CN108277275A - 钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途，属于医学领域。头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinomas,HNSCCs)是排名第六的恶性肿瘤之一，HNSCCs最明显的免疫学变化是细胞介导的免疫反应抑制，其肿瘤细胞通过多种方式逃避机体的免疫监视、抑制宿主的免疫应答，但目前还未发现针对HNSCCs的特异性肿瘤抗原。Calnexin是内质网中的I型跨膜蛋白，是一种重要的类凝集素分子伴侣并参与细胞内许多重要的生物学过程。本发明以口腔鳞癌作为研究模型，深入探讨肿瘤微环境中Calnexin介导的肿瘤进展与免疫逃逸机制，以期为肿瘤免疫治疗提供理论基础与潜在治疗策略。

Description

钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途，属于医学领域。

背景技术

头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinomas,HNSCCs)主要包括口腔鳞癌、口咽鳞癌、下咽鳞癌和喉鳞癌，是世界第六位最常见的恶性肿瘤之一。近年来，HNSCCs的发病率呈明显上升趋势，其5年生存率低于50％，大约1/3的患者会复发。HNSCCs的不良预后与机体对肿瘤的低免疫应答状态密切相关。细胞介导的免疫反应抑制是HNSCCs患者最显著的免疫学变化。传统的治疗方法主要包括手术和放化疗，局部复发、转移和第二原发灶是头颈部鳞癌治疗失败的主要原因。荷瘤状态下，肿瘤细胞能自发分泌免疫抑制性因子如TGF-B、IL-10、血管内皮生长因子(VEGF)等抑制T细胞的分化，或诱导多种具有负向免疫调节功能的抑制性免疫细胞亚群在肿瘤局部的扩增和聚集，抑制机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤。因此，寻求多种方法在体内激活免疫监视系统或通过药物中和免疫抑制分子从而控制肿瘤生长的免疫治疗已成为头颈部鳞癌治疗的重要手段。

内质网是真核细胞中蛋白质合成和Ca²⁺贮积的主要场所。内质网中的分子伴侣，主要包括钙联蛋白(Calnexin)、钙网蛋白(Calreticulin)、免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)和蛋白质二硫异构体(PDI)ERp57等。它们参与了新生多肽的转运、错误折叠蛋白的解聚或降解等过程，具有辅助蛋白质折叠和组装、保证蛋白质的正常构象和生物活性的功能。

发明内容

本发明的目的在于以Calnexin显著高表达的口腔鳞状细胞癌(oral squamouscell carcinoma,OSCC)作为研究模型，以其总蛋白与膜蛋白表达与临床预后相关性作为切入点，并以T细胞缺失裸鼠模型及人T淋巴细胞体外培养和体内过继免疫模型，深入探讨肿瘤微环境中Calnexin免疫逃逸机制，从而为头颈部鳞癌乃至系统性肿瘤免疫治疗提供理论基础与潜在治疗策略。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。

优选的，所述肿瘤相关疾病为头颈鳞癌、黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌。

优选的，所述肿瘤相关疾病为头颈鳞癌。

优选的，所述药物通过降低钙联蛋白水平、阻滞钙联蛋白的受体或阻断钙联蛋白的下游信号来治疗肿瘤相关疾病。

优选的，所述药物通过降低钙联蛋白水平、阻滞钙联蛋白的受体或阻断钙联蛋白的下游信号而促进T细胞增殖来治疗肿瘤相关疾病。

另一方面，本发明提供一种钙联蛋白抑制剂、钙联蛋白的受体阻滞药或钙联蛋白的下游信号拮抗药在制备用于治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。

优选的，所述钙联蛋白抑制剂为钙联蛋白抗体。

优选的，钙联蛋白的下游信号拮抗药为细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γ。

本发明的有益效果在于：本发明以口腔鳞癌作为研究模型，以其总蛋白与膜蛋白表达与临床预后相关性作为切入点，并以裸鼠成瘤和移植瘤模型及人T细胞体外增殖和体内过继免疫模型，深入探讨肿瘤微环境中Calnexin介导的肿瘤进展与免疫逃逸机理，为肿瘤免疫治疗提供理论基础与潜在治疗策略。

