CN103920150B

CN103920150B - Satb1在治疗皮肤t细胞淋巴瘤中的应用

Info

Publication number: CN103920150B
Application number: CN201410156173.2A
Authority: CN
Inventors: 汪旸; 涂平; 张高磊
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-04-17
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-04-17
Also published as: CN103920150A

Abstract

本发明公开了一种SATB1在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用。本发明公开了将如下任一物质作为靶点的产品在制备预防和/或治疗皮肤T细胞淋巴瘤的药物中的应用：（1）SEQ？ID？No.1所示的蛋白；（2）SEQ？ID？No.2所示的DNA分子；（3）SEQ？ID？No.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。SATB1蛋白特异性的表达于皮肤T细胞淋巴瘤皮损中CD30+的肿瘤性T细胞中，并发现SATB1蛋白的表达增高可以通过促进细胞周期进展而在皮肤T细胞淋巴瘤的发病和进展中起到重要的作用，SATB1作为靶点在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中具有广泛的应用前景。

Description

SATB1在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其基因作为靶点在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用；特别是涉及SATB1在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

皮肤T细胞淋巴瘤（CutaneousT-celllymphoma,CTCL）是结外非何杰金淋巴瘤（Extra-nodalNon-Hodgkin’slymphoma,NHL）的一种，是原发于皮肤的由皮肤归巢的T淋巴细胞克隆性增生造成的疾病，由一组临床表现、病程预后、治疗方法各异的疾病组成。其中蕈样肉芽肿（MycosisFungoides，MF）和原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病（CD30+cutaneouslymphoproliferativedisease,CD30+CLPD）是最常见的类型，两者发病率占到CTCL的80%以上。CD30+CLPD是表达CD30的T淋巴细胞在皮肤中克隆性增生导致的疾病，包括临床表现惰性的淋巴瘤样丘疹病（Lymphomatoidpapulosis，LyP），恶性的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（cutaneousanaplasticlargecelllymphoma,PCALCL），以及两者的中间类型。随着人们对这一类疾病认识的不断提高，皮肤T细胞淋巴瘤的发病率近年来快速增长。LyP的皮疹表现为伴坏死的的丘疹、结节，皮疹反复发作，可以自行消退，一般不需系统治疗；但约10-20%的LyP患者反复迁延多年后会出现持续增长的斑块和肿瘤，而进展到c-ALCL等侵袭性皮肤T细胞淋巴瘤。侵袭性的c-ALCL对常规化疗抵抗，其中20%的患者会出现系统侵犯并导致死亡。虽然MF不属于CD30+CLPD，但是MF中仍然会出现CD30+的异型T细胞，尤其在MF大细胞转化(Mycosisfungoideslargecelltransformation,MF-LCT)中，MF-LCT组织病理表现为细胞明显异型并有CD30+T淋巴瘤细胞出现，病情进展迅速，预后差。

LyP、PCALCL和MF起源于单个T淋巴细胞的优势克隆，LyP能够进展到PCALCL或MF已经得到证实。然而皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的恶性肿瘤细胞的发生发展机制仍然不清楚。既往关于这方面的研究主要集中于TGF-β受体的突变及CD30信号通路的改变。研究发现，与LyP相比，部分PCALCL细胞表面的TGF-β受体发生突变，从而摆脱了由CD30+T细胞自身分泌的TGF-β对细胞生长的负性调节及凋亡诱导，使细胞出现凋亡抵抗，进而出现不受控制的肿瘤性增生。但后来人们发现，只有一少部分PCALCL患者的TGF-β受体出现突变，故而其并不是导致凋亡抵抗的主要原因。又有研究显示：在对PCALCL细胞系的体外研究中观察到，PCALCL细胞的CD30受体激活以后，细胞出现增殖增加及凋亡抵抗。故而提出LyP及PCALCL细胞中CD30下游不同通路的激活可能导致疾病的不同临床表现及进展。但尚无研究表明LyP的皮损中有相应的细胞通路激活的证据。

SATB1（specialAT-richbindingprotein1,特异性AT富集区结合蛋白1）是一种组织特异性的核基质结合蛋白，主要表达于T细胞的前体——胸腺细胞上。SATB1以特殊的笼状结构分布于细胞核骨架，通过与DNA的特殊区域相结合而调控染色质的高级结构，同时参与染色体重塑、组蛋白乙酰化、甲基化等过程，从而调控多种组织特异性基因的表达。SATB1在T细胞的正常发育中起到至关重要的作用。SATB1基因敲除小鼠的胸腺细胞发育停滞在CD4+CD8+双阳性细胞阶段，而不产生CD4+或CD8+单阳性的成熟T细胞。SATB1在成熟的外周T细胞分化中的作用近年来成为研究热点。研究发现SATB1高表达于活化的CD4+T细胞，而在无反应CD4+T细胞及调节性T细胞中不表达。

SATB1在外周成熟T细胞及T细胞肿瘤中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种SATB1在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中的应用，本发明提供的SATB1蛋白特异性的高表达于皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T淋巴细胞上，且其表达随着疾病进展而增加。此外，SATB1蛋白的高表达对于维持肿瘤细胞的恶性生物学表型及疾病进展起到重要作用，抑制该基因的表达可以降低CD30+CLPD细胞系（如Mac－1）的生存率以及体外克隆形成能力、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。

