CN108220194B - 一株具防病促生功能的小链霉菌及其应用 - Google Patents

一株具防病促生功能的小链霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株可防治蔬菜土传病害并具有促生功能的小链霉菌菌株及其应用。本发明所提供的小链霉菌(Streptomyces parvus)，于2017年12月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.15001。该菌株分离自植物根际，生长比较迅速，产孢量大，发酵周期短，适用于实际生产。菌株HS57不仅对植物土传真菌病害侵染植物引起的病害及受真菌感染的土壤具有高效的生物防治作用，还能促进植物根系生长；其营养需求简单、生产成本低，具有良好的应用前景。

Description

一株具防病促生功能的小链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，特别涉及一株防治植物土传病害并具有促生功能的小链霉菌及其应用。
技术背景
土壤微生物可以划分为几大类群，细菌、真菌、放线菌。放线菌是产生抗生素最多的重要微生物类群，许多放线菌产生的抗生素和其他代谢产物对植物土传病害都有一定程度的防治效果，但目前很少有研究使用放线菌活菌制剂防治植物病害。国内也没有登记注册的商品化制剂，国外登记活菌制剂只有两种，分别是使用Streptomyces griseoviridisK61制成的可湿性粉剂Mycostop和Streptomyces lydicus WYEC 108制成的ActinovatePlus/M和Action-Iron。有关小链霉菌(Streptomyces parvus)防治植物病害和生产抗菌药物的研究报道，都是用于细菌性病害如番茄溃疡病和病毒病如烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)的防治，以及用于治疗由细菌耐药菌株感染引起的疾病的药物达托霉素(daptomycin)的生产。有关小链霉菌对真菌病害的防治研究还未见报道。尤其是针对发病严重的蔬菜土传病害，更缺乏相应的放线菌活菌制剂。获得具有我国自主知识产权的可防治多种土传病害的新的放线菌制剂，对补充生防资源以及病害的防控具有重要的现实意义。
本课题组从中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地的健康黄瓜根际分离到一株放线菌HS57，被鉴定为小链霉菌Streptomyces parvus，该菌株对多种土传病害，如：黄瓜枯萎病、菜豆根腐病、番茄根腐病等病害具有抑制作用，其中对黄瓜枯萎病具有强烈的抑制作用，防效可达60％以上。该菌株除了具有防病作用外，还可以促进植物的生长，是一株非常有应用潜力的菌株。
对于植物病害生防菌活菌制剂来说，提高制剂中含菌量，降低生产成本，简化生产条件，是实现生防菌大规模生产和应用的前提条件。目前国内外有关小链霉菌(Streptomyces parvus)菌株的发酵工艺研究较少，国内相关研究报道中所使用的Streptomyces parvus菌株是从土壤(田兆丰，2011；2015)或海洋(孙建龙，2012)中筛选出来的，与我们从黄瓜根际分离的小链霉菌HS57的环境差异很大，这也直接导致这些菌株在营养需求上的差异。而且很多研究也表明，即使同一种属的不同菌株对营养的需求也不尽相同。因此开展对植物土传病害具有防病作用的生防菌Streptomyces parvus HS57的发酵工艺研究，研制具有我国自主知识产权的生防菌剂对植物土传病害的防控具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株防治植物土传病害并具有促生功能的小链霉菌及其应用。
本发明所提供的小链霉菌菌具体为小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57菌株，该菌株已于2017年12月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15001。
本发明还包括活性成分为所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的菌剂。
所述菌剂中还可包括吸附载体；所述吸附载体可为硅藻土、草炭、蛭石、稻壳粉、玉米芯粉、珍珠岩和碳酸钙中的至少一种。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述吸附载体具体由稻壳粉和硅藻土按照体积比1∶1～3∶1的配比混和而成。
进一步，所述菌剂由所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的发酵液，或对发酵液进行离心后所得菌泥与所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg(如1L∶1Kg)的配比混和而成。
在本发明的一个实施例中，制备所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的发酵液时采用大量发酵培养液，所述小链霉菌HS57的发酵液中小链霉菌HS57的活菌数为10～80亿/mL(如30亿/mL)。其中，所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：水溶性淀粉0.2～0.5％、玉米淀粉0.3～0.8％、豆饼粉1.2～1.5％、MgSO4·7H2O 0.003～0.005％、碳酸钙0.03～0.05％；其中，％表示质量百分含量。
