CN108294046B - 一种大豆细菌性斑疹病的防治方法 - Google Patents

一种大豆细菌性斑疹病的防治方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆细菌性斑疹病的防治方法，用含有NiCl2，NaCl和选自代森锌、代森锰锌和丙森锌的组合物处理大豆种子，对大豆细菌性斑疹病的病原菌—地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)有很好的防治效果，相比于传统的防治方法，更简单，更省时，更实用，防治费用更低，因此在实际田间推广上更有优势。

Description

一种大豆细菌性斑疹病的防治方法
技术领域
本发明属于农业病害防治技术领域，具体涉及一种大豆细菌性斑疹病的防治方法。
背景技术
大豆细菌性斑疹病菌，又称细菌性叶烧病，属于黄单胞属，该属病原菌能侵染绝大多数蔬菜、经济作物和农作物，对农业生产造成巨大损失。是世界范围危害大豆的重要细菌病害，有研究报道，在某些特定地区，该病导致的减产高达40％。地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)是大豆细菌性斑疹的致病菌。高温、潮湿并伴随着零星强降雨的气候利于该病的发生。大豆细菌性斑疹病在中国境内各主要大豆产区均有发生，且南方较北方更为严重。该病害近年来在国内发病区域和发病面积有逐年扩展的趋势。
大豆是我国重要的粮食、油料作物，在我国农业生产中占有相当重要的地位。20世纪90年代以来，随着人们对大豆保健功能的不断认识，菜用大豆(俗称毛豆)迅速发展，成为部分地区出口创汇农产品和区域特色优势农作物。在大豆整个生育期，其生长不断受到各种病原物(如细菌)的攻击。在局部地区，高温、多雨、湿润的气候为大豆斑疹病菌的侵染和繁殖提供了适宜的环境，病害日渐严重，严重影响着大豆的产量和品质，成为制约部分地区(如浙江)菜用大豆产业发展的重要因素之一。
大豆细菌性斑疹病在大豆生长的各个阶段均可发病，主要危害叶片，也可侵染幼苗、茎、叶柄、豆荚和籽粒，引起大豆叶片早枯脱落、籽粒瘪小减产。病菌主要通过潜伏在染病种子或病株残体内越冬，成为来年的侵染源。目前，对大豆斑疹病害的防治方法包括选育、栽培抗性品种，实行合理轮作和深翻土壤，及时对病株残体进行深埋处理、使用化学农药等。本申请人在前期研究发现，金属离子组合物(NiCl2，NaCl，KCl、CrCl3，ZnCl2)能够显著地抑制地毯黄单胞菌大豆致病变种菌体生长，抑制地毯黄单胞菌大豆致病变种的毒性，抑制hrpE的表达，可以用于大豆细菌性斑疹病的防治，防治效果显著，对环境无污染，绿色环保，具有一定的增效作用(CN201610012843.2，CN201610013058.9)，用金属离子防治大豆斑疹病经验证是一种区别于传统杀菌剂作用模式的新型抗菌剂。本申请人后期还对金属离子抑制剂进行了改进，将其和常用的中生菌素、梧宁霉素、春雷霉素等杀灭细菌的农用抗生素混合，从而不仅能在未发病时对病害进行防治，对已经发病的大豆，仍然具有很好的补充性防治效果。可以用于拌种、浸种或包衣处理，在发病初期对病菌起到抑制作用，发病后起到补充性防治作用，防治的途径和作用均进一步的有所提升(已申请专利)。
本发明是在上述工作的基础上，通过进一步的研究和筛选，得到一种在实际使用过程中，更实际的一种大豆细菌性斑疹病的防治方法。本发明的防治方法相比于传统的防治方法，更简单，更省时，更实用，防治费用更低，因此在实际田间推广上更有优势。
发明内容
本发明的目的是提出一种大豆细菌性斑疹病的防治方法，对大豆细菌性斑疹病的病原菌—地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)有很好的防治效果，相比于传统的防治方法，更简单，更省时，更实用，防治费用更低，因此在实际田间推广上更有优势。
为达到本发明的目的所采取的技术方案如下：
一种大豆细菌性斑疹病的防治方法，其特征在于，用含有NiCl2，NaCl和选自代森锌、代森锰锌和丙森锌的组合物处理大豆种子，所述的大豆细菌性斑疹病的病原菌为地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)。进一步的处理的方式为拌种、浸种或包衣。优选地，所述组合物的组成为0.01μmol/L-50μmol/L的NiCl2，0.1μmol/L-100μmol/L的NaCl，1-10g/L的代森锌、代森锰锌和丙森锌。进一步的，组合物的组成为0.01μmol/L-50μmol/L的NiCl2，0.1μmol/L-100μmol/L的NaCl，1-5g/L的代森锌；0.01μmol/L-50μmol/L的NiCl2，0.1μmol/L-100μmol/L的NaCl，1-5g/L的代森锰锌；0.01μmol/L-50μmol/L的NiCl2，0.1μmol/L-100μmol/L的NaCl，1-5g/L的丙森锌。
本发明的有益效果：
1、本发明的防治方法可以很好的防治大豆细菌性斑疹病的病原菌，可以用于拌种、浸种或包衣处理；
