CN108295824A - 用于有机分子提纯、表面上具有正离子或质子化脂族残基的吸附剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如通式(I)的残基，其中所述残基通过共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团。而且，本发明涉及所述吸附剂的用途，优选在色谱应用方面，其用于有机分子尤其是药学活性化合物的提纯。本发明涉及一种具有固体支承材料的吸附剂，所述固体支承材料的表面具有如通式(I)的残基，其中所述残基通过共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面上或者本体固体支承材料本身表面上的官能团。而且，本发明涉及所述吸附剂的用途，优选在色谱应用方面，其用于有机分子尤其是药学活性化合物的提纯。

Description

用于有机分子提纯、表面上具有正离子或质子化脂族残基的 吸附剂
本案是“用于有机分子提纯、表面上具有正离子或质子化脂族残基的吸附剂”、申请日为2012年09月17日，申请号为201280045238.5(PCT/EP2012/068198)的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如通式(I)的残基，其中所述残基通过共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团。而且，本发明涉及所述吸附剂的用途，优选在色谱应用方面，其用于有机分子尤其是药学活性化合物的提纯。
背景技术
根据一个或多个以下与试样可能的反应模式，对用于有机分子以及生物分子的色谱介质进行传统分类。
-疏水性反应(反相)
-亲水性反应(正相)
-阳离子交换
-阴离子交换
-体积排阻
-金属离子螯合
通过植物提取或动物性或化学合成等方式提供新化合物往往要求提供新色谱材料、现有色谱材料的进一步研发、或者简单廉价的化合物提纯新方法。即，一直需要高度选择性下游提纯新技术，其能够在相同条件下无需扩大所需液体容积而大规模地处理。
对于给定的分离问题以上类别色谱的传统步骤应用得到的结果是每个阶段在产品纯度一步步地稳定提高的同时将导致产品损失，最后严重累积，更不用说操作时间和商品成本。将连续系列的顺序色谱步骤缩减为仅一个已经被多次证明，因此将早期阶段的亲和色谱引入下游工艺中会解决这个问题。从化学的观点来看，尽管亲和色谱是基于上述的相同反应模式，但通常是基于两个以上的模式的组合，亲和色谱有时被视为它自身的类别。通过采用亲和色谱，在分析物和吸附剂之间的特定反应可以在分析物和结合于色谱材料基质表面上的活性残基之间、以及在分析物和上述基质自身表面特性之间得到证实。
亲和色谱大多数采用整体凝胶相树脂。优秀的凝胶成型材料为中等-交联多糖、聚丙烯酰胺、以及聚(乙烯氧)。此类水凝胶一般确保相容性界面，由于其软度(变形挠性、弹性模数)、大孔体系、高极性以及高含水量以及无反应性或者变性化学基团，所述界面能够很好地容纳所述配位体的活性残基和与之反应的分析物。它们能够保有分析物(诸如蛋白质)于其自然状态，即保持它们正确折叠三维结构、连接状态、以及功能整体性，或者不会以化学方式改变复杂药学活性化合物的结构。但是，由于在施加压力的情况下会被压缩并且不能耐受因搅拌、柱填充或高液流速率导致的剪切应力，这些介质的机械耐性要远弱于无机支承材料。因此，与剧烈的HPLC处理条件完全相容的亲和吸附剂是非常少的。
仅仅在不久之前，发现固定相的机械耐性是上述吸附剂支承体的主体性质，而仅仅是固定相和流动相之间界面上的薄层负责物质交换及与生物性分析物的反应。因此，结合了机械性能极硬和尺寸稳定性、多孔三维核以及生物相容、凝胶状界面层功能的概念被提出，上述凝胶状界面层运载上述活性残基用于结合上述分析物，并且相关的合成问题已经得到技术性解决。此类混合材料采用了在无机氧化物或紧密交联的低极性聚合物的基体上松散交联的高极性聚合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种色谱用新吸附剂，即使是在应用于考虑机械应力或洗脱剂的溶液性质的情况下需要材料的高稳定性的色谱时，该吸附剂也能简单廉价地提纯有机分子。
本发明提供一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如以下通式(I)的残基，
其中所述残基通过通式(I)中虚线所示的共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面的官能团或者本体固体支承材料本身表面上的官能团；以及
其中所用符号和标记具备以下含义：
L为具有1到30个碳原子的(h+1)价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的(h+1)价支链烃基或脂环烃基，
其中，
所述基团中的一个或多个CH2-部分可以被-C(O)-、-C(O)NH-、O、S或-S(O)2-取代，以及
一个或多个氢原子可以由D、F、Cl、或OH取代，优选OH；
PB代表有机正离子基或有机质子化基；
h是代表结合于L的PB-部分数量的指数，并为1、2或3，更优选1或2，最优选1；
条件是，如果L代表共价单键，h为1并且PB通过所述PB基团的碳原子结合于上述官能团。
在一个实施方式中，更优选地，本发明吸附剂中通式(I)的残基连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面上的官能团。
Pb基团为有机正离子基或质子化基团，即能够在溶液中变成正离子基。优选地，在水溶液pH的范围为6到8时，该基团为正离子形式，即质子化形式。对于术语有机基团，可以认为不仅是含有氢和碳原子的基团，还可以是包括氮及氢的基团，诸如胺。本发明吸附剂的表面上存在所述正离子或质子化基团，保证提高所述吸附剂与具有多个羟基或氯基或具有负离子或去质子化基团的待提纯化合物的结合能力。
进一步优选，基团PB为含有至少一个胺形式的氮原子的基团。所述胺为伯、仲、叔或季胺。在仲、叔或季胺的情况下，所述残基优选为C1-6烷基。
基团Pb优选以下基团之一：
a)
其中，R1在每处独立地代表H或C1-6烷基，优选为H或CH3，及更优选每个R1具有相同含义，并且R2在每处独立地代表C1-6烷基，优选CH3，及更优选每个R2具有相同含义；
b)
其中，R1在每处独立地代表H或C1-6烷基；并且其中基团N(R1)2中的R1可以与其它基团的每个R1一起构成-(CH2)p-单元，彼此不同，其中p为2、3、4或5；
c)-N(R3)2或-[N(R3)3]+，其中R3为H、C1-6-烷基、单-或多环芳环体系或单-或多环杂芳环体系；
d)吡咯烷、哌啶、吗啉或哌嗪，在4-位被R3取代，R3具有c)项相同的含义，更优选哌嗪，并且最优选R3为-CH3或苯基的哌嗪；
e)-NH-(C1-6-亚烷基)-NH2，其中更优选-NH-(CH2)n-NH2，n＝1、2、3、4、5或6。
在本发明中，所述基团PB优选为以下基团中的一个：
具有1到30个碳原子的(h+1)价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的(h+1)价支链或脂环烃基优选为以下基团之一：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基(1-甲基亚丙基)、叔亚丁基、异亚戊基、正亚戊基、叔亚戊基(1,1-二甲基亚丙基)、1,2-二甲基亚丙基、2,2-二甲基亚丙基(新亚戊基)、1-乙基亚丙基、2-甲基亚丁基、正亚己基、异亚己基、1,2-二甲基亚丁基、1-乙基-l-甲基亚丙基、l-乙基-2-甲基亚丙基、1,1,2-三甲基亚丙基、1,2,2-三甲基亚丙基、1-乙基亚丁基、1-甲基亚丁基、1,1-二甲基亚丁基、2,2-二甲基亚丁基、1,3-二甲基亚丁基、2,3-二甲基亚丁基、3,3-二甲基亚丁基、2-乙基亚丁基、1-甲基亚戊基、2-甲基亚戊基、3-甲基亚戊基、环亚戊基、环亚己基、环亚庚基、环亚辛基、2-乙基亚己基、三氟亚甲基、五氟亚乙基、2,2,2-三氟亚乙基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、环亚戊烯基、亚己烯基、环亚己烯基、亚庚烯基、环亚庚烯基、亚辛烯基或环亚辛烯基，其中
所述基团中的一个或多个CH2-部分被-C(O)、-C(O)NH-、O、S或-S(O)2-取代，并且一个或多个氢原子可以由D、F、Cl、或OH取代，优选OH取代。
