CN108285929B - 与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P29、试剂盒及其应用 - Google Patents

与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P29、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P29、试剂盒及其应用，属于大白菜育种技术领域。本发明提供了与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29及用于扩增的引物对。本发明提供的Indel分子标记P29在筛选具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜及其类似大白菜品种中的应用。开发出的分子标记的应用解决了德高CR117等一类抗根肿病大白菜抗病基因的有效利用问题。标记的应用解决了该类型抗根肿病性状接种存在的鉴定周期长、病菌污染扩散以及接种鉴定存在的不准确问题。筛选准确率高，同时筛选操作简便，成本低廉，重复性好。

Description

与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P29、 试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于大白菜育种技术领域，具体涉及与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29及其应用。
背景技术
十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassica Woronin)侵染引起的一种世界性病害，寄主范围很广，可危害白菜、甘蓝、萝卜、花椰菜、油菜等100多种栽培的和野生的十字花科植物。大白菜是根肿病危害最严重的十字花科蔬菜之一，近年来，我国沿海地区、云贵川、东北部分地区以及西部地区等全国大部分地区都有根肿病发生，发生面积急剧增加并逐年加重，已经成为大白菜主产区的主要病害。
由于根肿病菌休眠胞子抗逆性强，在土壤中可存活10年以上，化学防治极为困难。抗病品种的选育和应用是解决根肿病危害的根本途径。而分子标记辅助育种是选育抗根肿病大白菜品种的有效手段。目前报道的大白菜抗根肿病基因有8个，分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk(Matsumoto et al.，1998；Piao et al.，2002,2004；Suwabeet al.，2003,2006；Hirai et al.，2004；Saito et al.，2006；Sakamoto et al.，2008)，其中Crr1定位于A8连锁群，Crr2定位于A1连锁群，Crr4定位于A6连锁群，CRc定位于A2连锁群，Crr3、CRa、CRb、CRk定位于A3连锁群。发明人所在课题组利用8个已发表根肿病抗病基因相关分子标记引物，对抗病大白菜材料进行分子标记筛选利用，目前已筛选出KBrH129J18R等多个标记可用于根肿病抗性筛选，但现有抗根肿病分子标记不能标记德高CR117、康根51号等多个抗病类型相似的抗病品种，阻碍了这类品种抗病基因转育与筛选利用。因此德高CR117类型品种抗根肿病分子标记的开发与应用，对大白菜抗根肿病育种有重要意义。
现有德高CR117类型根肿病抗病基因的利用是传统根肿病接种鉴定，杂交转育或自交分离后代抗根肿病性状的选择，只能依靠人工接种鉴定，不仅鉴定周期长、存在病菌扩散的风险并且该类抗病品种对大白菜根肿病菌抗病性表现为部分抗病性，即发病率和病情指数均不能达到0，因此接种鉴定的选择结果可靠性也不能保证。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的分子标记、试剂盒及其应用，所述分子标记能够准确筛选德高CR117大白菜抗根肿病性状，具有简单快速的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种用于扩增所述的Indel分子标记P29的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种用于筛选德高CR117大白菜抗根肿病性状的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对。
本发明提供了所述的Indel分子标记P29、所述的引物对或所述试剂盒在筛选具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜及其类似大白菜品种中的应用；
所述类似大白菜品种包括鲁信健根、真抗100或康根51号。
优选的，所述筛选的方法，包括以下步骤：
(1)用所述的引物对对待筛选德高CR117大白菜及其类似大白菜品种样本进行PCR扩增，得到的PCR产物；
(2)将所述PCR产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，产生74bp的电泳条带的样本判断为具有德高CR117大白菜抗根肿病性状。
优选的，所述步骤(1)中PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃预变性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。
优选的，所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系如下：
Figure BDA0001634074130000021
Figure BDA0001634074130000031
优选的，所述步骤(2)中SDS-PAGE凝胶的浓度为6％～8％。
优选的，所述具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜或德高CR117类似抗病大白菜品种还包括自交株。
本发明提供了与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述Indel分子标记P29与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁，与易感根肿病性状的德高CR117大白菜材料产生明显差异的条带，根据特定大小的条带进行鉴定。本发明提供的Indel分子标记P29用47份代表高感和高抗自交系进行验证，结果表明采用本发明提供的Indel分子标记P29进行筛选德高CR117大白菜抗根肿病性状准确率高，准确率达到100％。
本发明提供的Indel分子标记P29在筛选具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜类似大白菜品种中的应用；所述类似大白菜品种包括鲁信健根、真抗100或康根51号。开发出的分子标记的应用解决了德高CR117等一类抗根肿病大白菜抗病基因的有效利用问题。标记的应用对该类型抗根肿病性状的鉴定周期缩短、不存在病菌污染扩散的问题，鉴定结果准确。实施例的效果证明，筛选准确率高达100％，同时筛选操作简便，成本低廉，重复性好。本申请的鉴定周期为8～14d。
附图说明
图1为实施例1中采用Indel分子标记P29对小群体印证电泳图谱；
图2为实施例2中采用Indel分子标记P29对自交系鉴定图谱。
具体实施方式
本发明提供了与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29，具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述Indel分子标记P29在抗根肿病和易感根肿病的德高CR117大白菜材料中表达片段大小存在差异，具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜材料产生74bp的电泳条带。