附图说明

图1表示OSCC细胞系CANX mRNA的表达水平升高，*p<0.05,**p<0.01；

图2表示Western Blot检测OSCC细胞系Calnexin蛋白表达水平升高，*p<0.05；

图3表示8例口腔癌患者肿瘤及癌旁组织的CANX mRNA表达水平，4例样肿瘤组织CANX mRNA表达水平升高。*p<0.05,**p<0.01；

图4表示8例口腔癌患者肿瘤及癌旁组织的Calnexin蛋白表达水平，8例样本中有5例癌组织Calnexin的表达明显升高。癌组织的平均灰度值高于正常组织；

图5表示Calnexin在OSCC组织中的表达高于正常上皮，Calnexin染色包括强、中和弱表达，有部分Calnexin表达在细胞膜上，见白色箭头；

图6表示免疫荧光显微镜检测正常上皮和口腔癌组织中Calnexin的表达和定位，正常上皮内Calnexin表达较少，主要位于癌巢的肿瘤细胞胞浆内，也可表达在肿瘤细胞膜上(白色箭头)；

图7表示LV-CANX-shRNA和LV-Control转染HSC3和CAL27细胞转染效率检测(200×)；

图8表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后CANX mRNA的表达降低，*p<0.05；

图9表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后Calnexin总蛋白显著降低，**p<0.01；

图10表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后细胞的增殖活性增强；

图11表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后细胞周期的变化，CANX-shRNA组停留在G0/G1期的细胞数减少，S期的细胞数增加；

图12表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后侵袭能力下降(20×)，(A)接种 1.5×10⁵OSCC细胞于Transwell小室，24h后固定，结晶紫染色，显微镜下观察穿过滤膜的细胞数，(B)计数 5个视野内慢病毒转染的HSC3和CAL27细胞数，CANX-shRNA组穿过滤膜的细胞数显著低于Control组，**p<0.01；

图13表示CANX-shRNA转染HSC3和CAL27细胞后细胞的迁移能力下降(20×)，(A)接种 1.0×105OSCC细胞于Transwell小室，24h后固定，结晶紫染色，显微镜下观察穿过滤膜的细胞数，(B)计数5个视野内穿过滤膜的HSC3和CAL27细胞数，CANX-shRNA组穿过滤膜的细胞数显著低于Control组，**p<0.01；

图14表示CANX-shRNA转染HSC3细胞在裸鼠体内成瘤能力的评价，(A)裸鼠皮下成瘤，肿瘤呈结节状生长；CANX-shRNA组肿瘤体积大于Control组，(B)肿瘤取出的大体观，测量肿瘤体积，(C)荷瘤鼠在观察期内的体重变化和肿瘤体积的变化，CANX-shRNA组肿瘤体积明显大于Control组，*p<0.05；

图15表示LV-CANX和LV-Control转染HSC6细胞转染效率检测(200×)；

图16表示CANX过表达质粒转染HS6细胞后CANX mRNA的表达升高，*p<0.05；

图17表示Western bolt检测CANX过表达质粒转染HSC6细胞Calnexin总蛋白的表达升高，CANX组的Calnexin表达显著高于对照组，*p<0.05；

图18表示Calnexin影响共培养体系中细胞因子IL-10、IL-2、TNF-α、IFN-γ的分泌变化。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

1.材料与方法

1.1 口腔鳞状细胞癌细胞系舌鳞状细胞癌HSC3细胞系，购买于日本JCRB(Japanese Collection of Research Bioresource,JCRB)；HSC-6细胞由美国牙科颅面研究所Gutkind JS教授赠予；舌鳞状细胞癌CAL27细胞系，购买于ATCC(American TypeCulture Collection,Manassas,USA)；舌鳞状细胞癌CAL33和正常口腔角化上皮细胞NOK由J.Silvio Gutkind(National Institute of Dental and Craniofacial Research,NIH,Bethesda,MD)教授赠予。

