CN108201539B

CN108201539B - 联苯核苷氨基磷酸酯化合物的应用

Info

Publication number: CN108201539B
Application number: CN201711326774.3A
Authority: CN
Inventors: 张先; 赵立文; 储刚; 张亚楠; 朱玉成
Original assignee: 南京汇诚制药有限公司
Current assignee: Nanjing Huicheng Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108201539A

Abstract

本发明属于医药化学领域，提供本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶在制备用于治疗黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染后耐药患者，和/或预防耐药患者疾病发作或复发的药物中的应用。本发明的式1化合物具有好的抗耐药HCV的活性。

Description

联苯核苷氨基磷酸酯化合物的应用

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及具有肝炎病毒抑制作用的联苯核苷氨基磷酸酯化合物的应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界范围内流行的疾病，全球慢性感染者已超过2亿，埃及的慢性感染率为15％，巴基斯坦为4.8％，中国为3.2％，位列世界前三。丙型肝炎病毒感染的临床表现多样，轻至炎症，重至肝硬化、肝癌。慢性丙型肝炎还可以并发某些肝外表现，包括类风湿性关节炎、干燥性结膜角膜炎、扁平苔藓、肾小球肾炎、混合型冷球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和迟发性皮肤卟啉症等，可能是机体异常免疫反应所致。且丙肝肝硬化失代偿期时，可以出现各种并发症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性脑病，肝肾综合征，肝衰竭等表现。

HCV属于黄病毒科肝病毒属病毒，其与黄病毒科中的另外两个属即瘟病毒属和黄病毒属的基因结构相似。目前，治疗HCV感染的标准方法有干扰素以及干扰素和利巴韦林联合疗法。不过，仅50％的治疗者对该方法有反应，且干扰素具有明显的副作用，例如流行性感冒样症状、体重减低以及疲乏无力，而干扰素和利巴韦林联合疗法则产生相当大的副作用，包括溶血、贫血症和疲乏等。

另外，已开发的用于治疗HCV感染的药物包括蛋白酶抑制剂、噻唑烷衍生物、噻唑烷和N-苯甲酰苯胺、菲醌、解旋酶抑制剂、核苷聚合酶抑制剂和胶霉毒素、反义硫代磷酸酯寡核苷酸、依赖于IRES的翻译的抑制剂、核酶以及核苷类似物等。目前，核苷磷酸酯类化合物用于治疗黄病毒科病毒尤其是HCV感染是本领域的重要研发方向。

CN104031104A公开了一种如式1所示的新型核苷氨基磷酸酯化合物，其化学名称为(2S)-2-((([1，1′-联苯]-4-基氧基)(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯，该篇文献以其全部内容引入本文作为参考，

CN104031104A报道了(2S)-2-((([1，1′-联苯]-4-基氧基)(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯具有优异的抗病毒活性，对细胞的毒性小，可用于治疗黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染。

众所周知，随着抗HCV小分子药物的诞生，HCV耐药问题日益严重，这主要与抗HCV药物相关的耐药突变有关。因此，研究抗HCV药物对耐药丙肝患者的治疗作用，寻找新的抗HCV耐药药物有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶用于治疗和/或预防黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染后耐药患者的应用。

令人惊奇地，本发明的发明人现已发现，NS5B聚合酶核苷类抑制剂的耐药突变复制子S96T和S282T，非核苷类抑制剂的耐药突变复制子M414T，NS5A蛋白抑制剂的耐药突变复制子Q30E、L31V、Y93H突变，以及NS3蛋白酶抑制剂的耐药突变复制子V36M、R155K、D168A等对本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶均无明显耐药性。因此，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶可用于治疗黄病毒科病毒，尤其是丙型肝炎病毒感染后耐药患者，和/或预防耐药患者疾病发作或复发。体外实验证明，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶对耐药突变复制子S282T的抑制活性明显优于索非布韦(sofosbuvir，Sovaldi，GS-7977)，对耐药突变复制子S96T和M414T的抑制活性与野生型相比没有降低，对耐药突变复制子Q30E、L31V、Y93H、V36M、R155K、D168A抑制剂的活性没有降低，且对人体正常器官的细胞以及动物体细胞的毒性非常低，具有极高的选择性。

