CN108299273B - 检测自由基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测自由基的方法，包括步骤：将自由基捕捉树脂微球加入至含有自由基的样品中，进行自由基的捕捉；捕捉结束后，将得到的混合物进行过滤，分离得到带有树脂微球的物质；采用三氟乙酸将带有树脂微球的物质中的树脂切除，得到未反应的自由基捕捉剂和已反应的自由基加合物，然后进行检测分析。本发明提供的检测自由基的方法，分析对象中只含有未反应的自由基捕捉剂以及自由基加合物，彻底去除了反应基质中大量非自由基类化合物对分析的干扰，大大降低了分析对象的复杂程度，提高了分析的灵敏度和分离的效率。

Description

检测自由基的方法
技术领域
本发明涉及质谱分析技术领域，具体涉及一种检测自由基的方法。
背景技术
检测活性自由基最常用的方法是EPR自旋捕获方法。其原理是将自由基捕捉剂加入反应体系中，与各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物，借助电子顺磁共振(EPR)技术，可检测自旋加合物的数量和种类。然而，EPR谱只能根据加合物的g值和超精细耦合常数来区分自由基是不是R·，RO·和ROO·这几种自由基种类，它不能提供某种自由基的精确分子结构。
1998年Flicker和Green建立了一种分析自由基的新方法，他们合成了自由基捕捉剂3AP，并将3AP分散在直径6mm的玻璃微珠上，将燃烧的烟气通过玻璃微珠，烟气中的自由基R·可与I(3AP)反应生成自由基加合物II，之后将II从玻璃珠上洗脱，再与NDA(III)反应生成具有强烈荧光的物质IV。采用液相色谱耦合荧光检测器的方法，可以分析烟气中的多种自由基。但是这种方法只能通过与标样对比来确定HPLC中的谱峰到底是哪一种自由基，在标样有限的情况下不能完全鉴别出所有谱峰对应的自由基。
Figure BDA0001551966280000011
2009年Bartalis和Wooten改进了上述方法，采用HPLC耦合质谱的方法鉴定自由基的分子结构，具体如下：他们合成了自由基捕捉剂3AP和3CP，并将3AP或3CP分散在直径2mm或3mm的玻璃微珠上，将燃烧产生的烟气通过玻璃微珠，烟气中的自由基R·可与3AP或3CP反应生成自由基加合物3AP-R或3CP-R，之后将加合物从玻璃珠上洗脱，直接进行HPLC-MS/MS分析。由于3AP-R或3CP-R的二级质谱均具有特定的离子峰，所以依靠二级质谱的方法直接将自由基加合物谱峰识别出来，并且通过质谱确定自由基的分子式。这种方法无需进行荧光生色团的衍生化反应，且灵敏度高。
以上两种方法均采用将自由基捕捉剂分散在玻璃微珠上与自由基进行反应，这存在着一定的弊端。燃烧产生的烟气组成十分复杂，自由基只是其中很少的一部分物质，烟气中还含有大量非自由基物质。烟气通过玻璃微珠时，大量非自由基类物质也会吸附沉积在玻璃微珠上，并随自由基加合物一并被洗脱。虽然以上两种方法采用了引入荧光生色团或二级质谱的方法选择性的将自由基加合物的谱峰从HPLC的谱图中凸显出来，但是其他大量非自由基类物质的存在还是会对分析灵敏度和分离效率造成一定的影响。另外这种将自由基捕捉剂分散在玻璃微珠上的方法更加适用于烟气中自由基的分析，而对溶液中自由基的分析具有一定的局限性。
发明内容
针对现有技术中的局限，本发明目的在于提供一种检测自由基的方法，可用于捕捉烟气中或溶液中的自由基，自由基与自由基捕捉树脂微球上的自由基捕捉剂结合后就被固定在微球上，将微球切除后，即可用HPLC-MS或HPLC-MSMS进行分离和分析，分析对象中只含有未反应的自由基捕捉剂以及自由基加合物，彻底去除了反应基质中大量非自由基类化合物对分析的干扰，大大降低了分析对象的复杂程度，提高了分析的灵敏度和分离的效率。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种自由基捕捉剂，其化学式如式(1)所示；
Figure BDA0001551966280000031
优选地，自由基捕捉剂中的N元素标记为同位素N15。
第二方面，本发明提供了一种自由基捕捉树脂微球，其是将自由基捕捉剂和树脂通过化学键键合而成。
优选地，树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂；2-氯-三苯甲基氯树脂为微球状。
自由基捕捉树脂微球的制备方法包括步骤：将自由基捕捉剂与商业购买或自己合成的微球状2-氯-三苯甲基氯树脂通过化学键键合，之后用溶剂抽提树脂，洗去杂质，得到具备捕捉自由基功能的自由基捕捉树脂微球；其中，溶剂是将二氯甲烷和甲醇以5:1的体积比混合得到的有机溶剂。
本发明还保护自由基捕捉剂、自由基捕捉树脂微球在自由基检测中的应用。
第三方面，本发明还提供了一种检测自由基的方法，包括步骤：S1：将自由基捕捉树脂微球加入至含有自由基的样品中，进行自由基的捕捉；S2：捕捉结束后，将得到的混合物进行过滤，分离得到带有树脂微球的物质；S3：采用三氟乙酸将带有树脂微球的物质中的树脂切除，得到未反应的自由基捕捉剂和已反应的自由基加合物，然后进行检测分析。
优选地，步骤S1中，自由基捕捉树脂微球是采用本发明提供的自由基捕捉树脂微球。
优选地，步骤S1中，含有自由基的样品为烟气或者溶液。
优选地，步骤S2中，还包括将带有树脂微球的物质采用溶剂进行充分洗涤的步骤。
优选地，步骤S3中，检测分析是采用HPLC-MS进行分离和分析。
需要说明的是，本发明提供的自由基捕捉树脂微球，可用于捕捉烟气中或溶液中的自由基，自由基与自由基捕捉树脂微球上的自由基捕捉剂结合后就被固定在微球上。
捕捉实验结束后，通过过滤的方法分离微球，并用溶剂充分洗涤树脂微球，由于自由基通过化学键与树脂微球结合，所以不能被洗脱掉，而其他无关组分只是物理吸附在树脂上，可以被洗脱掉。
最后用三氟乙酸(TFA)将未反应的自由基捕捉剂以及已反应的自由基加合物从树脂上切下来，再用HPLC-MS进行分离和分析。
由于分析对象中只含有未反应的自由基捕捉剂以及自由基加合物，彻底去除了反应基质中大量非自由基类化合物对分析的干扰，大大降低了分析对象的复杂程度，提高了分析的灵敏度和分离的效率。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的自由基捕捉树脂微球，可用于捕捉烟气中或溶液中的自由基，自由基与自由基捕捉树脂微球上的自由基捕捉剂结合后就被固定在微球上，将微球切除后，即可用HPLC-MS进行分离和分析，方法简单，检测成本低；(2)本发明提供的检测自由基的方法，HPLC-MS分析对象中只含有未反应的自由基捕捉剂以及自由基加合物，彻底去除了反应基质中大量非自由基类化合物对分析的干扰，大大降低了分析对象的复杂程度，提高了分析的灵敏度和分离的效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例五中HPLC-MS检测得到的全离子流图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例一
本实施例提供一种自由基捕捉剂，化学式如式(1)所示：
Figure BDA0001551966280000051
实施例二
本实施例提供一种自由基捕捉剂，化学式如式(2)所示：
Figure BDA0001551966280000052
其中，N元素为N15。
实施例三
本实施例提供一种自由基捕捉树脂微球，它是将自由基捕捉剂和微球状2-氯-三苯甲基氯树脂通过化学键键合而成；其结构如式(3)所示：
Figure BDA0001551966280000053
其中，N元素为N15。
实施例四
本实施例提供一种自由基捕捉树脂微球的制备方法，包括步骤：
将实施例二的自由基捕捉剂和微球状2-氯-三苯甲基氯树脂通过化学键键合，然后用溶剂抽提树脂，洗去杂质，得到具备捕捉自由基功能的自由基捕捉树脂微球；其中，溶剂是将二氯甲烷和甲醇以5:1的体积比混合得到的有机溶剂。
制备过程如下所示：
实施例五
本实施例提供一种检测自由基的方法，包括步骤：
S1：将实施例四制备得到的自由基捕捉树脂微球加入至含有自由基的烟气中，进行自由基的捕捉；
S2：捕捉结束后，将得到的混合物进行过滤，分离树脂微球，并用溶剂充分洗涤树脂微球，得到带有树脂微球的物质(包括未反应的自由基捕捉树脂微球以及已反应的自由基加合物树脂微球)；其中，溶剂是将二氯甲烷和甲醇以5:1的体积比混合得到的有机溶剂；
S3：采用三氟乙酸将带有树脂微球的物质中的树脂切除，得到未反应的自由基捕捉剂和已反应的自由基加合物，然后采用HPLC-MS进行分离和分析。
检测方法的过程如下所示(
Figure BDA0001551966280000064
指检测样品中的自由基)：
Figure BDA0001551966280000062
检测结果：本实施例检测的样品中，检测分析得到的自由基(如图1所示)包括但不局限于：
Figure BDA0001551966280000063
Figure BDA0001551966280000071
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (6)