进一步优选，-如果取代-，L的仅一个或两个CH2-部分由-C(O)、-C(O)NH-、O、S或-S(O)2-取代，更优选两个CH2-部分被-C(O)-取代，其优选不直接彼此邻接。有这样含杂原子的部分的优势在于在这些部分和所述待提纯的化合物之间形成氢键，因此提高了结合强度和提纯能力。
进一步优选，-如果取代-，L的仅一个氢原子由D、F、Cl、或OH取代，优选由OH取代，因为OH能形成氢键。
优选地，L为具有1到20个碳原子，更优选1到10个碳原子的(h+1)价直链脂肪烃基或具有3到20个碳原子，更优选3到10个碳原子的(h+1)价支链或脂环烃基，其中所述基团中的一个或多个CH2-部分可以被-C(O)、-C(O)NH-、O、S或-S(O)2-取代，并且一个或多个氢原子可以由D、F、Cl、或OH，优选由OH取代。
L作为二价连接单元的优选实例如下：
共价单键，
-(C1-6-亚烷基)-,
-(C1-6-亚烷基)-CH(OH)-(C1-6-亚烷基)-,
-(C1-6-亚烷基)-X-(C1-6-亚烷基)-，X为O、S或-S(O)2-,
-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-O-(C1-6-亚烷基)-O-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-,
-C(O)-,
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-,
-C(O)-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-,
-C(O)-CH(NHC(O)O-(C1-6-烷基))-(C1-6-亚烷基)-,
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-,
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-NH-,
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-NH-(C1-6-亚烷基)-以及
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-NH-C(O)-(C1-6-亚烷基)-。
当L为三价连接单元，其优选如下通式：
其中，q为1、2、3、4、5、6、7或8。
L作为二价连接单元的优选实例如下：
共价单键，
-(CH2)2-,
-(CH2)4-,
-CH2-CH(OH)-CH2-,
-(CH2)2-S(O)2-(CH2)2-,
-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH(OH)-CH2-,
-C(O)-CH2-,
-C(O)-CH2CH2CH2-,
-C(O)-CH(CH3)-,
-C(O)-CH2-CH(OH)-CH2-,
-C(O)-CH(NHC(O)O-(异丁基))-CH2CH2CH2-,
-C(O)-CH2CH2-C(O)-,
-C(O)-CH2CH2-C(O)-NH-,
-C(O)-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-以及
-C(O)-CH2CH2CH2-NH-C(O)-(CH(叔丁基)-。
最优选L为以下单元之一:
共价单键,
-CH2-CH(OH)-CH2-,
-C(O)-CH2-CH(OH)-CH2-(优选通过C(O)-基团结合于支承材料)或
-C(O)-CH2CH2-C(O)-,
其中，在所有以上L的定义中，所述虚线或自由端线表示与所述固体支承材料的官能团或聚合物膜及PB的官能团结合的键，并且其中在所有以上列出的连接L中，优选首次提到的具有一个自由端线的原子于此位置连接到所述固体支承材料。
根据本发明，C1-6-烷基为直链、支链或环烷基。直链烷基优选具有1到6个、更优选1到3个碳原子。支链或环烷基优选具有3到6个碳原子。这些烷基的一个或多个氢原子可以被氟原子取代。而且，一个或多个CH2-基团可以被NR、O或S(R优选为H或C1-6-烷基)取代。如果一个或多个CH2基团被NR、O或S取代，则优选这些基团中的仅一个被取代；更优选被一个O原子取代。这些化合物的实例如下：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基、正戊基、仲戊基、环戊基、正己基、环己基、正庚基、环庚基、正辛基、环辛基、2-乙基己基、三氟甲基、五氟乙基以及2,2,2-三氟乙基。
C1-6-亚烷基或C1-3-亚烷基的定义如上述的烷基，其中一个氢原子缺位，并且所得二价单元具有两个键。
对于本发明而言，单-或多环芳环体系优选具有6到28个碳原子作为芳环原子。对于术语“芳环体系”，可以认为该体系不一定必须仅含有芳香基，而且体系中超过一个芳香单元可以通过短的非芳香单元连接或间断(<10％的原子不同于H,优选<5％的原子不同于H)，诸如sp3杂化C、O、N等或-C(O)-。这些芳环体系可以为单-或多环，即它们可包括一个(例如苯基)或两个(例如萘基)或多个(例如联苯)芳环，所述芳环可以是稠合或非稠合的，或者，这些芳环可为稠合及共价连接的环。所述环体系的芳环原子可由D、F、Cl、OH、C1-6-烷基、C1-6-烷氧基、NH2、-NO2、-B(OH)2、-CN或-NC取代。
优选芳环体系实例为苯基、联苯、三苯基、萘基、蒽基、联萘、菲基、二氢菲基(dihydrophenanthryl)、芘、二氢芘(dihydropyrene)、苝、并四苯、并五苯、苯并芘、芴、茚、和二茂铁基。
进一步优选，所述单或多环芳环体系具有6到14个芳环原子，其可以为取代或未取代。即环体系更优选为苯基、萘基、蒽基、或芘基，其可以为取代或未取代。
对于本发明而言，单-或多环杂芳环体系优选是具有5到28个、优选5到14个芳环原子的芳环体系。所述杂芳环体系含有至少一个选自N、O、S和Se(其余原子为碳)中的杂原子。对于术语“杂芳环体系”，可以认为该体系不一定必须仅含有芳香基和/或杂芳基，而且体系中超过一个(杂)芳香单元可以通过短的非芳香单元连接或间断(<10％的原子不同于H,优选<5％的原子不同于H)，诸如sp3杂化C、O、N等或-C(O)-。这些杂芳环体系可以为单-或多环，即它们可包括一个(例如吡啶基)或两个以上芳环，所述芳环可以是稠合或非稠合的，或者，这些芳环可为稠合及共价连接的环。
优选杂芳环体系例如为五元环，诸如吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、呋喃、噻吩、硒吩、噁唑、异噁唑、1,2-噻唑、1,3-噻唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,2,5-噻二唑、1,3,4-噻二唑、六元环如吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4-三嗪、1,2,3-三嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪、或稠合基、例如吲哚、异吲哚、吲哚嗪、吲唑、苯并咪唑、苯并三唑、嘌呤、萘咪唑、菲并咪唑、吡啶咪唑(pyridimidazole，吡啶并咪唑)、吡嗪并咪唑(pyrazinimidazole)、喹噁啉咪唑(chinoxalinimidazole)、苯并噁唑、萘噁唑、蒽并噁唑、菲并噁唑、异噁唑、苯并噻唑、苯并呋喃、异苯并呋喃、二苯并呋喃、喹啉、异喹啉、蝶啶、苯并-5,6-喹啉、苯并6,7-喹啉、苯并7,8-喹啉、苯并异喹啉、吖啶、吩噻嗪、吩噁嗪、苯并哒嗪、苯并嘧啶、喹噁啉、吩嗪、萘啶、氮杂咔唑(azacarbazole)、苯并咔啉(benzocarboline)、菲啶、邻二氮菲、噻吩并[2,3b]噻吩、噻吩并[3,2b]噻吩、二噻吩并噻吩、异苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并噻二唑噻吩或它们的组合，更优选咪唑、苯并咪唑和吡啶。
通式(I)的残基优选为L的优选及最优选实例与PB最优选实例的所有组合。
但是，进一步优选通式(I)的残基为如下之一：
本发明吸附剂进一步包括其它残基，其中所述其它残基通过共价单键连接于官能团上，所述官能团位于主体固体支承材料本身的表面上，或者，优选地，取决于所述固体支承材料包括聚合物膜与否，所述官能团位于固体支承材料表面的聚合物膜的表面上。