在一些实施方案中，所使用的式1化合物是式1化合物的立体异构体，其化学名称为(S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯，结构式如以下式1a，

本发明的发明人发现，式1a的化合物对HCV病毒及其耐药株具有明显优于式1的化合物的抑制活性。

本发明提供本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶用于治疗哺乳动物中HCV耐药的应用。优选地，所述哺乳动物为人。

可以将本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶与药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括但不限于经口、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、皮下和鼻内途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过口服、输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身施用或局部施用。所述制剂可通过本领域已知的方法制备。

优选地，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶以胃肠途径给药。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。

根据不同种属哺乳动物之间的剂量换算关系，根据优选的实施方案，对于口服给药，以本发明的式1化合物的重量计，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶在人中可以以200-2400mg/日，例如300-800mg/日，优选400-600mg/日的剂量单独给药。在另一个实施方案中，以本发明的式1化合物的重量计，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶在人中以200-2400mg/日，例如300-800mg/日，优选400-600mg/日的剂量与其他活性剂例如其他抗HCV药物组合给药。

在一些优选的实施方案中，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶以200-2400mg/日，例如300-800mg/日，优选400-600mg/日的剂量范围每日一次，连续6-48周，例如6周、12周、24周或48周，口服给药。实际使用的剂量可根据患者的需要以及治疗病症的严重程度而有所改变。在一个具体的实施方案中，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶以400-600mg/日的剂量范围每日一次，连续口服给药12周。在另一个具体的实施方案中，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶以400-600mg/日的剂量范围每日一次，连续口服给药24周。在另一些具体的实施方案中，本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶以400-600mg/日的剂量与其他抗HCV药物，例如聚乙二醇干扰素α2a联合，每日一次，连续口服给药12或24周。实际使用的剂量可根据患者的需要以及治疗病症的严重程度而有所改变。

尽管以上提供了本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶的典型剂量，但是临床医师可根据治疗患者的病情允许使用不同的剂量。

在一个实施方案中，本发明提供降低由需要治疗的患者体内的HCV所致病毒感染可能性的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶或它们与其他抗HCV活性剂的组合。在另一个实施方案中，本发明提供治疗和/或预防由需要治疗的患者体内的继发于HCV感染的肝纤维化、肝硬化或癌症的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶或它们与其他活性剂的组合。在一个实施方案中，所述HCV感染是由HCV耐药菌株引起。在一些实施方案中，所述HCV耐药是由丙型肝炎病毒复制子GT1b-NS5B的S96T、S282T和/或M414T突变引起的。在一个实施方案中，所述HCV耐药是由S96T突变引起的。在另一个实施方案中，所述HCV耐药是由S282T突变引起的。在再一个实施方案中，所述HCV耐药是由M414T突变引起的。本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶对NS5B聚合酶核苷类抑制剂相关的HCV耐药，例如NS5B聚合酶核苷类抑制剂的耐药突变S96T和S282T具有良好的活性，无明显耐药性。本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶对非核苷类抑制剂相关的HCV耐药，例如非核苷类抑制剂的耐药突变M414T具有良好的活性，无耐药性。本发明的式1化合物对耐药突变S282T的抑制活性优于GS-7977(索非布韦)。

