CN108254575A - 一种适用于椭偏成像传感器的双抗体夹心检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于非实时类型椭偏成像传感器的双抗体夹心法，能够排除血清非特异性吸附对检测结果的影响，实现椭偏成像传感器对分子量为5KD‑25KD的小分子蛋白质的血清学检测。通过在反应基体表面逐层加入捕获抗体、待测物血清样本、检测抗体形成双抗体夹心结构，通过多次加入同种不同浓度的血清样本进行多次上述实验过程，并通过椭偏成像传感器将加入不同浓度血清样本前后的双层膜和三层膜的厚度进行统计，并通过二者差值得到加入检测抗体前后的变化值，将多个变化值用通式拟合出待测物浓度计算关系，通过上述计算关系能够得到不同浓度的待测物血清样本浓度。

Description

一种适用于椭偏成像传感器的双抗体夹心检测方法

技术领域

本发明涉及小分子蛋白质血清学检测技术领域，具体涉及一种适用于非实时类型椭偏成像传感器的双抗体夹心法，能够排除血清非特异性吸附对检测结果的影响，实现椭偏成像传感器对分子量5～25KD的小分子蛋白质的血清学检测。

背景技术

椭偏成像传感器是一种无标记光学生物传感器，其已在临床标志物检测方面有着众多应用。椭偏成像传感器由反应芯片部分和椭偏成像部分组成。对于厚度在10纳米内的蛋白质超薄膜，椭偏成像信号与膜层厚度成线性关系。由于不同浓度蛋白质所形成的膜层厚度并不相同，通过建立椭偏成像信号和蛋白质膜层厚度关系的工作曲线，便可由椭偏成像信号计算得到蛋白质膜层厚度，继而得出待测蛋白质分子的浓度。

在检测蛋白质分子相互作用时，椭偏成像传感器多使用抗体作为配基，对待测蛋白质进行直接检测，即抗体直接捕获待测物蛋白质分子。这种直接检测方法对于大分子蛋白质具有较好检测效果。但对于分子量为5～25KD的小分子蛋白质检测，由待测物引起的信号很小，椭偏成像传感器难以直接检测到。为此，需要引入放大策略，提高椭偏信号，以实现小分子的检测。

双抗体夹心是一种常见的放大方法，能够有效提高信号，因此被普遍使用在小分子检测中。但现有的双抗体夹心方法，多为标记型传感器设计。由于标记型传感器对血清引起的非特异性吸附并不敏感，所以现有的双抗体夹心方法并未对血清非特异性吸附进行处理。但若将其直接引入到无标记的椭偏成像传感器中，非特异性吸附会严重影响检测的准确度，阻碍小分子蛋白质检测。因此，现有的双抗体夹心方法并不适用于椭偏成像传感器。

发明内容

本发明的目的是要提供一种适用于非实时类型椭偏成像传感器的双抗体夹心法，能够排除血清非特异性吸附对检测结果的影响，实现椭偏成像传感器对分子量为5～25KD的小分子蛋白质的血清学检测。

为了达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

一种适用于椭偏成像传感器的双抗体夹心法，包括以下步骤：

a.将捕获抗体加入反应基体，与其充分反应使所述捕获抗体固定在所述反应基体表面，之后使用缓冲液将未与反应基体连接的捕获抗体冲洗；

b.加入封闭液对所述反应基体的非特异性位点进行封闭，反应完毕后使用缓冲液将多余的封闭液冲洗；

c.加入待检测的血清样本使其与反应体系内的所述捕获抗体充分结合，形成捕获抗体和血清样本的双层膜复合物，使用缓冲液将未结合的血清样本冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双层膜复合物进行成像，记录双层膜厚度D1；

d.加入检测抗体，使其与反应体系内的所述血清样本充分结合，形成捕获抗体、血清样本和检测抗体的双抗体夹心复合物，使用缓冲液将未结合的检测抗体冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双抗体夹心复合物进行成像，记录三层膜厚度D2；

