CN108265008B

CN108265008B - 一株产漆酶的二年残孔菌

Info

Publication number: CN108265008B
Application number: CN201810145973.2A
Authority: CN
Inventors: 丁重阳; 李松; 赵丽婷; 王�锋; 李由然; 徐萌萌; 石贵阳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108265008A

Abstract

本发明公开了一株产漆酶的二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS‑4，属于生物技术领域。所述Abortiporus biennis LS‑4已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2017822。该菌株所产漆酶催化性能高，对多种染料脱色能力显著，且粗酶液单位酶活催化效率高，有利于漆酶在印染废水处理等领域的应用。

Description

一株产漆酶的二年残孔菌

技术领域

本发明涉及一株产漆酶的二年残孔菌(Abortiporus biennis)，属于生物技术领域。

背景技术

漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，最早是从漆树的分泌物中发现的。漆酶广泛存在于能有效降解木质素的白腐真菌中，它能通过单电子或多电子氧化催化许多底物，如多酚类、氨基酚类、芳香胺类与脂肪胺类等，基于漆酶的这一特性，它在造纸工业、废水处理、木材加工、生物修复、有机合成、生物传感等领域均具有广泛的应用前景。在工业废水中，往往有很大一部分是印染废水，对人类环境造成了极大的威胁。由于染料本身结构和组成的复杂性使得印染废水处理难度较大，通过漆酶高效环保的处理染料废水则成为一种有效手段。

漆酶主要存在于以担子菌和子囊菌为主的白腐真菌中，但这些真菌来源的漆酶在应用过程中还存在以下问题：(1)以真菌来生产天然漆酶时，存在生产效率低、催化条件受限、难以纯化等问题；(2)不同微生物来源的漆酶对不同结构类型染料的脱色作用具有特异性，即单种漆酶对不同类型染料的催化作用有强有弱，这为处理含有多种类型染料的废液也造成了一定困难；(3)目前分离得到的漆酶单位酶活对染料的脱色效率并不高，反应时间相对较长。因此，寻找催化效率高、作用范围广、成本低廉的优质酶源尤为重要。

二年残孔菌是隶属于残孔菌属的担子菌，国内外相关研究不多，但目前关于残孔菌发酵液中具体有效物质的研究如漆酶或其他木质素降解酶、利用残孔菌来进行染料高效脱色等研究均未得到展开。

发明内容

本发明的目的是提供一株产漆酶的二年残孔菌株。

本发明所述一株产漆酶的二年残孔菌株，其经分离筛选得到，为残孔菌属的一个新菌株，命名为Abortiporus biennis LS-4，已于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017822。

本发明所述Abortiporus biennis LS-4菌株，其菌丝体呈白色，气生菌丝旺盛，有明显的爬壁性，无色素分泌；生殖菌丝管状，透明，有明显的锁状联合。

本发明所述二年残孔菌株的分离筛选是通过对采集得到的样品进行消毒后，在有抗性的PDA培养基中进行反复纯化得到的。

本发明所述二年残孔菌株的鉴定是通过对其部分的18S rDNA序列进行BLAST比对和菌类分析，将该菌种鉴定为残孔菌属微生物，具体为一株二年残孔菌。

本发明中所述Abortiporus biennis LS-4的漆酶酶活测定是以ABTS为底物，在一定条件下与粗酶液反应，420nm下测定反应体系的吸光值，最终测得发酵第七天的漆酶酶活为28.8U/L，用考马斯亮蓝测蛋白的方法测得粗酶液蛋白含量为0.3mg/L。

在本发明的一种实施方式中，Abortiporus biennis LS-4的漆酶，粗酶液脱色实验结果显示酶液浓度仅为0.2U/mL即可对多类染料有良好的脱色效果，其中对靛蓝的脱色率在0.5h即达到98％，并逐渐稳定接近完全脱色。

本发明的优点：

本发明筛选得到一株具有高催化性能的残孔菌，其所产的漆酶脱色能力显著，粗酶液单位酶活催化效率高，具有良好的应用前景。本发明扩充了产漆酶的菌种库，也为寻找优质漆酶来源提供了更多的选择，有利于进一步提高漆酶的催化性能及其在印染废水等领域的深入应用。

生物材料保藏

二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4已于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017822，保藏地址为中国武汉市武汉大学。