本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶对NS3蛋白酶和NS5A蛋白抑制剂相关的HCV耐药具有良好的活性，无交叉耐药性。本发明提供本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶用于治疗和/或预防对NS3蛋白酶和NS5A蛋白抑制剂耐药的HCV感染的应用。对于NS3蛋白酶和NS5A蛋白抑制剂耐药的HCV患者，给予治疗和/或预防有效量的本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶。在一些实施方案中，本发明的化合物用于治疗的HCV耐药是由GT1b-NS3的V36M、R155K和/或D168A突变引起的。在另一些实施方案中，本发明的化合物用于治疗的HCV耐药是由GT1b-NS5A的L31V和/或Y93H突变所致。在另一些实施方案中，本发明的化合物用于治疗的HCV耐药是由GT1a-NS5A的Q30E、L31V和/或Y93H突变所致。在另一些实施方案中，本发明的化合物用于治疗的HCV耐药是由丙型肝炎病毒复制子GT1b-NS5B的S96T、S282T、M414T，GT1b-NS5A的L31V、Y93H，GT1a-NS5A的Q30E、L31V、Y93H和GT1b-NS3的V36M、R155K、D168A中的一种或多种突变所致。

在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶，还包含选自下列组成的一种或多种另外的抗HCV治疗剂：HCV NS3蛋白酶抑制剂、HCV NS5B RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂、核苷类似物、干扰素α、聚乙二醇化的干扰素、左旋韦林、韦拉米啶、TLR7激动剂、TLR9激动剂、亲环蛋白抑制剂、α葡萄糖苷酶抑制剂、NS5A抑制剂和NS3解螺旋酶抑制剂。

在另一些实施方案中，与本发明用于HCV感染治疗的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶组合的药物包括例如NM 283、VX-950、SCH 50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI 5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS 9190、ACH-1095、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GNI-104、IDX102、ADX184、GL59728、GL60667、PSI-7851、TLR9激动剂、PHX1766、SP-30及其混合物。在另一些实施方案中，对于继发于HCV感染的肝纤维化、肝硬化或癌症的治疗中，本发明的化合物还可与抗肝纤维化药物、抗肝硬化药物和/或抗癌药物联合施用。

在一个实施方案中，本发明提供本发明的式1化合物或其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物、立体异构体或结晶在制备治疗、预防或控制HCV感染的药物中的应用。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。包括顺反异构体、对映异构体和构象异构体。所有立体异构体均属于本发明的范围。本发明的化合物的单独立体异构体可基本上不含其它异构体或可以混合成例如外消旋体，或者与所有其它的立体异构体混合。

术语“药学可接受的盐”是指本发明所述的化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸可选自：磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、对甲苯磺酸、苹果酸、甲烷磺酸或其类似物。

术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本发明化合物的形式。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明范围内，溶剂合物优选是水合物。

术语“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。

附图说明

图1为式1a化合物正庚烷溶剂合物单晶的不对称结构单元示意图。

图2为式1a化合物正庚烷溶剂合物单晶的单胞示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得，其中(2′R)-N-苯甲酰基-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基胞苷-3′，5′-二苯甲酸酯购于苏利制药科技江阴有限公司。

实施例1(S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯

步骤1 (2′R)-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基尿苷-3′，5′-二苯甲酸酯的合成

将(2′R)-N-苯甲酰基-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基胞苷-3′，5′-二苯甲酸酯(8.0kg，14.0mol)、乙酸(64L)及纯化水(16L)加入100L反应釜中，开启搅拌，升温至120～140℃，剧烈回流，反应完全后，离心，所得滤饼用纯化水(24.0L)搅洗，离心，所得滤饼用甲醇(8.0L)搅洗，离心，干燥，得到标题化合物5.6kg，收率85.41％。

步骤2 1-[(2R，3R，4R，5R)-3-氟-4-羟基-5-羟甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基]嘧啶-2，4-(1H，3H)-二酮的合成

将步骤1中制得的(2′R)-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基尿苷-3′，5′-二苯甲酸酯(5.60kg，11.95mol)和无水甲醇(28.0L)加至50L反应釜中，氮气保护下，降温，待体系温度降为-10℃以下，向反应釜中滴加甲醇钠的甲醇溶液(3.66L，30％wt，17.93mol)，滴加完毕后，升温至室温，2h后，降温。待体系温度降为-10℃以下，向反应釜中滴加浓硫酸(5.60L，10.03mol)的甲醇溶液(体积比1∶9)，反应完全后，硅藻土助滤，甲醇洗涤滤饼，合并滤液。滤液减压浓缩，待析出大量白色沉淀，向旋蒸瓶中加入二氯甲烷(8.0L)，过滤，干燥滤饼，得到标题化合物1.84kg，收率59.15％。