所述其它残基为可与所述分析物反应的任意残基。优选地，所述其它残基还可以是通式(I)的残基，其不同于所述通式(I)的第一残基。换言之，本发明吸附剂可包括至少两种通式(I)的残基。
但是，不是在每种情况下，本发明吸附剂都必须包括超过一种残基，即在一个实施方式中本发明吸附剂不包括通式(I)的第一残基之外的其它残基。在这种情况下，通式(I)的残基优选通式(I)-1、(I)-2、(I)-3或(I)-4中之一。
在一种实施方式中，本发明吸附剂包括至少两种通式(I)的不同残基。在本实施方式中，进一步优选，所述两种不同残基选自通式(I)-1、(I)-2、(I)-3或(I)-4中的两个残基。最优选本发明吸附剂包括通式(I)-1的残基和通式(I)-2的残基。
通式(I)-1的残基和通式(I)-2的残基的摩尔比范围优选为5:1到35:1，更优选15:1到30:1，最优选20:1到25:1，其中所述残基量通过元素分析来计算。
所述固体支承材料优选为大孔材料。所述固体支承材料的孔径优选至少6nm，更优选20到400nm，并且最优选50到250nm。孔径处于这个范围对于确保足够高的提纯能力是重要的。如果所述孔径超出以上高限，在表面上必定交联的聚合物越多，导致聚合物韧性不够。人们认为，所述结合基团可能无法进入到对于结合待充分提纯的化合物来说很重要的位置上。如果所述孔径太小，则聚合物膜可能会覆盖所述孔，并且所述吸附剂的孔隙效应丧失了。
根据本发明吸附剂的一个实施方式，所述固体支承材料具有1m2/g到1000m2/g,更优选30m2/g到800m2/g，以及最优选50m2/g到500m2/g的比表面积。
优选所述固体支承材料具有30到80％(按体积计)，优选40到70％(按体积计)，最优选50到60％(按体积计)的孔隙度。上述孔隙度是依照DIN66133通过压汞法来测定的。上述固体支承材料的孔径也可以利用依照DIN66133的压汞法通过孔填充来测定。上述比表面积可以利用依照DIN 66132的BET法通过氮吸附来测定。
所述固体支承材料可以是有机聚合物材料或无机材料。
如果上述固体支承材料为有机聚合物材料，它基本是不膨胀的。出于这个原因，最优选所述聚合物材料具有高交联度。
上述聚合物材料，基于聚合物材料中的可交联基团的总量，优选以至少5％，更优选至少10％以及最优选至少15％的程度进行交联。优选地，所述聚合物材料的交联度不超过50％。
优选用于所述固体支承材料的聚合物材料选自由普通或表面改性聚苯乙烯(例如，聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯))、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、多糖(诸如淀粉、纤维素、纤维素酯、直链淀粉、琼脂糖、琼脂糖(凝胶)、甘露聚糖、黄原胶以及右旋糖酐)，以及其混合物组成的组。
本发明可用的聚合物材料，在所述交联实施前，优选具有10到10000，特别优选20到5000并且非常特别优选50到2000个重复单元。所述聚合物材料交联前的分子重量MW范围优选10000到2000000g/mol、特别优选100000到1500000g/mol、并且非常特别优选200000到1000000g/mol。根据现有标准技术通过利用凝胶渗透色谱(GPC)采用聚苯乙烯(例如)作为内标，可以进行MW的测定。
如果上述固体支承材料为无机材料，上述无机材料为某种无机矿物氧化物，优选选自由氧化硅、氧化铝、氧化镁、氧化钛、氧化锆、氟硅酸盐、磁铁矿、沸石、硅酸盐(硅藻土(cellite),kieselguhr)、云母、羟磷灰石、氟磷灰石、金属有机框架、陶瓷以及玻璃、如可控孔度玻璃(例如trisoperl)、金属诸如铝、硅、铁、钛、铜、银、金以及石墨或无定型碳组成的组。
无论所述固体支承材料是聚合物材料或无机材料，所述固体支承材料提供作为不溶性支撑的最小刚度和硬度的固体基础，并且提供一种基础，所述基础增加了固定相和流动相间的界面，所述界面为与分析物反应的场所，作为所述相之间的分离工艺的分子基础，并且所述基础特别在流动和/或压力条件下可用于提高机械强度和磨损性。
本发明的所述固体支承材料可为均质或多相复合物，并且由此可包括一种或多种以上所述材料的复合物，特别是多层复合物。
所述固体支承材料可为粒状材料，优选具有5到500μm的粒度。所述固体支承材料可为片状或纤维状材料诸如膜。所述固体支承材料的外部表面可以是平坦的(板、片、箔、盘、滑板(slides)、滤片(filters)、膜、织物或无纺物、纸)，或为弯曲的(凹形或者凸形、球、珠、粒、(空心)纤维、管、毛细管、瓶、样品盘中的孔)。
所述固体支承材料的内部表面的孔结构，其中包括构成规则、连续毛细管道或者构成不规则(不规则碎片)几何形状的空腔。微观地，其为平滑或粗糙的，取决于制作的方式。所述孔体系将连续地延伸贯穿整个固体支承材料或者终结于(分支)空腔。分析物在其溶解于流动相和保留在固定相表面之间的界面平衡速率、以及连续流动分离体系的效率，主要由通过扩散穿过上述固体支承材料的孔的物质传递和颗粒的特性分布及孔径来决定。孔径可任选地表示为非对称、多峰地(multimodal)和/或螺旋(例如，剖面)的不均匀分布。
如上述，上述固体支承材料的表面优选覆盖聚合物膜，所述聚合物包括独立链段或由独立链段组成。上述聚合物链优选彼此共价键交联。所述聚合物优选不是共价连接到上述固体支承材料的表面。本发明的发明人惊奇地发现，特别是用于提纯同时具有疏水性和正离子或质子化部分的化合物时，重要的是所述聚合物容易弯曲足以变形到可以让疏水性和正离子或质子化部分均可以与待提纯的化合物的疏水性及亲水性或负离子部分接触。本发明的发明人观察发现，如果使用共价连接到所述支承材料的表面的聚合物膜，提纯能力显著减小了。即，采用非共价表面结合交联聚合物作为聚合物膜具有三个优点：(1)聚合物的柔性，由于其不是表面结合；(2)交联确保所述膜结合于所述支承材料的表面且不丢失；(3)如果所述聚合物不共价连接到所述聚合物，则聚合物的厚度就能够被调整到所需薄的程度。
进一步优选，覆盖所述支承材料的聚合物为亲水性聚合物。聚合物的亲水性保证在吸附剂和待提纯的化合物间的亲水反应得以发生。
所述可交联聚合物的优选聚合物优选至少包括亲水基的单体(优选在其侧链)。优选亲水基为-NH2、-NH-、-OH、-COOH、-OOCCH3、酸酐、-NHC(O)-以及糖,其中更优选-NH2和-OH，并且最优选-NH2。
如果采用共聚物，优选共聚单体为简单烯烃单体或极性、惰性单体如乙烯基吡咯烷酮。
覆盖所述支承材料的聚合物实例：聚胺诸如聚乙烯胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、如聚赖氨酸等的聚氨基酸，以及除了那些含有氨基之外的功能聚合物诸如聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸，其前体聚合物诸如聚马来酸酐、聚酰胺或多糖(纤维素、右旋糖酐、支链淀粉等),其中聚酰胺诸如聚乙烯胺和聚烯丙胺是优选的，并且聚乙烯胺是最优选的。
并且，相对于本发明吸附剂的总量，优选本发明吸附剂中通式(I)残基含量范围为50到700μmol/mL，更优选80到650μmol/mL，最优选100到620μmol/mL，其中所述量通过元素分析来测定。
至于优异的提纯能力，进一步优选在本发明吸附剂中，通式(I)残基与所述聚合物(衍生度)的官能团的摩尔比优选超过0.2，其中在通式(I)残基应用之前，通式(I)残基的数量通过元素分析来测定，并且官能团的数量通过滴定来测定。
所述聚合物可以通过本领域已知的所有涂覆方式应用于所述大孔支承体，所述涂覆方式诸如：吸附、气相沉积、(液相、气相或等离子相)聚合反应、旋涂、表面凝结、浸润、浸泡、浸渍、冲洗、喷涂、湿润加工(damping)、蒸涂、施加电场或压力，以及基于分子自组装法，诸如(例如)液晶、LB膜技术或层膜成型(layer-by-layer film formation)。因此，所述聚合物可以直接涂覆作为单层或多层或在各层之上作为单独单层按顺序进行。优选在本发明中，所述聚合物涂覆于所述支承材料，其中所述非交联聚合物以水溶液形式应用到所述支承材料之后交联。
在本发明的吸附剂中，覆盖所述支承材料的聚合物重量与所述支承材料的重量之比优选范围为0.03到0.2，更优选0.045到0.12。如果上述比例超出高限，上述聚合物膜太厚，并且所述支承材料的孔被完全覆盖，导致吸附剂没有可用的孔。如果上述比例低于所述低限，所述聚合物的量不足以覆盖全部支承材料。而且，在后一种情况下，不得不使用更多交联剂以固定所述聚合物于上述支承材料，再次导致化合物膜不够坚韧。