1.2 细胞培养试剂

DMEM高糖培养基，Keratinocyte-SFM(1X)培养基，胎牛血清(FBS)，PBS，胰蛋白酶(0.02％EDTA)：美国Gibco公司，DMSO：Sigma公司。

1.3 细胞培养及冻存

人口腔癌细胞系HSC3、HSC6、CAL27、CAL33使用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基并放入温度为37℃、5％CO2浓度的常规培养箱中培养；人正常口腔角化上皮细胞NOK使用Keratinocyte-SFM(1X)培养基，不加血清，放入温度为37℃、5％CO2浓度的常规培养箱中培养。当貼壁细胞达到80～90％融合度时，用0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化3～5分钟，镜下观察肿瘤细胞明显皱缩变小、细胞间隙增大，并有大部分细胞漂浮时即加入6倍完全培养基终止消化，并用吸管吹打使细胞从培养瓶壁上洗下。将消化液1000rpm,5min离心弃去上清，沉下的细胞用DMEM完全培养基重悬并按1:3～1:5比例分瓶传代，1～2天更换一次培养基。

细胞冻存：选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天换液。将培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25％胰蛋白酶消化。适时加入含血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，5分钟)。去上清液，逐滴加入预先配好的冻存液：50％FBS+40％DMEM+10％DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×10⁶～1×10⁷cell/mL之间。将上述细胞分装于冻存管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。将装好的细胞冻存管放入程序降温盒中-80℃冰箱过夜，次日转入液氮中。

细胞复苏：从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中1～2分钟，使细胞融化。70％酒精消毒冻存管口，用吸管吸取细胞悬液注入离心管中，再加入10倍体积的含10％FBS的DMEM培养液，1000rpm离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，并将悬液转移到25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。24小时后给细胞换液，每日在显微镜下观察细胞状态和生长情况。

1.4 病例入组标准

1.临床样本：取自中山大学附属口腔医院2012年-2013年原发性口腔癌患者。患者术前未行放疗、化疗以及其它干预治疗。8例患者中男5人，女3人，年龄范围43-70岁，平均年龄51岁；按发病部位分，其中舌癌6例，颊粘膜癌2例。肿瘤组织标本及配对癌旁组织标本经手术切除后于液氮中保存。所有配对的癌和癌旁组织均经病理科组织学确诊，诊断符合原发性口腔癌标准。

2.石蜡样本：本研究使用的74例OSCC石蜡标本来自于2007-2009年在中山大学附属口腔医院口腔颌面外科首次确诊为口腔鳞癌并实施了肿瘤外科切除术的患者，临床病理资料通过病理记录和组织病理报告获得。

3.临床病理资料的采集

临床病理资料包括OSCC患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤细胞分化程度、原发灶部位、肿瘤大小、淋巴转移、临床TNM分期、手术方式、放疗、化疗、手术时间等，此部分资料通过病历记录和组织病理报告获得。临床TNM分期依据AJCC(2010年第七版)头颈部肿瘤TNM分期划分。

4.术后随访

终点事件为患者总生存时间(Overall Survival，OS)，所有病理随访时间均大于五年，随访内容包括术后肿瘤有无进展，有无采取必要的治疗措施等，所有受试者均知情同意，并签署知情同意书。

1.5 总RNA的提取

(1)将待检测的肿瘤细胞用1500rpm离心5min收集肿瘤细胞，弃上清；加入1ml的Trizol，用振荡器震荡至无明显沉淀，室温静置5min；组织的总RNA提取:从液氮中取出50-100mg肿瘤组织或癌旁组织置于1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

(2)向样品中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，4℃、12000g离心15min，吸取上层水相至新Ep管。

(3)向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育10min，4℃、12000g离心10min，弃去上清液，可见乳白色沉淀。

