CN108220327A - 培育抗白叶枯病植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了培育抗白叶枯病植物的方法。本发明所公开的培育抗白叶枯病植物的方法包括利用TALEN方法对目的植物的Xa5基因第一个外显子的含有序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸的DNA片段进行定点突变，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物，两条靶序列分别为序列4的第69‑85位的核苷酸序列和序列4的第104‑118位的互补序列。实验证明，利用本发明的方法对Xa5基因进行定点突变可以提高水稻的白叶枯病的抗性。可以利用本发明的方法中用到的物质(如TALEN‑Xa5‑1及其编码基因和TALEN‑Xa5‑2及其编码基因)及靶序列提高水稻的白叶枯病的抗性或培育抗白叶枯病植物。

Description

培育抗白叶枯病植物的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，培育抗白叶枯病植物的方法。
背景技术
水稻是我国的主要粮食作物，然而病虫害一直是制约水稻产量的重要因素，其中白叶枯病是主要病害之一。目前水稻生产中主要是化学防治，存在成本高、抗药性和环境污染等问题。利用水稻不同种质中存在的抗性基因培育抗病品种是控制水稻病害经济有效的方法，因此白叶枯病抗性基因的研究与利用一直是国内外水稻研究与育种的热点。利用经典遗传学和病理学方法先后在不同的水稻资源中鉴别出约40个白叶枯病抗性基因。近年来利用分子标记和基因组序列对其中的一些基因进行了基因组定位和克隆，成功克隆了9个抗白叶枯病基因，其中显性(Xa)基因6个Xa21、Xa1、Xa26、Xa27、Xa10和Xa23，三个隐性(xa)基因xa5、xa13和xa25。
基因编辑技术能原位地对基因进行编辑，改变DNA序列。其原理是利用序列特异性核酸酶在基因组中需要修饰的DNA序列或其附近制造DNA双链断裂，通过影响断裂的修复，改变裂口附近的DNA序列。基因编辑的优点在于，在基因编辑过程中引入生物体的外源基因能通过转基因后代的遗传分离而自然去除，且基因编辑造成的基因突变能稳定遗传。
基因编辑技术使用的序列特异性核酸酶有几类，包括锌指蛋白核酸酶(ZincFinger Nucleases，ZFN)、转录激活类效应因子核酸酶(Transcription Activator-LikeEffector Nucleases，TALEN)、RNA指导的序列特异性核酸酶和DNA指导的序列特异性核酸酶等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高水稻对白叶枯病的抗性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了培育抗白叶枯病植物的方法。
本发明所提供的培育抗白叶枯病植物的方法，包括A1)：A1)降低目的植物中Xa5基因编码蛋白质的含量或活性，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物。
上述培育抗白叶枯病植物的方法具体可包括A2)：A2)对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物。
上述培育抗白叶枯病植物的方法中，所述对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变，可包括B1)：B1)对所述目的植物的Xa5基因的第一外显子进行定点突变。所述目的植物的Xa5基因的第一外显子的序列可为序列表中序列4。
上述培育抗白叶枯病植物的方法中，所述对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变，具体可包括B2)：B2)在所述目的植物基因组DNA中，对下述S1)或S2)进行定点突变：
S1)对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸；
S2)含有S1)的DNA片段。
上述培育抗白叶枯病植物的方法中，所述对目的植物的Xa5基因进行定点突变可利用TALEN方法实现。
上述培育抗白叶枯病植物的方法中，利用TALEN方法对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变所用靶序列可为靶序列F和靶序列R；
所述靶序列F为下述T11)、T12)或T13)：
T11)序列表中序列4的第69-85位的核苷酸序列；
T12)与T11)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由T11)衍生的DNA序列；
T13)在严格条件下与T11)限定的DNA序列杂交的由T11)衍生的DNA序列；
所述靶序列R为下述T21)、T22)或T23)：
T21)序列表中序列4的第104-118位的互补序列；
T22)与T21)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由T21)衍生的DNA序列；
T23)在严格条件下与T21)限定的DNA序列杂交的由T21)衍生的DNA序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列4的第69-85位或序列4的第104-118位的互补序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述培育抗白叶枯病植物的方法可包括向所述目的植物中导入TALEN-Xa5-1的编码基因和TALEN-Xa5-2的编码基因，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物；
所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的序列可为如下H1)或H2)：
H1)序列1所示的氨基酸序列；
H2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；
所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的序列可为如下I1)或I2)：
I1)序列2所示的氨基酸序列；
I2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
所述TALEN-Xa5-1和所述TALEN-Xa5-2均由含有核定位信号(Nuclearlocalization signal,NLS)的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央识别区以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。其中，所述TALEN-Xa5-1和所述TALEN-Xa5-2的N端结构域和C端结构域均可为现有技术中的TALEN的N端结构域和C端结构域。
所述TALEN-Xa5-1可通过其中央识别区识别所述靶序列F，所述TALEN-Xa5-2可通过其中央识别区识别所述靶序列R。
上述H2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述TALEN-Xa5-1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述TALEN-Xa5-1的中央识别区的编码基因可通过将序列3的第2562-4295位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
上述I2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述TALEN-Xa5-2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述TALEN-Xa5-2的中央识别区的编码基因可通过将序列3的第6815-8344位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
上述培育抗白叶枯病植物的方法中，所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的编码基因可为如下h1)或h2)或h3)：
h1)编码序列是序列表中序列3的第2562-4295位的cDNA分子或DNA分子；
h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
h3)在严格条件下与h1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
和/或，所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的编码基因可为如下i1)或i2)或i3)：
i1)编码序列是序列表中序列3的第6815-8344位的cDNA分子或DNA分子；
i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
i3)在严格条件下与i1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，序列3的第2562-4295位所示的DNA分子编码TALEN-Xa5-1的中央识别区；序列3的第6815-8344位所示的DNA分子编码TALEN-Xa5-2的中央识别区。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质且具有TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列3的第2562-4295位或序列3的第6815-8344位的互补序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述文中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
利用所述培育抗白叶枯病植物的方法对对应于序列表中序列4的序列进行修饰或改变能获得抗白叶枯病的水稻植株。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述O1)、O2)、O3)或O4)的产品：
O1)下述O11)和/或O12)的蛋白质：
O11)所述TALEN-Xa5-1；
O12)所述TALEN-Xa5-2；
O2)下述O21)和/或O22)的基因：
O21)所述TALEN-Xa5-1的编码基因；
O22)所述TALEN-Xa5-2的编码基因；