将如下任一物质作为靶点的产品在制备预防和/或治疗皮肤T细胞淋巴瘤的药物中的应用：

（1）SEQIDNo.1所示的蛋白；

（2）SEQIDNo.2所示的DNA分子；

（3）SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。

所述皮肤T细胞淋巴瘤中具有CD30+的肿瘤性T细胞。

将如下任一物质作为靶点的产品在制备抑制皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞生长和/或增殖的药物中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）SEQIDNo.1所示的蛋白；

（2）SEQIDNo.2所示的DNA分子；

将如下任一物质作为靶点的产品在制备降低皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞肿瘤形成能力的药物中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）SEQIDNo.1所示的蛋白；

（2）SEQIDNo.2所示的DNA分子；

将如下任一物质作为靶点的产品在制备促进皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞凋亡的药物中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）SEQIDNo.1所示的蛋白；

（2）SEQIDNo.2所示的DNA分子；

如下任一物质作为诊断标记在制备检测皮肤T细胞淋巴瘤和/或其中CD30+的肿瘤性T细胞的药物或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）SEQIDNo.1所示的蛋白；

（2）SEQIDNo.2所示的DNA分子；

上述任一所述的应用中，所述皮肤T细胞淋巴瘤为蕈样肉芽肿或原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病。

所述蕈样肉芽肿为MF大细胞转化；

所述原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病为淋巴瘤样丘疹病或原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或两者的中间类型。

上述任一所述的应用中，所述皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞为淋巴瘤样丘疹病细胞外周血中的异型淋巴细胞或从淋巴瘤样丘疹病发展到原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤中的细胞；

具体为Mac-1、Mac-2A和Mac-2B细胞。

上述任一所述的应用中，所述产品为具有抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质,具体为SEQIDNo.1所示的蛋白的抗体。

上述任一所述的应用中，所述产品为具有抑制SEQIDNo.2所示的DNA分子和/或SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质；

所述物质具体为如下（1）-（4）任一所述的DNA分子：

（1）SEQIDNo.8所示的DNA分子；

（2）SEQIDNo.9所示的DNA分子；

（3）SEQIDNo.10所示的DNA分子；

（4）SEQIDNo.11所示的DNA分子。

如下（1）-（4）任一所述的DNA分子也属于本发明的保护范围：

（1）SEQIDNo.8所示的DNA分子；

（2）SEQIDNo.9所示的DNA分子；

（3）SEQIDNo.10所示的DNA分子；

（4）SEQIDNo.11所示的DNA分子。

SATB1作为靶点在治疗皮肤T细胞淋巴瘤中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为免疫组织化学染色（A）和组织免疫荧光双染（B）结果。

图2为流式细胞仪检测CD30和SATB1的表达。

图3为组织免疫荧光双染检测CD30和SATB1。

图4为Mac1、Mac2A、Ma2B、Hut78及Jurkat中SATB1mRNA（A）和SATB1蛋白（B）的表达。

图5为CD30+CLPD进展不同的标本中SATB1mRNA的表达。

图6为GV118慢病毒载体。

图7为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1-sh3和Mac1-sh4中SATB1mRNA（A）和SATB1蛋白（B）的表达。

图8为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞系在96小时内的增殖。

图9为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞培养7天后形成的细胞群落数以及形态。

图10为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞的细胞周期检测。

图11为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞的凋亡检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的统计学分析：

用SPASS11.0软件，计量资料采用均数±标准差表示。细胞mRNA的表达，细胞的生存率分析以及细胞凋亡采用计量资料，多个样本的均数比较采用单向方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

下述实施例中患者标本及对照标本：

下述实验遵循《赫尔辛基宣言》得到了北京大学第一医院伦理委员会批准，所有患者及正常对照均签署了知情同意书。实验从2002年到2014年在北京大学第一医院皮肤科收集50例CTCL包括6例MF-LCT（MF大细胞转化）、25例LyP（淋巴瘤样丘疹病）和19例PCALCL（原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤）石蜡标本（其中4例LyP和9例PCALCL石蜡组织切片由美国波士顿医学院罗格威廉姆斯医学中心的皮肤科MarshallE.Kadin教授提供；6例LyP石蜡组织切片由四川大学华西医学中心皮肤科教授王琳提供），以及25例皮肤良性炎性疾病标本和10例非大细胞转化的MF标本（此处指斑块期MF(plaquestageMF)、肿瘤期MF(tumorstageMF)标本，其中不含有表达CD30+的肿瘤性T细胞）作为对照，25例皮肤良性炎性疾病标本包括5例扁平苔藓、3例湿疹、4银屑病、5例特应性皮炎、5传染性软疣和3例嗜酸细胞增多性皮病；4例正常人外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）及初始T细胞（NaiveT细胞）作为细胞实验对照。所有炎症性皮肤病对照标本、LyP-A、LyP-C、PCALCL+、PCALCL-临床标本得到3位皮肤病理学专家最终诊断；CTCL病例的临床和病理诊断，根据最新的国际皮肤淋巴瘤协会（ISCL）、欧洲癌症研究和治疗组织（EORTC）以及美国皮肤淋巴瘤联盟（USCLC）推荐的最新修订标准。

鼠抗人SATB1单克隆抗体购自BDBioscience公司，货号为611182。

羊抗鼠生物素二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为SP2000。

辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

羊抗鼠/兔荧光二抗购自Invitrogen。

细胞系Hut-78和Jurkat购自美国ATCC。

细胞系Mac-1、Mac-2A和Mac-2B在文献“Davis,T.H.,etal.(1992)."Hodgkin'sdisease,lymphomatoidpapulosis,andcutaneousT-celllymphomaderivedfromacommonT-cellclone."NEnglJMed，326(17):1115-1122.”中公开过，公众可从北京大学第一医院获得。