(4)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，轻轻上下颠倒洗涤，4℃、7500g离心5min，弃去乙醇。

(5)空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入20uL RNase-Free处理水，充分溶解后通过紫外分光光度法检测波长在260nm及280nm的吸光光度值(OD260和OD280)。

1.6 RNA逆转录合成cDNA(按照Takara逆转录试剂盒操作说明)

(1)RT反应液配制(反应液在冰上进行配制)

(2)逆转录反应条件如下：

37℃15min(逆转录反应)

85℃5sec(逆转录酶的失活反应)

(3)将得到的RT反应液(cDNA)置于-20℃冰箱保存，用于下一步的PCR反应体系中。

1.7 荧光定量PCR反应

(1)PCR反应体系

(2)PCR扩增反应条件：

95℃5min；95℃10sec；60℃20sec；72℃20sec，35cycles；溶解曲线分析：95℃5sec；65℃1min；97℃；40℃10sec至冷却。

(3)琼脂糖凝胶电泳及图像分析

取上述PCR扩增产物各5μl加样于2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，其中一加样孔加入Marker I 5μl，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压90伏，电泳时间约40min，电泳结束后关闭电源，取出电泳胶，由于制胶时加入EB染色剂，此时在紫外线分析仪上可观察到清晰电泳条带，通过与Marker I上电泳条带的比较，可以判定CANX目的片段的大小，上述实验重复3次。

(4)结果与计算

各样品的目的基因和管家基因的CT值及浓度结果直接由机器自动生成。以内参GADPH为管家基因，使用△△CT方法计算各样本目的基因表达的变化倍数。

1.8 组织冰冻切片的免疫荧光检测

(1)将口腔癌组织切成大小合适的组织块，放在平面上用组织冰冻切片包埋剂进行包埋，迅速冷冻。

(2)切片温度调为-25℃，切片厚度约为5μm，用丙酮固定切片10min。

(3)将切片平铺于载玻片上，放在抽湿机旁室温干燥30min。PBS漂洗两遍后10％山羊血清封闭1h。

(4)不用PBS漂洗，每张组织切片上滴加兔抗人Calnexin单克隆抗体100μl(1:50稀释)，4℃孵育过夜。

(5)PBS洗3次，每次5min，洗去未结合的荧光抗体；dylight549山羊抗兔荧光二抗常温避光孵育1h，麦胚凝集素5ug/ml避光孵育10分钟，DAPI染核5分钟，PBS洗3次后用甘油缓冲液封片。

(6)置荧光显微镜下观察。

1.9 ELISA法检测细胞培养上清中IL-10、IL-2、TNF-α、IFN-浓度

收集上述增殖实验中各组细胞的培养上清，用ELISA法检测分泌的细胞因子的浓度。具体操作方法严格按照产品说明书操作。

1)使用双抗夹心ELISA检测细胞上清中的细胞因子含量。IL-10、IL-2、TNF-α、IFN-γ已预包被在6孔酶联检测板；

2)加入检测的细胞上清或细胞培养基对照；加入稀释后的检测抗体，室温孵育1～3小时(按照厂家说明书)；

3)取出96孔板，弃上清，wash buffer洗板3次，每次5分钟；

4)加入1:50稀释的Avdin-HRP，室温孵育20min。

5)取出96孔板，弃上清，wash buffer洗板3次，每次5分钟；

6)加入底物液，室温孵育5～10分钟后加入终止液，使用紫外-可见分光光度计在450nm波长检测光吸收值。

1.10 统计学分析：

采用SPSS20.0软件进行如下统计学处理：定量资料均服从正态分布，独立组间t检验，对病例资料进行统计描述。以OS为终点事件进行分别进行单因素Kaplan-Merier生存分析，并进行Log-rank检验。将单因素分析对预后有统计学意义的因素纳入多因素COX比例风险模型进行多因素分析。单因素及多因素分析时，均以p＝0.05作为显著性检验水准。