1.一种自由基捕捉树脂微球，其特征在于：
所述自由基捕捉树脂微球是将化学式如式(1)所示的自由基捕捉剂和树脂通过化学键键合而成；所述树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂；所述2-氯-三苯甲基氯树脂为微球状；
所述自由基捕捉剂中的N元素为N15。
2.权利要求1所述的自由基捕捉树脂微球在自由基检测中的应用。
3.一种检测自由基的方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将自由基捕捉树脂微球加入至含有自由基的样品中，进行自由基的捕捉；
S2：捕捉结束后，将得到的混合物进行过滤，分离得到带有树脂微球的物质；
S3：采用三氟乙酸将所述带有树脂微球的物质中的树脂切除，得到未反应的自由基捕捉剂和已反应的自由基加合物，然后进行检测分析；
步骤S1中，所述自由基捕捉树脂微球是采用权利要求1所述的自由基捕捉树脂微球。
4.根据权利要求3所述的检测自由基的方法，其特征在于：
步骤S1中，所述含有自由基的样品为烟气或者溶液。
5.根据权利要求3所述的检测自由基的方法，其特征在于：
步骤S2中，还包括将所述带有树脂微球的物质采用溶剂进行充分洗涤的步骤；所述溶剂是将二氯甲烷和甲醇以5:1的体积比混合得到的有机溶剂。
6.根据权利要求3所述的检测自由基的方法，其特征在于：
步骤S3中，所述检测分析是采用HPLC-MS或HPLC-MSMS进行分离和分析。
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