CN114908012A - 一株利于稻渔共生的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株利于稻渔共生的菌株及其应用，涉及一株菌株及其应用。本发明一株利于稻渔共生的菌株为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR‑7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24199。本发明上述利于稻渔共生的菌株在稻田养鱼中的用途。本发明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR‑7是一株具有解磷、产铁载体，并且具有较好的耐酸耐胆盐功能的菌株；可促进植物生长和增加农作物产量，从而降低农药化肥的使用量，降低生产成本，促进生态农业绿色发展等。

Description

一株利于稻渔共生的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株菌株及其应用。
背景技术
稻田养鱼共作技术的不断革新以及对稻渔共作模式的深入研究，稻渔共生生态系统应用发展迅速，成果斐然；但是国内外的研究主要集中于稻渔共生互利机制、稻田养殖病虫害控制及经济效益等研究。
发明内容
本发明从稻渔共生系统中微生物对养殖生物影响的全新角度出发，提供了一株利于稻渔共生的菌株及其应用。
本发明一株利于稻渔共生的菌株为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus) XCR-7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24199。
本发明上述利于稻渔共生的菌株在稻田养鱼中的用途。
本发明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌落为圆形，无色透明状，边缘整齐，中间突起，有黏性，经革兰氏染色为革兰氏阳性菌。在37℃培养环境中解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在SKM固体培养基上乳蛋白的水解圈直径D为16.04mm，菌落直径d为3.22mm，D/d为4.98；在37℃环境中DDP-IV抑制剂产率高达61.27％。解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus) XCR-7具有较强的解有机磷能力；解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7为能产生高铁鳌合能力的铁载体，37℃环境中产铁载体的Su值为57％。
在37℃条件下本发明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在胆盐浓度为0.6％的环境中存活率仍保持为79％；且解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7具有优异的耐酸性。
本发明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7是一株具有解磷、产铁载体，并且具有较好的耐酸耐胆盐功能的菌株；可促进植物生长和增加农作物产量，从而降低农药化肥的使用量，降低生产成本，促进生态农业绿色发展等。
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7可产生DDP-IV抑制剂，能够提升鱼饲料的利用率；且解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)XCR-7 对于水稻种子的萌发具有优异的促生作用。因此，解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7利于稻渔共生，促进稻田养鱼增产增收。
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7为解木糖赖氨酸芽孢杆菌，属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24199，保藏日期为2021年12月27日。
附图说明
图1是解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在SKM培养基上乳蛋白的水解试验结果图；
图2是解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在无机磷细菌培养基上的解磷试验结果图；
图3是解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在有机磷细菌培养基上的解磷试验结果图；
图4是解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7在CAS固体检测培养基上的铁载体筛选试验结果图；
图5是由解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7构建的系统发育树；
图6是实施例3中实验28d后解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus) XCR-7菌悬液浸种的水稻植株与清水浸种的对照组水稻植株的对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式一株利于稻渔共生的菌株为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24199。