O3)下述O31)和/或O32)的生物材料：
O31)与所述TALEN-Xa5-1相关的生物材料，为下述O31a)或O31b)：
O31a)含有所述TALEN-Xa5-1的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O31b)含有O31a)所述表达盒的重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O32)与所述TALEN-Xa5-2相关的生物材料，为下述O32a)或O32b)：
O32a)含有所述TALEN-Xa5-2的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O32b)含有O32a)所述表达盒的重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O4)利用所述培育抗白叶枯病植物的方法对Xa5基因进行突变得到的突变基因，将该突变基因命名为Xa5m。
上述产品中，所述的含有编码TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质的核酸分子的表达盒(TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2基因转录的启动子，还可包括终止TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述TALEN-Xa5-1或TALEN-Xa5-2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述产品中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1301载体。
上述产品中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌LBA4404或EHA105。
上述产品中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明的实施例中，所述重组载体为将pCAMBIA1301载体的HindIII和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列3的第7-9194位核苷酸所示的DNA分子得到的编辑Xa5基因的重组载体，该重组载体能表达TALEN-Xa5-1与TALEN-Xa5-2，TALEN-Xa5-1基因的表达由35S启动子启动，TALEN-Xa5-2基因的表达由Ubiquitin启动子启动。
所述TALEN-Xa5-1与所述TALEN-Xa5-2组合在一起、所述TALEN-Xa5-1的编码基因与所述TALEN-Xa5-2的编码基因组合在一起以及与所述TALEN-Xa5-1相关的生物材料与与所述TALEN-Xa5-2相关的生物材料组合在一起均可用于调控植物的白叶枯病抗性。所述调控植物白叶枯病抗性可为提高所述植物的白叶枯病抗性。
上述产品中，与序列4所示的Xa5基因的第一个外显子的序列相比，所述Xa5m的第一个外显子的序列均发生了改变。在本发明的实施例中，所述Xa5m的第一个外显子的序列如序列5-序列36所示。所述Xa5m除第一个外显子外，Xa5m的其他外显子序列均同于Xa5基因。
上述生物材料可为序列3的第7-9194位核苷酸或序列3所示的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1-X5中的任一应用：
X1、所述靶序列F和/或所述靶序列R在调控植物白叶枯病抗性中的应用；
X2、所述靶序列F和/或所述靶序列R在培育抗白叶枯病植物中的应用；
X3、所述产品在调控植物白叶枯病抗性中的应用；
X4、所述产品在制备调控植物白叶枯病抗性产品中的应用；
X5、所述产品在培育抗白叶枯病植物中的应用。
所述调控植物白叶枯病抗性可为提高所述植物白叶枯病抗性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了抗白叶枯病产品。
本发明所提供的抗白叶枯病产品，可以所述产品为活性成分还可以以所述产品与其他抗白叶枯病的物质组合在一起作为活性成分。
本发明中，所述植物可为M1)-M8)中的任一种：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)含有Xa5基因的单子叶植物或双子叶植物；
M3)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C的单子叶植物或双子叶植物；
M4)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C，且含有所述靶序列F和所述靶序列R的单子叶植物或双子叶植物；
M5)水稻；
M6)含有Xa5基因的水稻；
M7)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C的水稻；
M8)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C，且含有所述靶序列F和所述靶序列R的水稻。
实验证明，利用本发明的培育抗白叶枯病植物的方法不仅可以将Xa5基因进行定点编辑，并且Xa5基因定点编辑后的植物对白叶枯病的抗性增强：对野生型植物中Xa5基因进行突变得到的移码突变的植株和部分氨基酸序列发生突变的植株的病斑长度均显著低于野生型植物。表明，利用本发明的培育抗白叶枯病植物的方法对Xa5基因进行定点突变可以提高水稻的白叶枯病的抗性。利用本发明的培育抗白叶枯病植物的方法对Xa5基因进行定点编辑时引入的外源基因能通过转基因后代的分离而去除，同时产生的基因突变能稳定遗传，因此得到的水稻材料的性状更加稳定，对环境更加友好。可以利用本发明的培育抗白叶枯病植物的方法中用到的物质(如TALEN-Xa5-1及其编码基因和TALEN-Xa5-2及其编码基因)及靶序列提高水稻的白叶枯病的抗性或培育抗白叶枯病植物。
附图说明
图1为Xa5基因结构示意图及靶序列位置。
图2为Xa5m基因筛选用的酶切位点BbvCI和SacI以及靶序列(target F和targetR)的位置。
图3为T0代Xa5基因突变植株中Xa5m基因突变情况。
图4为MH86中Xa5基因突变提高水稻对白叶枯病的抗性。
图5为Xa5基因突变后水稻叶片病斑调查结果。
图6为TP309中Xa5基因突变提高水稻对白叶枯病的抗性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCAMBIA1301载体(Regulation of Inflorescence BranchDevelopment in Rice Through a Novel Pathway Involving the PentatricopeptideRepeat Protein sped1-D.Genetics.2014,197(4):1395-1407.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的水稻TP309(Regulation of Inflorescence BranchDevelopment in Rice Through a Novel Pathway Involving the PentatricopeptideRepeat Protein sped1-D.Genetics.2014,197(4):1395-1407.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的水稻IR24(Testifying the rice bacterial blightresistance gene xa5by genetic complementation and further analyzing xa5(Xa5)in comparison with its homolog TFIIAgamma1.Mol Gen Genomics.2006,275(4):354-366.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的杂交稻D62B(Do transgenesis and marker-assistedbackcross breeding produce substantially equivalent plants？A comparativestudy of transgenic and backcross rice carrying bacterial blight resistantgene Xa21.BMC Genomics,2013,14:738.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的杂交稻MH86(Do transgenesis and marker-assistedbackcross breeding produce substantially equivalent plants？A comparativestudy of transgenic and backcross rice carrying bacterial blight resistantgene Xa21.BMC Genomics,2013,14:738.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的杂交稻CX6221B为文献(Generation of marker-free,bacterialblight-resistant transgenic sterile line and hybrid rice with Xa21.PlantBreeding,2011,130(4):438–443.)中的D62B-Xa21，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的杂交稻CX8621(水稻无选择标记Xa21转基因系CX8621的获得与遗传分析.中国水稻科学2016,30(1):10-16.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的IRBB5(Testifying the rice bacterial blight resistancegene xa5by genetic complementation and further analyzing xa5(Xa5)incomparison with its homolog TFIIAgamma1.Mol Gen Genomics.2006,275(4):354-366.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。IRBB5基因组DNA中xa5基因第一外显子的序列为将序列表中序列4(即Xa5基因第一外显子的序列)的第116位的T替换为A、将第117位的C替换为G得到的序列。
