CN108226469B - 一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108226469B CN108226469B CN201810010297.8A CN201810010297A CN108226469B CN 108226469 B CN108226469 B CN 108226469B CN 201810010297 A CN201810010297 A CN 201810010297A CN 108226469 B CN108226469 B CN 108226469B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- kit
- peripheral blood
- blood mononuclear
- mononuclear cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 208000036066 Hemophagocytic Lymphohistiocytosis Diseases 0.000 title claims description 16
- 208000032672 Histiocytosis haematophagic Diseases 0.000 title claims description 16
- 208000014752 hemophagocytic syndrome Diseases 0.000 title claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 4
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 19
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150026868 CHS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037435 Combined immunodeficiency due to CD27 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 1
- 101000644045 Homo sapiens Protein unc-13 homolog D Proteins 0.000 description 1
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102100020988 Protein unc-13 homolog D Human genes 0.000 description 1
- 101710141059 Protein unc-13 homolog D Proteins 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000026309 X-linked immunodeficiency with magnesium defect, Epstein-Barr virus infection and neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 201000006722 X-linked immunodeficiency with magnesium defect, Epstein-Barr virus infection, and neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000023334 autosomal recessive lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001278 lymphoproliferative syndrome 2 Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用。本发明所述试剂盒包括抗MUNC13‑4抗体、抗MUNC13‑4抗体的同型对照抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体和抗抗体1，所述抗抗体为抗MUNC13‑4抗体及其同型对照抗体的抗抗体；其中，所述抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体以及抗抗体均为荧光抗体。本发明所述试剂盒及其应用能够快速、准确地诊断FHL3型患者，避免由于输血出现FHL3假阴性检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体而言，涉及一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用。
背景技术
噬血细胞综合征，又称为噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocyticlymphohistocytosis，HLH)，是由多种因素引起的淋巴细胞和组织细胞过度增殖、活化，产生大量炎症因子，从而引起的一种可危及生命的过度炎症反应状态。噬血细胞综合征临床上主要表现为发热、脾肿大、全血细胞减少、高甘油三酯血症、低纤维蛋白原血症、高铁蛋白血症。
HLH分为原发性HLH和继发性HLH。原发性HLH包括3类：①家族性噬血细胞综合征(FHL1，FHL2，FHL3，FHL4，FHL5型)；②免疫缺陷综合征(GS-2，CHS-1，HPS-II)；③EB病毒(EBV)驱动相关噬血细胞综合征(XLP-1，XLP-2，IL-2–inducible T-cell kinasedeficiency，CD27deficiency，XMEN)。