根据本发明的吸附剂的优选实施方式，基于所述交联聚合物中的可交联基团的总数量，所述交联聚合物的交联度为至少2％。基于所述交联聚合物中的可交联基团的总数量，更优选所述交联度为5到50％，再优选5到30％，最优选10到20％。所述交联度通过所使用的上述交联剂的化学计量予以方便地调节。据推断，将近100mol％的交联剂发生反应并形成交联。这点可以通过分析方法证实。上述交联度可以通过MAS-NMR光谱法和所述交联剂量与聚合物量的关系的定量测定来确定。本方法是最优选的。所述交联度还可以通过红外光谱法例如采用基于C-O-C或OH振动的校正曲线来确定。这两种方法都是本领域常规的标准分析方法。如果上述交联度超出高限，则上述聚合物膜不够柔韧，导致提纯能力较差。而且适用于结合的基团的数量和浓度减少。如果所述交联度低于上述低限，则所述膜在上述支承材料的表面上不够稳定。
用于交联所述聚合物的交联剂优选选自由二羧酸、二胺、二醇、脲和双环氧基化合物组成的组，更优选二羧酸和双环氧化合物组成的组，诸如乙二醇二缩水甘油醚、1,12-双-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-癸烷二羧酸、对苯二甲酸、联苯二羧酸、乙二醇二缩水甘油醚，最优选1,12-双-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-癸烷二羧酸。在一个实施方式中，所述至少一个交联剂为直链，柔韧可变形的分子长度为4-20个原子。
优选所述聚合物的分子量使用范围为5000到50000g/mol，但不限于该范围，该范围特别适用于聚乙烯胺。具有接近以上给定范围低限分子量的聚合物表现出能穿透载体上很窄的孔，所以具有高表面积及良好物质传递动力学、溶解率以及结合能力的固态材料可以用于本发明的吸附剂。
根据另一个实施方式，所述交联聚合物具有官能团，即以上提到的亲水侧链基团。
术语“官能团”是指任意简单清楚的化学部分，其属于位于所述固体支承材料表面上的交联聚合物，或属于在所述固体支承材料表面上聚合物制备过程中的可交联聚合物。因此，所述官能团可作为化学连接点或锚。官能团优选含有至少一个弱键和/或一个杂原子，优选基团作为亲核试剂或亲电试剂。
当前述通式(I)的残基结合于所述基团，优选官能团为伯和仲胺、羟基、以及羧酸或酯基。当所述残基与官能团结合，这些基团的性质将根据上述结合残基的结构而变化。
本发明还涉及一种制备吸附剂的方法，优选地，本发明的吸附剂包括：
(i)提供具有官能团的聚合物；
(ii)将所述聚合物的膜吸附到载体表面；
(iii)所述吸附的聚合物的官能团上是限定部分与至少一种交联剂进行交联；
(iv)所述交联聚合物的所述官能团上的其他限定部分与一个或多个通式(I)的残基结合(derivatising)。
优选被吸附在所述载体表面的聚合物溶解于水性介质中，其中水性介质的pH可以适当调整以溶解或悬浮所述聚合物。所述聚合物在所述载体表面的吸附优选通过将所述载体浸渍于含有所述聚合物的溶液或悬浮液中进行。然后，所述混合物优选振荡以实现所述成分的充分混合。毛细力确保所述载体的孔吸满所述溶液或悬浮液。然后，优选所述水在40-60℃的温度下真空蒸发，由此将所述聚合物以膜形式沉积在所述孔的壁上。然后，所述涂覆材料优选在有机溶剂诸如异丙醇或二甲基甲酰胺(DMF)中悬浮，并且优选通过交联剂如乙二醇二缩水甘油醚进行交联，优选在25-60℃的温度下交联4到8小时。
依据所述官能团的种类并依据通式(I)的残基，可以采用所述固体支承体的各种衍生方法(derivatization strategies)。如果所述固体支承材料含有氨基作为官能团，含有羧酸基团的残基可通过羧基碳原子并通过肽化学采用耦合剂或通过采用试剂中的反应性基团被连接到胺基氮原子上，所述耦合剂例如2-(lH-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(lH-6-氯代苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)、六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基-三-吡咯烷基磷(PyBOP)、丙基磷酸酐(T3P)等，所述试剂如异氰酸酯、环氧化物或酸酐。如果所述固体支承材料含有氨基，通式(I)残基的脂族碳原子可通过饱和碳原子亲核取代反应结合于所述胺基氮原子。
如果所述固体支承材料含有羟基，在连接到所述官能团上之前，含有羧酸基团的通式的残基可采用羧酸酰氯或羧酸酯通过羧基碳原子连接到所述羟基的氧原子上。如果上述固体支承材料含有羟基，通式(I)残基的脂族碳原子可通过饱和碳原子亲核取代反应连接到上述羟基的氧原子上。
如果所述固体支承材料含有羧酸基团、羧酸酯或羧酸酐，通式(I)和(II)的残基可通过诸如-NH2、-OH、-SH等亲核基团的亲核攻击而结合在羧酸基团、羧酸酯或羧酸酐的亲电碳原子上，从而形成酰胺、酯或硫酯。
在本发明的吸附剂的一个实施方式中，优选L结合所述官能团，优选上述官能团为胺基，优选-NH2。而且，进一步优选衍生化程度为100％以下，优选90％以下，确保所述聚合物膜包括可质子化的自由氨基由此形成正离子，从而提供一种能形成与待提纯的化合物结合的另外离子键的吸附剂。并且，与相对不柔韧的胺基相比，具有基团PB的所述通式(I)残基确保本发明吸附剂在聚合物膜的表面上具有更加柔韧的正离子或质子化基团。所有这些反应全部优选以确保本发明吸附剂的充分提纯能力。
本发明吸附剂可用于有机分子(有机化合物)的提纯或源自特定有机分子的溶液的提纯。即，本发明进一步涉及本发明吸附剂用于有机分子的提纯或有机分子的溶液的提纯。
术语“提纯”是指包括从含有所述有机分子分离或增加有机分子的浓度和/或纯度。
换言之，本发明涉及提纯有机分子的方法，其还包括通过使用本发明吸附剂从溶液中分离不需要的有机分子。
本发明吸附剂在提纯有机分子上的应用，或者通过使用本发明吸附剂用于提纯有机分子的方法，包括以下步骤：
(i)将溶解或悬浮在液体中的含有有机分子的粗混合物应用在具有本发明吸附剂或本发明方法制备的吸附剂的色谱柱；
(ii)通过采用洗脱剂将所述有机分子从所述色谱柱中洗脱。
在步骤(ii)中使用的洗脱剂可以是与步骤(i)中所用液体相同的溶剂，但也可以不同，这取决于提纯有机分子的必需条件。作为步骤(i)的液体或步骤(ii)的洗脱剂，可以采用色谱领域内采用的各种溶剂或缓冲体系。本发明所用的液体/溶剂的实例如下：四氢呋喃、甲醇、乙醇、水、冰醋酸、乙酸乙酰酯、含水甲酸、己烷、庚烷、戊烷、乙酸乙酯、乙酸、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷以及两种以上这些溶剂的混合物。更优选实例为：四氢呋喃、甲醇、水、冰醋酸、乙酸乙酰酯、含水甲酸、己烷、乙酸乙酯、乙酸、甲苯、二氯甲烷以及两种以上这些溶剂的混合物。这些溶剂的优选混合物如下：四氢呋喃/甲醇、水/冰醋酸、甲醇/乙酸乙酰酯、甲醇/含水甲酸、己烷/乙酸乙酯/甲醇、水/乙酸、甲苯/甲醇、二氯甲烷/乙酸乙酯以及二氯甲烷/乙酸/甲醇。
通过本发明吸附剂提纯的有机分子优选为药学活性化合物。
待提纯的有机分子，优选具有一个或多个(优选多个)负离子或极性、氢桥接或去质子化基团的化合物，或者具有多个羟基或氯基的化合物。在其结构中具有一个或多个所述基团的分子能够以优选方式与通式(I)吸附剂和/或聚合物的官能团的正离子或去质子化基团反应。
有机分子优选分子量范围为100到200000g/mol、更优选100到150000g/mol、最优选100到2500g/mol。
特别优选本发明的应用/方法中使用的有机分子为紫杉醇、10-去乙酰-浆果赤霉素(baccatin)III、孟鲁司特、多烯紫杉醇、舒更葡糖(新型肌松药拮抗药，sugammadex)、喷他霉素(pentamycine)、氟可龙(fluocortolone)，及这些分子的衍生物，或二氯苯酚异构体的混合物，或糖，优选单-糖诸如果糖以及葡萄糖，最优选以下结构的分子：
而且，本发明吸附剂还可用于从溶液中分离内毒素。本发明中使用的术语“内毒素”是指一类生物化学物质。内毒素为细菌的分解产物，其可以引起人体中的多种生理反应。内毒素为革兰氏阴性菌或蓝藻的外细胞膜(OM)的成分。从化学的角度来说，内毒素为脂多糖类(LPS)，其由亲水性多糖组分和亲脂性脂质组分构成。与上述起源于细菌的内毒素对比，内毒素热稳定性非常好并且耐受杀菌。目前最灵敏的内毒素测定方法是通过活化从鲎中分离的阿米巴样菌的溶菌产物中的凝血级联来实现的。该测试就是众所周知的LAL测试。
