液。每管加入500μL的Ripa细胞裂解液(使用前按照v/v＝100/1加入了蛋白酶抑制剂cocktail)。在冰上裂解1h，每5min用胰岛素注射器轻轻充分地吹打一次。裂解完成后进行2min的细胞超声破碎。然后4度下进行超速离心(13300rpm，15min)。收集上清液进行蛋白定量。每一种细胞的各个药物浓度作用后收集的蛋白要依据浓度进行配平。将配平后的蛋白加入一定量的5×SDS并在沸水中煮5min。保存于-20度下备用。

将各个浓度的蛋白用聚丙基酰胺凝胶电泳分离，并将目的蛋白转到相应的PVDF膜上。5％脱脂牛奶封闭2h，TBST清洗20min(5min/次)，在4度下过夜孵育对应的一抗。第二天回收一抗，用TBST清洗20min(5min/次)。然后37度下孵育对应的二抗1h，TBST清洗50min(10min/次)。最后进行蛋白曝光并保存曝光数据。

四、实验结果WB数据(图2c)表明WG020作用24h后，A375细胞中的Bax和cleaved-caspase3的表达被上调，而Bcl-2和pro-caspase3的表达下降了。同样，B16细胞中的Bax表达上升，Bcl-2表达也下调。这说明了WG020可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时促进促凋亡蛋白Bax的表达，引发凋亡后又激活pro-caspase3完成凋亡过程。这进一步说明了WG020通过诱导凋亡而抑制黑色素瘤细胞。

实施例6线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS)的检测

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020保存稀释方法同实施例3。

三、实验过程为了进一步研究WG020产生凋亡的机制，我们对扁柏作用后黑色素瘤细胞的线粒体膜电位以及细胞内的活性氧水平进行了检测。

将一定密度的A375细胞和B16细胞铺在6孔板中，24h后加入一系列浓度的WG020工作液，作用24h后吸走上清液，用预冷的PBS洗2次，加入配制好的Rh123(检测线粒体膜电位)或者DCFH-DA(检测活性氧水平)染料500μL/孔。37度下避光孵育30min。收集已经悬浮的细胞到对应的流式管中，用预冷PBS洗2次，最后上机检测线粒体膜电位和活性氧水平。

四、实验结果流式检测结果(图3a和b)表明，经过WG020作用24h后，A375细胞和B16细胞的线粒体膜电位明显下降，这种减少趋势也有浓度依赖性。ROS水平在A375细胞中也是明显下降，但是在B16细胞中却有着戏剧性的变化：在低浓度的WG020作用下，ROS水平随着浓度的上升而上升，但是到了高浓度时，ROS水平确是随着浓度的上升而下降，预示着不同浓度的WG020打破了ROS水平的平衡。

综合以上所有的机制探索结果，我们基本可以得出一个结论：扁柏双黄酮衍生物WG020通过线粒体介导的细胞凋亡通路来诱导细胞发生凋亡从而起到抗黑色素瘤的作用。

实施例7周期阻滞实验

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020保存稀释方法同实施例3。

三、实验过程为了探究WG020对黑色素瘤细胞的影响发生在细胞周期的哪一个时期，我们进行了细胞周期阻滞实验。将一定密度的A375细胞和B16细胞铺在6孔板中，24h后加入一系列浓度的WG020，每个浓度3个复孔，作用24h后吸走上清液，预冷PBS洗2次，用胰酶将细胞消化后收集到对应的流式管中。预冷PBS洗2次之后，加入75％的预冷乙醇在4度下固定细胞过夜。第二天离心(2500rpm,5min)除去乙醇，预冷PBS洗2次，每管加入500μL的碘化丙啶(PI)工作液(50μg/mL,用PBS稀释)，避光孵育15min后上机检测。

四、实验结果流式周期分析结果(图4a和b)显示A375细胞和B16细胞经过WG020处理后，S期细胞比例相对于空白对照组增加，且药物浓度越高，S期比例增加的程度越大。这预示着WG020引起黑色素瘤细胞S期阻滞。

