CN108192822A - 灌注培养方法及其用途 - Google Patents

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Y·杨
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Abstract

本发明涉及灌注培养方法及其用途。具体地，在此提供培养哺乳动物细胞的改进的方法，包括盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬浮在约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约40度至约55度)将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的搅拌；以及在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的基本没有哺乳动物细胞的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；以及培养哺乳动物细胞的方法。还提供了多种利用这些培养方法的方法。

Description

灌注培养方法及其用途
本发明是基于申请日为2013年10月23日、申请号为201380067513.8(国际申请号为PCT/US2013/066410)、名称为“灌注培养方法及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关文献的交叉引用
本申请要求2012年10月23日提交的美国临时专利申请序列号No.61/717,486的优先权，其整体内容通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学方法、细胞培养工艺进展、和重组蛋白的制造。
发明背景
含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞常用于生产治疗上或商业上重要的蛋白。虽然一些高通量(HT)细胞培养体系已在生物技术产业中用于分批补料(fed-batch)工艺多年，但已知并不存在用于基于灌注的细胞培养的HT模型。
目前培养哺乳动物细胞的摇管方法用50mm的轨道(投掷)摇动直径、180RPM的摇动速率、90°的摇动角度(即距水平90°或90°的反应者角度)、和10mL工作容积(w.v.)。已报道这些目前的摇管方法在非装置的(无控制器)培养中在分批条件下(batch conditions)促进中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的生长多至20x106细胞/mL(例如Sartorius网站)。
发明概述
本发明是基于(至少部分基于)发现了以本文描述的特定方式培养哺乳动物细胞导致充分提高的活细胞密度和重组蛋白产量。因而，本发明包括培养哺乳动物细胞的(体外)方法，所述方法包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬浮在约4％至约80％(例如约4％至约70％、约4％至约60％、或约4％至约30％)容器容积(例如盛有大于2mL的体积的容器，例如约2mL至约600mL、约2mL至约2L、约2mL至约3L的体积)的第一液体培养基中，在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约10度至约85度、15度至约85度、5度至约65度、或35度至约50度)将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM(例如约20RPM至约400RPM、120RPM至约240RPM、140RPM至约220RPM、160RPM至约180RPM、400RPM至约600RPM、600RPM至约800RPM、或800RPM至约1000RPM)的搅拌(例如在温育箱(incubator)中，如具有约3mm至约50mm的投掷(轨道)直径的摇动温育箱)，并且这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基(具有任何哺乳动物细胞密度，例如基本上无哺乳动物细胞)，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，例如其中第一和第二体积是约70％至约90％相等的，此时第一和第二体积是约为相等的(例如约0.1％至约3％内相等、约0.1％至约2％内相等、约1％至约5％内相等、约5％至约10％内相等、约10％内相等，或完全相等)。在一些实施方案中，第一和第二液体培养基可为相同的培养基。在一些实施方案中，第一和第二液体培养基可为不同的(例如不同的培养基或不同的浓度)。如本领域所知，搅拌水平(例如RPM速度)可以根据容器的尺寸和形状(例如容器的直径)以及用于进行温育的温育箱的投掷(轨道)直径而变化。例如，较小的投掷(轨道)直径可需要较高水平的搅拌(例如较高的RPM速度)，而较大的投掷(轨道)直径可需要较低水平的搅拌(例如较低的RPM速度)，从而达到相似的流体剪切力水平和溶解O2浓度。在另一个例子中，具有较大直径的容器可以需要较低的RPM速度，而具有较小直径的容器可以需要较高的RPM速度来达到相似的流体剪切力水平和溶解O2浓度。在一些实施方案中，用摇管温育箱以约25mm至约50mm的投掷(轨道)直径和约20RPM至约400RPM(例如约120RPM至约240RPM、140RPM至约220RPM、160RPM至约180RPM)的搅拌来进行温育。在一些实施方案中，用摇管温育箱，以约1mm至约25mm的投掷(轨道)直径和约20RPM至约1000RPM(例如约100RPM至约1000RPM、约200RPM至约1000RPM、约100RPM至约200RPM、约200RPM至约300RPM、约300RPM至约400RPM、约400RPM至约500RPM、约500RPM至约600RPM、约600RPM至约700RPM、约700RPM至约800RPM、约800RPM至约900RPM、约900RPM至约1000RPM)的搅拌来进行温育。
在一些例子中，容器是具有约40mL至约60mL容积的锥形容器，其反应者角度是约3°至约7°，搅拌是约65RPM至约105RPM，并且液体培养基体积是约15％至约25％的容器容积。在其他例子中，容器是具有约40mL至约60mL容积的锥形容器，其反应者角度是约3°至约7°，搅拌是约240RPM至约280RPM，并且液体培养基体积是约2％至约9％的容器容积。
在其他方法中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是15°约至约25°、搅拌是310RPM约至约350RPM、并且液体培养基的体积是约35％至约45％的容器容积。
在一些例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是25°约至约35°、搅拌是100RPM约至约140RPM、并且液体培养基的体积是约1％至约9％的容器容积。在其他例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是25°约至约35°、搅拌是235RPM约至约275RPM、并且液体培养基的体积是约27％至约37％的容器容积。
在一些方法中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是40°约至约50°、搅拌是140RPM约至约180RPM、并且液体培养基的体积是约15％至约25％的容器容积。