在紫杉醇、10-去乙酰-浆果赤霉素III、孟鲁司特、多烯紫杉醇、舒更葡糖(sugammadex)、喷他霉素(pentamycine)、氟可龙及它们的衍生物，或糖的提纯过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有通式(I)的残基。
在紫杉醇、10-去乙酰-浆果赤霉素III、孟鲁司特、多烯紫杉醇、舒更葡糖(sugammadex)、喷他霉素(pentamycine)或它们的衍生物的提纯过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有仅一种通式(I)的残基。在这种情况下，特别优选上述残基为通式(I)-1、(I)-2或(I)-3中之一。
在10-去乙酰-浆果赤霉素III、孟鲁司特、多烯紫杉醇或它们的衍生物的提纯过程中，优选本发明吸附剂含有通式(I)-3的残基。
在紫杉醇或其衍生物的提纯过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有(I)-2或(I)-3中的残基。
在舒更葡糖(sugammadex)及其衍生物的提纯过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有通式(I)-2的残基。
在喷他霉素(pentamycine)及其衍生物的提纯过程中，优选本发明吸附剂含有通式(I)-1的残基。
在氟可龙及其衍生物的提纯过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有通式(I)的两种不同残基。进一步优选，通式(I)的一种残基为通式(I)-1的残基，以及通式(I)的一种残基为通式(I)-2的残基。
在二氯苯酚混合物的分离过程中或糖的分离过程中，优选使用本发明吸附剂，其含有通式(I)-4的残基。
本发明还涉及用于液相色谱或固相提取柱，所述柱包括本发明吸附剂或本发明方法制备的吸附剂作为管状容器中的固定相，以及可选择的其他部件诸如：筛板(frits)、过滤板、流动分配器、密封件、连接件、螺栓、阀门或其他流体处理或连接元件。在一个实施方式中，上述方法进一步特征在于其物理及化学耐性，可承受高达20bar的处理压力、高达110℃的加热、以及常规消毒方法(sanitisation protocols)，因此其重复使用次数可高达1,000次，优选高达5,000次。本发明还涉及一批多个相同或不同的本发明吸附剂，或一批本发明方法制备的吸附剂，或一批微板或微芯片阵列形式的本发明的柱，亦或是能够并行处理的多毛细管或微流体装置。
本发明还涉及诊断或实验室提纯试剂盒，所述试剂盒具有本发明吸附剂，或本发明方法制备的吸附剂，或本发明的柱，或一批本发明吸附剂或柱，并且在同一包装单元中，进一步包括用于实现本发明方法或不同的分析、诊断或实验方法所需的其他化学或生物试剂和/或一次性产品。
本发明还涉及以下实施方式：
(i)通过使用本发明吸附剂提纯有机分子的方法。
(ii)根据实施方式(i)的方法，其中所述有机分子为药学活性化合物。
(iii)根据实施方式(i)或(ii)的方法，其中所述有机分子的分子量范围为100到200000g/mol。
(iv)根据实施方式(i)到(iii)中的任一个方法，其中所述有机分子选自由由紫杉醇、10-去乙酰-浆果赤霉素III、孟鲁司特、多烯紫杉醇、舒更葡糖(sugammadex)、喷他霉素(pentamycine)、氟可龙、二氯苯酚、它们的衍生物以及内毒素组成的组。
附图说明
本发明将通过以下附图和实施例得到进一步解释说明，所述附图与实施例不应当理解为对本发明保护范围的限制。
图1.粗喷他霉素(实线)和纯化喷他霉素(短划线)的分析色谱对比(实施例7)。
图2.实施例10中的紫杉醇分级。
图3.舒更葡糖提纯的分级色谱(实施例9)打印输出图。
图4.实施例8中的紫杉醇的分级。
图5.将所述粗紫杉醇(短划线)和所述提纯紫杉醇(实线)的分析色谱对比。
图6.实施例11中的10-去乙酰-浆果赤霉素III的分级。
图7.实施例12中的孟鲁司特的分级。
图8.将所述粗孟鲁司特(实线)和所述提纯产品(短划线)的分析色谱对比(实施例12)。
图9.实施例13中的多烯紫杉醇的分级。
图10.实施例14中的氟可龙的分级，产品馏分取自5.5到11.5分钟区段。
图11.将所述粗氟可龙(短划线)和所述提纯产品(实线)的分析色谱对比，箭头代表所述主要杂质(实施例14)。
图12.利用实施例15中的本发明吸附剂对实施例16中的不同二氯苯酚分级。
图13.利用市售Kromasil，C18，10μm吸附剂对实施例17中的不同二氯苯酚的分级。
图14.通过采用4-甲苯磺酸(前期分析)突破测试确定胺基数量的试样曲线。
图15.通过实施例15制备的本发明吸附剂分离的糖(见实施例18)粗混合物试样分级的色谱。
图16.通过市售吸附剂Kromasil(NH2，10μm)吸附剂分离的糖粗混合物(见实施例19)试样分级的色谱。
具体实施方式
分析方法：
通过采用4-甲苯磺酸(前期分析)突破测试确定胺基数量。
向尺寸33.5x 4mm(床容量0.42mL)的柱中填充各个吸附剂。随后所述填充柱采用以下介质以1.0mL/min的流速冲洗：
·5mL水
·10mL 100mM乙酸铵水溶液
·1mL水
·10mL 100mM三氟乙酸水溶液
·10mL水
在水以0.5mL/min速率被泵送通过上述装置5分钟之后，在具有泵和紫外检测仪的HPLC装置中观察到基线。在10mM的4-甲苯磺酸水溶液被泵送后，观察到在274nm处洗脱剂消失。在数分钟内，所述消失升高到约700mAU的水平，并且在这个水平(冲洗曲线)保持稳定。在25分钟后，上述柱被应用在泵和检测仪之间，并且用10mM 4-甲苯磺酸以0.5mL/min的速度冲洗。由于上述柱结合4-甲苯磺酸，上述消失下降到0mAU。如果所述柱的容量被耗尽，上述洗脱剂的消失再次上升至开始的水平约为700mAU。
为了确定4-甲苯磺酸的能力，在冲洗曲线水平下方的区域被集成为一个对照区，因此获得表面区和4-甲苯磺酸的量之间的关系。之后，滴定由柱吸附的所述甲苯磺酸溶液区域(突破区)，并且减去所述装置的容积和所述柱的死体积(0.5mL)。所述突破区直接表示结合到上述柱上的上述4-甲苯磺酸的数量。将该数量除以上述柱的容量则得到每mL吸附剂的甲苯磺酸容量，还得到吸附剂的胺基数量。为了更好地理解本方法，图14给出这样的试验曲线。
实施例1：含有通式(I)-1的残基的本发明吸附剂制备方法；
用聚乙烯胺涂覆来自DAISO的硅凝胶SP-1000-10获得6000g硅凝胶，所述聚乙烯胺采用pH调整为9.0的范围的2900g的12.4％聚乙烯胺水溶液。上述混合物在振筛机上搅拌直到所述溶液在上述硅凝胶的孔中完全吸满。之后，所述吸附剂在50℃下真空干燥直到上述水被完全蒸发。然后，干燥的吸附剂悬浮于18L异丙醇并且在55℃下和72.8g乙二醇二缩水甘油醚搅拌5小时。然后，所述吸附剂被过滤并以18L异丙醇、30L 0.5M三氟乙酸的水溶液、30L水以及30L甲醇洗涤。干燥后，上述吸附剂已经可以进一步改性。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约442μmol/mL。
13.5L已涂覆并交联的吸附剂以20L 0.5M三乙胺的二甲基甲酰胺溶液洗涤并随后悬浮于12.6L DMF中。加入1991g 2-(lH-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和730mL三乙胺(TEA)，并且在25℃下搅拌18小时。之后，上述混合物经过滤，并且所述吸附剂分别以5L DMF、20L0.5M三氟乙酸的DMF溶液、5L DMF、15L 0.5M TEA的DMF溶液以及20L DMF再次洗涤。所述吸附剂悬浮于9L DMF，并且加入996g HBTU和365mL TEA。并且所述混合物再次在25℃下搅拌18小时。之后，上述溶液经过滤，并且所述吸附剂分别以5LDMF、20L 0.5M TFA的DMF溶液、30L TFA的水溶液、30L水以及30L甲醇洗涤。之后于50℃下真空干燥，所述吸附剂备用。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约119μmol/mL通式(I)-1的残基。通式(I)-1的残基与改性前测定的胺基数量比值为约0.27。