附图说明

图1为温度-相对酶活曲线

图2为温度稳定性曲线

图3为pH-相对酶活曲线

图4为pH稳定性曲线

图5为金属离子对漆酶酶活的影

图6. 0.2U/mL二年残孔漆酶Lac对染料脱色效率结果

图7. 1U/mL二年残孔漆酶Lac对染料脱色效率结果

图8. 0.2U/mL变色栓菌漆酶对染料脱色效率结果

图9. 1U/mL变色栓菌漆酶对染料脱色结果

具体实施方式

实施例1菌株的筛选及酶活检测

1)菌株分离筛选：

将采集得到的菌株置于密封袋中，4℃保温箱中保存，回到实验室立即处理。

将采集得到的样品先用无菌水清洗3次，用75％的酒精进行表面消毒，然后用10％NaClO消毒10min，再用无菌水漂洗组织3-4次。

将上述处理好的组织用解剖刀切成0.5cm²的小块，将它们置于加了200μg/mL的氨苄，0.01％VB的PDA培养基(Potato DextroseAgar Medium)上，于25℃下培养约4-5天。待平板长出菌丝体，用接种环挑取菌丝，接种到另一PDA培养基上，如此反复纯化6次，将得到的菌种接到PDA斜面培养基上，待斜面覆盖满菌丝后，置于4℃保存。

2)形态学分析：采用PDA培养基、固体平板培养法培养菌株，光学显微镜对其进行形态学观察。

将残孔菌在PDA培养基上，25℃培养3天，菌落直径2-3cm，6-7天菌落铺满整个培养皿，培养基表面以接种块为中心，呈放射状的形成一层较厚白膜，菌落边缘不平整，中间较厚，边缘较薄，整个菌落丝状交织紧密。菌丝体呈白色，气生菌丝旺盛，有明显的爬壁性，无色素分泌；生殖菌丝管状、透明，有明显的锁状联合。

3)分子鉴定：采用18S rDNA鉴定。

分子学鉴定采用18S rDNA鉴定：取培养7天的菌丝体，用无菌蒸馏水清洗3遍，按常规提取DNA的方法操作，得到菌种DNA，引物采用18S rDNA菌种鉴定的通用引物，其序列如下：

正向引物为EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'

反向引物为EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'

PCR产物通过电泳检测并进一步的纯化、克隆、测序，得到18S rDNA碱基序列，通过在NCBI数据库中进行BLAST比对，我们发现Abortiporus biennis LS-4与已知残孔菌的ITS序列的相似性为99％；结合其形态学特征，确定它是一株真菌新种，将其归入残孔属(Abortiporus)，命名为Abortiporus biennis LS-4。

4)菌株培养(用于酶活测定)

一级种子培养基和二级发酵培养基(g·L^-1)：葡萄糖20，胰蛋白胨5，无氨基酵母(YNB)5，七水硫酸镁2，磷酸二氢钾3。

PDA固体培养基(g·L^-1)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉20。

从所保藏的长有菌种的斜面培养基上挑取1cm²大小的菌丝体接入一级种子培养基中，25℃，150rpm条件下培养4天。以10％的接种量将种子液接入二级发酵培养基中，相同条件培养7天，取发酵液上清作为粗酶液测定漆酶酶活。

5)漆酶酶活测定：以ABTS为底物，在1mL反应体系中包含：0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5)880μL，终浓度为1mmol·L^-1的ABTS 100μL，经适当稀释的粗酶液20μL(控制最终吸光值在0.2-0.8)，在40℃下反应5min后，420nm下测定吸光值(以热灭活的酶液为空白对照)。在上述反应条件和反应体系下，每分钟氧化1μmolABTS底物所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)，最终测得培养7天的发酵液上清漆酶酶活力为28.8U/L。

实施例2漆酶酶学性质的研究

1)最适反应温度及稳定性

将酶液分别在20-70℃下(10℃递增)保温5min，测定酶活后以活性最高组为100％，得到相对酶活与温度的关系，结果如图1，该漆酶的最适反应温度在40℃附近。

将酶液加入至pH5.0，0.1M的乙酸钠缓冲液中，在20-70℃的条件下保温1h，40℃下检测漆酶酶活，计算剩余漆酶的活性，以原始漆酶活力为100％，得到漆酶温度稳定性-相对酶活曲线，结果如图2，在20-50℃条件下漆酶的活力损失较小，温度继续提高后酶活力急剧下降。

2)最适反应pH及稳定性

分别配置pH 2.0-10.0(1.0递增)的反应缓冲液(0.1M)，测定酶活后以酶活最高组为100％，绘制相对酶活与pH的曲线，结果如图3，漆酶的最适反应pH在5附近。其中醋酸钠缓冲液配置2-6的pH梯度，磷酸钠缓冲液配置6-7的pH梯度，甘氨酸-NaOH缓冲液配置8-10的pH梯度。

4℃下将酶液于pH 2-10的缓冲液中孵育6h后，30℃下检测漆酶酶活，计算剩余漆酶的活性，以原始漆酶活力为100％，得到漆酶pH稳定性-相对酶活曲线，结果如图4，本发明漆酶在酸性条件下稳定性优于碱性条件。