在其他例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是55°约至约65°、搅拌是235RPM约至约275RPM、并且液体培养基的体积是约1％至约9％的容器容积。在其他例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是55°约至约65°、搅拌是168RPM约至约208RPM、并且液体培养基的体积是约55％至约65％的容器容积。
在一些方法中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是60°约至约70°、搅拌是230RPM约至约270RPM、并且液体培养基的体积是约75％至约85％的容器容积。
在其他例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是75°约至约85°、搅拌是310RPM约至约350RPM、并且液体培养基的体积是约35％至约45％的容器容积。在其他例子中，容器是锥形容器，其容积是约40mL至约60mL、反应者角度是75°约至约85°、搅拌是310RPM约至约350RPM、并且液体培养基的体积是约65％至约75％的容器容积。
在一些实施方案中，所添加的第二体积的第二液体培养基比所去除的第一体积的第一液体培养基少(例如至多少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％)。还提供了培养哺乳动物细胞的方法，其包括在梯度灌注方法中培养哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下被悬浮于液体培养基中，所述条件为在培养基中产生流体剪切力和溶解氧(O2)浓度，所述流体剪切力和溶解氧(O2)浓度与在透气性锥形容器中的液体培养基的容器(例如具有大于2mL容积或容积为约2mL至约600mL、约2mL至约2L、或约2mL至约3L的容器)的约4％至约80％(例如约4％至约70％、约4％至约60％、或约4％至约30％)容积中所达到的相同(或基本相同)，所述容器以距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约5度至约65度、或约35度至约50度)放置、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20RPM至约1000RPM的频率(例如约20RPM至约400RPM、约120RPM至约240RPM、约140RPM至约220RPM、约160RPM至约180RPM、约400RPM至约600RPM、约600RPM至约800RPM、或约800RPM至约1000RPM)搅拌(例如在温育箱中，如投掷(轨道)直径是约3mm至约50mm的摇动温育箱)。还提供了利用本文所述的任何示例性培养方法的生产重组蛋白的方法和测试重组蛋白制造工艺的方法。
本文提供了培养哺乳动物细胞的方法，其包括：提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；和在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基是基本上没有哺乳动物细胞的。在一些实施方案中，第一液体培养基占容器容积的约4％至约30％。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，CHO细胞含有编码重组蛋白(例如免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白)的核酸。
在一些实施方案中，容器在距水平约40至约55度进行温育。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。在一些实施方案中，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
在一些实施方案中，将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；并且在温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。在一些实施方案中，锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。在一些实施方案中，哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。在一些实施方案中，第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
还提供了培养哺乳动物细胞的方法，其包括在梯度灌注方法中培养哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下悬于液体培养基中，所述条件在培养基中产生与占透气性的锥形容器容积的4％-40％的培养基中所达到的基本相同的溶解氧(O2)浓度和流体剪切力，此时所述容器以距水平约5度至约85度的反应者角度放置、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的频率搅拌。
在一些实施方案中，锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，CHO细胞含有编码重组蛋白(例如免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白)的核酸。在一些实施方案中，第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
还提供了生产重组蛋白的方法，其包括：提供含有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述细胞悬于占容器容积的约4％至约80％的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将所述容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；以及从哺乳动物细胞或从第一或第二培养基回收重组蛋白。
在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基是基本上没有哺乳动物细胞的。在一些实施方案中，第一液体培养基占容器容积的约4％至约30％。在一些实施方案中，锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。在一些实施方案中，哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。
在一些实施方案中，重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在一些实施方案中，从哺乳动物细胞回收的重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
在一些实施方案中，容器以距水平约40度至约55度温育。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。在一些实施方案中，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