e.通过D2和D1的差值得到双抗体夹心复合物中由检测抗体带来的信号变化值；

f.通过多次对同种不同浓度的血清样本重复进行步骤a～e，并对检测结果用通式进行拟合，得到血清样本浓度值的计算关系，具体计算关系为：I＝A·c/(B+c)；其中，

I为由检测抗体带来的信号变化值，c为血清样本浓度，A，B为常数。

本发明提供的一种适用于椭偏成像传感器的双抗体夹心法，能够排除血清非特异性吸附对检测结果的影响，实现椭偏成像传感器对小分子蛋白质的血清学检测。

附图说明

图1是本发明提供的双抗体夹心法得到的双抗体夹心复合物的示意图；

图2是实施例1提供的一定浓度的降钙素原溶液通过本发明双抗体夹心法与罗氏检测法分别进行溶液浓度检测结果对比曲线图；

1.反应基体，2.封闭剂，3.捕获抗体，4.待测物，5.检测抗体。

具体实施方式

本发明提供一种适用于椭偏成像传感器的用于对小分子蛋白质进行血清学检测的双抗体夹心法，先将捕获抗体固定在固相表面也就是反应基底上，与其充分反应使捕获抗体固定在反应基体表面，之后使用缓冲液将未与反应基体连接的捕获抗体冲洗，加入封闭液对所述反应基体的非特异性位点进行封闭，反应完毕后使用缓冲液将多余的封闭液冲洗。之后加入待检测的血清样本使其与反应体系内的所述捕获抗体充分结合，形成捕获抗体和血清样本的双层膜复合物，使用缓冲液将未结合的血清样本冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双层膜复合物进行成像，记录双层膜厚度D1；由于捕获抗体与待测物之间存在特异性相互作用，待测物会被捕获在固相表面。之后加入检测抗体，使其与反应体系内的所述血清样本充分结合，形成捕获抗体、血清样本和检测抗体的双抗体夹心复合物，使用缓冲液将未结合的检测抗体冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双抗体夹心复合物进行成像，记录三层膜厚度D2；由于检测抗体也会与待测物发生相互作用，因此在固相表面会形成双抗体待测物的夹心复合物。检测抗体的加入可以有效放大椭偏信号。通过D2和D1的差值得到双抗体夹心复合物中由检测抗体带来的信号变化值；将膜层厚度D1从D2中减去能够有效降低由血清非特异性吸附造成的影响。通过多次对同种不同浓度的血清样本重复进行步骤a～e，并对检测结果用通式进行拟合，得到血清样本浓度值的计算关系式：I＝A·c/(B+c)；其中，I为由检测抗体带来的信号变化值，c为血清样本浓度，A，B为常数。

与待测物的膜层厚度相比，复合物的膜层厚度要大得多，并且远远大于椭偏成像技术的分辨率，故利用双抗体夹心法能够实现椭偏成像传感器对小分子蛋白质的检测。小分子血清学检测中，除了要对小分子信号进行放大，还需要考虑血清的非特异性吸附。加入血清样本时，在待测物与捕获抗体产生特异性结合的同时，血清中的复杂组分也会在固相表面上发生非特异性吸附，改变蛋白膜层的厚度，进而造成检测结果的假阳性,降低检测准确度。

血清非特异性吸附由加入血清的步骤引入，后续加入的检测抗体并不造成非特异性吸附。基于此，我们对双抗体夹心法进行了改进，利用检测抗体所引起的蛋白膜层厚度变化代替复合物所产生的信号变化，避免血清中非特异性吸附带来的影响。改进型双抗体夹心方法在有效放大检测信号的同时，还避免了血清非特异性吸附的干扰，使得椭偏成像传感器能够实现小分子蛋白质的血清学检测。

对于实时类型的椭偏成像传感器，由于其能够实时记录在操作过程中实时信号变化，无需采用特殊方案，只需采用双抗体夹心方法的一般流程即可。

对于非实时类型的椭偏成像传感器，则需要分别记录加入待测物和加入检测抗体后的信号，才能够得到由检测抗体所引起的信号变化。本发明正是针对非实时类型的椭偏成像传感器对分子量5～25KD的蛋白质的血清学检测所采用的双抗体夹心法。

