CN108251481A - 三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法 - Google Patents

三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法，包括以下步骤：将食用药用菌粉碎加入纤维素酶进行酶解；向酶解液中继续加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解；酶解完成后，接入枯草芽孢杆菌发酵；发酵完成后，将发酵液离心，然后取上清液经超滤膜过滤、纯化、灭菌、浓缩、干燥，即可得到所述食用药用菌菌肽。本发明采用菌酶相互配合的方法生产小肽，充分利用酶解和微生物各自的优势，发挥微生物与蛋白酶的协同作用使食用药用菌的蛋白降解的更为彻底，小肽化程度更高；并在后续纯化作用时，利用超滤膜过滤并经离子交换树脂纯化，得到高含量的食用药用菌菌肽。

Description

三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法
技术领域
本发明涉及三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法。
背景技术
食用菌是一类既可食用又可药用的大型真菌，素有“山珍”的盛名，食用菌中所含的氨基酸、维生素、矿物质的种类异常丰富，特别是富含人体所必须的多种氨基酸，食用菌中的蛋白质含量接近于猪、牛、羊肉和禽蛋的含量，而脂肪含量显著低于猪、牛、羊肉，尤其是人参、冬虫夏草等食用菌具有免疫调节作用，延缓细胞衰老和抗肿瘤等作用，具有很高的应用价值和开发前景。
但是，食用菌直接食用后人体对蛋白质的吸收有限，为了提高其吸收效果，可以将蛋白质粉解为小肽以提升食用菌的营养价值，但是，现有的分解方法多是采用蛋白酶酶解，但是往往由于酶解的程度不完全从而导致所得小肽的含量较低。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法。利用纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对食用药用菌分步酶解，并将酶解液经枯草芽孢杆菌发酵，得到食用药用菌菌肽。该方法所得食用药用菌菌肽的产量和纯度较高。
本发明提供的技术方案为：
三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法，包括如下步骤：
S1：将食用药用菌粉碎，加入蒸馏水配制原料液，并调节原料液的pH，然后加入纤维素酶进行酶解；
S2：将酶解液反复冻融2次，待酶解液自然升温至常温后，超声15～30min并调节pH；然后向酶解液中继续加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解；
S3：酶解完成后，将酶解液放入发酵罐中，接入枯草芽孢杆菌发酵；
S4：发酵完成后，将发酵液离心，然后取上清液经超滤膜过滤、纯化、灭菌、浓缩、干燥，即可得到所述食用药用菌菌肽。
进一步地，所述食用药用菌为灵芝、冬虫夏草、菌菇中的一种。
所述步骤S1中，食用药用菌和蒸馏水的料液比为1g：15～20mL，优选为1g：15mL；使用HAc调节体系的pH为4.0～6.0，优选为4.5；纤维素酶的添加量为1000～1500U/g，优选为1200U/g；酶解的温度和时间分别为60～75℃酶解1.5～3h，优选为65℃酶解2h。此处的添加量是酶添加到原料液中后，酶在原料液中的活力值。
所述纤维素酶的酶活力≥100000U/g。
所述步骤S2中，使用NH4Ac调节体系的pH为6.5～7.5，优选为7.0；木瓜蛋白酶的添加量为500～800U/g，优选为650U/g；中性蛋白酶的添加量为700～1000U/g，优选为800U/g；酶解的温度和时间分别为35～65℃酶解3～6h，优选为55℃酶解5h。
所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的酶活力分别为≥800U/g、≥500000U/g。
所述步骤S2中，于-15～-25℃反复冻融2次。
所述步骤S3中，枯草芽孢杆菌经常规方法扩大培养至活菌数为3～5×108cfu/g，然后加入到发酵罐中；所述枯草芽孢杆菌的接种量为酶解液质量的0.1～0.5％，优选为0.3％；发酵的温度和时间分别为45～55℃发酵6～8h，优选为50℃，6h。