下述实施例中的白叶枯病原菌PXO86生理小种(Testifying the rice bacterialblight resistance gene xa5by genetic complementation and further analyzingxa5(Xa5)in comparison with its homolog TFIIAgamma1.Mol Gen Genomics.2006,275(4):354-366.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、水稻中Xa5基因的定点突变
本发明提供了一个由两个TALEN单体组成的核酸酶，该核酸酶的名称为TALEN-Xa5，TALEN-Xa5的两个单体的名称分别为TALEN-Xa5-1和TALEN-Xa5-2。TALEN-Xa5-1和TALEN-Xa5-2均由含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央识别区以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。TALEN-Xa5-1的中央识别区的序列为序列表中序列1；TALEN-Xa5-2的中央识别区的序列为序列表中序列2。
本发明利用TALEN-Xa5实现了水稻中Xa5基因的定点突变，TALEN-Xa5-1识别序列4的第69-85位(靶序列F,target F)所示的DNA片段，TALEN-Xa5-2识别与序列4第104-118位反向互补的序列(靶序列R,target R)所示的DNA片段，其中序列4为Xa5基因的第一个外显子的DNA序列，靶序列F和靶序列R在Xa5基因中的位置如图1所示。具体操作步骤如下：
1、重组载体及重组农杆菌的制备
将pCAMBIA1301载体利用HindIII和SacI进行双酶切，得到载体骨架；将合成的序列3所示的DNA分子利用HindIII和SacI进行双酶切，得到外源DNA片段；将载体骨架与外源DNA片段连接，得到编辑Xa5基因的重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA1301-TALEN-Xa5。pCAMBIA1301-TALEN-Xa5能表达TALEN-Xa5-1与TALEN-Xa5-2，TALEN-Xa5-1基因的表达由35S启动子启动，TALEN-Xa5-2基因的表达由Ubiquitin启动子启动。
序列3的第2562-4295位所示的DNA分子(TALEN-Xa5-1基因)编码序列1所示的TALEN-Xa5-1的中央识别区；序列3的第6815-8344位所示的DNA分子(TALEN-Xa5-2基因)编码序列2所示的TALEN-Xa5-2的中央识别区。
将pCAMBIA1301-TALEN-Xa5分别导入根瘤农杆菌LBA4404和EHA105中，将得到的重组农杆菌分别命名为LBA4404-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5和EHA105-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5；将pCAMBIA1301分别导入根瘤农杆菌LBA4404和EHA105中，将得到的重组农杆菌分别命名为LBA4404-pCAMBIA1301和EHA105-pCAMBIA1301。
2、水稻中Xa5基因的定点突变
2.1、利用水稻转化方法完成水稻中Xa5基因的定点突变
水稻TP309和水稻IR24以及杂交稻D62B、MH86、CX6221B和CX8621基因组DNA中两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C，且两条染色体均含有靶序列F和靶序列R。
采用农杆菌介导的转化方法，利用步骤1的LBA4404-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5和EHA105-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5及LBA4404-pCAMBIA1301(用作空载体对照)和EHA105-pCAMBIA1301(用作空载体对照)完成水稻中Xa5基因的定点突变，其中LBA4404-pCAMBIA1301和LBA4404-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5用于转化水稻TP309的愈伤组织，而EHA105-pCAMBIA1301和EHA105-pCAMBIA1301-TALEN-Xa5用于转化水稻IR24和杂交稻D62B、MH86、CX6221B、CX8621的愈伤组织。
最终得到水稻TP309、水稻IR24以及杂交稻D62B、MH86、CX6221B和CX8621基因组中Xa5基因被定点突变的水稻(Xa5基因定点突变水稻)，将这些水稻分别命名为TP309-Xa5m、IR24-Xa5m、D62B-Xa5m、MH86-Xa5m、CX6221B-Xa5m和CX8621-Xa5m，将对应的转空载体对照水稻分别命名为TP309-CK、IR24-CK、D62B-CK、MH86-CK、CX6221B-CK和CX8621-CK。
3、Xa5基因定点突变水稻的鉴定
3.1 Xa5基因定点突变水稻的分子检测
提取Xa5基因定点突变水稻基因组DNA，用PCR扩增/酶切的方法检测Xa5基因的突变情况，PCR扩增所用PCR引物序列如下：
Test-F：AGAGAAATCTGGCGTCTCGTC
Test-R：TACGTGTCGGACGTGAATGG
这对PCR引物能扩增出TALEN-Xa5靶序列F和靶序列R所在DNA区段前后约400-500bp的DNA序列(PCR产物总长为949bp)。野生型水稻(Xa5基因未被定点突变的水稻)的PCR产物在靶序列F和靶序列R的互补序列之间存在BbvCI的识别序列，利用BbvCI能将PCR产物切成507bp、442bp的两段；当基因编辑影响了该BbvCI的识别序列，则PCR产物不能被BbvCI切开，明显区别于野生型的两条带。
野生型水稻的PCR产物在靶序列F和靶序列R的互补序列之间还存在SacI的识别序列，为了尽可能检测到更多的基因突变，本发明还利用了SacI进行检测。对于野生型水稻的PCR产物而言，SacI不是单酶切位点，酶切PCR产物产生三条带，大小分别是494bp、374bp和81bp，其中81bp带较小，不易检出，但另外两条带用1.5％琼脂糖凝胶电泳可以检测；当基因编辑影响了靶序列F和靶序列R的互补序列之间的SacI识别序列，位于TALEN-Xa5靶序列间隔区的SacI酶切位点消失，利用SacI对PCR产物进行酶切，酶切产物为两条带，374bp的条带不受影响，另一条带的大小根据基因编辑插入或删除的DNA片段长度而发生变动，区别于野生型的电泳结果。BbvCI和SacI的识别序列以及靶序列(target F和target R)的位置如图2所示。
4、T0代Xa5基因定点突变水稻的筛选
对T0代Xa5基因定点突变水稻(以下简称T0代水稻)的检测，采用潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin phosphotransferase)上的引物进行PCR以及步骤3.1的Xa5基因定点突变水稻的分子检测方法来鉴定，潮霉素磷酸转移酶基因上的PCR引物为Hpt-F和Hpt-R，引物序列如下：
Hpt-F：CGCCGATGGTTTCTACAA
Hpt-R：GGCGTCGGTTTCCACTAT
首先利用Hpt-F和Hpt-R检测得到阳性苗，然后对检测得到的阳性苗利用步骤3.1的Xa5基因定点突变水稻的分子检测方法进行Xa5基因突变的检测，最终对两次检测均为阳性苗的植株的Test-F与Test-R的PCR产物进行测序，确定Xa5基因的突变类型。
T0代Xa5基因突变植株中Xa5基因突变情况如图3所示，Xa5基因突变后得到的植株基因组中对应于序列表中的序列4为序列5-序列36。T0代水稻总共出现32种突变类型，变异多半发生的两个靶序列之间，有些靶序列本身也受到了影响；变异源于碱基缺失(-)和插入(+)，mutant列中的数字是受到影响的核苷酸数目；靶序列用灰色标示；WT为TP309、IR24、MH86、D62B、CX6221B和CX8621的相应序列。
5、T1代Xa5基因定点突变水稻的筛选
对T1代Xa5基因定点突变水稻的筛选是要去除外源TALEN-Xa5-1基因和TALEN-Xa5-2基因的影响，筛选纯合的Xa5基因突变植株。
使用两对PCR引物分别对T0代Xa5基因突变植株的基因组DNA进行扩增：一对引物是Hpt-F和Hpt-R，另一对引物是Fok-F和Fok-R。当两对引物均扩增不到产物，且提取的植物基因组DNA正常时，则认为转入的外源TALEN-Xa5基因不再完整，其对靶基因不再发挥作用。Hpt-F和Hpt-R的序列如下：
Hpt-F：CGCCGATGGTTTCTACAA；Hpt-R：GGCGTCGGTTTCCACTAT
Fok-F和Fok-R引物序列如下：
Fok-F：CTACAGGGGAAAGCACCTGG；Fok-R：ATAGGCAGATTGTAGCCGCC
虽然TALEN-Xa5-1基因和TALEN-Xa5-2基因中编码FokI核酸酶的序列存在差异，但是Fok-F和Fok-R引物设计在FokI核酸酶的保守序列区，能同时检测出TALEN-Xa5-1基因和TALEN-Xa5-2基因中的是否存在FokI核酸酶序列。
筛选纯合Xa5基因突变植株，首先利用步骤3.1的Xa5基因定点突变水稻的分子检测方法进行，对于阳性植株再对其Test-F与Test-R的PCR产物进行测序，选择测序结果无杂峰的植株，该植株即为纯合Xa5基因突变植株。
实施例2、T2代纯合Xa5基因突变植株对白叶枯病的抗病性鉴定
选取实施例1的TP309-Xa5m、IR24-Xa5m、D62B-Xa5m、MH86-Xa5m、CX6221B-Xa5m和CX8621-Xa5m的T2代纯合Xa5基因突变植株，将Xa5基因发生突变后得到的基因命名为Xa5m基因，突变可以分成两个主要类型：一类是移码突变，插入或删除非3的整倍数的核苷酸，造成后续的编码框发生移码，由于突变发生的位置比较靠前(位于第一外显子)，移码的结果是导致基因编码产物丧失功能，实现基因敲除；另一类是非移码突变，插入、删除或替换的核苷酸数目是3的整数倍，其结果仅改变Xa5蛋白部分氨基酸序列。MH86背景的水稻发生了多种类型的移码突变(即基因Xa5敲除突变)和非移码突变(即在基因Xa5第一外显子编码的氨基酸序列中存在插入、替换或删除)，TP309、D62B、CX6221B、CX8621背景的水稻中也存在多种导致基因Xa5移码或非移码的突变体，IR24背景的水稻中只得到了一种非移码的删除27个核苷酸突变体，其突变类型见图3的No.4。