2021年9月，选取黑龙江省鸡西市密山市兴凯湖区养殖的鲤，将鲤肠道内含物置于含玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将 10-3、10-4、10-5梯度取100μL涂布于SKM培养基(请给出中文名称或英文全称)平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。采用乳蛋白水解圈的方法进行筛选，挑取产生透明圈的菌株进行纯化。然后，将纯化的菌株接种于96孔板，每孔准确滴加25μL、1.6mmol/L 的甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺和25μL的CFS或CFE；在37℃下反应15min，再加入50μL、 0.01U/mL的DDP-IV(二肽基肽酶IV)，在37℃继续反应1h，之后再加入100μL、1mol/L 的醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.0)终止反应，使用酶标仪在405nm处检测反应溶液的吸光值，获取菌株DDP-IV抑制率。
其中，DDP-IV抑制率计算公式为：
Figure BDA0003651554240000031
A待测样品：25μL样品+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠；
A样品空白：25μL样品+50μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠；
A阴性对照：25μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠；
A阴性空白：75μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠。
挑选DDP-IV抑制率较高的菌株。其中，菌株XCR-7在SKM固体培养基上乳蛋白的水解圈直径D为16.04mm，菌落直径d为3.22mm，D/d为4.98(如图1所示)；菌株XCR-7在37℃环境中DDP-IV抑制剂产率高达61.27％。
将具有较高DDP-IV抑制率的分离纯化菌株分别用灭菌牙签接种于有机磷细菌培养基与无机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。观察是否有溶磷圈出现。其中，菌株XCR-7在无机磷细菌培养基上培养一段时间后菌落周围具有一定的透明圈出现，随着培养时间的增加，透明圈没有明显的变化(如图2所示)；菌株XCR-7在有机磷细菌培养基上具有较为明显的透明圈出现(如图3所示)。表明菌株XCR-7具有较强的解有机磷能力，而解无机磷的能力相对较弱。
将具有较高DDP-IV抑制率的分离纯化菌株重新活化后接种到LB平板上培养24h，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到CAS固体检测培养基，37℃倒置培养2～3d，观察菌落周围变色圈大小。其中，菌株XCR-7在CAS培养基上培养一段时间后菌落周围形成明显的变色圈，说明菌株XCR-7能产生高铁鳌合能力的铁载体(如图4所示)。
对菌株XCR-7进行铁载体含量试验：
(1)将活化的菌苔接种于限铁SA液体培养基中，37℃摇床培养48h；
(2)将生长48h的菌株XCR-7菌悬液转移到已灭菌的10mL离心管中，13000rpm离心15min；
(3)将上清液转移到经浓盐酸处理过的试管中，加入一定量现配的CAS检测液使上清液与检测液的体积比为1:1，充分混匀后室温静置1h；
(4)测定630nm波长处的吸光度值(A)，取双蒸水作为对照调零，以同法测定的未接种的SA限铁培养基与检测液混合后630nm(Baakza et al.,2004)波长处的吸光度值作为参比值(Ar)，并以下式表示铁载体活性单位：
Su≈(Ar-As)/Ar×100；
式中：Su为铁载体含量；Ar为所测未接种的SA限铁培养基与检测液上清液的OD值；As为所测培养基上清液的OD值。铁载体活性单位小于10时，一般认为是阴性的，并且铁载体与检测液的混合物无颜色变化。
经检测，菌株XCR-7在37℃环境中产铁载体的Su值为57％，说明菌株XCR-7具有较强的产铁载体能力。
菌株XCR-7的16S rRNA鉴定：采用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株DNA。采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL体系：10×缓冲液2.5μL、Taq酶0.5μL、dNTPs 2μL、引物27F 0.5μL、引物1492R 0.5μL、DNA模板1μL、ddH2O 18μL。PCR扩增反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性50s、56℃退火30s、72℃延伸1.5min，循环次数30次；72℃再延伸10min，4℃保存。将PCR扩增产物送往RuiBiotech公司测序，菌株XCR-7的16S rRNA与解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)(FJ477040.1)相似度为99％。通过NCBI数据库比对菌株16S rRNA的测序结果，并构建系统进化树(如图5所示)。由图5菌株XCR-7的系统发育树可以看出菌株XCR-7与解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)(FJ477040.1)同处最小的一个分支，进化距离较近。
菌株XCR-7的生理生化鉴定：将菌株XCR-7在固体LB培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。菌株XCR-7菌落为圆形，无色透明状，边缘整齐，中间突起，有黏性，经革兰氏染色为革兰氏阳性菌。菌株XCR-7的部分生理生化指标如表1所示。
表1
Figure BDA0003651554240000041
Figure BDA0003651554240000051
XCR-7与解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化以及16S rRNA鉴定结果，确定菌株XCR-7为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，将其命名为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)XCR-7。