步骤3 (S)-2-[[(1，1′-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于50L玻璃反应釜中，氮气保护下，加入三氯氧磷(1.53kg，10mol)和二氯甲烷(10L)，搅拌，降温至-30℃以下。滴加三乙胺(1.01kg，10mol)的二氯甲烷(5L)溶液，滴加过程，保持内温低于-30℃。滴加完毕，缓慢滴加4-羟基联苯(1.7kg，10mol)的四氢呋喃(3.4L)溶液，滴毕搅拌30min。控制内温低于-30℃，加入L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.68kg，10mol)，滴加三乙胺(2.02kg，20mol)的二氯甲烷(8.0L)溶液，搅拌30min。升温至0℃左右，滴加五氟苯酚(1.84kg，10mol)，三乙胺(1.01kg，10mol)的二氯甲烷(7.0L)溶液，滴加过程中，反应放热升温，滴加完毕，内温升至室温，反应完全后，过滤，滤饼用二氯甲烷(2.5L×4)洗涤，合并滤液，将滤液用纯化水(25L)洗涤，分液，有机相减压浓缩，加入庚烷(5L×2)带溶剂，离心，真空干燥，称重，得类白色固体状标题化合物3.71kg，收率70.13％。

步骤4 (S)-2-[[(S)-(1，1′-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于30L反应釜中，氮气保护下，加入(S)-2-[[(1，1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯(3.70kg，7.0mol)、甲基叔丁基醚(2.40kg)、正庚烷(9.0kg)、三乙胺(77g，0.7mol)和五氟苯酚(43g，0.21mol)，加热至40℃，强力机械搅拌。反应完全后，离心，真空干燥，得(S)-2-[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯粗品3.5kg，收率94.59％。

步骤5 (S)-2-[[(S)-(1，1′-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的精制

于100L玻璃反应釜中，加入(S)-2-[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯粗品(4.50kg)和异丙醇(81.0L)，搅拌，升温至回流，溶清。氮气保护下，降温。离心，真空干燥，得类白色固体状标题化合物3.40kg，收率75.56％。

步骤6 (S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的合成

于50L玻璃反应釜中，加入1-[(2R，3R，4R，5R)-3-氟-4-羟基-5-羟甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基]嘧啶-2，4-(1H，3H)-二酮(1.30kg，5.0mol)和四氢呋喃(15.6L)，搅拌，氮气保护，降温至-10℃以下。滴加叔丁基氯化镁溶液(8.0L，8.0mol)，滴毕，0～5℃继续反应1h。加入(S)-2-[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)(五氟苯氧基)磷酰基]氨基]丙酸异丙酯成品(2.12kg，4.0mol)，滴加完毕，5～10℃反应，10～11h后取样，HPLC监控，反应完全后，降温至0℃以下，向反应液中加入2N盐酸(4.0L，8.0mol)淬灭反应。淬灭过程控制温度在0～10℃。滴加完毕，搅拌10min。减压浓缩，蒸干得固液残余物，加入乙酸乙酯(40.0L)和纯化水(20.0L)，分液。向有机相中加入5％碳酸钠水溶液(10.0L)洗涤，然后水洗，过滤，旋干，再次加入二氯甲烷7.0L，浓缩，得油状发泡物，向油状发泡物中加入乙酸异丙酯(15.0L)，溶清后，降温，析出大量白色沉淀。降温，过滤，干燥滤饼，得类白色固体状标题化合物1.98kg，收率81.72％。