2、本发明方法相比于传统的防治方法，更简单，更省时，更实用，防治费用更低，因此在实际田间推广上更有优势。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步的说明，但本发明并不局限于此，实施例中的百分比均为重量比。
实施例1
本实施例的组合物包含0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，5g/L的代森锌，将上述组分充分混合搅拌均匀，得到本发明的组合物。
实施例2
本实施例的组合物包含0.5μmol/L的NiCl2，0.8μmol/L的NaCl，7g/L代森锰锌，将上述组分充分混合搅拌均匀，得到本发明的组合物。
实施例3
本实施例的组合物包含3.5μmol/L的NiCl2，2μmol/L的NaCl，8g/L的丙森锌，将上述组分充分混合搅拌均匀，得到本发明的组合物。
实施例4
本实施例的组合物包含1μmol/L的NiCl2，15μmol/L的NaCl，6g/L的代森锌，将上述组分充分混合搅拌均匀，得到本发明的组合物。
比较试验A(和CN201610012843.2，CN201610013058.9中描述的方法相同，组合物是本申请的组合物)
实验材料：地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.glycines)、NB液体培养基、NiCl2、NaCl，ZnCl2、代森锌、2％大豆汁液(大豆新鲜叶片在液氮中研磨成粉末，然后溶于去离子水中，0.22um过滤灭菌)。
试验方法：
1、菌体生长测定
(1)挑选地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)菌落接种于20ml NB液体培养基中，于28℃、200rpm摇床上振荡培养20h(OD600≈1.0)；
(2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接种于新鲜的NB液体培养基中，继续振荡培养直到OD600达到约1.0为止；
(3)将步骤(2)中的菌液5000g离心3min收集菌体，然后用培养基1(含2％大豆汁液、0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，5g/L的代森锌)重新悬浮菌体；然后，5000g离心3min收集菌体，用培养基1再次重新悬浮菌体；然后接种于20ml培养基1中(初始OD600≈0.1)，200rpm、28℃摇床上振荡培养；每隔4h检测1次菌体浓度；
CK1：将步骤(3)中的培养基1替换成培养基2(含2％大豆汁液、0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，0.08μmol/L的ZnCl2)，其他条件不变；
CK2：将步骤(3)中的培养基1替换成培养基3(含2％大豆汁液、5g/L的代森锌)，其他条件不变；
CK3：将步骤(3)中的培养基1替换成培养基4(2％大豆汁液)，其他条件不变；测定结果见表1。
Figure BDA0001561103600000061
表1中的数据表明：本发明的组合物对地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.glycines)菌体生长有很好的抑制作用，且抑制效果优于单独使用金属抑制剂或代森锌，说明本发明的组合物具有协同增效作用，可以显著地抑制地毯黄单胞菌大豆致病变种的毒性。
比较试验B
1、致病性检测
(1)挑选地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)菌落接种于20ml NB液体培养基中，于28℃、200rpm摇床上振荡培养20h(OD600≈1.0)；
(2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接种于新鲜的NB液体培养基中，继续振荡培养直到OD600达到约1.0为止；
(3)将步骤(2)中的菌液5000g离心3min收集菌体，然后用灭菌去离子水重新悬浮菌体；然后，5000g离心3min收集菌体，用灭菌去离子水再次重新悬浮菌体；调OD600至0.2；
(4)在步骤(3)得到的菌液中加入NiCl2、NaCl、代森锌，调整NiCl2、NaCl、代森锌的终浓度分别为0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，5g/L代森锌；将混合后的菌液喷雾接种大豆植株(感病品种(绥农10)，六周龄)；
CK4：在步骤(3)得到的菌液中加入NiCl2、NaCl、ZnCl2，调整NiCl2、NaCl、ZnCl2的终浓度为0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，0.08μmol/L的ZnCl2，
CK5：在步骤(3)得到的菌液添加代森锌后直接喷雾接种大豆植株(感病品种(绥农10)，六周龄)，其他条件不变。在步骤(3)得到的菌液直接喷雾接种大豆植株形成空白CK，测定结果见表2。
Figure BDA0001561103600000081
表2中的数据表明：本发明的组合物对地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.glycines)的毒性抑制作用优于金属抑制剂和代森锌。