所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：
(1)培养所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57，得到所述小链霉菌HS57的发酵液；在所述发酵液中，所述小链霉菌的活菌数为10～80亿/mL(如30亿/mL)；
(2)将步骤(1)所得发酵液或离心后的菌泥和所述吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg(如1L∶1Kg)的配比混和，得到所述菌剂。
在步骤(1)中，培养所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：水溶性淀粉0.2～0.5％、玉米淀粉0.3～0.8％、豆饼粉1.2～1.5％、MgSO4·7H2O 0.003～0.005％、碳酸钙0.03～0.05％；其中，％表示质量百分含量。
所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的发酵液也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种用于防治植物土传病害、促进植物生长性能的产品。
本发明所提供的用于防治植物土传病害的产品。
所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57或所述菌剂或所述发酵液在如下(1)或(2)中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)防治植物土传病害、促进植物生长；
(2)制备用于防治植物土传病害的产品
所述植物土传病害具体为由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、丝核菌(Rhizoctonia solani)等病原真菌引起的土传病害。
所述植物具体可为黄瓜、番茄、红芸豆。
本发明还提供了一种防治植物土传病害的方法。
本发明所提供的防治植物土传病害的方法，具体可为如下(A)、(B)、(C)或(D)：
(A)包括如下步骤：向植物种子中加入所述菌剂稀释液，进行拌种后播种。所述的菌剂稀释液的浓度为0.1亿/mL；
(B)包括如下步骤：将所述植物的根系置于所述菌剂的稀释液中浸泡，浸泡后栽种，并在生长期灌根。所述的菌剂稀释液的活菌数为0.1亿/mL；
(C)包括如下步骤：所述菌剂与育苗基质混和，然后将所述植物播种于育苗基质中；
(D)上述(A)、(B)、(C)方法的两两任意组合或三种方法的组合使用。
在所述(A)中，所述菌剂中所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为15亿/g；所述植物种子与所述菌剂(所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为15亿/g)的混和配比具体可为1∶1(质量比)。进一步，所述拌种具体为：将所述菌剂(所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为15亿/g)与水按照1g∶150mL的配比稀释成稀糊状物，再向其中加入与所述菌剂等质量的所述植物种子进行搅拌。
在所述(B)中，所述菌剂的稀释液中所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为0.1亿/mL；所述浸泡的时间为30min。
在所述(C)中，所述混和后基质中所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为0.1亿/g；
在所述(D)中，所述菌剂的浓度与所述的(A)、(B)、(C)中各自的使用浓度一致。
本发明所提供的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57CGMCC No.15001具有如下优势：
1、该菌株分离于健康植物根际，与植物亲和力强，能够在植物根际快速大量定殖，具有生态位优势。
2、对多种植物病害具有高效防治作用，还能促进植物生长。
3、该菌株的营养需求比较简单，发酵周期短，成本低，容易大规模生产和商品化应用。
本发明所提供的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57 CGMCC No.15001是从中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地的健康黄瓜根际分离到的一株放线菌。该菌株的特点是：在高氏一号或PDA培养基平板上培养时，该菌株生长速度很快，这是生防菌可大规模生产和应用的前提条件之一。对黄瓜枯萎病、菜豆根腐病、番茄根腐病等多种病害具有抑制作用。该菌株除了具有防病作用外，还可以促进植物根系的生长，是一株非常有潜力的菌株。经鉴定，该菌株为小链霉菌(Streptomyces parvus)，定名为HS57。该菌株对黄瓜枯萎病具有强烈的抑制作用，防效可达60％以上。HS57菌株发酵培养时，生长速度快、48小时之内可完成发酵，发酵结束后活菌数可达到30～80亿/mL，生产成本低。因此HS57是一株非常有潜力的植物土传病害生防菌，从而提出了本发明。