其中，家族性噬血细胞综合征3型(familial hemophagocyticlymphohistiocytosis,FHL3)与UNC13D基因(表达MUNC13-4蛋白)缺陷有关。正常情况下，Munc13-4和细胞毒颗粒共同定位于效应细胞与靶细胞接触位点附近，启动细胞毒颗粒的分泌。FHL3患者由于MUNC13-4蛋白的缺陷或缺失，其细胞毒颗粒虽可锚靠于靶细胞膜上，但其分泌、与靶细胞膜的融合，以及颗粒内容物释放等过程受损，造成NK细胞和CTL的细胞毒作用缺陷，从而影响其对靶细胞的杀伤作用。
FHL3是一种没有特异性临床表现的罕见疾病，目前，主要通过免疫印迹(westernblot,WB)和基因测序检测受试者是否表现出MUNC13-4蛋白的缺乏或发生基因突变来诊断FHL3。然而由于HLH患者在急性发病期往往需要输血治疗，患者的血细胞与被输入的正常血细胞混合，外源引入正常表达MUNC13-4蛋白的HPBMC细胞。同时，除HPBMC细胞外，血小板也大量表达MUNC13-4蛋白，且在分离过程中HPBMC细胞容易混入血小板。因此，FHL3阳性患者在对HPBMC细胞进行WB检测时，经常无法检测到MUNC13-4蛋白的缺乏，难以获得准确的诊断结果。
因此，本领域亟待建立一种能够快速、准确地检测FHL3的方法，建立统一规范的操作流程。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒，所述试剂盒能够快速、准确地用于诊断FHL3型患者，避免由于输血或者血小板混入HPBMC细胞而出现FHL3假阴性检测结果。
本发明的第二目的在于提供一种前述试剂盒在制备诊断家族性噬血细胞综合征3型的产品中的应用，所述产品能够快速、准确地诊断FHL3型患者，有利于改善患者的治疗和预后。
本发明的第三目的在于提供一种使用前述试剂盒检测外周血单核细胞中MUNC13-4蛋白丰度的方法，本发明所述方法从靶细胞的选择和结果的确证等方面对操作流程进行规范，确保检测结果准确无误。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒，所述试剂盒用于流式细胞术，所述试剂盒包括抗MUNC13-4抗体、抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体和抗抗体1，所述抗抗体1为抗MUNC13-4抗体及其同型对照抗体的抗抗体；
其中，所述抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体以及抗抗体1均为荧光抗体。
本发明还涉及前述试剂盒在制备诊断家族性噬血细胞综合征3型的产品中的应用。
本发明还涉及一种使用前述试剂盒检测外周血单核细胞中MUNC13-4蛋白丰度的方法。
具体实施方式
一种诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒，所述试剂盒用于流式细胞术，所述试剂盒包括抗MUNC13-4抗体、抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体和抗抗体1，所述抗抗体1为抗MUNC13-4抗体及其同型对照抗体的抗抗体；
其中，所述抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体以及抗抗体1均为荧光抗体。
本发明所述试剂盒用于流式细胞术，其中，所述试剂盒包括用于检测MUNC13-4的抗体，还包括用于检测CTL和NK细胞标志物CD3、CD56和CD8a的抗体，以及用于检测血小板标志物CD41a的抗体。首先，本发明所述试剂盒用于流式细胞术，因此，其不但能够检测样品是否表达MUNC13-4蛋白及其丰度，还能够获得表达MUNC13-4蛋白的细胞与不表达MUNC13-4细胞的比例。进一步地，由于所述试剂盒中还包括CTL、NK细胞和血小板的标志物，因此，其还能够细化不同细胞亚群中表达MUNC13-4蛋白细胞的比例情况。根据上述比例，本领域技术人员可以容易地区分FHL3型阴性患者、接受输入健康血液的FHL3阳性患者和未接受健康血液的FHL3阳性患者，排除外源输入血液对诊断结果的干扰。
例如，本发明所述试剂盒通过抗NK细胞标志物CD56的抗体和抗MUNC13-4抗体可以得到如下检测结果：(1)受试者NK细胞均表现为MUNC13-4蛋白不表达/表达量下降；(2)受试者NK细胞均表现为MUNC13-4蛋白正常表达；(3)受试者包括MUNC13-4蛋白正常表达的NK细胞和MUNC13-4蛋白不表达/表达量下降的NK细胞。其中，第(1)种检测结果对应FHL3型阳性患者，第(2)种检测结果对应非FHL3患者，第(3)种检测结果对应接受健康血液的FHL3阳性患者或非FHL3的HLH患者急性期。
在一些具体的实施方式中，所述抗CD3抗体标记FITC、抗CD56抗体标记APC、抗CD8a抗体标记percp Cy5.5、标记CD41a标记eFluor450、抗抗体1标记PE。
优选地，所述MUNC13-4抗体为Abcam，#ab109113；
优选地，所述抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体为Abcam，#ab172730；
优选地，所述抗抗体1为Abcam，#ab72465。
在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括分离外周血单核细胞和血小板的试剂和/或流式细胞术的辅助检测试剂。
在一些具体的实施方式中，所述分离外周血单核细胞和血小板的试剂包括抗凝剂和Ficoll分离液中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述抗凝剂为EDTA或肝素钠。
在一些具体的实施方式中，所述流式细胞术的辅助检测试剂包括固定剂、破膜剂、流式缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述固定剂为eBioscience，#00-5521-00；
优选地，所述破膜剂为eBioscience，#00-8333-56。
在一些具体的实施方式中，所述流式缓冲液为含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mM EDTA的1×PBS溶液；