步骤7 (S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的精制

于30L反应釜中，加入(S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯粗品(4.80kg)和乙酸异丙酯(24.0L)，搅拌，加热溶清。加入活性炭(144g)，搅拌30min，趁热过滤，降温，过滤，干燥滤饼，得白色固体4.40kg，收率：91.67％，纯度大于98％。ESI-MS m/z：604.2[M+H]-。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ：11.48(s，1H)，7.67(d，2H)，7.64-7.62(m，2H)，7.59(d，1H)，7.47(t，2H)，7.37(t，1H)，7.33(d，2H)，6.04(d，1H)，6.02(d，1H)，5.83(d，1H)，5.57(d，1H)，4.89-4.84(m，1H)，4.42-4.39(m，1H)，4.29-4.24(m，1H)，4.05-4.02(m，1H)，3.88-3.82(m，2H)，1.29-1.24(m，6H)，1.16-1.15(m，6H)。31PNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ4.07ppm。

步骤8 (S)-2-[[[(S)-(1，1’-联苯基-4-氧基)]-[((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4-二氧代-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基]磷酰基]氨基]丙酸异丙酯的构型确证

称取步骤7制备的化合物(15mg)于3mL小瓶中，加入二氯甲烷/正庚烷(5mL，体积比为2∶1)的混合溶剂体系中，震荡得到的澄清溶液，用封口膜盖住小瓶并在上面扎孔，室温下放置6天，得到单晶。绝对构型通过单晶X-射线衍射图谱确定，检测仪器为Agilent Super单晶衍射仪，测试条件为铜靶、管压40kv、管流40mA，晶体结构解析方法为直接法(SHELXTL和OLEX2)，测得的单晶结构数据表见表1，单晶衍射图谱见图1、2。通过单晶X-射线衍射图谱进一步确认了实施例1化合物的结构。

表1单晶结构信息表

实施例2 本发明的化合物的抗HCV-1b复制子活性检测

参照中国专利申请CN105985355A公开的方法检测本发明的式1和式1a化合物抗HCV-1b复制子的活性。式1的化合物参照CN104031104A实施例1的方法制备。使用索菲布韦(GS-7977，购于上海皓元生物医药科技有限公司，货号HY-15005)作为对照药。

具体测试步骤见CN105985355A的实施例1，该篇专利申请以其全部内容引入本文作为参考。

如CN105985355A中所述，HCV 1b复制子细胞，即稳定转入HCV基因型1b复制子的Huh7细胞系，由药明康德(上海)新药开发有限公司提供。

测试的每个化合物用100％DMSO配制成10mM母液后，用含0.5％DMSO的完全培养液稀释至10μM，然后依次3倍稀释，共10个浓度。HCV-1b复制子细胞每孔接种8X10³个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。实验重复三次。

实验结果显示，本发明的式1a化合物对HCV 1b复制子的EC₅₀值为0.036μM，明显优于式1化合物的EC₅₀值，亦明显优于索菲布韦的EC₅₀值(0.092μM)。在测定浓度范围内，本发明的式1a化合物没有显示出细胞毒性，CC₅₀值大于最高检测浓度10μM。

实施例3 本发明的化合物的抗HCV-1a复制子活性检测

参照中国专利申请CN105985355A实施例2的方法检测本发明的式1和式1a化合物抗HCV-1a复制子的活性。使用索菲布韦作为对照药，其来源如实施例2中所述。

如CN105985355A中所述，HCV 1a复制子细胞，即稳定转入HCV基因型1a复制子的Huh7细胞系，由药明康德(上海)新药开发有限公司提供。

测试的每个化合物用100％DMSO配制成10mM母液后，用含0.5％DMSO的完全培养液稀释至10μM，然后依次3倍稀释，共10个浓度。HCV-1a复制子细胞每孔接种8X10³个细胞，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。实验重复三次。

实验结果显示，本发明的式1a化合物对HCV 1a复制子的EC₅₀值为0.01μM，明显优于式1化合物的EC₅₀值，亦明显优于索菲布韦的EC₅₀值(0.07μM)。在测定浓度范围内，本发明的式1a化合物没有显示出细胞毒性，其对HCV 1a复制子的CC₅₀值＞10μM。