PowerGreenPCRMasterMix试剂盒购自LifeTechnology公司，产品目录号为4368577。

pGC-LV载体、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体在文献“You,W.,etal.(2013).ConstructionoflentiviralvectorcontainingHomosapiensforkheadboxC2geneanditsexpressioninbonemarrowmesenchymalstemcellsofrabbits.ZhongguoXiuFuChongJianWaiKeZaZhi27(5):535-540.”中公开过,公众可从北京大学第一医院获得。

MethoCultCFC培养基购自StemCellTechnologies，货号为H4230。

SATB1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

SATB1的基因序列如SEQIDNo.2所示，编码区为SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位所示。

实施例1、SATB1在皮肤T细胞淋巴瘤CD30+的肿瘤性T细胞中特异性高表达

一、免疫组织化学染色

将MF大细胞转化（MF－LCT）、淋巴瘤样丘疹病（LyP）、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（PCALCL）石蜡标本进行免疫组织化学染色，步骤如下：

（一）标本石蜡包埋，制成5μm的切片，常规脱蜡入水，顺次放入二甲苯I、II各10分钟，无水乙醇I、II，体积百分含量95％的乙醇水溶液I、II，体积百分含量80％的乙醇水溶液各5分钟，蒸馏水充分水化3-5分钟，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次5分钟。

（二）抗原修复：将组织切片放入0.01mol的枸橼酸钠缓冲液中在微波炉中高火加热至沸腾后，换至中火加热10min，拿出静置冷却至室温。

（三）每张切片滴加1滴3%过氧化氢阻断溶液，室温下孵育10-15分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性。用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次5分钟。

(四)除去PBS液，每张切片滴加正常山羊血清遮盖组织，室温下孵育15-20分钟，以封闭非特异性抗原。

（五）除去血清，每张切片滴加一抗（鼠抗人SATB1单克隆抗体），4℃过夜。阴性对照（皮肤良性炎性疾病标本和非大细胞转化的MF标本（斑块期MF(plaquestageMF)、肿瘤期MF(tumorstageMF)标本，其中不含有CD30+的肿瘤性T细胞））使用PBS代替一抗。

（六）用PBS（pH7.4）冲洗2次，每次5分钟。除去血清，每张切片滴加1滴羊抗鼠生物素二抗，室温下孵育20分钟。用PBS冲洗3次，每次3-5分钟。

（七）除去PBS液，每张切片滴加1滴辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温下孵育20分钟。用PBS（pH7.4）冲洗2次，每次3-5分钟。

（八）除去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜观察显色5-10分钟。

（九）自来水冲洗，苏木素复染3-5分钟，1%盐酸酒精分化1分钟。

（十）切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

MF大细胞转化（MF－LCT）、淋巴瘤样丘疹病（LyP）、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（PCALCL）中的细胞以具有CD30+的肿瘤性T细胞为特点。

MF大细胞转化（MF－LCT）、淋巴瘤样丘疹病（LyP）、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（PCALCL）石蜡标本经过上述免疫组织化学染色的结果如图1中A所示，染色结果见表1。

二、组织免疫荧光双染

（一）将标本制备成3.5μm的石蜡组织切片，并在70度烤片2小时。

（二）两个二甲苯各脱蜡15分钟。

（三）在体积百分含量分别为100%、95%、85%、70%乙醇的水溶液中各放置5分钟。

（四）PBS冲洗2次，每次3分钟。

（五）柠檬酸盐缓冲液95度修复25分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟。

（六）3%过氧化氢在室温下孵育15分钟，孵育时避光。PBS冲洗3次，每次3分钟。

（七）一抗（鼠抗人SATB1单克隆抗体）在4度下孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3分钟。

（八）羊抗鼠/兔荧光二抗(购自Invitrogen，Alexaflour488/595)在室温下孵育1小时，孵育时避光，PBS冲洗3次，每次3分钟。

（九）用含有DAPI的封片胶封片并盖上盖玻片，避光放置10分钟。

（十）使用Leica激光共聚焦显微镜，选取405/488/543激光观察相应指标在目的细胞着色情况。

LyP石蜡标本的组织免疫荧光双染实验结果如图1中B所示。

图1表明，SATB1高表达于CD30+的肿瘤性T细胞中。

SATB1蛋白在6例斑块期MF(plaquestageMF)、4例肿瘤期MF(tumorstageMF)、5例MF大细胞转化（MF－LCT）、23例淋巴瘤样丘疹病（LyP）、12例原发皮肤间变大细胞淋巴瘤（PCALCL）中的表达情况如表1所示。

其中23例LyP中有19例SATB1出现阳性表达，而且3例SATB1表达阴性的病例，CD30蛋白的表达也为阴性。12例PCALCL患者SATB1和CD30蛋白均为阳性表达。5例MF－LCT患者SATB1和CD30蛋白均为阳性表达。10例非大细胞转化的MF（6例斑块期MF(plaquestageMF)、4例肿瘤期MF(tumorstageMF)）其SATB1蛋白的表达均为阴性。

从以上结果可以看出SATB1蛋白的表达与CD30的表达高度相关。

同时，组织免疫荧光双染激光共聚焦显示SATB1和CD30蛋白共同表达于核大深染，胞浆丰富，明显异型的CD30+T淋巴瘤细胞包膜和细胞核上，两者高度一致的共定位，CD30+T淋巴瘤细胞旁边的组织细胞和反应性增生的炎细胞不表达SATB1。