优选地，所述流式缓冲液为含有2％FBS和2mM EDTA的1×PBS溶液。
本发明还涉及前述试剂盒在制备诊断家族性噬血细胞综合征3型的产品中的应用。
本发明还涉及一种使用前述试剂盒检测外周血单核细胞中MUNC13-4蛋白丰度的方法，所述方法包括：
a)、从待检样本中分离血小板和外周血单核细胞，对所述外周血单核细胞进行计算并调整其细胞浓度；
b)、将步骤1)中所述外周血单核细胞和所述血小板分为两组，其中所述外周血单核细胞中加入抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体，所述血小板中加入抗CD41a抗体，之后，所述外周血单核细胞和所述血小板均按以下方式处理：
b1)、孵育；
b2)、离心，弃上清，将沉淀与细胞固定剂共孵育；
b3)、离心，弃上清，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；
b4)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
b5)、将重悬后的样品分为两组，分别加入抗MUNC13-4抗体和抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体并孵育；
b6)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
b7)、每管加抗抗体1并孵育；
b8)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬，并用流式细胞仪进行检测；
本发明所述方法为流式细胞术检测方法，通过该方法可以检测样品中表达MUNC13-4蛋白的细胞的占比情况，并进一步获取不同细胞亚群中表达MUNC13-4蛋白细胞的占比情况。根据占比情况准确区分FHL3型阴性患者、接受输入健康血液的FHL3阳性患者和未接受健康血液的FHL3阳性患者，排除外源输入血液对诊断结果的干扰。
在一些具体的实施方式中，在步骤a)中，所述细胞的浓度为3.5～4.5×106/ml；
优选地，所述细胞的浓度为4×106/ml。
在一些具体的实施方式中，在步骤b)中，所述抗CD3抗体的加入量为15～25μl/200μl外周血单核细胞，所述抗CD56抗体和抗CD8a抗体的加入量为5～15μl/200μl外周血单核细胞；所述抗CD41a抗体的加入量为5～15μl/200μl血小板；
优选地，所述抗CD3抗体的加入量为20μl/200μl外周血单核细胞，所述抗CD56抗体和抗CD8a抗体的加入量为10μl/200μl外周血单核细胞；优选地，所述抗CD41a抗体的加入量为10μl/200μl血小板。
在一些具体的实施方式中，在步骤b1)中，所述孵育的条件为室温避光孵育15～30分钟，优选地，孵育20分钟；
在一些具体的实施方式中，在步骤b2)中，固定的条件为2～8℃下避光固定40～60分钟，优选地，在4℃下避光固定50分钟。
在一些具体的实施方式中，在步骤b3)中，破膜的条件为2～8℃下避光固定30～50分钟，优选地，在4℃下避光破膜40分钟；
在一些具体的实施方式中，在步骤b4)中，孵育的条件为室温避光孵育15～30分钟，优选地，孵育20分钟；
在一些具体的实施方式中，在步骤b5)中，所述抗MUNC13-4抗体的加入量为0.5～2μl/100μl重悬后的样品，优选地，1μl/100μl重悬后的样品；所述同型对照抗体的加入量为0.5～2μl/100μl重悬后的样品，优选地，1μl/100μl重悬后的样品。
在一些具体的实施方式中，所述方法为非诊断目的的。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述试剂盒及其使用方法可以检测不同细胞亚群中表达MUNC13-4蛋白细胞的占比情况，根据占比情况可以准确区分FHL3型阴性患者、接受输入健康血液的FHL3阳性患者和未接受健康血液的FHL3阳性患者，从而排除排除外源输入血液对诊断结果的干扰。
(2)本发明所述方法还对靶细胞的选择、结果的确证以及操作条件进行限定，建立统一规范的操作流程，确保检测结果准确无误。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据实施例1所述方法检测正常健康受试者NK细胞和CTL细胞中MUNC13-4的表达情况；
图2为根据实施例1所述方法检测未接受健康血液的FHL3型阳性患者的NK细胞和CTL细胞中MUNC13-4的表达情况；
图3为根据对比例1所述方法检测健康受试者和未接受输血的FHL3型阳性患者HPBMC中MUNC13-4的表达情况，其中1为健康受试者HPBMC，2为未接受输血的FHL3患者的HPBMC，K562为阳性对照。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
一种通过流式细胞术检测NK细胞、细胞毒性T(CTL)细胞和血小板中MUNC13-4蛋白的表达丰度的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取加入EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，从血浆层收集血小板，通过Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单核细胞(PBMC)并计数，调整外周血单核细胞的浓度至为4.0×106/ml，备用；
(2)取离心管，加200μl已稀释HPBMC细胞，此管作为HPBMC样本管，此管加入20μlCD3-FITC、10μl CD56-APC和10μl CD8a-Percp Cy5.5；
(3)取离心管，加200μl已稀释的血小板，此管为血小板样本管，此管中加10μlCD41a-eFluor450；
(4)所述HPBMC样本管和血小板样本管在室温下避光孵育20分钟后，每管加2mlPBS，1200转、5分钟离心，弃上清；
(5)固定：将4×固定剂(eBioscience，#00-5521-00)稀释至1×，每管加2ml，震荡混匀，4度避光固定50分钟后，1200转、5分钟离心，弃上清；