从以上实验可以看出，本发明的化合物对丙肝病毒1b亚型和1a亚型表现出良好的抑制活性，同时对宿主细胞具有非常低的毒性，有效性高，安全性好，适合用于治疗和/或预防与HCV感染相关的疾病。

另外，本发明的发明人还采用NS5B嵌合型复制子的瞬时转染细胞(Huh-7细胞)测试了本发明的式1a化合物、索菲布韦等对抗丙型肝炎病毒基因型GT2b、GT3a、GT4a和GT5a的活性。结果显示，本发明的式1a化合物对NS5B的嵌合型复制子GT1b/GT2b、GT1b/GT3a、GT1b/GT4a和GT1b/GT5a均有抑制活性，EC₅₀值分别为10.32nM、17.62nM、16.68nM和17.52nM；索菲布韦对上述基因型丙型肝炎病毒复制子的EC₅₀值分别为22.68nM、54.52nM、36.02nM和53.32nM。

上述实验结果表明本发明的式1a化合物对所测试的各种基因型复制子的抑制活性均优于对照化合物索菲布韦2-3倍。

实施例4 本发明的化合物对HCV耐药突变复制子抑制活性的研究

本实施例测试本发明的式1a化合物对HCV耐药突变复制子的抑制活性。使用的其它类别的丙型肝炎病毒抑制剂参考化合物包括NS5B聚合酶核苷类抑制剂索非布韦(来源如实施例2中所述)、NS5A蛋白抑制剂雷迪帕韦(Ledpasvir，GS-5885，根据WO2010/132601中公开的方法合成，并通过氢谱和质谱确认)和NS3蛋白酶抑制剂西美匹韦(Simeprevir，TMC435，购自上海楼岚生物科技有限公司)。

将本发明式1a化合物、索菲布韦、雷迪帕韦、西美匹韦分别用100％DMSO配制成10mM的母液，保存于氮气柜中。

使用肝癌细胞株Huh-7细胞用于丙型肝炎病毒复制子的瞬时转染实验，将其在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液中培养。

所有丙型肝炎病毒耐药突变复制子均以GT1b或GT1a复制子为骨架，耐药突变通过点突变导入相应的基因。导入的突变通过核苷酸测序确定。本实施例中所用的丙型肝炎病毒突变复制子以及化合物检测起始浓度见表2。

表2HCV复制子及化合物检测起始浓度

wt表示野生型，S为丝氨酸，T为苏氨酸，M为蛋氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Y为酪氨酸，H为组氨酸，Q为谷氨酰胺，E为谷氨酸，R为精氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，A为丙氨酸，例如S96T表示96位残基的丝氨酸突变为苏氨酸，余同。

主要试剂为荧光素酶检测试剂Bright-Glo^TM(Promega，货号：E2650)。

主要仪器为多功能酶标仪(Perkin Elemer，型号：Envision)和电穿孔仪(Bio-Rad，型号：Xcell)。

本发明的化合物对所有丙型肝炎病毒耐药突变复制子活性的测定均采用瞬时转染实验，在Huh-7细胞中进行。先将复制子质粒DNA用相应的限制性内切酶线性化后，用T7RNA聚合酶将DNA转录成RNA。用电击穿孔法将体外转录制备的复制子RNA转染到Huh-7细胞内。转染后的细胞以每孔1x10⁴个细胞的密度接种到96孔实验板中，然后加入3倍系列稀释后的化合物，共8个浓度，三复孔。各化合物在不同复制子实验中采用的起始浓度见表2。细胞培养中的DMSO终浓度为0.5％。细胞在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素DMEM培养液，5％CO₂、37℃条件下培养3天。然后应用荧光素酶检测试剂Bright-GloTM测定荧光素酶报告基因表达水平，用于计算化合物对丙型肝炎病毒复制子的抑制率。使用GraphPad Prism(version 5)软件对化合物的抑制率数据进行非线性拟合分析，得到化合物的EC₅₀值。各实验重复2次，每次3复孔。