保藏说明
菌种名称：小链霉菌
拉丁名：Streptomyces parvus
菌株编号：HS57
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年12月1日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15001
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的分离与鉴定
(一)小链霉菌HS57菌株的分离
本发明的小链霉菌(Streptomyces parvus)是从健康黄瓜根际中，对紧贴在根上1mm的根际土进行系列梯度稀释涂布后分离获得的，分离方法为：
(1)小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的分离：在河北省廊坊市农科院试验基地，采集健康黄瓜根际土。称取过孔径为2mm网筛的根际土1g，放入加有玻璃珠的99mL无菌水的三角瓶中，置于180rpm的摇床上摇30min。用移液枪进行系列梯度稀释。取100μL稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个梯度涂布三个培养皿，27～28℃培养3～7天。挑取不同形态的放线菌，转接到高氏一号培养基(即NA固体培养基)上划线纯化。
所述高氏一号培养基组分及配比为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g、蒸馏水1000mL，调pH到7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌30min。
配制时，先用冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000mL。
(2)小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57除菌发酵滤液对病原真菌的抑制作用
采用含毒介质法测定小链霉菌HS57除菌发酵滤液对病原菌F.oxysporum、R.solani和F.solani的抑制作用，结果表明(表2)：小链霉菌HS57的除菌发酵滤液对病原菌F.oxysporum的抑制效果很好，抑制率可达63.91％；对病原菌R.solani和F.solani的抑制率分别为55.92％和59.48％。
表1 小链霉菌HS57次级代谢产物对病原菌的抑制
Figure BSA0000157130410000041
(二)小链霉菌HS57菌株的鉴定
提取菌株HS57的基因组DNA，用通用引物27F和1492R扩增16S rDNA序列，并进行测序。
27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3′。
菌株HS57的16S rDNA的序列已经提交GenBank，登录号为MG551267。鉴于上述分子生物学特性鉴定结果，将步骤一分离并纯化得到的菌株HS57鉴定为小链霉菌(Streptomyces parvus)。该小链霉菌(Streptomyces parvus)已于2017年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15001。
实施例2：
小链霉菌(Streptomyces parvus)菌剂的制备
1、将实施例1获得的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57 CGMCC No.15001的菌苔移植到种子培养液中，28～30℃摇床振荡培养20h得到种子液。
其中，种子培养液组成成分为：可溶性淀粉4.8g、牛肉膏0.6g、葡萄糖0.2g、酵母粉1.0g、蛋白胨0.6g、pH 7.0，蒸馏水定容至200mL，分装成4瓶，碳酸钙0.2g/瓶。
2、按3％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到大量培养发酵培养液中，培养温度28℃，转速150～180rpm，初始pH 7.0～7.2，培养时间40h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57 CGMCC No.15001的活菌数可达70亿/mL。
3、将步骤2获得的小链霉菌发酵液经离心获得的菌泥与吸附载体——稻壳粉和硅藻土(体积比2∶1)按照体积质量比为1∶1(即1L∶1Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述离心转速为12000rpm，离心时间为20min；所述的菌剂中小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57CGMCC No.15001的活菌数可达150亿/g，含水量在5％以内。
实施例3：小链霉菌HS57菌剂的防病作用