经过T1代的筛选，得到大量不同遗传背景的、纯合的基因Xa5m水稻植株，同时这些植株中不再含有完整的外源TALEN基因，基因组更加稳定；分单株套袋收种，每个单株的后代作为一个T2代单系。鉴定T2代纯合Xa5m基因植株对白叶枯病的抗性，利用非转基因的背景材料和T1代筛选出的基因Xa5没有发生突变的植株T2代做对照。具体检测方法如下：
将白叶枯病原菌PXO86生理小种在PSA培养基培养基上于28℃培养72h，接菌前用纯净水调节菌体浓度至109CFU/mL。
在水稻分蘖盛期，通过剪叶法对充分伸展的叶片接种白叶枯病原菌PXO86生理小种，每株水稻病原菌的接种量均相同。接种18-25天左右(根据天气状况而有所不同)，当病斑长度明显而稳定时进行调查，调查时，每株水稻接种病原菌的时间相同。每一植株测量三片叶，求其平均值作为抗性指标对其抗病情况进行调查。
抗病性实验结果表明，Xa5基因突变后得到的植株基因组中对应于序列表中的序列4为序列5-序列36的植株对白叶枯病原菌PXO86的抗病性均增强。其中，敲除基因Xa5的水稻材料，即纯合的基因Xa5移码突变体，均表现出对白叶枯病原菌PXO86的抗病性增强。其余TALEN-Xa5编辑产生的非移码突变体，虽然其对白叶枯病原菌PXO86的抗性有高有低，但是均比对照材料(含基因Xa5)的抗病性强。由于TALENT-Xa5设计的靶序列是固定的，其引起的基因编辑方式是具有一定倾向性的，位于FokI核酸酶切点附近的突变率较高，离切点越远突变率降低。因此实验获得的突变体材料其突变主要集中改变了Xa5蛋白的第32-34位氨基酸，其中所有引起水稻抗病性增强的突变均影响了第32位氨基酸。
正常的Xa5蛋白第32位氨基酸是谷氨酸(Glu)，各种突变体中Xa5蛋白的第32位氨基酸分别为：亮氨酸(图3的No.1)、谷氨酰胺(图3的No.20)、缬氨酸(图3的No.16)、精氨酸(图3的No.22)、缬氨酸(图3的No.7)、苯丙氨酸(图3的No.4)、异亮氨酸(图3的No.14)。此外，有一个插入突变体材料，其编码的Xa5蛋白，第32位氨基酸不变，但是在32、33位之间又插入了1个谷氨酸(图3的No.28)，突变的结果至少影响了第32位氨基酸的酸碱性，该材料对白叶枯病原菌PXO86的抗病性也有所提高。
在籼稻材料中，MH86背景的水稻材料中获得的非移码突变体种类最多，且同时也有移码突变体。下面具体给出籼稻MH86-Xa5m和粳稻TP309-Xa5m的各突变类型的抗病性检测结果。
MH86-Xa5m的各突变类型的病斑长度如图4、图5和表2所示。图4、图5和表2中，CK1是未经过转基因的背景材料MH86(即Xa5基因未发生突变)；CK2、CK3是T2代单系，其T0代基因Xa5发生突变，但在T1代突变丢失，且TALENT-Xa5基因不完整(经过Hpt和Fok引物PCR呈阴性反应)的材料；CK4是其两条染色体均含有隐性等位基因xa5的抗病水稻材料IRBB5，作为抗病对照；K1、K2-1、K2-2是基因Xa5发生移码突变的T2代单系，其所含基因Xa5m的突变类型如图4的表(图4中下图)中所示，其中K2-1和K2-2的突变类型相同但来源于不同的T1代的植株；M1-1、M1-2、M1-3、M1-4和M1-5突变类型相同但来源于不同的T1代的植株，M2-1、M2-2、M2-3、M2-4和M2-5突变类型相同但来源于不同的T1代的植株，M1和M2属于非移码突变。K1、K2-1、K2-2、M1-1、M1-2、M1-3、M1-4、M1-5、M2-1、M2-2、M2-3、M2-4、M2-5和M3均为纯合突变单株。柱形图上的字母a/b/c表示差异的显著性(P<0.01)；(-)表示碱基缺失，(+)表示碱基增加。K1基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列为序列5(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列5)，K2-1和K2-2基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列6(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列6)，M1-1、M1-2、M1-3、M1-4和M1-5基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列7(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列7)，M2-1、M2-2、M2-3、M2-4和M2-5基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列8(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列8)，M3基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列为序列9(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列9)。其中序列5和序列6是移码突变，即基因Xa5敲除突变体；序列7、序列8和序列9是非移码突变，在基因Xa5第一外显子编码的氨基酸序列中存在插入、替换或删除。
表2、MH86-Xa5m对白叶枯病原菌的抗病性检测结果
植株类型 病斑长度(cm)
CK1 6.12±0.89
CK2 5.99±0.98
CK3 5.88±0.99
K1 3.21±0.72
K2-1 3.55±0.57
K2-2 3.42±0.46
M1-1 3.78±0.56
M1-2 3.70±0.53
M1-3 3.41±0.42
M1-4 3.83±0.56
M1-5 3.28±0.45
M2-1 3.25±0.46
M2-2 3.47±0.58
M2-3 3.51±0.69
M2-4 3.61±0.51
M2-5 3.31±0.50
M3 3.45±0.69
CK4 2.36±0.47
结果显示，Xa5基因经过突变后的植株对白叶枯病的抗性增强：对MH86中Xa5基因进行突变得到的MH86-Xa5m中，Xa5基因第一外显子的序列突变为序列5-9的植株的病斑长度均显著低于MH86。表明，Xa5基因第一外显子的突变可以提高水稻的白叶枯病的抗性。
在粳稻TP309背景的材料中也得到了类似的突变体(TP309-Xa5m)，它们的病斑长度如图6和表3所示。图6和表3中，CK1是未经过转基因的背景材料TP309(即Xa5基因未发生突变)；CK2、CK3、CK4是T2代单系，其T0代基因Xa5发生突变，但在T1代突变丢失，且TALENT-Xa5基因不完整(经过Hpt和Fok引物PCR呈阴性反应(未扩增出条带))的材料；CK5是其两条染色体均含有隐性等位基因xa5的抗病水稻材料IRBB5，作为抗病对照；K1、K2属于移码突变(即基因Xa5敲除突变体)，其突变类型如图6的表(图6中下图)中所示；其中K1-1、K1-2、K1-3代表不同的T2代单系，突变类型均相同，来源于不同的T1代单株，K2-1、K2-2、K2-3、K2-4代表不同的T2代单系，突变类型均相同，来源于不同的T1代单株。M1是基因Xa5的非移码突变，其中M1-1、M1-2、M1-3和M1-4分别是不同的T2代单系，突变类型均相同，来源于不同的T1代单株。K1-1、K1-2、K1-3、K2-1、K2-2、K2-3、K2-4、M1-1、M1-2、M1-3和M1-4均为纯合突变单株。柱形图上的字母a/b/c/d表示差异的显著性(P<0.01)；(-)表示碱基缺失，(+)表示碱基增加。K1-1、K1-2、K1-3基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列6(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列6)，K2-1、K2-2、K2-3、K2-4基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列10(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列10)，M1-1、M1-2、M1-3和M1-4基因组DNA中对应于序列表中序列4的序列均为序列11(即Xa5基因第一外显子的序列突变为序列11)。
表3、TP309-Xa5m对白叶枯病原菌的抗病性检测结果
植株类型 病斑长度(cm)
CK1 6.51±0.67
CK2 5.38+0.82
CK3 5.36±0.94
CK4 5.84±0.97
K1-1 2.62±0.47
K1-2 2.73±0.37
K1-3 3.05±0.44
K2-1 3.53±0.43
K2-2 3.60±0.61
K2-3 3.52±0.45
K2-4 3.43±0.83
M1-1 3.13±0.49
M1-2 3.53±0.64
M1-3 3.53±0.53
M1-4 3.18±0.62
CK5 2.36±0.47
结果显示，Xa5基因经过突变后的粳稻对白叶枯病的抗性增强：对TP309中Xa5基因进行突变得到的TP309-Xa5m中，Xa5基因第一外显子的序列突变为序列6、10和11的植株的病斑长度均显著低于TP309。表明，Xa5基因第一外显子的突变可以提高水稻的白叶枯病的抗性。
综上结果显示，对不同遗传背景的水稻材料进行Xa5基因第一外显子编辑，产生移码突变的突变体(得到的突变体对应于序列表中序列4所示的Xa5基因第一外显子的序列分别为序列表中序列5、序列6、序列10、序列12、序列14-19、序列23-26、序列28、序列30、序列31和序列33-35)均能提高其对白叶枯病的抗性；另外，虽不造成基因移码突变，但是改变了关键位置的氨基酸序列(得到的突变体对应于序列表中序列4所示的Xa5基因第一外显子的序列分别为序列表中序列7-9、序列11、序列13、序列20-22、序列27、序列29、序列32和序列36)，也能改变水稻对白叶枯病的抗病性。故对Xa5基因第一外显子进行编辑所产生的具有蛋白质结构和功能改变都能提高水稻的抗病性。
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<160> 36
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<210> 1
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
65 70 75 80
