CN108220279A - 一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法 - Google Patents

一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多相催化技术领域，具体公开了一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，包括以下步骤：(1)制备介孔氧化硅载体材料：介孔氧化硅材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈三维互通的结构；(2)制备固定化酶；(3)催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在36‑39℃，搅拌速度控制在为95‑105r/min；固定化酶的用量为48‑55g/L，己酸浓度为0.28‑0.32mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8‑2。本发明的方案通过将游离酶固载在氧化硅载体上来增强脂肪酶的催化活性，在不加水的反应体系中，使合成已酸乙酯的效果效率明显提高。

Description

一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催 化合成己酸乙酯的方法
技术领域
本发明属于多相催化技术领域，主要涉及一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯活性的方法。
背景技术
酶是一种天然存在的高分子生物催化剂，其本身具有催化选择性强，反应速度快，反应条件温和，清洁无污染等特性，是开发绿色催化过程的优良选择。脂肪酶是一类特殊的酶，它不仅能催化酯水解、酯合成、酯交换、高聚物合成以及立体异构体拆分等有机反应，也可以在水溶液中进行油脂的改性，因此脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、废水处理方面、洗涤和生物表面活性剂的合成以及药物合成等许多领域得到广泛应用。
己酸乙酯是一种非常重要的精细化学品，能用作有机溶剂、用于有机合成、配制人造香精等，用途广泛。利用游离的脂肪酶催化己酸和乙醇进行酯化反应，在不加水的反应体系中，游离酶催化酯化反应的活性很低，合成己酸乙酯的量十分小，利用游离的脂肪酶合成己酸乙酯效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，与游离酶催化的己酸乙酯合成反应相比，都在不加水的反应体系中，使用该固定化酶催化合成已酸乙酯的效果明显提高，已酸乙酯产量可以显著增加。
为了达到上述目的，本发明的基础方案为：一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯活性的方法，包括以下步骤：
(1)准备介孔氧化硅材料：所述介孔氧化硅载体材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈三维互通的结构；纳米孔道的孔径为16-20nm，比表面积为560-630cm2g-1，孔容为2.5-2.8cm3g-1；
(2)制备固定化酶：采用步骤(1)的介孔氧化硅材料作为载体制备固定化酶；
(3)催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在37-40℃，搅拌速度控制在为95-105r/min；所述固定化酶的用量为48-55g/L，己酸浓度为0.28-0.32mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8-2。
本技术方案中的介孔氧化硅材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道内含有丰富的吸附水。这些吸附水可以增强固载的脂肪酶的催化活性，使其催化的己酸和乙醇酯化为己酸乙酯的反应中已酸的转化率得到显著提高，己酸乙酯的产量显著增加。利用该介孔氧化硅材料作为载体固载脂肪酶，得到的固定化酶，在不另外加水的反应体系中，该固定化酶催化己酸和乙醇发生酯化反应能够达到97％的己酸转化率。同样条件下，采用游离的脂肪酶催化己酸和乙醇发生酯化反应仅能达到14％的己酸转化率，远远低于在相同条件下固定化酶的己酸转化率。己酸和乙醇发生进行酯化反应时，合理控制反应的条件，使固定化酶能够发挥最大的效用；控制固定化酶的用量，使固定化酶能够充分且较为迅速的催化己酸和乙醇进行酯化反应；控制己酸和乙醇的用量，由于己酸的价格远高于乙醇，使乙醇过量，确保己酸能够完全反应，在反应体系中不存在剩余。利用本基础方案催化己酸和乙醇发生酯化反应，己酸的转化率高，已酸乙酯的产量多，效果十分显著。