比较试验C
1、hrp基因表达检测(Real-time PCR)
(1)挑选地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)菌落接种于20ml NB液体培养基中，于28℃、200rpm摇床上振荡培养20h(OD600≈1.0)；
(2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接种于新鲜的NB液体培养基中，继续振荡培养直到OD600达到约1.0为止；
(3)将步骤(2)中的菌液5000g离心3min收集菌体，然后用培养基A(含2％大豆汁液、0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，5g/L代森锌)重新悬浮菌体；然后，5000g离心3min收集菌体，用培养基A再次重新悬浮菌体；然后接种于20ml培养基A中，200rpm、28℃摇床上振荡培养；
(4)诱导培养24h后，5000g离心3min，收集菌体；
(5)用RNA提取试剂盒(
Figure BDA0001561103600000091
RNA Kit，Code No.ER101)提取总RNA；
(6)以RNA为模板，合成第一链cDNA(
Figure BDA0001561103600000092
EasyScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix，Code No.AE311)；
(7)以cDNA为模板，采用real-time PCR(TaKaRa，
Figure BDA0001561103600000093
Premix Ex TaqTM GC(Perfect Real Time)，Code No.RR071A)技术检测高表达、代表性hrp基因(hrpE)及内参基因(ihfA)的表达；
CK6：将步骤(3)中的培养基A替换成培养基B(含2％大豆汁液、0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl，0.08μmol/L的ZnCl2)，其他条件不变；
CK7：将步骤(3)中的培养基A替换成培养基C(含2％大豆汁液、5g/L代森锌)，其他条件不变；
CK8：将步骤(3)中的培养基A替换成培养基D(2％大豆汁液)，其他条件不变。测定结果见表3。
Figure BDA0001561103600000101
表3中的数据表明：本发明的组合物能够显著地抑制hrpE的表达，且抑制效果优于单独使用金属抑制剂和代森锌的抑制效果，表明本发明的组合物具有协同增效作用。
比较试验D：
本发明的组合物对大豆细菌性斑疹病的防治效果测定(参照《中华人民共和国国家标准GB/T 17980.113-2004》进行田间药效试验)
用本申请的组合物处理大豆种子，测试本申请的组合物对大豆细菌性斑疹病的防治效果。试验中所用种子均为人工带菌后的种子(用Xanthomonas axonopodispv.glycines进行诱病处理)，采用药液浸种的方法处理带菌种子，处理后的种子清水冲洗3次后直接播种，定期观察幼苗发病情况，用CN 201610013058.9实施例4的金属抑制剂作为对照药剂(CK9)，试验各处理采用随机区组排列，四周设保护行。试验药剂为本申请的实施例组合物，用药量为200g·ai/hm2，对照药剂为65％代森锌WP(CK10)，按照推荐用药量为300g/hm2。试验结果见表4。
Figure BDA0001561103600000111
从表4可以看出，本发明的组合物处理种子时，防治效果好，金属抑制剂组合物和代森锌、代森锰锌和丙森锌起到很好的协同补充作用，综合防治效果优于单独使用金属抑制剂组合物和代森锌、代森锰锌和丙森锌，利于常规的推广。
总结：大豆细菌性斑疹病在大豆整个生育期均可发生，病情发展迅速，发生严重，因此在防治的过程中要考虑整个大豆的生长过程，在种子阶段进行预防性防治是比较省时省力的一种方法，研究不同的防治方法对大豆细菌性斑疹病的防治具有一定的积极意义。在生长季节温暖和频繁有阵雨的条件下，更要注意斑疹病的发生，做好预防。在防治病害的过程中，首先考虑将金属离子抑制剂和农用抗生素或代森锌、代森锰锌和丙森锌混合使用，避免单独使用，以便起到最优的防治效果。

Claims (3)

1.一种大豆细菌性斑疹病的防治方法，其特征在于，用含有NiCl2，NaCl和代森锌的组合物处理大豆种子，所述的大豆细菌性斑疹病的病原菌为地毯黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)，组合物的组成为0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl和5g/L的代森锌。
2.根据权利要求1的防治方法，其特征在于，处理的方式为拌种、浸种或包衣。
3.一种防治大豆细菌性斑疹病的组合物，其特征在于所述组合物的组成为0.09μmol/L的NiCl2，0.5μmol/L的NaCl和5g/L的代森锌。
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