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
500 505 510
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala
515 520 525
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
530 535 540
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
545 550 555 560
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
565 570 575
His Gly
<210> 2
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
65 70 75 80
Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
100 105 110
Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
115 120 125
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
130 135 140
Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
145 150 155 160
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
165 170 175
Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
180 185 190
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
210 215 220
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala
245 250 255
Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
260 265 270
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
290 295 300
His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly
305 310 315 320
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
325 330 335
Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn
340 345 350
Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
355 360 365
Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala
370 375 380
Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu
385 390 395 400
Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg
420 425 430
Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val
435 440 445
Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val
450 455 460
Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu
485 490 495
Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly
500 505 510
<210> 3
<211> 9200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
aagcttgcat gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc 60
attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt 120
gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata 180
gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta 240
aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt 300
gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta 360
catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt 420
ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta 480
ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta 540
agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt 600
aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc 660
aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg 720
ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac 780
gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat 840
tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc 900
tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct 960
cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc 1020
cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac 1080
ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta 1140
cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt 1200
ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt 1260
gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt 1320
gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt 1380
gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat 1440
tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg 1500
aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag 1560
atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc 1620
tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta 1680
tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg 1740
ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgttacttc tgcagactag tccagtgtgg tggaattcgc catggactac 2040
aaagaccatg acggtgatta taaagatcat gacatcgatt acaaggatga cgatgacaag 2100
atggccccca agaagaagag gaaggtgggc atccacgggg tacccatggt agatttgaga 2160
actttgggat attcacagca gcagcaggaa aagatcaagc ccaaagtgag gtcgacagtc 2220
gcgcagcatc acgaagcgct ggtgggtcat gggtttacac atgcccacat cgtagccttg 2280
tcgcagcacc ctgcagccct tggcacggtc gccgtcaagt accaggacat gattgcggcg 2340
ttgccggaag ccacacatga ggcgatcgtc ggtgtgggga aacagtggag cggagcccga 2400
gcgcttgagg ccctgttgac ggtcgcggga gagctgagag ggcctcccct tcagctggac 2460
acgggccagt tgctgaagat cgcgaagcgg ggaggagtca cggcggtcga ggcggtgcac 2520
gcgtggcgca atgcgctcac gggagcaccc ctcaacctga cctcactccg gaacaagtgg 2580
tcgcaatcgc gagcaataac ggcggaaaac aggctttgga aacggtgcag aggctccttc 2640
cagtgctgtg ccaagcgcac ggtctcactc cggaacaagt ggtcgcaatc gcgagcaata 2700
acggcggaaa acaggctttg gaaacggtgc agaggctcct tccagtgctg tgccaagcgc 2760