综上所述，SATB1特异性的高表达于CD30+的肿瘤性T细胞中。

表1SATB1和CD30在CTCL中的表达统计

正常T淋巴细胞高表达CD30是T淋巴细胞活化的重要标志，T淋巴细胞活化后表现为细胞体积变大，细胞增殖基因表达增加和CD30促发的细胞凋亡等，整个过程属于良性反应性增生。

为了进一步证实SATB1仅仅在皮肤T细胞淋巴瘤中的CD30+肿瘤性T细胞过表达，同时也排除SATB1在CD30+肿瘤性T细胞和CD30+CLPD细胞系（如Mac－1，Mac－2A或Mac－2B）中过表达仅仅与细胞活化有关。使用CD3/CD28活化4例正常人的PBMC和NaiveT淋巴细胞作为对照，活化120小时后采用流式细胞术检测SATB1和CD4/30的表达情况。实验过程如下述步骤三和步骤四所示。

三、外周血单个核细胞（PBMC）的提取和CD4+NaiveT细胞的分离纯化

（一）采取10ml正常人的外周血置于EDTA抗凝的采血管（购自BD），将其与10mL无钙和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）混合均匀,缓缓加在15mLFicollpaqueplus（购自GE）上面。

（二）在室温下以400G/min，离心35分钟。

（三）小心移除上层的浅黄色血清。

（四）吸出Ficollpaqueplus与血清界面层的白膜，即为外周血单个核细胞，用体积百分含量2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）室温下以100G转速离心10分钟洗涤外周血单个核细胞两次，并计数。将得到的外周血单个核细胞一部分用体积百分含量10%DMSO+90%胎牛血清（FBS）-80度冻存，另一部分进行CD4+NaiveT细胞的分离纯化。

（五）用40μL试剂盒NaiveCD4+TCellIsolationKitII（购自MiltenyiBiotec公司）中的纯化缓冲液重悬PBMC，轻轻混匀。

（六）加入10μLNaiveCD4+TCellBiotin-antibodycocktail（购自MiltenyiBiotec公司），轻轻混匀。冰上孵育5min。

（七）加入30μL纯化缓冲液轻轻混匀。

（八）加入20μLNaiveCD4+TCellMicrobeadcocktailⅡ（购自MiltenyiBiotec公司）,轻轻混匀,冰上孵育10min。

（九）向磁珠中加入3ml纯化缓冲液（试剂盒NaiveCD4+TCellIsolationKitII中），洗涤磁珠，弃去缓冲液。

（十）加入400μL纯化缓冲液，轻轻混匀，得到悬液。

（十一）将准备好的磁柱固定在磁力架上，500μL悬液加入磁柱中，收集过滤液。

（十二）再加3ml纯化缓冲液到磁柱中，收集过滤液，与上一步的过滤液合并。

（十三）100g/min离心5分钟，弃上清，得沉淀，即为NaiveCD4+TCell。

（十四）2ml纯化缓冲液（试剂盒NaiveCD4+TCellIsolationKitII中）洗涤NaiveCD4+TCell两次，用于下述实验。

四、CD3抗体及CD28抗体诱导T细胞活化实验

CD3抗体可特异地识别T细胞表面的CD3分子，通过由T细胞表面的TCR-CD3复合物与APC表面MHC-Ⅱ类分子-抗原肽的结合，T淋巴细胞全面活化过程中不仅需要TCR/CD3复合物的第一信号，还需要CD28这一重要的第二信号来增强T细胞活化与增殖。

（一）将CD30+CLPD细胞系Mac－1、步骤三的正常人PBMC或步骤三分离的CD4+NaiveT细胞以1x10⁵细胞/mL的浓度悬浮于新鲜培养基中。

（二）将步骤（一）细胞加入包被了anti-CD3antibody和anti－CD28antibody（均购自BD）的24孔板中，每孔1mL，每个细胞设置两个副孔。

（三）每隔48小时换液，同时将1/3的上清液再次加到原培养板中。

24孔板在孵箱中孵育5天后，对每个孔中的CD4+NaiveT细胞和PBMC、以及未经活化的CD4+NaiveT细胞和PBMC进行流式检测CD4/30和SATB1的表达情况；结果以FlowJo8.0软件分析。

其中CD4，CD30和SATB1分别用购自BD公司的荧光抗体FITCMouseanti-CD4、PEMouseanti-CD30和Alexa647Mouseanti-SATB1进行标记。

结果如图2所示。

图2中，Mac-1代表CD30+CLPD细胞系Mac－1，Naive代表步骤三分离的CD4+NaiveT细胞，ActivatedNaive代表CD3/CD28活化的CD4+NaiveT细胞，PBMC代表步骤三分离的PBMC细胞，ActivatedPBMC代表CD3/CD28活化的PBMC细胞。

图2表明，活化的PBMC和CD4+NaiveT细胞高表达CD30；CD4+NaiveT细胞活化前后SATB1均低表达，表达量无明显变化；虽然PBMC活化后SATB1表达有所增加，但是明显低于Mac-1细胞。

除了使用CD3/CD28刺激正常人PBMC和CD4+NaiveT细胞作为对照外，同时选择三种与CD30+T淋巴细胞相关的良性炎症性皮肤病作为对照，包括传染性软疣、特应性皮炎和嗜酸细胞增多性皮病。这三种皮肤病组织中频繁出现CD30+T淋巴细胞21-23，检测这些CD30+肿瘤性T细胞是否高表达SATB1,以进一步验证SATB1仅仅在皮肤T细胞淋巴瘤的CD30+肿瘤性T细胞过表达。