对黄瓜枯萎病的防治效果：先用Armstrong培养液对镰刀菌进行培养，3～4天后镜检计数，将培养液用500目无菌网筛过滤后，稀释至1×105孢子/mL备用；将HS57菌剂稀释至1×107cfu/mL备用。将镰刀菌孢子悬浮液与HS57菌剂悬浮液按体积比1∶10混和，然后将消毒好的种子加入混和液中浸种30min。每处理3个重复，每个重复播种10粒黄瓜种子，以不混和HS57菌剂悬浮液的等量无菌水中浸种的处理作对照。播种3周后调查黄瓜的生长发病情况。
所述的Armstrong培养液的组分和配比为：葡萄糖20.0g，KCl 1.6g、MgSO4.7H2O0.4g、Ca(NO3)2 5.9g、KH2PO4 1.1g，FeSO4 0.2μg/mL，ZnSO4 0.2μg/mL、MnSO4 0.2μg/mL，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌30min。
其中，FeSO4、ZnSO4、MnSO4可先配成母液。即分别称取上述三种药品0.02g于100mL蒸馏水中，混合均匀后取1mL于上述999mL混合液中即可。
表2 小链霉菌HS57菌剂对黄瓜枯萎病的防病效果
Figure BSA0000157130410000061
调查结果(表2)表明，不同浓度的HS57菌悬液处理对黄瓜枯萎病的防效不同，菌剂中孢子浓度为106和107cfu/mL时防效较好，分别为76.6％和78.8％。
对番茄根腐病的防治效果：采用病原菌拌土测定菌剂HS57对番茄根腐病的防病效果。将20mL孢子浓度为107cfu/mL的HS57菌液浇灌到生长3周的番茄苗根部，一天后将直径为5mm的培养好的番茄根腐病病原菌接在番茄苗根部，9天时调查发病情况。
由表3可知，9天时，小链霉菌HS57对番茄根腐病的防治效果可达100％。
表3 小链霉菌HS57菌剂对番茄根腐病的防治效果
Figure BSA0000157130410000062
实施例4：小链霉菌HS57发酵液的促生作用
将黄瓜种子在68℃烘箱中烘3h，然后用1％的NaClO浸泡30s，无菌水漂洗5次，转移到无菌的滤纸上，晾干，用不同浓度(106、107cfu/mL)的小链霉菌HS57菌剂浸泡半小时，播种于无菌的按照体积比1∶1混和的基质和砂子中。共5种处理，每处理3次重复，每重复15颗种子，共45颗种子，以等体积无菌水处理的种子为对照。记录出苗时间、出苗率；生长1周后测定株高，2周后测定株鲜重和根鲜重。
表4 不同浓度的小链霉菌HS57菌剂对黄瓜生长的影响
Figure BSA0000157130410000063
由上表4可看出，小链霉菌HS57菌剂浓度为106和107cfu/mL时对黄瓜具有一定的促生作用，且对株高及根鲜重的促生作用较明显。

Claims (8)

1.小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15001。
2.一种活体菌剂，其活性成分为权利要求1所述的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的活菌数为30～80亿/mL。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为固体菌剂，由所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的发酵液和吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg的配比混和而成的固体菌剂，或所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57发酵液经离心后的菌泥和吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg的配比混和而成。
5.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)培养权利要求1所述的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57，得到所述小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液或发酵液经离心后的菌泥和权利要求2中所述的吸附载体按照1L∶1Kg至1L∶3Kg的配比混和，得到所述菌剂。
6.根据权利要求5所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养权利要求1所述的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57的培养基的溶剂为水，培养基溶质及浓度如下：水溶性淀粉0.2～0.5％、玉米淀粉0.3～0.8％、豆饼粉1.2～1.5％、MgSO4·7H2O0.003～0.005％、碳酸钙0.03～0.05％；其中，％表示质量百分含量。
7.根据权利要求1所述的小链霉菌(Streptomyces parvus)HS57在防治植物土传病害、促进植物生长中的应用。
8.根据权利要求2-4任一权利要求所述的菌剂在防治因病原菌侵染引起的植物土传病害、促生功能中的应用，其特征在于，所述的植物土传病害为由镰刀菌Fusariumoxysporum、Fusarium solani、丝核菌Rhizoctonia solani、黄瓜枯萎病或番茄根腐病病原真菌引起的土传病害。
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