acggtctgac cccagagcag gtcgtggcca ttgcctcgaa tggagggggc aaacaggcgt 2820
tggaaaccgt acaacgattg ctgccggtgc tttgtcaggc acacggcctg accccagagc 2880
aggtcgtggc gatcgcaagc cacgacggag gaaagcaagc cttggaaaca gtacagaggc 2940
tgttgcctgt gctttgtcag gcacacggcc tgaccccaga gcaggtcgtg gccattgcct 3000
cgaatggagg gggcaaacag gcgttggaaa ccgtacaacg attgctgccg gtgctttgtc 3060
aggcacacgg cctgacccca gagcaggtcg tggcgatcgc aagccacgac ggaggaaagc 3120
aagccttgga aacagtacag aggctgttgc ctgtgctttg tcaggcacac ggcctgaccc 3180
cagagcaggt cgtggcgatc gcaagccacg acggaggaaa gcaagccttg gaaacagtac 3240
agaggctgtt gcctgtgctt tgtcaggcac acggcctcac tccggaacaa gtggtcgcaa 3300
tcgcctccaa cattggcggg aaacaggcac tcgagactgt ccagcgcctg cttcccgtgc 3360
tgtgccaagc gcacggtctc actccggaac aagtggtcgc aatcgcgagc aataacggcg 3420
gaaaacaggc tttggaaacg gtgcagaggc tccttccagt gctgtgccaa gcgcacggtc 3480
tgaccccaga gcaggtcgtg gcgatcgcaa gccacgacgg aggaaagcaa gccttggaaa 3540
cagtacagag gctgttgcct gtgctttgtc aggcacacgg cctcactccg gaacaagtgg 3600
tcgcaatcgc gagcaataac ggcggaaaac aggctttgga aacggtgcag aggctccttc 3660
cagtgctgtg ccaagcgcac ggtctcactc cggaacaagt ggtcgcaatc gcgagcaata 3720
acggcggaaa acaggctttg gaaacggtgc agaggctcct tccagtgctg tgccaagcgc 3780
acggtctgac cccagagcag gtcgtggcga tcgcaagcca cgacggagga aagcaagcct 3840
tggaaacagt acagaggctg ttgcctgtgc tttgtcaggc acacggcctc actccggaac 3900
aagtggtcgc aatcgcctcc aacattggcg ggaaacaggc actcgagact gtccagcgcc 3960
tgcttcccgt gctgtgccaa gcgcacggtc tgaccccaga gcaggtcgtg gcgatcgcaa 4020
gccacgacgg aggaaagcaa gccttggaaa cagtacagag gctgttgcct gtgctttgtc 4080
aggcacacgg cctgacccca gagcaggtcg tggcgatcgc aagccacgac ggaggaaagc 4140
aagccttgga aacagtacag aggctgttgc ctgtgctttg tcaggcacac ggcctgaccc 4200
cagagcaggt cgtggcgatc gcaagccacg acggaggaaa gcaagccttg gaaacagtac 4260
agaggctgtt gcctgtgctt tgtcaggcac acggcactca cgcctgagca ggtagtggct 4320
attgcatcca atggaggggg cagacccgca ctggagtcaa tcgtggccca gctttcgagg 4380
ccggaccccg cgctggccgc actcactaat gatcatcttg tagcgctggc ctgcctcggc 4440
ggacgacccg ccttggatgc ggtgaagaag gggctcccgc acgcgcctgc attgattaag 4500
cggaccaaca gaaggattcc cgagaggaca tcacatcgag tggcaggatc ccagctggtg 4560
aagagcgagc tggaggagaa gaagtccgag ctgcggcaca agctgaagta cgtgccccac 4620
gagtacatcg agctgatcga gatcgccagg aacagcaccc aggaccgcat cctggagatg 4680
aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gaaagcacct gggcggaagc 4740
agaaagcctg acggcgccat ctatacagtg ggcagcccca tcgattacgg cgtgatcgtg 4800
gacacaaagg cctacagcgg cggctacaat ctgcctatcg gccaggccga cgagatggag 4860
agatacgtgg aggagaacca gacccggaat aagcacctca accccaacga gtggtggaag 4920
gtgtacccta gcagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgagcggcca cttcaagggc 4980
aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaatgg cgccgtgctg 5040
agcgtggagg agctgctgat cggcggcgag atgatcaaag ccggcaccct gacactggag 5100
gaggtgcggc gcaagttcaa caacggcgag atcaacttca gatcttgata actcgagctc 5160
gaggatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 5220
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 5280
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 5340
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 5400
tctatgttac tagatccgat gataagctgt caaacatgag aattggcgcg ccatggtgga 5460
gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc 5520
tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 5580
tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca 5640
ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 5700
acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca 5760
agtggattga tgtgaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 5820
atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa 5880
acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg 5940
aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct 6000
ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 6060
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg 6120
atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 6180
atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctgctagcgt 6240
ttaaacttaa gctgatccac tagtccagtg tggtggaatt cgccatggac tacaaagacc 6300
atgacggtga ttataaagat catgacatcg attacaagga tgacgatgac aagatggccc 6360
ccaagaagaa gaggaaggtg ggcatccacg gggtacccat ggtagatttg agaactttgg 6420
gatattcaca gcagcagcag gaaaagatca agcccaaagt gaggtcgaca gtcgcgcagc 6480
atcacgaagc gctggtgggt catgggttta cacatgccca catcgtagcc ttgtcgcagc 6540
accctgcagc ccttggcacg gtcgccgtca agtaccagga catgattgcg gcgttgccgg 6600
aagccacaca tgaggcgatc gtcggtgtgg ggaaacagtg gagcggagcc cgagcgcttg 6660
aggccctgtt gacggtcgcg ggagagctga gagggcctcc ccttcagctg gacacgggcc 6720
agttgctgaa gatcgcgaag cggggaggag tcacggcggt cgaggcggtg cacgcgtggc 6780
gcaatgcgct cacgggagca cccctcaacc tgacctcact ccggaacaag tggtcgcaat 6840