(6)破膜：将10×破膜剂(eBioscience，#00-8333-56)稀释至1×，每管先加1ml破膜剂，震荡混匀，1200转、5分钟离心，弃上清，随后每管再加2ml破膜剂，震荡混匀，4度避光破膜40分钟，1200转、5分钟离心，弃上清；
(7)每管加2ml流式缓冲液(2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液)，混匀，1200转、5分钟离心，弃上清；
(8)分对照管：样品管每管加200ul流式缓冲液，混匀，吸取100ul到对应的对照管；
(9)样本管中加入抗人MUNC13-4抗体(Abcam，#ab109113)1μL，对照管加入兔IgG 1μL(Abcam，#ab172730)。室温避光孵育15min；
(10)每管加2ml流式缓冲液，1200转、5分钟离心，弃上清；
(11)每管加1ul羊抗兔IgG-PE(Abcam，#ab72465)，室温避光孵育20分钟；
(12)每管加2ml流式缓冲液，1200转、5分钟离心，弃上清；
(13)每管加100ul流式缓冲液，上机检测。
对比例1
一种通过Western Blot检测MUNC13-4蛋白的表达的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取加入EDTA或肝素钠抗凝静脉全血2ml，通过Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)，血小板收集自血浆层；
(2)加入100μl预冷的蛋白裂解液(RIPA)，冰上孵育30分钟；
(3)4℃，12000rpm离心15min取上清；
(4)测定蛋白浓度(BCA试剂盒)；
(5)蛋白煮样：按照蛋白：5×loading buffer＝4:1混合后，100℃水浴5分钟；
(6)配制12％SDS-PAGE胶；
(7)上样及电泳：依次加入蛋白Marker和煮好的待分析的蛋白样本(每孔10μg)，一般浓缩胶70V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下凝胶末端处，即停止；
(8)转膜：PVDF膜，恒流300mA，60分钟；
(9)封闭：将膜置于小盒子中，加入5％脱脂奶粉(TBST)，室温下在脱色摇床上封闭2小时；
(10)直接加入配好的一抗(抗人MUNC13-4抗体，1:1000，Abcam，#ab109113)(用5％脱脂奶粉/TBST稀释至适当浓度),室温下脱色摇床上动2小时后4℃冰箱过夜；
(11)取出膜，室温下在脱色摇床上用TBST洗膜，共三次，每次10分钟；
(12)加入配好的二抗(羊抗兔，1:2000，Abcam，#ab97051)(用5％脱脂奶粉/TBST稀释至适当浓度)，室温下脱色摇床上摇动1小时；
(13)取出膜，室温下在脱色摇床上用TBST洗膜，共三次，每次10分钟；
(14)将配制好的放光液(Thermo，#34577)滴在膜的蛋白一侧，使二者充分接触；
(15)设置荧光成像分析仪程序，并运行显影。
实验例1
召集2名受试者，其中第一名受试者为健康受试者，第二名受试者为未接受输血的FHL3患者。采集前述2名受试者的血样并分离获得HPBMC细胞。参照实施例1所述方法检测受试者HPBMC中MUNC13-4蛋白的表达，具体检测结果如图1～2所示。
如图1～2所示，与第一名受试者(健康受试者)相比，第二名受试者的NK细胞和CTL细胞只表现出MUNC13-4蛋白表达的下降，诊断结论为所述第二名受试者为未接受输血的FHL3患者，与实际情况一致。
实验例2
召集2名受试者，其中其中第一名受试者为健康受试者，第二名受试者为未接受输血的FHL3患者，采集所述受试者的血样并分离获得HPBMC。
参照对比例1所述方法检前述受试者HPBMC以及阳性对照K562细胞中MUNC13-4蛋白的表达，具体检测结果如图3所示。其中，健康受试者以及未接受输血的FHL3患者表现出与阳性对照基本一致的表达量，检测结果不能将健康受试者与未接受输血的FHL3患者区分。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (16)
1.一种诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于流式细胞术，所述试剂盒包括抗MUNC13-4抗体、抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体和抗抗体1，所述抗抗体为抗MUNC13-4抗体及其同型对照抗体的抗抗体；
其中，所述抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体、抗CD41a抗体以及抗抗体均为荧光抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD3抗体标记FITC、抗CD56抗体标记APC、抗CD8a抗体标记percp Cy5.5、标记CD41a标记eFluor450、所述抗抗体标记PE。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括分离外周血单核细胞和血小板的试剂和/或流式细胞术的辅助检测试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述分离外周血单核细胞和血小板的试剂包括抗凝剂和Ficoll分离液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗凝剂为EDTA或肝素钠。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述流式细胞术的辅助检测试剂包括固定剂、破膜剂、流式缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述流式缓冲液为含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mM EDTA的1×PBS溶液。