与直接法相比，本发明双抗体夹心法不仅能够有效放大小分子蛋白质的检测信号，还能避免血清非特异性吸附的影响。在理论上，本发明双抗体夹心法的椭偏信号放大率为检测抗体分子量与待测物分子量之比。在非特异性吸附上，本发明双抗体夹心法几乎不受血清非特异性吸附的影响。

本发明提供的双抗体夹心法，其中捕获抗体和检测抗体的浓度分别为0.05～0.4mg/mL，优选为0.1～0.3mg/mL或0.15～0.25mg/mL，最优取值为0.1mg/mL。

捕获抗体、封闭液、血清样本以及检测抗体的加入速度分别控制在0.5～2μL/min，优选为1～1.5μL/min，最优取值为1uL/min。

缓冲液优选为PBST缓冲液，冲洗速度控制在10～20μL/min，优选为13～18μL/min，冲洗时间为2～10min，优选为5-8min。

捕获抗体与检测基底结合反应的时间、血清样本与捕获抗体结合反应的时间、检测抗体与血清样本结合反应的时间，分别控制在5～20min，优选为10～15min，最优取值为10min。

使用封闭液对反应基体的非特异性位点进行封闭，完全反应的时间为15～60min，优选为25～45min。

上述最大取值范围中的取值依据为，最小值能够实现在最小范围内检测信号清晰可用即可，最大值能够实现饱和反应。

在实际的实验过程发现，在使用封闭液对非特异性位点进行封闭的效果并不理想，所以，本发明提供一种双抗体夹心法，通过记录加入检测抗体前后的变化值最终得到待测物浓度，在该过程中，可以完全忽略由于血清蛋白与反应基底所产生的非特异性结合，实验结果准确。

实施例1：基于椭偏成像传感器的血清中降钙素原的定量检测

使用小分子蛋白降钙素原(13KD)作为模型分子，利用本发明提供的双抗体夹心法进行检测。具体方法如下：

将0.1mg/mL降钙素原捕获抗体以1uL/min注入硅基底，使降钙素原捕获抗体固定在硅基底表面，反应10min之后使用PBST缓冲液以15uL/min的速度清洗5min以洗去未连接上的捕获抗体。清洗完毕之后使用封闭液对硅基底上的非特异性位点进行封闭，封闭液的注入速度控制在1uL/min，反应时间为30min，之后，使用PBST缓冲液以15uL/min清洗5min以洗去未反应的封闭剂。将不同浓度的降钙素原标准溶液以2uL/min加入反应体系，使得降钙素原标准溶液中的血清蛋白与降钙素原捕获抗体结合，反应15min之后，使用PBST缓冲液以15uL/min清洗5min以洗去未结合的降钙素原标准溶液，得到降钙素原捕获抗体和降钙素原标准溶液的双层复合物，使用非实时性椭偏成像传感器对加入每种浓度的降钙素原标准溶液之后双层膜的厚度进行检测并记录数值D1。

再将0.2mg/mL降钙素原检测抗体以1uL/min注入反应体系，使其与降钙素原标准溶液特异性结合，反应15min之后使用PBST缓冲液以15uL/min清洗5min以洗去未结合的降钙素原检测抗体，最终形成降钙素原捕获抗体、降钙素原标准溶液以及降钙素原检测抗体的双抗体夹心复合物，结合过程如图1所示。

使用非实时性椭偏成像传感器对每次加入降钙素原检测抗体之后的双抗体夹心复合物的厚度进行检测并记录数值D2。通过D2和D1的差值得到降钙素原检测抗体带来的信号变化值。