实施例2：含有通式(I)-2的残基的本发明吸附剂制备方法；
如实施例1中所述，150g来自DAISO的Daisogel SP-1000-10以133.9g的11.2％聚乙烯胺水溶液涂覆。在560mL DMF和9.6g 1,12-双-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-癸烷二羧酸中，并且在25℃下进行交联4小时。之后，上述溶液经过滤，并且所述吸附剂分别以1.8L DMF、3L 0.5M TFA的DMF溶液、6L 0.1M TFA的水溶液、1.8L水以及1.8L甲醇洗涤。之后于40℃下真空干燥。
10.5g已涂覆并交联的吸附剂以300mL 0.5M三乙胺的二甲基甲酰胺溶液洗涤并且随后悬浮于20mL水中。加入4.42mL缩水甘油基三甲基氯化铵溶液(75％水溶液)，并且所述混合物于25℃下搅拌3天。之后，所述混合物经过滤，所述吸附剂以300mL水、300mL 0.5MTEA的DMF溶液和300mL水洗涤。所述吸附剂悬浮于20mL水和4.42mL缩水甘油基三甲基氯化铵(75％水溶液)中。所述混合物再次于25℃下搅拌3天。之后，所述溶液被过滤，并且所述吸附剂以300mL水、300mL 0.1M TFA的DMF溶液、500mL TFA的水溶液、300mL水及300mL甲醇洗涤。之后于50℃下真空干燥备用。
实施例3：含有通式(I)-2的残基的本发明吸附剂制备方法(不同交联)
以145.2g的12.4％聚乙烯胺水溶液进行涂覆以得到300g硅凝胶。以3.64g乙二醇二缩水甘油醚在850mL异丙醇溶液中在25℃下进行交联4小时。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约559μmol/mL。
所述涂覆的吸附剂的所有其他参数以及改性根据实施例2来进行。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约268μmol/mL通式(I)-2的残基。通式(I)-2的残基与改性前测定的胺基的比值为约0.48。
实施例4：含有通式(I)-3的残基的本发明吸附剂制备方法
按照实施例1中所述的方法，来自Phenomenex的Jupiter SP-300-15以20.4g的9.8％聚乙烯胺水溶液涂覆，得到25g硅凝胶。所述交联于150mL二甲基甲酰胺和1.3g 1,12-双-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基)-癸烷二羧酸在25℃下进行交联18小时。然后，所述溶液被过滤，并且所述吸附剂以230mL DMF、780mL 0.1M TFA水溶液、230mL水以及230mL甲醇洗涤。所述吸附剂在40℃下真空干燥。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约470μmol/mL。
25g已涂覆硅凝胶以200mL 0.5M TEA的DMF溶液洗涤，并且之后悬浮于100mL DMF中。加入4.43g 1-甲基哌嗪-4-琥珀酸酰胺、8.4g 2-(lH-苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)以及2.24g三乙胺，并且在25℃下搅拌混合物12小时。上述悬浮液经过滤，并且所述吸附剂分别以250mL DMF、400mL 0.1M TFA的DMF溶液、250mL DMF以及300mL0.5M TEA的DMF溶液洗涤。所述吸附剂再次悬浮于100mL DMF。加入2.22g HBTU和1.12g三乙胺，并且所述混合物在25℃下搅拌12小时。上述悬浮液经过滤，并且所述吸附剂分别以250mL DMF、400mL 0.1M TFA的水溶液、250mL水、以及250mL甲醇洗涤。所述吸附剂在50℃下真空干燥后备用。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约410μmol/mL通式(I)-3的残基。通式(I)-3的残基与改性前测定的胺基数量的比值为约0.87。
实施例5：含有通式(I)-3的残基的本发明吸附剂制备方法(不同固体支承体)
来自DAISO的硅凝胶SP-1000-10以59.7g的13.4％聚乙烯胺水溶液和另外加入40g水将pH调整为9.5的聚乙烯胺涂覆，获得100g硅凝胶。上述混合物在振筛机上搅拌直到所述溶液在上述硅凝胶的孔中完全吸满。之后，所述吸附剂在50℃下真空干燥直到上述水被完全蒸发。然后，上述干燥的吸附剂悬浮于300mL异丙醇，并且在55℃下和1.62g乙二醇二缩水甘油醚搅拌5小时。然后，所述吸附剂被过滤并以500mL异丙醇、500mL 0.5M三氟乙酸的水溶液、500L水以及500L甲醇洗涤。干燥后，上述吸附剂已经可以进一步改性。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约596μmol/mL。
根据实施例4进行改性，将其量调整到用于改性的吸附剂的量。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约423μmol/mL通式(I)-3的残基。通式(I)-3的残基与改性前测定的胺基的比值为约0.71。
实施例6：含有通式(I)-1的残基及通式(I)-2的残基的本发明吸附剂制备方法
1200g来自DAISO的硅凝胶SP-1000-10以600g的12.0％聚乙烯胺水溶液并另外加入的340g水来涂覆聚乙烯胺。将pH调整为9.3，并且上述混合物在振筛机上搅拌直到所述溶液在上述硅凝胶的孔中完全吸满。之后，所述吸附剂在50℃下真空干燥直到上述水被完全蒸发。然后，干燥的吸附剂悬浮于4.4L异丙醇，并且在50℃下和14.5g乙二醇二缩水甘油醚搅拌4小时。然后，所述吸附剂被过滤并以7L异丙醇、14L 0.5M三氟乙酸的水溶液、14L水以及8L甲醇洗涤。干燥后，上述吸附剂已经可以进一步改性。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约494μmol/mL。
对于第一次改性，所述吸附剂以13L 0.5M TEA的TMF溶液，并且随后悬浮在2L DMF中。加入465g HBTU和171mL TEA，并且在25℃下搅拌混合物19小时。之后过滤，并分别以1.5L DMF、1.5L 0.5M TFA的DMF溶液、1.5L DMF、1.5L 0.5M TEA的DMF溶液以及1.5L DMF洗涤。所述混合物再次悬浮于2L DMF。加入465g HBTU和171mL TEA，并且所述混合物在25℃下再搅拌19小时。之后经过滤，并且以1.5L DMF、1.5L 0.5M TFA的DMF溶液、1.5L DMF、1.5L0.5M TEA的DMF溶液以及1.5L DMF洗涤。
第二次改性是依照实施例2利用183.2g缩水甘油基三甲基氯化铵以及122.2g TEA在3.5L DMF中的溶液分两步进行，从而得到1.3kg涂覆的吸附剂。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约114μmol/mL通式(I)-1的残基与5μmol/mL通式(I)-2的残基。通式(I)-1及通式(I)-2的残基与改性前测定的胺基数量的比值为约0.24。
实施例7：通过利用实施例1中制备的吸附剂提纯喷他霉素
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述喷他霉素和几种杂质的粗混合物。实施例1中制备的所述吸附剂被填充于250x 50.8mm钢柱。分离方法如表1所示。
表1：用于提纯喷他霉素的方法：
几种馏分的分析如下表2所示。
表2：喷他霉素粗混合物的几种馏分(EW1到EW4)分析结果：
*RRT:在分析色谱中的相对保留时间。
图1所示为色谱1(粗，实线)到色谱2(提纯，短划线)的所述主要杂质。
依照实施例1亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-1的残基(配体)低于100μmol/mL将导致比实施例1的吸附剂更低的纯度和产率。将配体量减少到低于80μmol/mL将使提纯能力和产率显著降低。可见，如果配体量减少到低于50μmol/mL，就几乎对喷他霉素没有选择性了。
同样地，通式(I)-1的残基与聚合物的官能团量的摩尔比低于0.2的吸附剂，其得到的喷他霉素的纯度和产率方面降低了20％，原因在于保有率非常低。
实施例8：通过利用实施例2中制备的吸附剂提纯紫杉醇