实施例8转移抑制实验

一、实验材料

试验药物扁柏双黄酮衍生物WG020保存稀释方法同实施例3。

三、实验过程先通过划痕实验来探究WG020对黑色素瘤细胞“愈合迁移”能力的影响。将A375细胞铺在6孔板中，24h后在细胞贴壁层用200μL的枪头直直地画一条线，弃去上清液，加入一系列浓度的WG020，每个浓度3个复孔。培养24h后显微镜下观察划痕愈合情况并拍照对比。由结果(Figure 6a)可知，空白对照组A375细胞实现了很大程度的“自动愈合”，而给药处理组的A375细胞划痕痕迹的宽度则明显大于空白对照组。接下来进行迁移和侵袭实验，在体外模拟体内肿瘤真实存在的环境进一步考察WG020对A375细胞转移能力的影响。迁移实验中，在24孔板中放入小室，上室加入50μL一定密度的细胞悬液(2×10⁶/mL,无血清无抗体的双无培养基配制)和50μL用双无培养基配制的一定浓度的WG020药液，下室加600μL用完全培养基配制的一定浓度WG020工作液，并设置空白对照组。侵袭实验中，上室加入60μL基质胶(用双无培养基按照体积比1:5稀释)，待基质胶充分凝固后，上室加入50μL一定密度的细胞悬液(1×10⁶/mL,无血清无抗体的双无培养基配制)和50μL用双无培养基配制的一定浓度的WG020药液，下室加入600μL完全培养基，并设置空白对照组。迁移和侵袭实验的后处理相同，即孵育24小时后，吸走上室和下室的液体，用棉签小心擦净上室未迁移或侵袭的细胞。用预冷PBS洗小室2次后将小室置于600μL预冷甲醇中固定15min，再用预冷的PBS洗2次，将小室置于600μL结晶紫染料(质量浓度为0.5％)中，避光染色2h。最后用预冷的PBS洗干净背景，将膜小心割下用甘油封片，在显微镜下观察并计数。

四、实验结果表明经过WG020处理后(图5a)，A375细胞划痕愈合能力受到了抑制，而且这种抑制效应也是有浓度依赖性的。划痕实验初步表明WG020可以抑制A375细胞的转移。

再通过迁移和侵袭实验，经过WG020处理后，A375细胞发生迁徙和侵袭的数目大大减少，且药物作用浓度越高，发生迁移侵袭的A375细胞数目就越少。迁移侵袭实验结果(图5)表明，WG020对黑色素瘤细胞A375的转移有着很好的抑制作用。

Claims

1.一种扁柏双黄酮衍生物WG020，其特征在于，结构式为式I：

2.如权利要求1所述的扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法，其特征在于，按照如下合成路线进行：在扁柏双黄酮的基础上与TBDPSCl反应选择性保护酚羟基得叔丁基二苯基扁柏双黄酮，叔丁基二苯基扁柏双黄酮再经醋酐乙酰化得四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，然后脱除硅基保护得四乙酰扁柏双黄酮，四乙酰扁柏双黄酮在吡啶作用下与环丁二酸酐反应得四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，经EDCl,NHS作用得中间体化合物6，化合物6与氨基糖反应得酰胺7，经甲醇钠作用脱除乙酰基保护得到目标产物WG020；即如下：

3.如权利要求2所述的扁柏双黄酮衍生物WG020的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)精密称取扁柏双黄酮，加入乙腈溶解，待完全溶解后加入TBDPSC1和咪唑，室温反应1h，用饱和氯化铵溶液猝灭反应，用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析，氯仿：丙酮＝10:1，得黄色固体产物叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用；

(2)取步骤(1)中的黄色固体产物，加入乙酸酐和吡啶，加热回流1h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰叔丁基二苯基扁柏双黄酮，干燥备用；

(3)室温下，取步骤(2)中的黄色固体产物，溶于THF中，再滴加TBAF，反应3h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮，干燥备用；

(4)将四乙酰扁柏双黄酮溶于有机溶剂中，加入吡啶和环丁二酸酐，加热回流24h，抽滤，得黄色固体产物四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸，干燥备用；

(5)将四乙酰扁柏双黄酮氧代丁酸溶于无水四氢呋喃中，搅拌并加入N-羟基琥珀酰亚胺和EDCl，氮气保护下室温反应12h，收集滤液并旋干，二氯甲烷萃取并用饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥浓缩得到粗产物，粗产物用硅胶柱层析分离，洗脱剂为氯仿：丙酮＝10:1，得到黄色固体中间体6，干燥备用；

(6)将中间体6溶于DMF，加入2-氨基葡萄糖，室温反应过夜，抽滤，得中间体7，干燥备用；

4.如权利要求1所述的扁柏双黄酮衍生物WG020在制备抗黑色素瘤药物先导化合物中的应用。