8.权利要求1～7任一项所述试剂盒在制备诊断家族性噬血细胞综合征3型的产品中的应用。
9.一种使用权利要求1～7任一项所述试剂盒检测外周血单核细胞中MUNC13-4蛋白丰度的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)、从待检样本中分离血小板和外周血单核细胞，对所述外周血单核细胞进行计数并调整其细胞浓度；
b)、将步骤1)中所述外周血单核细胞和所述血小板分为两组，其中所述外周血单核细胞中加入抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD8a抗体，所述血小板中加入抗CD41a抗体，之后，所述外周血单核细胞和所述血小板均按以下方式处理：
b1)、孵育；
b2)、离心，弃上清，将沉淀与细胞固定剂共孵育；
b3)、离心，弃上清，将沉淀与细胞破膜剂共孵育；
b4)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
b5)、将重悬后的样品分为两组，分别加入抗MUNC13-4抗体和抗MUNC13-4抗体的同型对照抗体并孵育；
b6)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬；
b7)、每管加抗抗体1并孵育；
b8)、离心，弃上清，用流式缓冲液洗涤沉淀后重悬，并用流式细胞仪进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，其中，步骤a)中，所述细胞的浓度为3.5～4.5×106/ml；
步骤b)中，所述抗CD3抗体的加入量为15～25μl/200μl外周血单核细胞、抗CD56抗体、抗CD8a抗体的加入量为5～15μl/200μl外周血单核细胞；所述抗CD41a抗体的加入量为5～15μl/200μl血小板；
步骤b1)中，所述孵育的条件为室温避光孵育15～30分钟；
步骤b2)中，固定的条件为2～8℃下避光固定40～60分钟；
步骤b3)中，破膜的条件为2～8℃下避光固定30～50分钟；
步骤b4)中，孵育的条件为室温避光孵育15～30分钟；
步骤b5)中，所述抗MUNC13-4抗体的加入量为0.5～2μl/100μl重悬后的样品；所述同型对照抗体的加入量为0.5～2μl/100μl重悬后的样品。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b1)中，孵育20分钟。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b2)中，固定的条件为在4℃下避光固定50分钟。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b3)中，破膜的条件为在4℃下避光破膜40分钟。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b4)中，孵育的条件为室温避光孵育20分钟。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b5)中，所述抗MUNC13-4抗体的加入量为1μl/100μl重悬后的样品。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，其中，步骤b5)中，所述同型对照抗体的加入量为1μl/100μl重悬后的样品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810010297.8A CN108226469B (zh) | 2018-01-05 | 2018-01-05 | 一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810010297.8A CN108226469B (zh) | 2018-01-05 | 2018-01-05 | 一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108226469A CN108226469A (zh) | 2018-06-29 |
| CN108226469B true CN108226469B (zh) | 2020-07-31 |
Family
ID=62643016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810010297.8A Expired - Fee Related CN108226469B (zh) | 2018-01-05 | 2018-01-05 | 一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108226469B (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105547971B (zh) * | 2016-01-08 | 2018-05-01 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 细胞毒性t细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法 |
| CN106947835B (zh) * | 2017-04-24 | 2018-10-23 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | Eb病毒感染淋巴细胞亚群的鉴定方法及其应用 |
| CN107037219A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-08-11 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | X‑连锁淋巴增殖综合征诊断试剂盒及其应用 |
-
2018