对NS5B聚合酶核苷类抑制剂耐药突变S96T、S282T和NS5B聚合酶非核苷类抑制剂耐药突变M414T的实验结果见表3。参照化合物索菲布韦的结果与历史数据一致。

表3抗已知NS5B聚合酶抑制剂耐药突变复制子活性

实验结果表明，本发明式1a化合物对NS5B核苷类抑制剂耐药突变S96T和S282T及对NS5B非核苷类抑制剂耐药突变M414T的抑制活性与对野生型GT1b的相比无明显降低。这三个耐药突变对本发明式1a化合物无耐药性。

本发明的式1a化合物对丙型肝炎病毒NS5A抑制剂耐药突变复制子的实验结果见表4。参考化合物雷迪帕韦的实验结果与历史数据基本一致。

表4抗已知NS5A抑制剂耐药突变复制子活性

实验结果表明，本发明的式1a化合物对NS5A蛋白抑制剂耐药突变均无耐药性。

本发明的式1a化合物对丙型肝炎病毒NS3抑制剂耐药突变复制子的实验结果见表5。参考化合物西美匹韦的耐药倍数与历史数据基本一致。

表5抗已知NS3蛋白抑制剂耐药突变复制子活性

结果表明，本发明的式1a化合物对NS3蛋白酶耐药突变均无耐药性。

由以上的丙型肝炎病毒耐药突变复制子实验可以看出，本发明的化合物对NS5B聚合酶核苷类抑制剂耐药突变(S96T、S282T)或非核苷类抑制剂耐药突变(M414T)均无明显耐药性，与NS5A蛋白以及NS3蛋白酶抑制剂无交叉耐药性。因此，本发明的化合物可以与NS5A蛋白和/或NS3蛋白酶抑制剂进行联合用药，并可用于预防或/和治疗体内丙型肝炎病毒已对NS5B聚合酶抑制剂、NS5A蛋白抑制剂和/或NS3蛋白酶抑制剂产生了耐药的患者。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims

1.式1a的化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗和/或预防哺乳动物黄病毒科病毒丙型肝炎病毒感染后耐药的药物中的应用，

2.根据权利要求1的应用，其中所述丙型肝炎病毒感染后耐药是由丙型肝炎病毒的耐药菌株所引起。

3.根据权利要求2的应用，其中所述药物用于对NS5B聚合酶核苷类抑制剂和非核苷类抑制剂、NS5A蛋白抑制剂以及NS3蛋白酶抑制剂的耐药。

4.根据权利要求1-3之任一项的应用，其中所述丙型肝炎病毒感染后耐药是由以下丙型肝炎病毒复制子突变中的一种或多种所致：

GT1b-NS5B的S96T、S282T、M414T突变；

GT1a-NS5A的Q30E、L31V、Y93H突变；

GT1b-NS5A的L31V、Y93H突变；和

GT1b-NS3的V36M、R155K、D168A突变。

5.根据权利要求1-3之任一项的应用，其中所述哺乳动物为人。

6.根据权利要求4的应用，其中所述哺乳动物为人。

7.根据权利要求1-3之任一项的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐的给药剂量为200-2400mg/日。

8.根据权利要求4的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐的给药剂量为200-2400mg/日。

9.根据权利要求5的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐的给药剂量为200-2400mg/日。

10.根据权利要求7的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐的给药剂量为300-800mg/日。

11.根据权利要求10的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐的给药剂量为400-600mg/日。

12.根据权利要求1-3之任一项的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为局部或全身给药剂型。

13.根据权利要求4的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为局部或全身给药剂型。

14.根据权利要求5的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为局部或全身给药剂型。

15.根据权利要求6的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为局部或全身给药剂型。

16.根据权利要求7的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为局部或全身给药剂型。

17.根据权利要求12的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为口服给药剂型。

18.根据权利要求17的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为固体或液体剂型。

19.根据权利要求18的应用，其中所述式1a的化合物或其药学可接受的盐配制为片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂或混悬剂。