所述步骤S4中，所述超滤膜为截留分子量为5KD的中空纤维超滤膜。
所述步骤S4中，所述纯化的方法为：收集超滤膜的透过液，经酸性阳离子交换树脂柱纯化。
所述酸性阳离子交换树脂柱的洗脱液分别依次为：pH3.5～4的酸性洗脱液，pH为6.8～7.2的中性洗脱液和pH为10～11的碱性洗脱液。进一步地，洗脱液依次优选为：pH为3.5的醋酸溶液，pH为7.0的醋酸铵溶液，pH为10.5的氨水。采用不同pH的洗脱液进行梯度洗脱，对小肽的分离更彻底，纯化程度更高。
本发明还提供了根据上述生产方法制备得到的食用药用菌菌肽。其可作为营养物质添加到饮品和保健品中，可提高身体机能，兼有抗癌、抗衰老的辅助功效。
本发明公开的三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法中，首先通过纤维素酶使纤维素的链段变短，产生的多糖可为后续的发酵步骤提供能源支持，并破坏食用药用菌的细胞壁，使其包裹的成分溶出，同时使与其结合的其他成分的水溶性增加；随后经过反复冻融和超声作用，使各成分充分溶出，提高后续酶解的程度；后续采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，两者可使内容物中的蛋白质水解为小肽，且二者在中性条件下的酶活较强，在后续发酵操作时，无需进一步调节体系的pH即可进行发酵，可降低成本和简化操作；采用枯草芽孢杆菌作为菌源进行发酵，其在发酵的过程中会分泌出蛋白酶，利用蛋白酶的内切作用可将酶解不彻底的蛋白质进一步分解为小肽，提高小肽的产量。
本发明公开的三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法中，料液比、酶添加量、菌接种量、体系酸碱度、酶解及发酵的温度与时间等各生产参数是发明人经过反复试验确定的最优的实验参数，在这些参数条件下，所得的食用药用菌菌肽的含量较高，偏离这些参数范围均会影响最终的食用药用菌菌肽的含量。
与现有技术相比，本发明采用菌酶相互配合的方法生产小肽，充分利用酶解和微生物各自的优势，发挥微生物与蛋白酶的协同作用使食用药用菌的蛋白降解的更为彻底，小肽化程度更高；并在后续纯化作用时，利用超滤膜过滤并经离子交换树脂纯化，得到高含量的食用药用菌小肽。
具体实施方式
实施例1
三酶一酵灵芝菌肽的生产方法，包括如下步骤：
S1：将灵芝粉碎，按料液比为1g：15mL加入蒸馏水配制原料液，并使用HAc调节原料液的pH为4.5，然后加入纤维素酶于65℃酶解2h；纤维素酶在原料液中酶活力为1200U/g；
S2：将酶解液于-25℃反复冻融2次，待酶解液自然升温至常温后，超声30min并使用NH4Ac调节pH为7.0；然后向酶解液中继续加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶于55℃酶解5h；所述木瓜蛋白酶的添加量为650U/g，中性蛋白酶的添加量为800U/g；
S3：酶解完成后，将酶解液放入发酵罐中，按0.3％的接种量接入活菌数为4×108cfu/g枯草芽孢杆菌于50℃发酵6h；
S4：发酵完成后，将发酵液离心，然后取上清液经截留分子量为5KD的中空纤维超滤膜过滤；收集超滤膜的透过液，经酸性阳离子交换树脂柱纯化，依次用pH为3.5的醋酸溶液，pH为7.0的醋酸铵溶液，pH为10.5的氨水洗脱，以茚三酮显色反应鉴定并收集小肽，然后产物经灭菌、浓缩、干燥，即可得到所述灵芝菌肽，对得到的灵芝菌肽经HPLC对小肽的含量进行检侧，结果表明相对分子质量小于2KD的小分子肽含量为88％。
实施例2
三酶一酵菌菇菌肽的生产方法，包括如下步骤：
S1：将菌菇粉碎，按料液比为1g：20mL加入蒸馏水配制原料液，并使用HAc调节原料液的pH为5.5，然后加入纤维素酶于70℃酶解1.5h；纤维素酶在原料液中酶活力为1500U/g；
S2：将酶解液于-15℃反复冻融2次，待酶解液自然升温至常温后，超声20min并使用NH4Ac调节pH为7.2；然后向酶解液中继续加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶于65℃酶解4h；所述木瓜蛋白酶的添加量为500U/g，中性蛋白酶的添加量为1000U/g；