进一步，所述介孔氧化硅材料采用以下步骤制备得到：(1)向HCl溶液中加入P123，搅拌得澄清溶液；(2)向得到的澄清溶液中加入1,3,5-三甲基苯，在33-38℃下搅拌3.5-4.5h；(3)将TEOS加入至步骤(2)得到的溶液中进行搅拌，回流水解得到水解混合物；(4)将步骤(3)得到的水解混合物在115-125℃下处理68-75h；(5)过滤步骤(4)的物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体；(6)将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后灼烧得到白色粉末。采用上述方法制备得到的介孔氧化硅材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道呈三维互通的结构，纳米孔道内含有丰富的吸附水，利用该介孔氧化硅材料作为载体制备固定化酶，纳米孔道内丰富的吸附水可以有效增强固定化酶的催化活性。
进一步，所述P123的用量为44-46g；所述HCl溶液的体积为1000-1100ml，浓度为1.75-1.82mol/L；所述TEOS用量为95-100ml；所述1,3,5-三甲基苯用量为33-34g。经过多次试验得到，采用上述配比制备介孔氧化硅材料，得到的介孔氧化硅材料性能更加优越。
进一步，制备介孔氧化硅材料的步骤(3)中，回流的温度为33-38℃，回流的时间为20-28h。将参数控制在上述范围，有利于获得水解混合物。
进一步，制备介孔氧化硅材料的步骤(6)中，灼烧的温度为540-560℃，时间为3.8-4.2h。步骤(5)得到的介孔氧化硅材料上还粘附有表面活性剂，为得到较为纯净的介孔氧化硅材料需将表面活性剂除去，而煅烧温度过高会导致材料的烧结，经过多次试验得到，将参数设置为以上范围，能在不破坏介孔氧化硅材料的基础上能够较好的除去表面活性剂。
进一步，所述固定化酶采用以下步骤制备得到：a、将介孔氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.2-1.8h；b、过滤步骤(1)得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物；c、用含酶滤液对滤出物冲洗3-4次，再用190-240mL缓冲液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化酶；d、将过滤后得到的固定化酶用滤纸吸干，放入4℃冰箱内保存。介孔氧化硅材料不会对脂肪酶的结构产生影响以致改变脂肪酶的催化性能，所以以此氧化硅材料为载体能够最大限度的保留脂肪酶的结构和催化性能。采用上述方法制备固定化酶，酶能够很好地固载在介孔氧化硅材料上，而且介孔氧化硅材料本身具有的三维堆积而成的纳米孔道能够得到很好的保持，不会受到破坏，可以保证介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水能够很好的与脂肪酶接触，增强脂肪酶的催化活性。
进一步，所述介孔氧化硅材料的用量为0.4-0.6g，酶液的用量为90-110ml。经过多次试验发现，采用上述的用量，脂肪酶能够较好地固载在介孔氧化硅材料上。
进一步，所述酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到缓冲液内中，搅拌0.8-1.2h，静止1.5-2h，取上清液；所述脂肪酶干酶粉的用量为4.8-5.2g,缓冲液的用量为1L。选用脂肪酶配制酶液，脂肪酶有助于催化合成己酸乙酯，同时介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水具有增强脂肪酶催化活性的作用，有助于提高己酸乙酯的合成量。
进一步，所述缓冲液为pH值为6.5-6.6的磷酸盐缓冲液。制备固定化酶时，选用该pH值的磷酸盐缓冲液，能够有效除去介孔氧化硅载体表面吸附不牢固的脂肪酶；制备酶液时，选用该pH值的磷酸盐缓冲液液，制备得到酶液性能较好。
附图说明
图1是本发明使用的介孔氧化硅材料的扫描电镜图(a,b)以及透射电镜图(c,d)；
图2是本发明使用的介孔氧化硅材料进行的吸附水脱附实验的质谱检测图；
图3是本发明使用的介孔氧化硅材料负载的固定化酶的扫描电镜图(a,b)以及透射电镜图(c,d)；
图4是游离酶、氧化硅载体材料、固定化酶的紫外-可见漫反射图；
图5是游离酶催化己酸和乙醇的酯化反应中，反应体系中加入的水的量对游离酶的催化活性影响的示意图；
图6是游离酶和固定化酶催化的己酸和乙醇的酯化反应的催化活性的对比图。
具体实施方式
下面对原料选用进行了说明，并以实施例1为例详细说明一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其它实施例在表1中体现，未示出的部分与实施例1相同。
制备固定化酶用到的脂肪酶干酶粉来自于深圳绿微康生物工程有限公司，按照国标(GB/T 23535-2009)里的橄榄油乳化法测定的酶活为25000U/g；对比例中使用的游离酶同为来自于深圳绿微康生物工程有限公司的脂肪酶干酶粉，酶活25000U/g。固定化酶中包含介孔氧化硅材料和脂肪酶干酶粉，50g的固定化酶中约含有5g脂肪酶干酶粉。
本发明用到的P123是一种三嵌段共聚物，全称为:聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，是一种非离子表面活性剂，来自Aldrich公司。