2.结论

2.1 Calnexin在口腔鳞状细胞癌细胞中的表达升高

本实施例应用RT-PCR对四种口腔鳞状细胞癌细胞系(HSC3、HSC6、CAL27、CAL33)和口腔正常角化上皮细胞(NOK)进行CANX的mRNA检测，结果发现CANX基因在四种口腔癌细胞系中的表达均高于口腔正常角化上皮细胞(NOK)(图1)。CAL33细胞系的CANX表达水平明显高于其它3个OSCC细胞系。

此外，本研究还应用Western blot方法检测了上述4个OSCC细胞系和NOK细胞的Calnexin总蛋白水平的表达，发现4个OSCC细胞系的Calnexin总蛋白水平相比口腔正常角化细胞明显升高(图2)。

2.2 Calnexin在口腔鳞状细胞癌组织中的表达升高

我们选取8对OSCC患者的肿瘤标本，用RT-PCR的方法检测了CANX mRNA的表达，结果发现：8例肿瘤标本中，有4例肿瘤组织的CANX mRNA的表达水平明显高于其癌旁正常组织(图3)。同时，应用Western blot检测Calnexin蛋白在OSCC组织中的表达，发现8例肿瘤样本中，有5例Calnexin蛋白表达水平高于癌旁组织(图4)。

2.3 Calnexin在OSCC组织中的表达特征

Calnexin免疫染色阳性物质为呈棕黄色颗粒，位于细胞膜或细胞浆内，染色阳性的细胞广泛分布于肿瘤上皮，偶见散在分布周围间质中，不同病例的石蜡组织切片中Calnexin的免疫染色强度和阳性细胞的比例分布不一，正常口腔上皮中Calnexin表达较弱或不表达(如图5)。免疫荧光结果显示：Calnexin在正常上皮内几乎不表达，在上皮下固有层的结缔组织中少部分表达，而在肿瘤组织内高表达；Calnexin主要位于肿瘤细胞胞浆内，有部分定位于细胞膜，如图6。

2.4 成功构建稳定敲除CANX的HSC3和CAL27细胞

慢病毒转染HSC3和CAL27细胞后7天，利用荧光显微镜观察慢病毒载体中GFP的表达情况，结果如图7所示：CANX-shRNA和对照组转染后细胞有90％出现绿色荧光。

收集转染的HSC3和CAL27细胞，应用RT-PCR检测CANX mRNA的表达情况，结果发现与空白对照组相比，阴性对照组CANX mRNA的表达未见明显异常，而RNA干扰组CANX的mRNA表达明显降低(图8)。应用Western blot检测Calnexin蛋白的表达情况，结果发现空白对照组与阴性对照组Calnexin蛋白的表达未见明显差异，而RNA干扰组Calnexin蛋白表达明显降低(图9)。

2.5 CANX基因沉默可促进HSC3和CAL27细胞的增殖活性

本研究应用CCK8法检测沉默CANX基因后HSC3和CAL27细胞的增殖活性，结果发现：接种24h后，HSC3细胞的CANX-shRNA和Control组的增殖活性无明显差异；24h后，CANX-shRNA组细胞的增殖逐渐高于Control组，到72和96h时CANX-shRNA组细胞的增殖数显著高于Control组，两组相比有显著性差异(72h：p＝0.039；96h：p＝0.021)。CAL27细胞接种24h和48h时CANX-shRNA和Control组无显著性差异；72h时CANX-shRNA组略高于Control组；96h时CANX-shRNA组的细胞增殖活性明显高于Control组(p＝0.0387)(图10)。