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述紫杉醇和几种杂质的粗混合物。实施例2中制备的所述吸附剂被填充于40x 4mm钢柱。在一个单一色谱步骤采用5％甲醇的乙酸乙酰酯溶液的等度法对紫杉醇进行提纯。所述分级过程如表4所示。所取的不同馏分(B1到B14)如表3所示。
表3：所取的不同馏分中紫杉醇的纯度和产率：
馏分No. 纯度[％] 产率[％]
B1 0.59 2.2
B2 0.66 0.4
B3 3.53 0.4
B4 26.71 3.0
B5 90.29 20.3
B6 96.79 26.4
B7 96.71 21.5
B8 96.65 11.9
B9 83.5 12.3
B10 24.52 1.1
B11 14.09 0.2
B12 0.57 0.3
B13 3.55 0.1
B14 3.73 0.0
在图5中，通过将粗混合物(短划线色谱)与上述提纯产品(实线)进行比较，能够清楚看到杂质的去除。
实施例9：通过利用实施例3中制备的吸附剂提纯舒更葡糖
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述舒更葡糖和几种杂质的粗混合物。实施例3中制备的所述吸附剂被填充于轴向压缩的ModCol 250x 25.4mm钢柱。通过等度法采用60％甲醇在(全部)500mM甲酸水溶液来提纯舒更葡糖。图3所示为具有不同所取馏分的分级色谱。不同馏分的含量如表4所示。
表4：所述主要产品Org_25_AT(舒更葡糖)和不同杂质Org_48_C、Org_19_B等的不同馏分(AS1到AS6)含量
RRT:在分析色谱中的相对保留时间。
依照实施例3亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-2的残基(配体)超过100μmol/mL还能得到优异产率下的可接受的提纯能力。将配体量减少到低于80μmol/mL将使提纯能力和产率显著降低。如果配体量减少到低于50μmol/mL，就几乎对舒更葡糖没有选择性了。
同样地，通式(I)-2的残基与聚合物的官能团量的摩尔比为0.2以上的吸附剂，仍表现出对于舒更葡糖的选择性。吸附剂中所述比例低于0.2，则对于舒更葡糖的选择性非常低或几乎无选择性。
实施例10：通过利用实施例4中制备的吸附剂提纯紫杉醇
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述紫杉醇和几种杂质的粗混合物。实施例4中制备的所述吸附剂被填充于33.5x 4mm钢柱。通过己烷/乙酸乙酯/甲醇50/44/6的等度法在单一色谱步骤中来提纯紫杉醇，从起始纯度93％分别达到纯度99.34、产率68％以及纯度99.22％、产率92％。分级过程如图2所示。关键杂质7-表紫杉醇、2-去苯甲酰基-2-甲基巴豆酰基紫杉醇(2-debenzoyl-2-tigloylpaclitaxel)、2’-O-苯甲酰基紫杉醇(2’-O-benzoylpaclitaxel)以及7,13-双侧链-紫杉醇(7,13-bis-sidechain-paclitaxel)被除去了低于0.1％，并且在某些情况下接近或低于所述紫外检测限度如表5所示。
表5：在分级过程中所取的不同馏分含量(J1到J10)
依照实施例4亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-3的残基(配体)超过200μmol/mL还能得到提纯能力比实施例4吸附剂提纯能力的80％要高。将配体量减少到低于80μmol/mL，提纯能力和产率还处于可接受的范围。可见如果配体量减少到低于50μmol/mL，就几乎对紫杉醇没有选择性了。
同样地，通式(I)-3的残基与聚合物的官能团量的摩尔比为0.2以上的吸附剂仍可得到高纯度紫杉醇，尽管产率很低。吸附剂中所述比例低于0.2，则对于紫杉醇的选择性非常低或几乎无选择性。
实施例11：通过利用实施例4中制备的吸附剂提纯10-去乙酰-浆果赤霉素III
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述10-去乙酰-浆果赤霉素III和几种杂质的粗混合物。实施例4中制备的所述吸附剂被填充于250x 20mm钢柱。根据表6中的方法提纯10-去乙酰-浆果赤霉素III。10-去乙酰-浆果赤霉素III的分级过程如图5所示。
表6：用于提纯10-去乙酰-浆果赤霉素III的色谱法
表7所示为对所取馏分的分析。
表7：所取不同馏分(AG1到AG15)的分析结果：
依照实施例3亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-3的残基(配体)超过100μmol/mL仍表现出良好产率条件下的可接受提纯能力。将配体量减少到低于80μmol/mL，将显著降低提纯能力和产率。如果配体量减少到低于50μmol/mL，就对10-去乙酰-浆果赤霉素III没有选择性了。
同样地，通式(I)-3的残基与聚合物的官能团量的摩尔比大于0.2的吸附剂仍表现出对于10-去乙酰-浆果赤霉素III的选择性。吸附剂中所述比例低于0.2，则对于10-去乙酰-浆果赤霉素III的选择性非常低或几乎无选择性。
实施例12：通过利用实施例5中制备的吸附剂提纯孟鲁司特
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述孟鲁司特和几种杂质的粗混合物。实施例5中制备的所述吸附剂被填充于250 x 4mm钢柱。采用甲苯/甲醇97.5/2.5的等度法进行提纯。图7所示为分级过程。可以从起始纯度95.0％的粗混合物得到纯度99.8％产率82％的孟鲁司特。图8所示为提纯产品(短划线)与粗混合物(实线)对比的分析色谱。
依照实施例5亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-3的残基(配体)超过100μmol/mL仍表现出良好产率条件下的可接受提纯能力。将配体量减少到低于80μmol/mL，将显著降低提纯能力和产率。如果配体量减少到低于50μmol/mL，就对孟鲁司特没有选择性了。
同样地，通式(I)-3的残基与聚合物的官能团量的摩尔比大于0.2的吸附剂仍表现出对于孟鲁司特的选择性。吸附剂中所述比例低于0.2，则对于孟鲁司特的选择性非常低或几乎无选择性。
实施例13：通过利用实施例4中制备的吸附剂提纯多烯紫杉醇
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述多烯紫杉醇和几种杂质的粗混合物。实施例4中制备的所述吸附剂被填充于250x 4mm钢柱。采用二氯甲烷/乙酸乙酯97/3的等度法进行提纯。图9所示为分级过程。可以得到纯度99.03％、产率84％的多烯紫杉醇。
依照实施例4亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-3的残基(配体)超过200μmol/mL仍能得到提纯能力比实施例4吸附剂提纯能力的80％要高。将配体量减少到低于约80μmol/mL，提纯能力和产率还处于可接受的范围。可见如果配体量减少到低于50μmol/mL，就对多烯紫杉醇没有任何选择性了。
同样地，通式(I)-3的残基与聚合物的官能团量的摩尔比为0.2以上的吸附剂仍能得到高纯度多烯紫杉醇，尽管产率低。吸附剂中所述比例低于0.2，则对于多烯紫杉醇的选择性非常低或几乎无选择性。
实施例14：通过利用实施例6中制备的吸附剂提纯氟可龙
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离所述氟可龙和几种杂质的粗混合物。实施例6中制备的所述吸附剂被填充于40x 4mm钢柱。采用100％二氯甲烷的等度法和1％乙酸的甲醇溶液洗涤步骤进行提纯。图10所示为分级过程，及图11所示为粗混合物(短划线)和提纯产品(实线)的分析色谱。使用该方法可以得到纯度99.0％、产率93％的氟可龙。
依照实施例6亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-1和(I)-2的残基(配体)低于100μmol/mL将导致比实施例6吸附剂更低的纯度及产率。将配体量减少到低于约80μmol/mL，将显著降低提纯能力和产率。如果配体量减少到低于50μmol/mL，就几乎对氟可龙没有任何选择性了。
同样地，通式(I)-1和(I)-2的残基与聚合物的官能团量的摩尔比低于0.2的吸附剂，对于所得到氟可龙的纯度及产率将降低10％以上。