S3：酶解完成后，将酶解液放入发酵罐中，按0.5％的接种量接入活菌数为3×108cfu/g枯草芽孢杆菌于55℃发酵8h；
S4：发酵完成后，将发酵液离心，然后取上清液经截留分子量为5KD的中空纤维超滤膜过滤；收集超滤膜的透过液，经酸性阳离子交换树脂柱纯化，依次用pH为3.5的醋酸溶液，pH为7.0的醋酸铵溶液，pH为10.5的氨水洗脱，以茚三酮显色反应鉴定并收集小肽，然后产物经灭菌、浓缩、干燥，即可得到所述菌菇菌肽，对得到的菌菇菌肽经HPLC对小肽的含量进行检侧，结果表明相对分子质量小于2KD的小分子肽含量为87％。
所述菌菇为草菇、平菇、杏鲍菇、金针菇、香菇、茶树菇、猴头菇、木耳中的一种或者多种。
实施例3
食用菌菌肽的应用
将实施例1制备得到的灵芝菌肽与其他辅料一起配制菌肽饮品。具体配方为：灵芝菌肽10份、蜂蜜2份、牛磺酸0.5份、柠檬酸1.5份、山梨酸钾1.0份、果胶2.0份、水80份。该菌肽饮品能显著提升身体免疫力，调节身体机能。
比较例1
其他同实施例1，只是步骤S1中的原料液不经纤维素酶酶解，直接进行S2步骤，最终得到的灵芝小肽的含量为70％。
比较例2
其他同实施例1，只是将步骤S2中的木瓜蛋白酶全部替换为中性蛋白酶，最终得到的灵芝小肽的含量为73％。
比较例3
其他同实施例1，只是在步骤S2完成后直接将酶解液进行后续的纯化操作，最终得到的灵芝小肽的含量为64％。
上述参照实施例对三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.三酶一酵食用药用菌菌肽的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将食用药用菌粉碎，加入蒸馏水配制原料液，并调节原料液的pH，然后加入纤维素酶进行酶解；
S2：将酶解液反复冻融2次，待酶解液自然升温至常温后，超声15～30min并调节pH；然后向酶解液中继续加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解；
S3：酶解完成后，将酶解液放入发酵罐中，接入枯草芽孢杆菌发酵；
S4：发酵完成后，将发酵液离心，然后取上清液经超滤膜过滤、纯化、灭菌、浓缩、干燥，即可得到所述食用药用菌菌肽。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述食用药用菌为灵芝、冬虫夏草、菌菇中的一种。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S1中，食用药用菌和蒸馏水的料液比为1g：15～20mL；使用HAc调节体系的pH为4.0～6.0；纤维素酶的添加量为1000～1500U/g；酶解的温度和时间分别为60～75℃酶解1.5～3h。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中，使用NH4Ac调节体系的pH为6.8～7.2；木瓜蛋白酶的添加量为500～800U/g；中性蛋白酶的添加量为700～1000U/g；酶解的温度和时间分别为35～65℃酶解3～6h。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S3中，枯草芽孢杆菌的活菌数为3～5×108cfu/g，所述枯草芽孢杆菌的接种量为酶解液质量的0.1～0.5％；发酵的温度和时间分别为45～55℃发酵6～8h。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述超滤膜为截留分子量为5KD的中空纤维超滤膜。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述纯化的方法为：收集超滤膜的透过液，经酸性阳离子交换树脂柱纯化。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述酸性阳离子交换树脂柱的洗脱液分别依次为：pH3.5～4的酸性洗脱液，pH为7～7.5的中性洗脱液和pH为10～11的碱性洗脱液。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的生产方法制备的食用药用菌菌肽。
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