最后，将不同浓度降钙素原标准溶液对应的信号变化值用通式进行拟合，得到工作曲线I＝51.820·c/(21.341+c)(R²＝0.997)。

将未知浓度的降钙素原血清样品用和上述同样步骤进行检测，将所得的信号变化值带入上述工作曲线，计算得到降钙素原血清样本浓度。

上述实施例中体系条件优化值如下：

捕获抗体在硅基底上达到结合饱和即可，浓度过小信号响应较弱，浓度过大造成试剂浪费，确定降钙素原捕获抗体浓度为0.1mg/mL。

将降钙素原捕获抗体加入硅基底时的速度控制，速度过慢降低检测效率，速度过快无法有效结合，确定降钙素原捕获抗体进样速度为1uL/min。降钙素原捕获抗体反应时间为10min，为信号增加至不再变化所用的最短时间。

PBST缓冲液进样速度为15uL/min，速度过慢未结合样品洗涤不彻底，速度过快已结合样品解吸附。PBST缓冲液清洗时间为5min，时间过短未结合样品洗涤不彻底，时间过长已结合样品解吸附。

封闭液进样速度为1uL/min，速度过慢降低检测效率，速度过快封闭不彻底。封闭液反应时间为30min，时间过短封闭不彻底，时间过长降低检测效率。

降钙素原标准溶液/血清样本进样速度为2uL/min，速度过慢降低检测效率，速度过快无法有效结合。降钙素原标准溶液/血清样本反应时间为15min，时间过短降低检测效率，时间过长结合不彻底。

降钙素原检测抗体浓度为0.2mg/mL，浓度过小信号响应较弱，浓度过大增加位阻不利于结合。降钙素原检测抗体进样速度为1uL/min，速度过慢降低检测效率，速度过快无法有效结合。降钙素原检测抗体反应时间为15min，信号增加至不再变化所用的最短时间。

本发明的双抗体夹心法的最低检出限为0.085ng/mL。相同条件下，直接法的最低检出限高于1ng/mL。双抗体夹心法的灵敏度高于直接法一个量级以上。

本发明提供的双抗体夹心法的检测范围为0.125～128ng/mL。该方法通过选择性实验和回收实验证明具有良好的特异性和准确度。将真实血清样本与医院同时进行双盲检测，改进型双抗体夹心法结果与罗氏检测法结果具有良好的一致性，如图2所示。实验结果证实了借助改进型双抗体夹心法，椭偏成像传感器能够成功实现对血清中降钙素原的定量检测。同时，该方法可以应用于其他基于椭偏成像传感器的小分子检测，具有良好的普遍适用性。

以上，虽然说明了本发明的几个实施方式，但是这些实施方式只是作为例子提出的，并非用于限定本发明的范围。对于这些新的实施方式，能够以其他各种方式进行实施，在不脱离本发明的要旨的范围内，能够进行各种省略、置换、及变更。这些实施方式和其变形，包含于本发明的范围和要旨中的同时，也包含于权利要求书中记载的发明及其均等范围内。

Claims (1)

1.一种适用于椭偏成像传感器的双抗体夹心法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将捕获抗体加入反应基体，与其充分反应使所述捕获抗体固定在所述反应基体表面，之后使用缓冲液将未与反应基体连接的捕获抗体冲洗；

b.加入封闭液对所述反应基体的非特异性位点进行封闭，反应完毕后使用缓冲液将多余的封闭液冲洗；

c.加入待检测的血清样本使其与反应体系内的所述捕获抗体充分结合，形成捕获抗体和血清样本的双层膜复合物，使用缓冲液将未结合的血清样本冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双层膜复合物进行成像，记录双层膜厚度D1；

d.加入检测抗体，使其与反应体系内的所述血清样本充分结合，形成捕获抗体、血清样本和检测抗体的双抗体夹心复合物，使用缓冲液将未结合的检测抗体冲洗之后，使用非实时性椭偏仪对形成的所述双抗体夹心复合物进行成像，记录三层膜厚度D2；

e.通过D2和D1的差值得到双抗体夹心复合物中由检测抗体带来的信号变化值；

f.通过多次对同种不同浓度的血清样本重复进行步骤a～e，并对检测结果用通式进行拟合，得到血清样本浓度值的计算关系式：I＝A·c/(B+c)；其中，

I为由检测抗体带来的信号变化值，c为血清样本浓度，A，B为常数。