铁载体是微生物铁吸收的一种重要方式，可改善微生物对铁离子的吸收运输，增加环境中铁离子移动性，由此大幅增加植物生产的生物量。含有铁载体的解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7，不但能促进稻鱼共生中水稻的生长，而且能通过产生更高亲和力的铁载体与致病菌竞争铁元素达到抑菌效果，提高鲤免疫防御能力，降低病原菌在肠道菌群中的比例。
溶磷微生物可将植物不能吸收利用的固定态磷转化为可吸收的有效磷，因此，解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7可供植物吸收利用，促进植物根系生长，改善根系组成，从而增加作物产量，减少化学肥料投入。
具体实施方式二：本实施方式配制解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus) XCR-7菌液。
黄豆芽500g加水100mL，煮沸1h，过滤后补足水分，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为50％的豆芽汁。
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌液培养基由1000mL 质量分数为10％豆芽汁、14g葡萄糖、2.2g氯化铵和0.6g磷酸二氢钾组成。
以0.2％的接种量将解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7种子液接种于解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)XCR-7菌液的活菌数达到6.58×108cfu/mL，(而种子液中活菌数为4.23×108cfu/mL)。
实施例1
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7耐酸实验：
配制LB液体培养基并用0.1mol/L盐酸调节液体培养基pH值分别为2.0、3.0、4.0，再以2％的接种量将解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌液(菌液活菌数6.58×108cfu/mL)分别接种于上述液体培养基中，并设置不加盐酸的培养基作为对照。37℃培养3h，之后活菌计数。选择合适的稀释度，吸取100μL液体涂布平板，每个稀释度两个平板，在超净台内吹干。
存活率＝酸调节培养液的活菌数/不加盐酸培养液的活菌数×100％。
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7耐酸实验结果如表2所示。说明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7具有优异的耐酸性。
表2
Figure BDA0003651554240000061
实施例2
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7耐胆盐实验：
将解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌液(菌液活菌数6.58 ×108cfu/mL)以2％的接种量分别接种于不同胆盐浓度0.2％、0.4％和0.6％的液体培养基中，设置无胆盐培养基做对照，37℃培养4h，之后活菌计数。每个稀释度两个平板，在超净台内吹干。
存活率＝胆盐培养液的活菌数/不加胆盐培养液的活菌数×100％。
解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7耐胆盐实验结果如表3所示。说明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7具有优异的耐胆盐性能。
表3
Figure BDA0003651554240000062
实施例3
将解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7接入50mL LB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养过夜，用无菌水将培养液稀释至菌体浓度为105CFU/mL，作为菌悬液，备用。
选取150粒饱满一致的龙粳31水稻种子置于55℃温水中浸泡18h，然后随机均分为2组分别置于1×105cfu·mL-1解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7 菌悬液和清水中浸泡5h；将浸种后的种子，用蒸馏水冲洗3次后，均匀置于垫有3层滤纸的培养皿中(直径10cm)，对应喷撒5mL浸种液(即浸泡在解木糖赖氨酸芽孢杆菌 XCR-7菌悬液中的种子喷撒5mL解木糖赖氨酸芽孢杆菌XCR-7菌悬液，浸泡在清水中的种子喷撒5mL清水)于种子表面。28℃条件下催芽后，播于含15kg水稻田土壤移栽盆中，每盆5粒，28d后取苗，测量其株高、根长、分蘖数、总株鲜质量和总株干质量，3次重复。
实验结果如表3所示，其中经解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus) XCR-7菌悬液浸种的水稻植株生物量明显高于清水浸种的对照组。与对照相比，经解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7菌悬液浸种处理的水稻植株，其根长、株高、分蘖数、总株质量和总干质量分别增加了28.42％、22.59％、124.47％、112.84％和158.54％，呈差异显著。说明解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus xylanilyticus)XCR-7 对于水稻种子的萌发具有优异的促生作用。
表3
Figure BDA0003651554240000071

Claims (2)

1.一株利于稻渔共生的菌株，其为解木糖赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus)XCR-7，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24199。
2.如权利要求1所述利于稻渔共生的菌株在稻田养鱼中的用途。
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