本发明用到己酸、乙醇、无水环己烷、TEOS皆为分析纯试剂，来自Aldrich公司；1,3,5-三甲基苯为BR试剂，来自Aldrich公司。
本发明用到的缓冲液为磷酸盐缓冲液，采用分析纯的NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O试剂配制，这些试剂来自成都科龙化工。
实施例1
一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，包括以下步骤：
(1)准备介孔氧化硅材料：如图1所示，介孔氧化硅载体材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈三维互通的结构；纳米孔道的孔径为18nm，比表面积为5600cm2g-1，孔容为2.6cm3g-1。介孔氧化硅材料采用以下步骤制备得到：A、向浓度为1.8mol/L、体积为1070ml的HCl溶液中加入44.5g的P123，搅拌得澄清溶液。B、向得到的澄清溶液中加入33.5g的1,3,5-三甲基苯，在35℃下搅拌4h。C、将97gTEOS加入至步骤B得到的溶液中，并搅拌回流水解，回流的温度为35℃，回流的时间为24h，得到水解混合物。D、将步骤C得到的水解混合物在120℃下处理72h。E、过滤步骤D的物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体。F、将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后在马弗炉中灼烧得到白色粉末，灼烧的温度为550℃，时间为4h。
(2)制备固定化酶：固定化酶采用以下步骤制备得到：a、将介孔氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.5h；其中介孔氧化硅材料的用量为0.5g，酶液的用量为100ml。酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到pH值为6.56的缓冲液内，搅拌1h，静止2h，取上清液，上清液即为酶液；其中脂肪酶干酶粉的用量为5g，缓冲液的用量为1L。b、过滤步骤a得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物；c、用含酶滤液对滤出物冲洗4次，再用200mLpH值为6.56的液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化酶；d、将过滤后得到的固定化酶用滤纸吸干，放入4℃冰箱内保存。
(3)催化己酸和乙醇发生酯化反应：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在37℃，搅拌速度控制在为100r/min；所述固定化酶的用量为50g/L，己酸浓度为0.3mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.9。
表1
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于：没有步骤(1)、(2)的操作，步骤(3)己酸和乙醇发生酯化反应：以无水环己烷为溶剂，游离的脂肪酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在37℃，搅拌速度控制在为100r/min；其中游离酶的用量为5g/L，己酸浓度为0.3mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.9。
对比例2
在与实施例1相同的条件下，采用游离的脂肪酶作为催化剂催化已酸和乙醇进行酯化反应，在反应体系中加入水。加入水的体积的不同，己酸的转化率发生变化，根据这个变化做出图5。
分析说明：
将实施例1与对比例1进行对比，可以看出，实施例1中的己酸转化率高达到90％以上，而对比例1中的己酸转化率远远低于20％，如图6所示。这说明，在同为不加水的反应体系中，使用本技术方案合成己酸乙酯的效果远远优于使用游离的脂肪酶催化合成己酸乙酯。
分析对比例2，在反应体系中加入比例为1Vol.％的去离子水时，己酸转化率显著增高，可达到86％左右，这说明反应体系中水的加入可以显著增加上述游离的脂肪酶催化己酸和乙醇的酯化反应的能力，加入的去离子水超过1Vol.％时，随着去离子水的增加，己酸转化率下降。与实施例1相比，使用游离酶催化合成己酸乙醋，即便在加入水的反应体系中，己酸的转化率仍低于使用不发明中的固定化酶催化合成己酸乙醋。
对实施例1中的介孔氧化硅材料进行电镜扫描，得到图1，从图1a中可以看到此材料的粒子形貌均一，全部呈现为团状聚集体，尺度在1-5微米左右。图1b所示的分辨率更高的扫描电镜图中可以辨认出图1a中的聚集体粒子由很多的纳米孔道所组成，这些孔道呈现互相交错的形态。从图1c,d所示的透射电镜图中可以看到这种材料的聚集体粒子由所含的纳米孔道三维堆积而成，这些孔道的孔径非常均一。所得的氧化硅材料的孔径为18nm，比表面积为600cm2g-1，孔容为2.6cm3g-1。