实施例15：含有通式(I)-4的残基的本发明吸附剂制备方法
来自DAISO的硅凝胶SP-120-10以254g的11.8％聚乙烯胺水溶液的聚乙烯胺涂覆，并另外加入250g水稀释将pH调整为8.0-8.5，获得600g硅凝胶。上述混合物在振筛机上搅拌直到所述溶液在上述硅凝胶的孔中完全吸满。之后，所述吸附剂在50℃下真空干燥直到上述水被完全蒸发。然后，干燥的吸附剂悬浮于2700mL异丙醇，并且在55℃下和12.12g乙二醇二缩水甘油醚搅拌6小时。然后，所述吸附剂被过滤并以3000mL异丙醇、9000mL0.1M盐酸(HCl)的水溶液、3000mL水以及4500mL甲醇洗涤。干燥后，上述吸附剂已经可以进一步改性。
通过滴定确定所得中间体的胺基数量为约720μmol/mL。
50g已涂覆的交联吸附剂悬浮于150mL DMF，以300mL DMF、300mL 0.5M三乙胺(TEA)的DMF溶液以及300mL DMF洗涤，并且再次悬浮于150mL DMF。加入5.76g左旋肉碱(L-Carnitine)、13.56g O-苯并三唑-l-基-四甲基脲六氟磷酸盐(O-Benzotriazol-l-yl-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)以及4.98g TEA，并且所述混合物在50℃下搅拌4小时。之后，上述混合物经过滤，并且所述树脂以上述第二反应步骤进行处理。之后，所述树脂以300mL DMF、300mL 0.1M HCl的DMF溶液、300mL 0.1M HCl的水溶液、300mL水以及300mL甲醇洗涤。所述吸附剂在50℃下真空干燥后备用。
通过元素分析测定，所得吸附剂含有约612μmol/mL通式(I)-4的残基。通式(I)-4的残基与改性前测定的胺基数量的比值为约0.85。
实施例16：通过利用实施例15中制备的吸附剂分离不同的二氯苯酚
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离含有3,4-二氯苯酚、3,5-二氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,5-二氯苯酚以及2,6-二氯苯酚的粗混合物。实施例15中制备的所述吸附剂被填充于250x 4mm钢柱。为了提纯，使用了不同梯度的两种洗脱剂(A和B)，如下表8所示。洗脱剂A为水，且洗脱剂B为乙腈。
图12所示为分级过程。
表8
依照实施例15亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-4的残基(配体)超过100μmol/mL仍具有可接受的分离能力。将配体量减少到低于80μmol/mL，将降低分离能力。可见如果配体量减少到低于50μmol/mL，就没有分离能力。
同样地，通式(I)-4的残基与聚合物的官能团量的摩尔比为0.2以上的吸附剂仍能充分实现分离。若吸附剂中所述比例低于0.2，则分离能力非常低。
实施例17(对照例)：通过使用吸附剂Kromasil(C18,10μm)分离不同的二氯苯酚：
除了采用吸附剂Kromasil(C18,10μm)外，应用与实施例16中完全相同的分离方法。分级过程如图13所示。
实施例18：通过利用实施例15中制备的吸附剂分离葡萄糖和果糖混合物
通过采用四通道低压梯度泵(LPG 580、LPG 680、或LPG 3400)、自动进样器(Gina50、ASI-100或WPS-300)、六通道柱转换阀(Besta)、柱式加热器以及二极管阵列紫外检测仪(UVD 170U、UVD 340S、或VWD 3400)构成的Dionex HPLC系统，得以分离含有葡萄糖和果糖的粗混合物。实施例15中制备的所述吸附剂被填充于40 x 4mm钢柱。为了提纯，使用了不同梯度的两种洗脱剂(A和B)，如下表9所示。洗脱剂A为含有1wt％甲酸的水溶液，及洗脱剂B为含有1wt％甲酸的乙腈溶液。
图15所示为分级过程。
表9
依照实施例15亲和制备的吸附剂，含有通式(I)-4的残基(配体)超过100μmol/mL仍具有可接受的分离能力。将配体量减少到低于80μmol/mL，将降低分离能力。如果配体量减少到低于50μmol/mL，就没有分离能力了。
同样地，通式(I)-4的残基与聚合物的官能团量的摩尔比为0.2以上的吸附剂仍能充分实现分离。若吸附剂中所述比例低于0.2，则分离能力非常低。
实施例19(对照例)：通过使用吸附剂Kromasil(NH2,10μm)分离糖混合物
除了采用吸附剂Kromasil(C18,10μm)外，应用与实施例18中完全相同的分离方法。分级过程如图16所示。

Claims (10)

1.一种具有固体支承材料的吸附剂，所述吸附剂的表面具有如以下通式(I)的残基，
其中所述固体支承材料的表面由一种聚合物膜覆盖，所述聚合物包括单独链段或由单独链段构成，所述单独链段经由交联剂的官能团彼此共价交联，但所述单独链段未共价结合于所述固体支承材料的表面，并且
其中所述残基通过通式(I)中虚线所示的共价单键连接到位于固体支承材料表面上的聚合物膜表面上的聚合物的官能团，该官能团并非交联剂的官能团；以及
其中所用符号和标记具备以下含义：
L代表共价单键或者为具有1到30个碳原子的(h+1)价直链脂肪烃基或具有3到30个碳原子的(h+1)价支链烃基或脂环烃基，
其中，
所述基团中的一个或多个CH2-部分被-C(O)-、-C(O)NH-、O、S或-S(O)2-取代，以及
一个或多个氢原子可以由D、F、Cl、或OH取代，优选OH；
PB为以下所述基团之一：
(II)
h为代表结合于L的PB-部分个数的指数，且h为1、2或3；
条件是，如果L代表共价单键，则h为1并且PB通过所述PB基团的碳原子结合于聚合物的其中一个官能团。
2.如权利要求1所述的吸附剂，其中L选自由如下基团构成的组：
共价单键、
-(C1-6-亚烷基)-、
-(C1-6-亚烷基)-CH(OH)-(C1-6-亚烷基)-、
-(C1-6-亚烷基)-X-(C1-6-亚烷基)-，其中X为O、S或-S(O)2-、
-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-O-(C1-6-亚烷基)-O-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-、
-C(O)-、
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-、
-C(O)-(C1-3-亚烷基)-CH(OH)-(C1-3-亚烷基)-、
-C(O)-CH(NHC(O)O-(C1-6-烷基))-(C1-6-亚烷基)-、
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-、
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-NH-、
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-C(O)-NH-(C1-6-亚烷基)-、
-C(O)-(C1-6-亚烷基)-NH-C(O)-(C1-6-亚烷基)-以及
(III)
其中，q为1、2、3、4、5、6、7或8,
其中，所述虚线或自由端线代表与上述固体支承材料的官能团或所述聚合物膜的官能团、及PB的官能团连接的键。
3.如权利要求1或2所述的吸附剂，其中h为1。
4.如权利要求1到3中任一项所述的吸附剂，其中PB为以下所述基团之一：
(IV)
5.如权利要求1到4中任一项所述的吸附剂，其中所述吸附剂包括两个以上不同的通式(I)残基。
6.如权利要求1到5中任一项所述的吸附剂，其中所述聚合物为聚胺、聚乙烯胺、或含有聚胺的共聚物或共混聚合物。
7.如权利要求1到6中任一项所述的吸附剂在有机分子提纯上的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述有机分子包括一个或多个负离子或去质子化基团、和/或多个羟基或氯基。
9.如权利要求7或8所述的应用，其中所述有机分子的分子量范围为100到200000g/mol。
10.如权利要求7到9中任一项所述的应用，其中所述有机分子选自由紫杉醇、10-去乙酰-浆果赤霉素III、孟鲁司特、多烯紫杉醇、舒更葡糖、喷他霉素、氟可龙、它们的衍生物、以及内毒素组成的组。
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