组织免疫荧光双染实验同步骤二，结果如图3所示。

图3表明，散在细胞表达CD30，然而这些CD30（+）细胞SATB1低表达或无表达，两者表达呈分离状态。

以上结果表明正常淋巴细胞活化不能引起SATB1过表达。

因此，以上结果证实了在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中，SATB1特异性的高表达于CD30+的肿瘤性T细胞中。

实施例2、SATB1的表达随皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的进展而升高

下述细胞系的来源以及特性如表2所示。

表2所用细胞系的来源及特性

实施例中所用细胞培养采用RPMI1640液体培养基，加体积百分含量为10%的胎牛血清、100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，细胞在培养基中呈悬浮式生长，置入恒温37℃、湿润的5%CO₂细胞培养箱，根据细胞状态进行换液传代。

一、提取Hut78、Jurkat、Mac-1、Mac-2A和Mac-2B的总RNA并合成cDNA第一链。

二、实时荧光定量PCR

以步骤一得到的cDNA为模板，用针对SATB1基因的特异引物进行PCR扩增，产物为80bp至120bp。利用PowerGreenPCRMasterMix试剂盒，用SYBRGreen法进行PCR产物的实时荧光定量。同时扩增18s和GAPDH基因作为实时荧光定量PCR的内参。实时荧光定量PCR反应在ABIprism7500sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems)上进行。

实时荧光定量PCR反应体系：

其中上游引物：5’-GCAGGAAATGAAGCGTGCTAA-3’（SEQIDNo.3）

上游引物：5’-AGCTCGCACAACCATCCCT-3’（SEQIDNo.4）

实时荧光定量PCR反应条件：

实时荧光定量PCR解离曲线：

95℃15s

60℃1min

95℃15s

数据的收集及处理：

采用AppliedBiosystemsPrism7500系统自带软件进行实时分析读数，读取不同样本的Ct值。以18s和GAPDH的Ct值作为内参，以消除细胞数目不同的差别及cDNA的加样误差。每个样本分别重复2管，取均值为最终结果。根据ΔΔCt法计算得到样本中SATB1基因的拷贝数。

三、免疫印记

（一）提取Hut78、Jurkat、Mac-1、Mac-2A和Mac-2B的蛋白质并定量，具体步骤如下：

1、收集1x10⁷细胞，离心沉淀后在-80℃冷冻10分钟。

2、将100μL蛋白裂解液加入细胞沉淀中，吹打混匀。

3、在4℃振荡器上孵育1小时。

4、在4℃离心机上12000rpm离心10分钟。

5、收集上清液并保存在-70℃冰箱中。

6、利用Bio-rad蛋白质微分析法，以纯化的胎牛血清为标准品，对待测蛋白质在595nm处的吸光度进行分析并进行蛋白定量。

（二）蛋白电泳

1、利用NuPAGENovexBis-TrisMiniGels系统（InvitroGen，USA），取上述步骤（一）纯化的蛋白样品15μL加入NuPAGELDS上样缓冲液及NuPAGE蛋白还原剂，在70℃孵育10分钟，得到变性的蛋白样品。

2、将变性的蛋白样品加入NuPAGENovexBis-TrisMini4%-12%梯度预制胶中，200V稳压进行电泳。

（三）转膜

将切下浓缩胶的分离胶置于硝酸纤维素膜上，全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，条件为30V，1小时。

（四）抗体孵育及显像

1、将硝酸纤维素膜（NC膜）置于5g/100ml脱脂牛奶的TBST溶液中振荡1小时封闭非特异性抗原。

2、将鼠抗人SATB1单克隆抗体以1：1000比例加入含有5g/100mlBSA的TBST溶液中，振荡4℃过夜。

3、振荡清洗NC膜，并放置于以1:5000比例加入羊抗鼠二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）的TBST溶液中，室温下振荡1小时。

4、振荡清洗NC膜，并加入混合好的化学发光底物PierceECLWesternBlottingSubstrate（购自ThermoScientific），化学发光后在KodakX线片成像系统中显示成像。

同时以GAPDH作为内参。

LyP和PCALCL分别处于CD30+CLPD疾病谱系的两端。LyP-A型组织病理表现为大量炎性细胞背景下散在的CD30+T淋巴瘤细胞增生；LyP-C型组织病理表现为结节状或片状的CD30+T淋巴瘤细胞增生，CD30+T淋巴瘤细胞占比超过50%；PCALCL组织病理表现为弥漫的恶性T淋巴细胞增生，肿瘤细胞所占比例超过75%，总之CD30+T淋巴瘤细胞随皮肤CD30+淋巴细胞增生性疾病（CD30+cutaneouslymphoproliferativedisease,CD30+CLPD）进展恶性度和肿瘤细胞负荷均明显增加。

Mac1、Mac2A和Mac2B是三株从一例LyP进展为PCALCL患者的血液和皮损中分离获得的细胞系，其中Mac1细胞系来自于患者早期临床表现为LyP时，患者外周血中的异型淋巴细胞,Mac2A,Mac2B来自于患者从LyP进展到PCALCL时从患者皮肤的肿瘤性结节中分离得到的细胞系,通过步骤一、步骤二的实时荧光定量PCR和步骤三的免疫印迹检测了这三株细胞SATB1的mRNA和蛋白的表达情况，并与Hut78和Jurkat细胞系进行对比。