2.6 流式细胞仪分析CANX基因沉默后HSC3和CAL27细胞的增殖周期

为了进一步研究Calnexin对肿瘤细胞增殖的影响，本研究通过流式细胞仪检测了HSC3和CAL27细胞CANX-shRNA和Control组细胞周期的变化，发现CANX-shRNA组处于G0/G1期的细胞比例低于Control组(HSC3细胞Control组70.24±1.1％，CANX-shRNA组33.64±0.7％，p＝0.0332；CAL27细胞Control组70.41±1.3％，CANX-shRNA组39.95±1.2％，p＝0.0379)；CANX-shRNA组处于S期的细胞百分比明显高于Control组(HSC3细胞Control组20.83±1.4％，CANX-shRNA组54.44±1.2％，p＝0.0375；CAL27细胞Control组23.42±1.3％，CANX-shRNA组49.85±1.0％，p＝0.0391)，说明干扰组的细胞相比对照组处于更加旺盛的增殖状态(图11)，而Calnexin可能是通过调控细胞周期的变化影响肿瘤细胞的增殖。

2.7 CANX基因沉默抑制HSC3和CAL27细胞的侵袭和迁移能力

为了研究Calnexin对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响，本研究将慢病毒转染的HSC3和CAL27细胞进行了Tanswell小室侵袭和迁移实验，结果发现：两种OSCC细胞株的侵袭性和迁移能力明显降低，与对照组相比细胞穿过滤膜的数量显著减少，统计学上有显著性差异(侵袭实验:HSC3p＝0.00614，CAL27p＝0.00857；迁移实验：HSC3p＝0.00596，CAL27p＝0.00926)(图12，图13)。

2.8 裸鼠皮下移植瘤形成，CANX基因沉默后HSC3细胞体内成瘤体积显著增加

为了探讨靶向沉默CANX基因对HSC3细胞体内成瘤能力的影响，本研究将LV-CANX-shRNA和LV-Control转染的HSC3细胞接种于裸鼠皮下，观察肿瘤细胞在裸鼠体内的生长情况。瘤细胞注射后，局部出现小皮丘，1～2天消失，然后逐渐形成肿瘤硬结。瘤持续生长，开始呈圆形或者椭圆形，后来可呈结节状，大约在7～10天，裸鼠皮下形成的肿块直径可达3～5mm大小。每3天测量裸鼠体重和肿瘤大小，结果显示CANX-shRNA组肿瘤体积增长较快，从第13天开始至第28天，CANX-shRNA组肿瘤体积显著大于Control组(p<0.05)(图14)。

2.9 成功构建稳定过表达CANX的HSC6细胞

慢病毒转染HSC6细胞后7天，利用荧光显微镜观察慢病毒载体中GFP的表达情况，结果如图15所示：CANX过表达组和Control组转染后细胞有90％出现绿色荧光。收集转染的HSC6细胞，应用RT-PCR检测CANX mRNA的表达情况，结果表明：阴性对照组CANX mRNA的表达与空白对照组基本一致，而CANX过表达组的mRNA表达升高(图16)。应用Western blot检测CANX蛋白的表达水平，发现Calnexin总蛋白水平在CANX组显著升高(图17)。

2.10 Calnexin作用于T细胞后，培养上清中细胞因子IL-10、IL-2、TNF-α和IFN-γ 表达明显变化

将辐照后的过表达CANX的稳定转染细胞株HSC6-CANX或对照组HSC6-Control细胞与CD3+T共培养72h，使用ELISA法检测前述共培养体系中，细胞培养上清细胞因子IL-10、IL-2、TNF-α、IFN-γ24、48和72h的分泌情况，结果发现：IL-2在24h分泌最高，然后很快下降，到72h最低；24h时，对照组显著高于CANX组(p＝0.013)。对照组IL-10的分泌在各时间段均高于CANX组，在48h和72h差异最明显(p＝0.024)，两组IL-10的分泌均随时间推移而逐渐下降。IFN-γ在两组24h分泌最低，48h最高，到72h逐渐下降，在48h和72h CANX组IFN-γ的分泌明显低于对照组(48h p＝0.025，72h p＝0.031)。TNF-α的分泌在24h时两组接近，然后CANX组呈显著下降的趋势，72h最低；对照组在48小时最低，然后逐渐上升，72h最高；72h时对照组TNF-α的分泌显著高于CANX组(p＝0.017)(图18)。