3)金属离子对酶活力的影响的比较

向漆酶反应体系中分别加入金属离子溶液5mM(Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、K⁺、Al³⁺)，4℃保温10min，按标准方法测定酶活，以不加金属离子的酶活力为100％，结果如柱形图5所示，Fe³⁺、Fe²⁺对酶活有显著的抑制作用，而Cu²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、K⁺对酶活有明显促进作用。

实施例3漆酶Lac脱色实验

用漆酶粗酶液对不同结构的染料进行脱色。反应体系(10mL)：取10mL染料并加入漆酶至相应终浓度，在40℃下反应12h后分别在染料最大吸收波长处测定吸光值A₁，同时以热灭活粗酶液作为对照，同样方法测得其吸光值A₀，则染料脱色率＝[(A₀-A₁)/A₀]×100％。染料的浓度及测量波长如表1所示。

分别采用0.2U/mL、1U/mL的漆酶浓度分别进行脱色实验，实验结果如图6、7所示。本发明漆酶对四大类染料的脱色效果均很显著，其中靛蓝、靛红染料反应12h后脱色率几乎为100％。0.2U/mL用量即可获得理想的脱色效果，从反应速率上来看，前1h脱色反应基本完成，此时活性艳蓝KN-R、活性艳蓝X-BR靛红、靛蓝、结晶紫、孔雀石绿、酸性酪蓝K、直接蓝86脱色率分别达到75.3％、72.0％、98.6％、96.2％、66.1％、80.2％、70.2％、75.1％，1h后反应逐步稳定，12h时上述染料脱色率依次为83.6％、77.6％、99.6％、98.4％、76.6％、82.6％、72.0％、77.1％。漆酶浓度提高并未使得染料脱色率发生明显提高。

对比例1漆酶对染料脱色实验

以漆酶活力较高的变色栓菌为对照菌株，将培养7天后的粗酶液用于脱色实验，其酶活为302.2U/L，蛋白含量为2.6mg/L。依据实施例3的操作进行染料脱色实验，酶液浓度保持0.2U/mL和1U/mL两个梯度。分别得到图8、图9。从图中可以看出，漆酶浓度为0.2U/mL时，脱色率普遍不高，此时酶浓度为反应的限制性因素。将漆酶浓度提高至1U/mL时，染料脱色率也得到提高，活性艳蓝KN-R、活性艳蓝X-BR脱色率从54％、32.5％提高至83.1％、73.1％；靛红、靛蓝脱色率从72％、87.6％提高至97.4％、95.9％；结晶紫、孔雀石绿脱色率从41.9％、42.7％提升至69.9％、88.7％；；酸性酪蓝K、直接蓝86脱色率从20.8％、26.2％提升至60.9％、70.5％。

从实验结果可看出，本发明中残孔菌漆酶浓度为0.2U/mL时，即可达到变色栓菌漆酶浓度为1U/mL时的脱色率，并且在反应1h后便趋于稳定，催化效率更高；12h后残孔菌漆酶Lac对染料的脱色率普遍高于变色栓菌漆酶对染料的脱色率；并且对各类染料均表现出较强的脱色能力。

表1染料信息

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株产漆酶的二年残孔菌

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 二年残孔菌

<400> 1

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tgcacgcctc ggttatttcc aaattcttta cacctctgtg cactttacat ggatttttta 180

tattttctta ttgatggacg ttcgagcttg ccaccgcgag tttgacgaaa gtcaattgaa 240

gatttaaagt ctgtggttta cacatttata cgcttcagtt taaagaatgt aatactcgcg 300

tttaacgcaa ttaaataata caactttcag caacggatct cttggctctc gcatcgatga 360

agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 420

ttgaacgcac cttgcgctcc ttggtattcc gaggagcatg cctgtttgag tgtcatggta 480

ttctcaattc tctcaacttt tgttgtcaga attggacttg gaggtatgcc ggtgttttaa 540

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aacttaagca tatcaataag cggaggaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 780

ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 840

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 900

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims

1.一株二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4，已于2017年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017822，保藏地址为中国武汉市武汉大学。

2.权利要求1所述二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4在生产漆酶中的应用。

3.权利要求1所述二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4在造纸工业、废水处理、木材加工、生物修复、有机合成或生物传感领域的应用。

4.权利要求1所述二年残孔菌(Abortiporus biennis)LS-4在染料脱色中的应用，其特征在于，所述染料包括：靛蓝、靛红、活性艳蓝KN-R、活性艳蓝X-BR、结晶紫、孔雀石绿、酸性酪蓝K、直接蓝86。