结果如图4所示。

图4中，A为Mac1、Mac2A、Mac2B、Hut78及Jurkat中SATB1mRNA的表达情况。

B的上排为Mac1、Mac2A、Mac2B、Hut78及Jurkat中SATB1蛋白的表达情况，下排为内参GAPDH蛋白表达情况。

图4表明，Mac1,Mac2A,Mac2B的SATB1的表达依次增高，提示SATB1的表达随着CTCL疾病进展而增加。

鉴于Mac1、Mac2A和Mac2B三株细胞系能够很好反映PCALCL进展过程中CD30+T淋巴瘤细胞生物学特征。为了进一步在临床标本中量化SATB1是否随CD30+CLPD进展表达有所增加，进一步检测了LyP-A型、LyP-C型和SATB1（＋）PCALCL临床标本的SATB1和CD30mRNA表达情况。由于CD30+CLPD中有大量反应性增生的炎性细胞以及上述三种病变中CD30和SATB1之间共定位的关系，为了更准确地反映SATB1是否随CD30+CLPD进展表达有所增加，使用CD30作为内参以消除肿瘤载量增加导致的SATB1表达增加。

SATB1mRNA的检测方法同步骤一和步骤二。

CD30mRNA的检测方法同步骤一和步骤二，其中

CD30引物分别为5’-CTGTGTCCCCTACCCAATCTGT-3’（SEQIDNo.5）和

5’-CCTCAAAGGTGGTGTCCTTCTC-3’（SEQIDNo.6）。

CD30＋LPD临床标本（LyP-A、LyP-C、PCALCL+，PCALCL-和MF-LCT）中SATB1和CD30的表达结果如图5所示。

图5中，PT:病人编号，*代表P<0.05，与LyP-A组相比。

图5表明，SATB1表达量从LyP-A→LyP-C→PCALCL明显增加。表明SATB1随CD30+CLPD进展表达逐步增高，这一结论与SATB1在Mac-1、Mac-2A和Mac-2B细胞表达趋势一致，进一步验证了SATB1随着CTCL疾病进展表达升高,这预示着SATB1可以作为皮肤T细胞淋巴瘤和/或其中CD30+的肿瘤性T细胞的诊断标记。

实施例3、SATB1的高表达促进皮肤T细胞淋巴瘤疾病恶性生物学表型

一、慢病毒载体

GV118慢病毒载体为克隆载体，其结构如图6所示。

图6中，GV118载体全长10307bp,HpaI,XhoI为多克隆位点。GFP作为荧光标记用于转染细胞的筛选。氨苄西林抗性基因可用于细胞克隆的筛选基因。

二、RNA干扰慢病毒载体的构建

（一）shRNA序列的设计：

针对SATB1基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计如下RNA（shRNA）序列干扰靶点序列：

shRNA0:

5’-GCGTTAACCGATTCGGTGCTACTCTATGCAAGAGATCGAGTAGCACCGAATCGCTCGAG-3’；（SEQIDNo.7）

shRNA1:

5’-GCGTTAACAGTCCTTAAACCAACAATAGCAAGAGTATTGTTGGTTTAAGGACTCTCGAG-3’；（SEQIDNo.8）

shRNA2:

5’-GCGTTAACAATGCTCTGAAGGACTTACGCAAGAGGTAAGTCCTTCAGAGCATTCTCGAG-3’；（SEQIDNo.9）

shRNA3:

5’-GCGTTAACACTGTCTTACGTGACAGATGCAAGAGATCTGTCACGTAAGACAGTCTCGAG-3’；（SEQIDNo.10）

shRNA4:

5’-GCGTTAACTTCCCAAGTACACCATCATGCAAGAGATGATGGTGTACTTGGGAACTCGAG-3’。（SEQIDNo.11）

其中shRNA0为对照片段，shRNA1-shRNA4为具有结合并降解SATB1mRNA功能的片段。

（二）双链DNAOligo和载体DNA片段的消化和准备

步骤（一）设计的5条shRNA序列以及GV118载体的多克隆位点的限制性内切酶位点均为HpaI和XhoI。

HpaI和XhoI分别双酶切shRNA0-shRNA4，分别得到基因片段；HpaI和XhoI双酶切GV118，得到载体大片段；将基因片段分别与载体大片段连接，得到重组质粒，分别命名为GV-SATB1-sh0、GV-SATB1-sh1，GV-SATB1-sh2、GV-SATB1-sh3、GV-SATB1-sh4。将重组质粒送测序，结果正确。

三、慢病毒的收获及其介导RNAi

（一）转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含体积百分含量为10%胎牛血清的培养基调整细胞密度为1.2x10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

（二）转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

（三）向一灭菌离心管中加入所制备的各重组质粒（GV-SATB1-sh0、GV-SATB1-sh1，GV-SATB1-sh2、GV-SATB1-sh3或GV-SATB1-sh4）10μg、pGC-LV载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg，按照Lipofectamine2000试剂盒（购自Invitrogen公司）的说明书进行转染，收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。

（四）于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片，得各病毒上清液。

（五）以0.45μm滤器过滤上清液。

（六）将各病毒上清液分别以体积比1:50,1:100的比例加入到培养在24孔板中的2×10⁵个/孔的Mac-1细胞悬液中。

（七）37℃培养箱中孵育24小时后，离心弃去上清，PBS冲洗2次，加入新鲜的培养基继续培养72小时。

分别得到转染GV-SATB1-sh1的Mac1-sh1、转染GV-SATB1-sh2的Mac1-sh2、转染GV-SATB1-sh3的Mac1-sh3、转染GV-SATB1-sh4的Mac1-sh4和转染GV-SATB1-sh0的Mac1-sh0细胞。

（八）收集未转染的Mac1、以及Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1-sh3、Mac1-sh4和Mac1-sh0细胞进行流式细胞学分析，通过GFP阳性细胞的比例检测转染效率，结果表明转染细胞成功，对转染成功的细胞进行如下检测：

1、采用实施例2中步骤一、二和步骤三的方法进行实时荧光定量PCR和免疫印记，检测Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1-sh3和Mac1-sh4中SATB1的mRNA和蛋白表达水平。

结果如图7所示。

图7中，A为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1-sh3和Mac1-sh4中SATB1mRNA的表达情况；B的上排为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1-sh3和Mac1-sh4中SATB1蛋白的表达情况，下排为内参GAPDH蛋白表达情况。

图7表明，通过RNAi介导的基因敲减，Mac1细胞中的SATB1无论是在mRNA水平还是蛋白水平表达显著降低。

2、细胞生存率分析

细胞生存率分析利用CellTiter96AQueousNon-RadioactiveCellProliferationAssay试剂盒（购自Promega公司），通过四氮唑比色法进行。该方法利用细胞对四唑盐的生物还原性，以及四唑盐的还原产物甲月替在特定波长的吸光性，来测量存活细胞的数量。

该试剂盒中主要试剂为一种新的四唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium,innersalt;MTS]。具体实验方法如下：

1）细胞计数并将Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞以2x10⁴个/毫升的浓度培养在6孔板中。把细胞放入孵箱内培养24小时、48小时、72小时以及96小时。

2）在每个时间点混匀细胞，取100μL细胞混悬液至96孔板中，每个细胞做2个复孔。

3）每孔中加入20μL预先配置好的MTS溶液，在37℃孵箱中孵育2小时。

4）96孔板在分光光度仪中测定其在490nm处的吸收峰值，并进行计算和统计学分析。

运用MTS检测Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞系在96小时内的增殖情况，以反映SATB1降低后对细胞增殖的影响。

结果如图8所示。

图8表明，Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞系的增殖与未转染的Mac1和转染对照片段的细胞系Mac1-sh0相比显著降低，在24小时时间段内，四株细胞均出现了微弱的生长，但是随着时间的延长Mac1、Mac1-sh0细胞系呈现指数级生长，而Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞系的增殖几乎处于停滞状态，在48、72以及96h时间段与Mac1、Mac1-sh0细胞系相比差异均具有统计学意义（P<0.05，ANOVA），SATB1的表达降低导致细胞增殖显著抑制。

3、细胞体外克隆形成能力的检测

运用甲基纤维素培养基（MethoCultCFC，H4230,购自StemCellTechnologies）分析细胞的体外克隆形成能力，甲基纤维素培养基允许单个细胞克隆原位增殖，形成单细胞克隆细胞群落，可确保细胞在最佳状态下生长。镜下计数10³个细胞/平皿。将细胞加入MethoCultCFC中并涡旋震荡。然后使用注射器和钝端针头将混合好的细胞接种到CFC半固体培养基中，37℃,5%CO₂孵育箱中培养14-16天，用倒置显微镜和栅格计数皿计数和评估集落类型。以上实验重复三次取平均值。

结果如图9所示。

图9中，A为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞培养14天后形成的细胞群落数；B为在倒置显微镜下观察到的Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞系形成细胞群落的形态，*代表P<0.05（与Mac1和Mac1-shO组相比）。

图9表明，接种于CFC半固体培养基14天后，与Mac1和Mac1-sh0细胞系相比，Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞系形成的细胞群落显著减少，并且细胞群落的直径明显缩小，Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞形成的群落数与Mac1和Mac1-sh0相比，差异有统计学意义（P<0.05，ANOVA），表明SATB1的表达降低导致细胞体外肿瘤形成能力显著降低。

4、细胞周期分析

采用PI细胞周期分析法对Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2所处的细胞周期阶段进行分析。PI为一种可以等量嵌入DNA的荧光染料。细胞在不同周期时DNA的总量不同，通过流式细胞仪测定到的PI的信号强度也不同。

为了证明细胞增殖的抑制是否由于细胞周期的停滞所引起，进行如下实验：

1）计数1x10⁶细胞，离心并将其重新混悬在0.3mL的PBS缓冲液中。

2）向细胞中逐滴加入0.7mL冰的无水乙醇以固定细胞，同时不断振荡混匀。

3）将细胞样本置冰1小时或者4℃过夜。

4）1000rpm离心5分钟以去除固定液，用冰的PBS缓冲液冲洗细胞两次。

5）将细胞重新溶于500μLPI溶液中，在室温下避光孵育60分钟。

6）加入3mLPBS缓冲液，室温下1000rpm离心5分钟。

7）将上清液小心移除，并将细胞重新混悬在500μLPBS中。

8）利用流式细胞仪PE/PI通道进行分析。

实验重复3次取平均值。

结果如图10所示。

图10中，A为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞的细胞周期分布示意图。B和C分别为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞在G1期和S期细胞的百分比，*代表P<0.05（与Mac1、Mac1-sh0相比）。

图10B表明，Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1、Mac1-sh0细胞中G1期的细胞所占的比例分别为78.74%、90.60%、37.61%、37.39%。Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞G1期的细胞比例与Mac1、Mac1-sh0细胞中G1期的细胞比例相比显著增高，差异有统计学意义（P<0.05，ANOVA）。

图10C表明，Mac1-sh1、Mac1-sh2、Mac1、Mac1-sh0细胞中S期的细胞所占的比例分别为22.0%、4.42%、57.48%、54.8%。Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞S期的细胞比例与Mac1、Mac1-sh0细胞中S期的细胞比例相比显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，ANOVA）。

以上结果表明SATB1的表达降低导致了细胞周期的显著停滞。

5、细胞凋亡分析

细胞的生长抑制除了细胞周期停滞的原因外，还可能是细胞自发性凋亡的增加所导致，为了检测SATB1的降低是否会导致细胞自发性凋亡的增加，进行细胞凋亡分析。

采用AnnexinV:PEApoptosisDetectionKitI试剂盒（购自BDPharmingen，USA）进行AnnexinV介导的细胞凋亡分析。AnnexinV能与一种细胞膜分子相结合，在凋亡细胞中这种膜分子外露并可以被识别和检测。该方法中耦合了PE的AnnexinV可以与凋亡细胞上的相关膜分子相结合，通过流式细胞技术检测到PE阳性的细胞群体即为凋亡细胞。同时，7-aminoactinomycinD（7-AAD）被用于死亡细胞的染色。具体实验方法如下：

1）分别计数5x10⁵Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞，以冷的PBS缓冲液清洗细胞两次；将细胞重新以1x10⁶细胞/mL的浓度悬浮在结合缓冲液中。

2）将100μL细胞悬浮液转移到5mL的培养管中。

3）每管中分别加入5μLPE耦合的AnnexinV以及5μL7-AAD。

4）轻轻混匀细胞并将细胞在室温下避光孵育15分钟。

5）每管中加入400μL结合缓冲液，在1小时内经流式细胞仪检测。

实验重复3次取平均值。

结果如图11所示。

图11中，A为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞的流式检测结果。

B为Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞的AnnexinV阳性细胞的比例，*代表P<0.05（与Mac1、Mac1-sh0相比）。

图11A表明，Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞AnnexinV阳性细胞的比例与Mac1、Mac1-sh0AnnexinV阳性细胞的比例相比明显增高，说明SATB1敲减的细胞出现了自发性凋亡。

图11B表明，Mac1、Mac1-sh0、Mac1-sh1和Mac1-sh2细胞的AnnexinV阳性细胞比例分别为6.8%、5.9%、47.63%和38.76%，Mac1-sh1、Mac1-sh2细胞AnnexinV阳性细胞比例与Mac1、Mac1-sh0中的AnnexinV阳性细胞比例相比明显增加，差异有统计学意义（P<0.05，ANOVA）。

因此，SATB1的表达降低导致细胞的自发性凋亡显著增加。

综上表明，SATB1的高表达在皮肤T细胞淋巴瘤的肿瘤恶性生物学表型中起到重要作用。

综上所述，SATB1蛋白特异性的高表达于皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T淋巴细胞上，且其表达随着疾病进展而增加。此外，SATB1蛋白的高表达对于维持肿瘤细胞的恶性生物学表型及疾病进展起到重要作用，抑制该基因的表达可以降低CD30+CLPD细胞系（如Mac－1）的生存率以及体外克隆形成能力、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。因此，SATB1可以作为皮肤T细胞淋巴瘤新的诊断标记和治疗靶点。

Claims

1.将如下任一物质作为靶点的产品在制备预防和/或治疗皮肤T细胞淋巴瘤的药物中的应用：

(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子；

所述产品为抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质；

或，所述产品为抑制SEQIDNo.2所示的DNA分子和/或SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质；

所述抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质或抑制SEQIDNo.2所示的DNA分子和/或SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质为如下(1)-(4)任一所述的DNA分子：

(1)SEQIDNo.8所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.9所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.10所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.11所示的DNA分子。

2.将如下任一物质作为靶点的产品在制备抑制皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞生长和/或增殖的药物中的应用：

(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

所述产品为抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质；

或，所述产品为抑制SEQIDNo.2所示的DNA分子和/或SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质；所述抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质或抑制SEQIDNo.2所示的DNA分子和/或SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子活性的物质为如下(1)-(4)任一所述的DNA分子：

(1)SEQIDNo.8所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.9所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.10所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.11所示的DNA分子。

3.将如下任一物质作为靶点的产品在制备降低皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞肿瘤形成能力的药物中的应用：

(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

所述产品为抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质；

(1)SEQIDNo.8所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.9所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.10所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.11所示的DNA分子。

4.将如下任一物质作为靶点的产品在制备促进皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞凋亡的药物中的应用：

(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

所述产品为抑制SEQIDNo.1所示的蛋白活性的物质；

(1)SEQIDNo.8所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.9所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.10所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.11所示的DNA分子。

5.如下任一物质作为诊断标记在制备检测皮肤T细胞淋巴瘤和/或其中CD30+的肿瘤性T细胞的药物或试剂盒中的应用：

(1)SEQIDNo.1所示的蛋白；

(2)SEQIDNo.2所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.2中自5’末端起第1736位至第4024位核苷酸所示的DNA分子。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述皮肤T细胞淋巴瘤为蕈样肉芽肿或原发皮肤CD30+T淋巴细胞增殖性疾病。

7.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述皮肤T细胞淋巴瘤中CD30+的肿瘤性T细胞为淋巴瘤样丘疹病细胞外周血中的异型淋巴细胞或从淋巴瘤样丘疹病发展到原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤中的细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述淋巴瘤样丘疹病细胞外周血中的异型淋巴细胞为Mac-1；

所述从淋巴瘤样丘疹病发展到原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤中的细胞为Mac-2A和Mac-2B细胞。

9.如下(1)-(4)任一所述的DNA分子：

(1)SEQIDNo.8所示的DNA分子；

(2)SEQIDNo.9所示的DNA分子；

(3)SEQIDNo.10所示的DNA分子；

(4)SEQIDNo.11所示的DNA分子。