图2是对实施例1中的介孔氧化硅材料进行的吸附水脱附实验的质谱检测图。图中可见，对应H2O的质量数为18的信号在脱附温度为30℃左右即开始明显增加，随着脱附温度的逐渐增加而急剧上升，在脱附温度为在80℃时达到最大值，然后逐渐下降，在140℃左右已经降低到和基线相当的水平。继续增加脱附温度至在288℃左右也没有观察到其他的H2O的信号。吸附水脱附实验说明在此氧化硅材料的纳米孔道内存在丰富的吸附水，这些吸附水在脱附温度为30℃即可脱附说明其应该是物理吸附水，具有和游离态的水相似的性质。
图3是对实施例1中的介孔氧化硅材料负载的固定化酶的扫描电镜图(a,b)以及透射电镜图(c,d)。对比图1所示的氧化硅载体材料的扫描电镜图和透射电镜图，可以发现经过上述固定化酶的制备过程，载体材料的粒子形貌和三维堆积的纳米孔道结构都的到了很好的保持。
图4是游离酶(脂肪酶干酶粉)、介孔氧化硅材料、固定化酶的紫外-可见漫反射图。可以看到载体材料的谱图在整个波长范围内都没有表现出吸收峰。游离酶的谱图则在波长为276nm处有一个清晰的吸收峰；在波长接近200nm处呈现出一个很强的吸收边。固定化酶的谱图表现出与游离酶的谱图非常一致的特征，同样在276nm处具有一个明显的吸收峰，以及接近200nm处的很强的吸收边。这说明经过上述制备过程，游离酶被成功地固载在载体材料上得到了固定化酶催化剂。

Claims (9)

1.一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备介孔氧化硅材料：所述介孔氧化硅载体材料具有三维堆积而成的纳米孔道，纳米孔道内含有吸附水，纳米孔道呈三维互通的结构；纳米孔道的孔径为16-20nm，比表面积为560-630cm2g-1，孔容为2.5-2.8cm3g-1；
(2)制备固定化酶：采用步骤(1)的介孔氧化硅材料作为载体制备固定化酶；
(3)催化合成己酸乙酯：以无水环己烷为溶剂，固定化酶为催化剂，加入已酸和乙醇进行酯化反应，反应温度控制在37-40℃，搅拌速度控制在为95-105r/min；所述固定化酶的用量为48-55g/L，己酸浓度为0.28-0.32mol/L，己酸与乙醇的摩尔比为1:1.8-2。
2.根据权利要求1所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述介孔氧化硅材料采用以下步骤制备得到：
(1)向HCl溶液中加入P123，搅拌得澄清溶液；
(2)向得到的澄清溶液中加入1,3,5-三甲基苯，在33-38℃下搅拌3.5-4.5h；
(3)将TEOS加入至步骤(2)得到的溶液中进行搅拌，回流水解得到水解混合物；
(4)将步骤(3)得到的水解混合物在115-125℃下处理68-75h；
(5)过滤步骤(4)的物料，得到白色固体，用去离子水冲洗滤出的白色固体；
(6)将冲洗后的白色固体在室温下干燥，然后灼烧得到白色粉末。
3.根据权利要求2所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述P123的用量为44-46g；所述HCl溶液的体积为1000-1100ml，浓度为1.75-1.82mol/L；所述TEOS用量为95-100g；所述1,3,5-三甲基苯用量为33-34g。
4.根据权利要求3所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：制备介孔氧化硅材料的步骤(3)中，回流的温度为33-38℃，回流的时间为20-28h。
5.根据权利要求4所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：制备介孔氧化硅材料的步骤(6)中，灼烧的温度为540-560℃，时间为3.8-4.2h。
6.根据权利要求1所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述固定化酶采用以下步骤制备得到：
a、将介孔氧化硅材料放入装有酶液的容器中，搅拌吸附1.2-1.8h；
b、过滤步骤(1)得到的物料，分别得到含酶滤液和滤出物；
c、用含酶滤液对滤出物冲洗3-4次，再用190-240mL缓冲液冲洗滤出物，然后再次过滤得到固定化酶；
d、将过滤后得到的固定化酶用滤纸吸干，放入4℃冰箱内保存。
7.根据权利要求6所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述介孔氧化硅材料的用量为0.4-0.6g，酶液的用量为90-110ml。
8.根据权利要求7所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述酶液采用以下步骤制备得到：取脂肪酶干酶粉加入到缓冲液内中，搅拌0.8-1.2h，静止1.5-2h，取上清液；所述脂肪酶干酶粉的用量为4.8-5.2g,缓冲液的用量为1L。
9.根据权利要求8所述的一种利用介孔氧化硅材料纳米孔道内的吸附水增强脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH值为6.5-6.6的磷酸盐缓冲液。
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