IL-2是辅助性T细胞Th1分泌的主要细胞因子，可以促进T细胞的增殖与分化。本研究结果发现IL-2在24h时对照组显著高于CANX组，说明对照组Th1细胞的增殖比CANX组更明显。IL-10是由Th2细胞克隆分泌，能够抑制Th1细胞克隆IL-2和IFN-γ的合成。在24、48和72h IL-10的分泌对照组均高于实验组，说明Calnexin可能也具有抑制Th2细胞克隆活化，减少负性免疫细胞增殖的功能。IFN-γ由免疫系统中的T细胞和NK细胞产生的，TNFα由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，二者均参与肿瘤的免疫过程。在共培养体系中检测到较高浓度的TNF-α和IFN-γ说明T细胞在与肿瘤细胞接触的过程中发挥了杀伤肿瘤细胞的作用，由于本实验的T细胞未经肿瘤抗原免疫，故推测这种杀伤作用属于非特异性杀伤。此外，CANX组TNF-α和IFN-γ的分泌均显著低于对照组，反映了在此共培养体系中CANX组产生的促进T细胞活化和杀伤因子较少，T细胞的活化处于抑制的状态。

小结：Calnexin在OSCC系和癌组织中的mRNA水平和蛋白水平均高于正常角化上皮细胞和正常的癌旁组织；癌组织中的Calnexin主要定位于肿瘤细胞胞浆内，少部分表达于胞膜上；口腔肿瘤上皮中Calnexin总蛋白及膜蛋白均高表达；在体内、外研究中，沉默CANX基因促进了OSCC细胞的增殖，沉默CANX基因可抑制OSCC细胞的侵袭和转移能力；荧光显微镜、Real-Time PCR和Western blot检测证明成功构建稳定沉默CANX基因的OSCC细胞株HSC3-CANX-shRNA、CAL27-CANX-shRNA和阴性对照细胞株HSC3-Control、CAL27-Control，检测空白对照组与阴性对照组CANX mRNA和蛋白的表达未见明显差异，而RNA干扰组CANXmRNA和蛋白表达明显降低(p<0.01)；CCK8肿瘤细胞增殖实验结果显示：与对照组细胞相比，沉默CANX基因可增强口腔癌细胞体外增殖能力，CANX-shRNA组细胞在96h时与Control组相比有显著差异(p<0.05)；细胞周期结果表明：沉默CANX基因的肿瘤细胞停留于G0/G1期的细胞比例减少(p<0.05)；而位于S期的细胞比例增加(p<0.05)；侵袭实验和迁移实验表明，与对照组相比较，沉默CANX基因抑制了口腔癌细胞体外侵袭和迁移的能力，与对照组相比，CANX-shRNA组细胞穿过滤膜的数量显著减少(p<0.01)；裸鼠皮下成瘤实验和裸鼠舌部原位移植瘤转移实验表明：沉默CANX基因可促进肿瘤生长，抑制肿瘤转移。与对照组相比较，沉默口腔癌细胞CANX基因使裸鼠体内成瘤体积明显增大(p<0.05)，但是口腔癌细胞在裸鼠体内的转移能力下降；外源性重组及内源性肿瘤细胞表达Calnexin蛋白在体外可以抑制细胞因子IL-10、IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.钙联蛋白在筛选用于诊断或治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤相关疾病为头颈鳞癌、黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤相关疾病为头颈鳞癌。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过降低钙联蛋白水平、阻滞钙联蛋白的受体或阻断钙联蛋白的下游信号来治疗肿瘤相关疾病。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物通过降低钙联蛋白水平、阻滞钙联蛋白的受体或阻断钙联蛋白的下游信号而促进T细胞增殖来治疗肿瘤相关疾病。

6.钙联蛋白抑制剂、钙联蛋白的受体阻滞药或钙联蛋白的下游信号拮抗药在制备用于治疗肿瘤相关疾病的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述钙联蛋白抑制剂为钙联蛋白抗体。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，钙联蛋白的下游信号拮抗药为细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γ。