- 2018-01-05 CN CN201810010297.8A patent/CN108226469B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108226469A (zh) | 2018-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dignat-George et al. | Endothelial microparticles: a potential contribution to the thrombotic complications of the antiphospholipid syndrome | |
| AU2006297033B2 (en) | Use of N-myristoyltransferase on non-tumor tissue for cancer diagnosis | |
| CN106947835B (zh) | Eb病毒感染淋巴细胞亚群的鉴定方法及其应用 | |
| JPH06505332A (ja) | 総白血球表面抗原を用いた治療法及び診断法 | |
| CN107860924B (zh) | 新型γδT细胞在制备评估AML疗效试剂盒中的应用 | |
| CN108680756A (zh) | 一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法 | |
| Arntz et al. | Rheumatoid arthritis patients with circulating extracellular vesicles positive for IgM rheumatoid factor have higher disease activity | |
| CN107299111A (zh) | 检测MOG‑IgG的CBA试剂盒用的细胞爬片组件制备、CBA检测试剂盒及其应用 | |
| Liang et al. | Correlations of the expression of γδ T cells and their co-stimulatory molecules TIGIT, PD-1, ICOS and BTLA with PR and PIBF in the peripheral blood and decidual tissues of women with unexplained recurrent spontaneous abortion | |
| CN110174519B (zh) | 一种基于固相凝集技术的汇检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法 | |
| CN105547971B (zh) | 细胞毒性t细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法 | |
| CN108226469B (zh) | 一种快速诊断家族性噬血细胞综合征3型的试剂盒及其应用 | |
| JP7220474B2 (ja) | 迅速なオンデマンドヘパリン起因性血小板減少症機能的アッセイ | |
| CN105445171B (zh) | 自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法 | |
| CN110488012A (zh) | 一种新生儿肺炎的辅助诊断试剂盒及应用 | |
| Girard et al. | Trypanosoma cruzi induces regulatory B cell alterations in patients with chronic Chagas disease | |
| Tasaki et al. | A novel method of CD31-combined ABO carbohydrate antigen microarray predicts acute antibody-mediated rejection in ABO-incompatible kidney transplantation | |
| Klatka et al. | T-lymphocyte activation is correlated with the presence of anti-EBV in patients with laryngeal squamous cell carcinoma | |
| KR101926166B1 (ko) | 수용체 시너지 활성을 이용한 nk 세포의 활성도 검사 방법 및 이를 이용한 nk 세포의 활성도가 관련된 질환의 진단 방법 | |
| CN106443012B (zh) | 一种试纸条及其制备方法与在尿微量白蛋白和β2微球蛋白联合检测中的应用 | |
| Kerns et al. | Safety Profiling of Tumor-targeted T Cell–Bispecific Antibodies with Alveolus Lung-and Colon-on-Chip | |
| JPWO2019069980A1 (ja) | 大腸癌の検出方法 | |
| Zahran et al. | The frequency and clinical implications of lymphocyte subsets and circulating plasma cells in newly diagnosed multiple myeloma patients | |
| RU2817215C2 (ru) | Способ диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных | |
| RU2488114C1 (ru) | Способ определения аутоантител к тромбоцитам |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200731 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |