CN108192908A - 利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法 - Google Patents

利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法。本发明通过基因工程手段，首次向筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis NRRL 18488)基因组中插入正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2，来增加基因工程菌中正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2表达量，以达到提升基因工程菌发酵产FK506能力之目的。通过上述策略构建出的基因工程菌发酵FK506产量为324mg/L，较出发菌株‑S.tsukubaensis NRRL18488产量提高了36％。因此，本发明对于提升菌株发酵FK506产量具有很大的应用潜力。同时，也为利用基因工程手段改造菌株发酵高产FK506提供新的方法。

Description

利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法
技术领域
本发明属链霉菌基因工程技术领域，涉及一种S.tsukubaensis的正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2共表达构建基因工程菌的方法，以及利用该方法所构建的基因工程菌在提高他克莫司产量中的应用。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus，简称FK506)是一种23元大环内酯类免疫抑制剂，于1984年首次由日本藤泽制药公司从S.tsukubaensis代谢产物中分离得到。FK506作为高效的免疫抑制剂，其具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，因而已广泛应用于器官移植、皮肤病、自身免疫系统紊乱以及癌症等多种疾病治疗之中。然而，FK506是一种结构复杂的次级代谢产物，其生产受到发酵周期长、产量低和成本高等诸多因素的制约，严重影响了FK506在医学领域的应用以及工业化生产规模。
目前，筛选FK506高产菌株常常采用物理或化学方法进行菌株诱变以获得高产菌株，或采用莽草酸和油脂耐受性等策略来筛选FK506高产菌株。然而，利用上述方法获得的高产菌株常存在回复突变频率高、工作强度大、费时费力以及不确定性大等缺点，严重限制FK506的工业化生产。因此，利用基因工程手段对FK506生产菌株进行重新构建以及改造，以达到提升菌株发酵高产FK506的目，满足工业和临床的实际应用需求。
S.tsukubaensis中存在着错综复杂的代谢调控网络，并严格控制着抗生素的合成。其中，调控因子对于S.tsukubaensis抗生素产量产生严重影响。例如，在S.tsukubaensis L19中，通过共表达tcs7、fkbN2个正调控因子，基因工程菌株发酵产FK506产量较原始菌株提高了89％；在S.tsukubaensis KCCM11116P中，分别对内源型SARP家族转录调控因子bulZ、bulY及来源于海洋链霉菌的异源型调控基因sx5140进行高表达，结果表明3个调控因子均能提高FK506合成量。然而，调控因子也会出现自调控或受到其他调控因子的控制，以维持其浓度在胞内的平衡，遂导致提高调控因子的拷贝数也不能明显提高抗生素的产量。
研究表明，调控因子可通过控制相应靶基因以对链霉菌的初级代谢、次级代谢、形态分化、营养物质的吸收以及有害物质的排出等，因而共同增加正调控因子及其靶基因的拷贝数可避免因调控因子浓度低而造成相应靶点表达量不高的问题。但是，共表达正调控因子及其靶基因构建高产FK506基因工程菌株策略未在S.tsukubaensis中进行使用。因此，本发明首次向S.tsukubaensis基因组中整合外源的正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2，来构建基因工程菌，以达到提升基因工程菌发酵产FK506能力之目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法；具体步骤如下：
1)根据tsuZ和tsuS2已知序列设计PCR引物，以S.tsukubaensis NRRL18488基因组DNA为模板，扩增正调控因子tsuZ基因以及其靶基因tsuS2；
2)将正调控基因tsuZ与靶基因tsuS2通过融合PCR串联成一个大片段，将所得大片段整合到表达载体pIB139中，得到重组表达载体pOtsuZS2；
3)将2)中构建好的重组表达载体pOtsuZS2，利用接合转移方法整合到S.tsukubaensis NRRL18488基因组上，构建成基因工程菌；
4)培养3)中所构建的基因工程菌株，发酵生产FK506。
具体说明如下：
本发明一种基于正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2的高产FK506基因工程菌改造方法，首次将正调控基因tsuZ及其靶基因tsuS2利用整合型质粒接合到S.tsukubaensis基因组中，以此构建高产FK506基因工程菌。
tsuZ基因(来自于原始菌株-S.tsukubaensis NRRL18488)为多效性SARP家族转录调控因子，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其对他克莫司的合成起正调控作用。
靶基因tsuS2(来自于原始菌株-S.tsukubaensis NRRL18488)编码γ-丁酮内酯合酶，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其对他克莫司的合成起促进作用。
表达载体pIB139(本发明该载体直接来自于实验室保藏，(Di H,Li S,Xia M,etal.Genome-scale metabolic network guided engineering of Streptomycestsukubaensis for FK506production improvement[J].Microbial Cell Factories,2013,12(1):52.)，但目前已经是商业化载体，本技术领域人员可以通过BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心或者武汉淼灵生物科技有限公司购买)。
本发明所述的基因工程菌构建方法如下：
1)获得重组表达载体：重组表达载体中包括tsuZ基因和tsuS2基因；
2)将重组表达载体转入到S.tsukubaensis NRRL18488中，并选择基因组中含有外源tsuZ基因和tsuS2基因的基因工程菌。
本发明培养的重组筑波链霉菌基因工程菌进行发酵，从发酵液中提取FK506原料产品。
利用本发明的方法检测基因工程菌FK506发酵产量为324mg/L，出发菌株FK506发酵产量为238mg/L，基因工程菌FK506发胶产量提高了约36％。
附图说明
图1tsuZ和tsuS2基因扩增电泳结果；
图2tsuZ和tsuS2基因融合PCR电泳结果；
图3构建tsuZ和tsuS2基因串联过表达重组质粒pOtsuZS2流程图；
图4重组质粒pOtsuZS2单酶切、双酶切以及pIB139酶切电泳结果；
图5构建tsuZ和tsuS2基因过表达工程菌PCR电泳结果；
图6出发菌株-S.tsukubaensis NRRL18488及基因工程菌株FK506产量结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和效果更加清晰，本发明结合附图和具体实施例进行说明：
作为本发明的优选方式，提供一种在S.tsukubaensis中提高FK506产量的方法。
第一步，提取S.tsukubaensis NRRL18488基因组DNA，设计并合成引物，用于扩增正调控因子tsuZ基因和靶基因tsuS2；第二步，将两片段融合成一个串联的大片段，并克隆至整合型表达载体，获得重组载体；第三步，将第二步得到的重组载体通过接合转移技术，转移到出发菌株中。采用抗性筛选得到重组载体整合到亲本基因组中的基因工程菌株，并用PCR扩增方法验证基因工程菌株；第四步，测定第三步得到的基因工程菌株产FK506能力。
于tsuZ基因(来自于原始菌株-S.tsukubaensis NRRL18488)为多效性SARP家族转录调控因子，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其对他克莫司的合成起正调控作用。
靶基因tsuS2(来自于原始菌株-S.tsukubaensis NRRL18488)编码γ-丁酮内酯合酶，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其对他克莫司的合成起促进作用。
表达载体是pIB139载体。重组筑波链霉菌基因工程菌进行发酵，从发酵液中提取FK506原料产品。
实施例
1、S.tsukubaensis NRRL18488基因组DNA提取、正调控基因tsuZ和靶基因tsuS2扩增
首先，将S.tsukubaensis NRRL18488(NRRL Cuture Collection ofAgricultural Research Service,USA)接种至ISP4液体培养基(葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉20g/L，KNO3 2g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4×7H2O 0.5g/L，FeSO4×7H2O 0.025g/L，ZnSO4×7H2O0.1g/L，CaCl2 0.02g/L，MnSO4×H2O 0.005g/L，pH＝7.0)，28℃，220rpm培养48h；其次，离心收集2mL菌体，用无菌水洗涤2-3次。然后加入0.2g石英砂与200μL DNA提取液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)漩涡震荡3min后，加入200μL的TE缓冲液继续震荡3min，12000rpm离心5min后取上清；最后，在上清中加入3M醋酸钠和无水乙醇沉淀基因组DNA，并用70％的乙醇洗涤两次，挥发掉多余的水分后加入50μL的超纯水溶解。
利用引物tsuZ-F(5＇-AGTGCTCATATGAGAATTCAGGTTCTGG-3＇，下划线为NdeI位点)与tsuZ-R(5＇-ATGTCCGCCTCCTTTGTCAGGCGGCGAAGAGGT-3＇，下划线为与tsuS2-F的互补序列)从S.tsukubaensis NRRL18488基因组上PCR扩增得到tsuZ基因片段。利用tsuS2-F(5＇-CAAAGGAGGCGGACATGTGGTATGTATCTTCGGGCTTACCG-3＇，下划线部分为RBS序列)与tsuS2-R(5＇-TAATCTAGAGATGGAACTCGGCGTCAGAAGC-3＇，下划线部分为XbaI位点)扩增得到tsuS2基因片段。引物由金唯智生物科技有限公司(天津分公司)合成(下同)。
PCR反应总体系为100μL(反应试剂购自北京全式金生物技术有限公司)，反应条件为：94℃，5min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，90sec，30个循环；72℃，10min。
2、tsuZ和tsuS2两片段的融合PCR以及重组表达载体的构建
扩增得到的tsuZ、tsuS2经琼脂糖凝胶电泳验证条带的大小，其中tsuZ为822bp(如图1所示)，tsuS2为1053bp(如图1所示)。将tsuZ和tsuS2基因PCR产物分别进行纯化回收(纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司)，以进行后续的融合PCR。以tsuZ-F和tsuS2-R为引物，tsuZ与tsuS2以摩尔比为1:1的比例为模板，通过融合PCR将两片段特异性的融合在一起。融合PCR反应总体系为100μL(反应试剂购自北京天根生化科技有限公司)，反应条件为：94℃，5min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，3min，30个循环；72℃，10min。通过琼脂糖凝胶电泳验证融合片段的大小并进行割胶纯化回收大小符合1875bp的片段(如图2所示)。
重组载体pOtsuZS2构建流程如图3所示，具体方法如下：首先，将tsuZ和tsuS2基因的融合片段经限制性内切酶NdeI(赛默飞世尔科技有限公司)和XbaI(赛默飞世尔科技有限公司)消化，再次纯化后与相同酶酶切的质粒pIB139(pIB139质粒上包含有ΦC31整合酶及其对应的attP序列，还含有安普霉素抗性片段以及强启动子ermEp*)连接(T4DNA连接酶，赛默飞世尔科技有限公司)，然后将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，转化产物涂布于含有50μg/mL安普霉素的Luria-Bertani平板(以下简称LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)，37℃静置培养16h，提取质粒酶切验证，并以pIB139的酶切结果作为对照(如图4所示)。酶切验证正确的质粒进行测序，测序工作由金唯智生物科技有限公司(天津分公司)完成，将酶切片段大小正确且测序结果正确的质粒作为共表达载体pOtsuZS2。3、基因工程菌株的构建
将筛选得到的共表达载体pOtsuZS2转化ET12567(pUZ8002)(Kieser T,Bibb MJ,Buttner MJ,Chater KF,Hopwood DA:Practical Streptomyces Genetics.UnitedKingdom:John Innes Foundation；2000.)感受态细胞，转化产物涂布于含安普霉素50μg/mL，卡那霉素25μg/mL，氯霉素30μg/mL的LB平板上，37℃静置培养16h，挑取平板上生长的单菌落至含有安普霉素50μg/mL，卡那霉素25μg/mL，氯霉素30μg/mL的LB液体培养基中，37℃培养过夜。取500μL的培养物接种到50mL含有相应抗生素的新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5左右，5000rpm离心5min，收集菌体。用等体积新鲜的LB液体培养基洗涤菌体2-3遍，最后将菌体悬浮于1mL的LB液体中。
刮取S.tsukubaensis新鲜的孢子，用0.9％的生理盐水制成单孢子悬液，4层无菌纱布进行过滤除杂，12000rpm离心5min收集孢子，并用2×YT培养基(蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L)洗涤孢子2-3遍，并将孢子悬液的浓度制成108个/mL，50℃金属浴热激10min，37℃孵育2h。
取上述处理好的ET12567与单孢子悬液按1:1的比例混合，孢子数不能低于108个，将混合后的菌液于12000rpm离心5min后去上清，剩余的菌泥用残余的培养基混匀后，滴在之前准备好的铺在ISP4固体平板上的滤膜(0.22μm)上。
30℃培养36h后，刮取菌泥涂在萘啶酮酸50μg/mL和安普霉素50μg/mL的ISP4培养基上继续于30℃培养5-7d，直至形成肉眼可见的菌落后，再次将菌落转至含相应抗生素的燕麦固体培养基上(10％蔗糖，20％燕麦粉，20％琼脂)，28℃培养10d长至孢子成熟。
挑取ISP4上的链霉菌，接入YEME液体培养基(酵母提取物3g/L，蛋白胨5g/L，麦芽提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖340g/L，pH＝6.8，115℃灭菌20min后加入2mL/L的2.5M的MgCl2×6H2O)，28℃培养48h后，提取基因组，用pIB139质粒上的引物pIB-F(5＇-CGATGCTGTTGTGGGCACA-3＇)与pIB-R(5＇-CGCGTTGGCCGATTCAT-3＇)PCR结果验证如图5所示。将酶切验证正确的PCR产物进行测序，测序正确的为构建成功的基因工程菌。测序工作由金唯智生物科技有限公司(天津分公司)完成。
4、孢子培养、种子培养及摇瓶发酵条件
将出发菌株与前述的基因工程菌株培养在固体培养基上，28℃，10d左右，长至孢子变灰。
从斜面/平板上刮取一满环的孢子接种于40mL/250mL的ISP4液体种子培养基中，在28℃、220rpm的条件下培养48h，这时可见瓶底有细沙状的菌丝体挂壁。
将培养好的种子以10％的接种量，接种于40mL/250mL的发酵培养基(葡萄糖10g/L，可溶性淀粉24g/L，糊精35g/L，蛋白胨4g/L，酵母浸粉5g/L，CaCO3 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnCl2×6H2O 0.5g/L，(NH4)2SO41g/L，豆油2.5g/L，Tween80 1.25g/L，pH＝7.0)在28℃、220rpm的条件下培养168h。
5、产量的测定
预处理：FK506为S.tsukubaensis胞内产物，所以样品用甲醇进行萃取，具体的方法为：取2mL的发酵液与3mL的甲醇相混合后于50℃下水浴3h，每间隔半小时漩涡震荡一次，温育后的样品于8000rpm下离心10min，将上清用0.22μm的滤膜过滤后即为待测样品。
高效液相色谱的检测方法：液相色谱仪1100Series(Agilent Company，USA)，SBC-18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为V(乙腈)：V(10Mm H2PO4水溶液)＝65：35，流速为1mL/min，检测波长为210nm，进样量为20μL。
分析测定发酵液中FK506的产量如附图6所示。在所述的摇瓶条件下，工程菌的发酵产量(324mg/L)比出发菌株(238mg/L)高了约36％。
本发明公开和提出的利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgagaattc aggttctggg gccgttgagt gccgaggtca acgggggatc catcgttccc 60
accgcggcca agccgcggca gatcctgtcc ctgatggcgc tctatccggg gcgtgtcctg 120
cccgtcccga tgctcatgga agagatctgg gggaccgcgc cgccgcagag cgccctcacc 180
accctgcaga cctacatcct ccagctccgc agaagactgg acaccgcgat gggcccgagc 240
gcaccgggcg gagccaagga ggtactggcc acccggcacg ggggatatct gctgcagatc 300
cccgaagcca gcgtcgacgt ccacgagtac gagcgtctgg cacgccaggg acagaccgct 360
ttcgaaacgg gggacaacga ggtgtcggcg cggcggctgc gggccgctct cgacctgtgg 420
aagggaccgg ccctcgtcga catacgcgtc ggaccgatcc tcgacatcga ggtcagacgc 480
ctggaggaga gccggctggc cgtcgtcgaa cgccgtatcg acgccgacct caaactcggc 540
cggcacaccg aactcatccc cgaactgacc gacctgacgg cccgccaccc ccagcacgag 600
ggcctgcacg cgcagatgat ggtggcgctg taccggtcgg ggcggcaggc cggggccctg 660
gaggcctacc gcaggctgcg gatgcgcctg atcgacgaac tcggcgtgga gccctcgccg 720
cagctgcagc ggctgcacca ggccatgctc tccgtcgacc cgcagctgga cgtggtggcg 780
ggagcgcggc gcacctcgac cttcgacctc ttcgccgcct ga 822
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggtatgta tcttcgggct taccgggggg agagcacccc tggtgcaggc cactacggct 60
cagggggatt ccatgtccgc gagcacgttc cgcaccgacc gcgcactacc cggcacggca 120
ggcacaccgg gcagcgcggc agtacctccg ggggcgaggc cggcgcccga ccggccgctg 180
accagcatcg tcccgaagga actcgtccac cgcacgggcg tcgccgaggt catgctcacc 240
ggctgggagc gggtggaagg cgaccacttc acggtgaccg cccagtggcc ccgcggccac 300
agcctcttca ccaccggggg ccgttatcac ccgctgattg ccgcagaaac gatccgccag 360
gcggggatcc tgctggccca caccgagtac ggcgtaccgc tggacgggcc gctgccggtg 420
gaggagatcc gggtgagcac ccgccccggg ctcttcggca tcggctggac acccgccacg 480
ctcgaactcc gggtcaccgt ccggccgcgg cacgcggacg acgggaccct gacggggctg 540
cgcgccgaga ccgagatccg ccgcgacggc cgtacggccg cgaccggtct gagcgccgtc 600
gcctgcgtca cggcgcccga ggacgagcgg ccgccctccc gccgcccggc cctgcgggac 660
gggcttccgg ccgccgcacc gcaggccccc cttgcgccgc aggccgtcgg acgcctctct 720
cccctggacg tcgtcctgtc ccccaccccg cggccggacc gctggctgct gcgcaccgac 780
accgggcatc ccgtcttcac cggccgcggc ggccggatcc cggacatggt gctgctcgaa 840
gcggcctgtc aggccacggc catgaccctg ggacgcccct gcacaccgct ggacatcgcc 900
gccgggttcg ggcccggcac cgtaccggcc ggcccgtgcg tgatcggggc gcgccgtctg 960
cccgccgccg ggggaacgga gtcggtgctg gtgacgggcc gtctccacgg cgaaccggtg 1020
ttccactcca cggtgaccgc ggccgccggc tga 1053

Claims (3)

1.一种利用筑波链霉菌提高他克莫司发酵产量的方法；具体步骤如下：
1)根据tsuZ和tsuS2已知序列设计PCR引物，以S.tsukubaensis NRRL18488基因组DNA为模板，扩增正调控因子tsuZ基因以及其靶基因tsuS2；
2)将正调控基因tsuZ与靶基因tsuS2通过融合PCR串联成一个大片段，将所得大片段整合到表达载体pIB139中，得到重组表达载体pOtsuZS2；
3)将2)中构建好的重组表达载体pOtsuZS2，利用接合转移方法整合到S.tsukubaensisNRRL18488基因组上，构建成基因工程菌；
4)培养3)中所构建的基因工程菌株，发酵生产FK506。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于tsuZ基因为多效性SARP家族转录调控因子，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于靶基因tsuS2编码γ-丁酮内酯合酶，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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