本发明提供了一种用于扩增所述的Indel分子标记P29的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对即可。本发明实施例中，所述引物对委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明提供了一种用于筛选德高CR117大白菜抗根肿病性状的试剂盒，包括所述的引物对。所述试剂盒还包括采用PCR检测德高CR117大白菜抗根肿病性状的常规试剂。
本发明提供了所述的Indel分子标记P29、所述的引物对或所述试剂盒在筛选具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜及其类似大白菜品种中的应用；所述类似大白菜品种包括鲁信健根、真抗100或康根51号。
在本发明中，所述筛选的方法，优选包括以下步骤：
(1)用所述的引物对对待筛选德高CR117大白菜样本进行PCR扩增，得到的PCR产物；
(2)将所述PCR产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，产生74bp的电泳条带的样本判断为具有德高CR117大白菜抗根肿病性状的材料，产生154bp电泳条带的样本判断为易感根肿病性状的德高CR117大白菜材料。
本发明用所述的引物对对待筛选德高CR117大白菜样本进行PCR扩增，得到的PCR产物为所述的Indel分子标记P29。在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选为94℃预变性5min，94℃预变性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。所述PCR扩增的反应体系优选如下：
Figure BDA0001634074130000041
Figure BDA0001634074130000051
得到PCR产物后，本发明将所述PCR产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，产生74bp的电泳条带的样本判断为具有德高CR117大白菜抗根肿病性状的材料。
所述SDS-PAGE凝胶的浓度优选为5％～8％，更优选为6％。本发明对所述制备SDS-PAGE凝胶的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备方法即可。所述SDS-PAGE凝胶电泳的电压优选为1500V～2200V，更优选为2000V。所述SDS-PAGE凝胶电泳的电流优选为40～80mA，更优选为60mA。所述SDS-PAGE凝胶电泳的时间优选为45～90min，更优选为60min。
在本发明中，所述SDS-PAGE凝胶电泳后，优选将SDS-PAGE凝胶染色。所述染色优选为银染。本发明对所述银染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的银染方法即可。得到银染后的SDS-PAGE凝胶后，根据凝胶中的Marker的条带，观察每个样本扩增条带的大小，判断结果。74bp电泳条带的序列具体如序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
在本发明中，所述具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜或德高CR117类似抗病大白菜品种优选还包括自交株。
下面结合实施例对本发明提供的与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
实验材料的准备
2016年9月19日对德高CR117大白菜F2群体及高代抗病自交系和感病自交系进行根肿病接种鉴定，10月28日调查根肿病发病情况，并选取高感和高抗F2单株及高感和高抗自交系提取基因组DNA，委托壹基因公司进行基因组重测序。根据测序结果设计引物。利用F2抗病和感病单株进行小群体(表1)验证，小群体印证选择抗病F2单株9个，感病F2单株7个，结果如图1所示；用已有抗病和感病自交系(表2)印证，结果图2所示。
表1小群体验证
编号 F2单株编号 74bp抗病特征带
1 R1 有
2 R2 有
3 R3 有
4 R4 有
5 R5 有
6 R6 有
7 R7 有
8 R8 有
9 R9 有
10 S1 无
11 S2 无
12 S3 无
13 S4 无
14 S5 无
15 S6 无
16 S7 无
表2自交系鉴定
Figure BDA0001634074130000071
Figure BDA0001634074130000081
Figure BDA0001634074130000091
图1为P29对小群体印证电泳图谱。如图1所示，1-9为抗病F2单株，10-16为感病F2单株。
图2为P29对自交系鉴定图谱。47份材料1,2,3,5,6,7,8,15,42为感病自交系材料；16为杂合材料，43为其他基因型抗根肿病材料。
由上述可知，本发明提供的Indel分子标记P29及引物对能有效解决德高CR117及类似品种抗根肿病性状的筛选问题，筛选结果准确可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛市农业科学研究院
<120> 与德高CR117大白菜抗根肿病性状连锁的Indel分子标记P29、试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaatgacgg tgacagaggt ttcatgttga agagagagag aggaagtgtg tctgaagaaa 60
gaggaagatt gggt 74
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaatgacgg tgacagaggt ttc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccaatctt cctctttctt cag 23

Claims (9)

1.与德高CR117大白菜抗根肿病性状紧密连锁的Indel分子标记P29，其特征在于，所述Indel分子标记P29的核苷酸序列为如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种用于扩增权利要求1所述的Indel分子标记P29的引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列为如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列为如序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.一种用于筛选德高CR117大白菜抗根肿病性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物对。
4.权利要求1所述的Indel分子标记P29、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在筛选具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述筛选的方法，包括以下步骤：
(1)用权利要求2所述的引物对对待筛选德高CR117大白菜品种样本进行PCR扩增，得到的PCR产物；
(2)将所述PCR产物进行SDS-PAGE凝胶电泳，产生74bp的电泳条带的样本判断为具有抗德高CR117大白菜根肿病性状的材料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃预变性45s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系如下：
Figure FDA0002502000480000011
Figure FDA0002502000480000021
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中SDS-PAGE凝胶的浓度为6％～8％。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述具有抗根肿病性状的德高CR117大白菜品种还包括自交株。
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