cgcgagcaat aacggcggaa aacaggcttt ggaaacggtg cagaggctcc ttccagtgct 6900
gtgccaagcg cacggtctca ctccggaaca agtggtcgca atcgcgagca ataacggcgg 6960
aaaacaggct ttggaaacgg tgcagaggct ccttccagtg ctgtgccaag cgcacggtct 7020
cactccggaa caagtggtcg caatcgcctc caacattggc gggaaacagg cactcgagac 7080
tgtccagcgc ctgcttcccg tgctgtgcca agcgcacggt ctgaccccag agcaggtcgt 7140
ggcgatcgca agccacgacg gaggaaagca agccttggaa acagtacaga ggctgttgcc 7200
tgtgctttgt caggcacacg gcctcactcc ggaacaagtg gtcgcaatcg cctccaacat 7260
tggcgggaaa caggcactcg agactgtcca gcgcctgctt cccgtgctgt gccaagcgca 7320
cggtctcact ccggaacaag tggtcgcaat cgcctccaac attggcggga aacaggcact 7380
cgagactgtc cagcgcctgc ttcccgtgct gtgccaagcg cacggtctca ctccggaaca 7440
agtggtcgca atcgcgagca ataacggcgg aaaacaggct ttggaaacgg tgcagaggct 7500
ccttccagtg ctgtgccaag cgcacggtct cactccggaa caagtggtcg caatcgcctc 7560
caacattggc gggaaacagg cactcgagac tgtccagcgc ctgcttcccg tgctgtgcca 7620
agcgcacggt ctcactccgg aacaagtggt cgcaatcgcc tccaacattg gcgggaaaca 7680
ggcactcgag actgtccagc gcctgcttcc cgtgctgtgc caagcgcacg gtctgacccc 7740
agagcaggtc gtggcgatcg caagccacga cggaggaaag caagccttgg aaacagtaca 7800
gaggctgttg cctgtgcttt gtcaggcaca cggcctgacc ccagagcagg tcgtggccat 7860
tgcctcgaat ggagggggca aacaggcgtt ggaaaccgta caacgattgc tgccggtgct 7920
ttgtcaggca cacggcctga ccccagagca ggtcgtggcc attgcctcga atggaggggg 7980
caaacaggcg ttggaaaccg tacaacgatt gctgccggtg ctttgtcagg cacacggcct 8040
cactccggaa caagtggtcg caatcgcgag caataacggc ggaaaacagg ctttggaaac 8100
ggtgcagagg ctccttccag tgctgtgcca agcgcacggt ctcactccgg aacaagtggt 8160
cgcaatcgcc tccaacattg gcgggaaaca ggcactcgag actgtccagc gcctgcttcc 8220
cgtgctgtgc caagcgcacg gtctcactcc ggaacaagtg gtcgcaatcg cctccaacat 8280
tggcgggaaa caggcactcg agactgtcca gcgcctgctt cccgtgctgt gccaagcgca 8340
cggtactcac gcctgagcag gtagtggcta ttgcatccaa tggagggggc agacccgcac 8400
tggagtcaat cgtggcccag ctttcgaggc cggaccccgc gctggccgca ctcactaatg 8460
atcatcttgt agcgctggcc tgcctcggcg gacgacccgc cttggatgcg gtgaagaagg 8520
ggctcccgca cgcgcctgca ttgattaagc ggaccaacag aaggattccc gagaggacat 8580
cacatcgagt ggcaggatcc cagctggtga agagcgagct ggaggagaag aagtccgagc 8640
tgcggcacaa gctgaagtac gtgccccacg agtacatcga gctgatcgag atcgccagga 8700
acagcaccca ggaccgcatc ctggagatga aggtgatgga gttcttcatg aaggtgtacg 8760
gctacagggg aaagcacctg ggcggaagca gaaagcctga cggcgccatc tatacagtgg 8820
gcagccccat cgattacggc gtgatcgtgg acacaaaggc ctacagcggc ggctacaatc 8880
tgcctatcgg ccaggccgac gagatgcaga gatacgtgaa ggagaaccag acccggaata 8940
agcacatcaa ccccaacgag tggtggaagg tgtaccctag cagcgtgacc gagttcaagt 9000
tcctgttcgt gagcggccac ttcaagggca actacaaggc ccagctgacc aggctgaacc 9060
acaaaaccaa ctgcaatggc gccgtgctga gcgtggagga gctgctgatc ggcggcgaga 9120
tgatcaaagc cggcaccctg acactggagg aggtgcggcg caagttcaac aacggcgaga 9180
tcaacttctg ataagagctc 9200
<210> 4
<211> 129
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 4
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccggagctcg ccattcaagt tcttgtccag 120
tttgataag 129
<210> 5
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctcgccatt caagttcttg tccagtttga taag 104
<210> 6
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccggctcgcc attcaagttc ttgtccagtt 120
tgataag 127
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccgctcgcca ttcaagttct tgtccagttt 120
gataag 126
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcgcc attcaagttc ttgtccagtt tgataag 117
<210> 9
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccgcgtgcgc ctaaactttt tgataag 117
<210> 10
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg cacgccattc aagttcttgt ccagtttgat aag 113
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<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccattca agttcttgtc cagtttgata ag 102
<210> 14
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccgccattca agttcttgtc cagtttgata 120
ag 122
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<213> 人工序列
<400> 15
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc tcgccattca agttcttgtc cagtttgata 120
ag 122
<210> 18
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctt 60
cgccattcaa gttcttgtcc agtttgataa g 91
<210> 19
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccctcgccat tcaagttctt gtccagtttg 120
ataag 125
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc cccattcaag ttcttgtcca gtttgataag 120
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagt cccattcaag ttcttgtcca gtttgataag 120
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg cattcaagtt cttgtccagt ttgataag 108
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<213> 人工序列
<400> 23
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc cctcgccatt caagttcttg tccagtttga 120
taag 124
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<213> 人工序列
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gccattcaag ttcttgtcca gtttgataag 30
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tcgcccatcg ccattcaagt tcttgtccag tttgataag 109
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ttgtccagtt tgataag 107
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg cacccccagc ccggagctcg ccattcaagt tcttgtccag 120
tttgataag 129
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctcgccatt caagttcttg tccagtttga taag 104
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ctcgccattc aagttcttgt ccagtttgat 120
aag 123
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcttg tccagttttg ataag 105
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
ggctcgccat tcaagttctt gtccagtttg ataag 95
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccggaggagc tcgccattca agttcttgtc 120
cagttttgat aag 133
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccgagctcgc cattcaagtt cttgtccagt 120
ttgataag 128
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctgtcc agtttgataa g 101
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<213> 人工序列
<400> 35
atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagc ccggagtcgc cattcaagtt cttgtccagt 120
ttgataag 128
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<213> 人工序列
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atggccacct tcgagctcta ccggaggtcc accattggca tgtgcctcac tgagacgctc 60
gacgagatgg tctccagcgg caccctcagt gtccagtttg ataag 105

Claims (10)

1.培育抗白叶枯病植物的方法，包括A1)或A2)：
A1)降低目的植物中Xa5基因编码蛋白质的含量或活性，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物；
A2)对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变，包括B1)或B2)：
B1)对所述目的植物的Xa5基因的第一外显子进行定点突变；
B2)在所述目的植物基因组DNA中，对下述S1)或S2)进行定点突变：
S1)对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸；
S2)含有S1)的DNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述对目的植物的Xa5基因进行定点突变是利用TALEN方法实现的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：利用TALEN方法对所述目的植物的Xa5基因进行定点突变所用靶序列为靶序列F和靶序列R；
所述靶序列F为下述T11)、T12)或T13)：
T11)序列表中序列4的第69-85位的核苷酸序列；
T12)与T11)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由T11)衍生的DNA序列；
T13)在严格条件下与T11)限定的DNA序列杂交的由T11)衍生的DNA序列；
所述靶序列R为下述T21)、T22)或T23)：
T21)序列表中序列4的第104-118位的互补序列；
T22)与T21)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由T21)衍生的DNA序列；
T23)在严格条件下与T21)限定的DNA序列杂交的由T21)衍生的DNA序列。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述目的植物中导入TALEN-Xa5-1的编码基因和TALEN-Xa5-2的编码基因，得到白叶枯病抗性高于所述目的植物的抗白叶枯病植物；
所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的序列为如下H1)或H2)：
H1)序列1所示的氨基酸序列；
H2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；
所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的序列为如下I1)或I2)：
I1)序列2所示的氨基酸序列；
I2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的编码基因为如下h1)或h2)或h3)：
h1)编码序列是序列表中序列3的第2562-4295位的cDNA分子或DNA分子；
h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
h3)在严格条件下与h1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TALEN-Xa5-1的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
和/或，所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的编码基因为如下i1)或i2)或i3)：
i1)编码序列是序列表中序列3的第6815-8344位的cDNA分子或DNA分子；
i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子；
i3)在严格条件下与i1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TALEN-Xa5-2的中央识别区的cDNA分子或基因组DNA分子。
7.下述O1)、O2)、O3)或O4)的产品：
O1)下述O11)和/或O12)的蛋白质：
O11)权利要求5中所述TALEN-Xa5-1；
O12)权利要求5中所述TALEN-Xa5-2；
O2)下述O21)和/或O22)的基因：
O21)权利要求5或6中所述TALEN-Xa5-1的编码基因；
O22)权利要求5或6中所述TALEN-Xa5-2的编码基因；
O3)下述O31)和/或O32)的生物材料：
O31)与权利要求5中所述TALEN-Xa5-1相关的生物材料，为下述O31a)或O31b)：
O31a)含有权利要求5或6中所述TALEN-Xa5-1的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O31b)含有O31a)所述表达盒的重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O32)与权利要求5中所述TALEN-Xa5-2相关的生物材料，为下述O32a)或O32b)：
O32a)含有权利要求5或6中所述TALEN-Xa5-2的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O32b)含有O32a)所述表达盒的重组载体、重组微生物或重组细胞系；
O4)利用权利要求1-6中任一所述方法对Xa5基因进行突变得到的突变基因。
8.下述X1-X5中的任一应用：
X1、权利要求4中所述靶序列F和/或所述靶序列R在调控植物白叶枯病抗性中的应用；
X2、权利要求4中所述靶序列F和/或所述靶序列R在培育抗白叶枯病植物中的应用；
X3、权利要求7所述产品在调控植物白叶枯病抗性中的应用；
X4、权利要求7所述产品在制备调控植物白叶枯病抗性产品中的应用；
X5、权利要求7所述产品在培育抗白叶枯病植物中的应用。
9.根据权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为M1)-M8)中的任一种：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)含有Xa5基因的单子叶植物或双子叶植物；
M3)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C的单子叶植物或双子叶植物；
M4)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C，且含有权利要求4中所述靶序列F和所述靶序列R的单子叶植物或双子叶植物；
M5)水稻；
M6)含有Xa5基因的水稻；
M7)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C的水稻；
M8)基因组DNA中一条染色体或两条染色体对应于序列表中序列4的第116位和第117位的核苷酸分别为T和C，且含有权利要求4中所述靶序列F和所述靶序列R的水稻。
10.抗白叶枯病产品，含有权利要求7所述产品。
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