在一些实施方案中，将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；并且在温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。
在一些实施方案中，第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
还提供了生产重组蛋白的方法，其包括：在梯度灌注方法中培养含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下悬于液体培养基中，所述条件为在培养基中产生与占透气性的锥形容器容积的4％-40％的液体培养基体积中所达到的基本相同的溶解氧(O2)浓度和流体剪切力，此时所述容器以距水平约5度至约85度的反应者角度放置、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的频率搅拌。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从液体培养基回收的。
在一些实施方案中，重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在一些实施方案中，从哺乳动物细胞回收的重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。在一些实施方案中，液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
还提供了用于测试用于制作重组蛋白的制造工艺的方法，其包括：提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测细胞中的或第一或第二培养基中的重组蛋白；以及将细胞中或第一或第二培养基中存在的重组蛋白量与重组蛋白的参考水平进行比较。
在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基是基本上没有哺乳动物细胞的。在一些实施方案中，所述重组蛋白的参考水平是用不同的培养方法产生的重组蛋白水平。在一些实施方案中，所述不同的培养方法利用不同的第一和第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的锥形容器、不同的温度、不同的搅拌水平、或锥形容器的不同反应者角度。在一些实施方案中，不同的培养方法利用不同的原材料、抗成团剂(anti-clumpingagents)、或化学上定义的液体培养基。
在一些实施方案中，所述方法用于进行高通量细胞培养实验，以进行实验设计(design-of-experiment,DOE)或质量源于设计(quality-by-design,QBD)研究。在一些实施方案中，第一液体培养基占约4％至约30％的容器容积。在一些实施方案中，锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。在一些实施方案中，哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。
在一些实施方案中，重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在一些实施方案中，从哺乳动物细胞回收的重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是同时进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是连续进行的。在一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是定时地进行的。在一些实施方案中，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
在一些实施方案中，将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；并且在温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。
在一些实施方案中，第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
还提供了测试第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充物、或哺乳动物细胞来源的用于产生重组蛋白的方法中的功效的方法。这些方法包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同的方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用一种或多种不同的第一和第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的不同的原料成分或补充物、或不同的哺乳动物细胞来源；以及将与和参考水平相比重组蛋白量增加有关的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充物、或哺乳动物细胞来源鉴定为有效用于产生重组蛋白的方法。
还提供了优化重组蛋白制造工艺的方法。这些方法包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较；以及鉴定并去除或改变制造工艺中与和参考水平相比产生的重组蛋白量减少相关的任何培养组分或参数；或鉴定并向制造工艺添加与和参考水平相比产生的重组蛋白量增加相关的任何培养组分或参数。
还提供了测试第一或第二液体培养基、用于生成的第一或第二液体培养基原材料、或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法。这些方法包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同方法使用一种或多种不同的第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的不同原材料、或不同的哺乳动物细胞来源；并当产生的重组蛋白水平低于参考水平时，将第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。污染物可为生物污染物(例如分枝杆菌属(mycobacterium)、真菌、细菌、病毒(例如囊泡状病毒(vesivirus))、或不合意的哺乳动物细胞)。
如本文所用的，关于名词前面的词语“一个/一种”代表一个或多个具体的名词。例如，短语“一个哺乳动物细胞”代表“一个或多个哺乳动物细胞”。
术语“哺乳动物细胞”意指任何来自或来源于任何哺乳动物(如人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛(cow)、或兔)的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞可为永生化的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是已分化的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化的细胞。
术语“第0天”意指将哺乳动物细胞接种入第一液体培养基处的时间点。
术语“第1天”意指将哺乳动物细胞接种入第一液体培养基后第0天和约24小时之间的时间段。
术语“第2天”意指将哺乳动物细胞接种入第一液体培养基后约24小时至约48小时之间的时间段。
术语“第3天”意指将哺乳动物细胞接种入第一液体培养基后约48小时至约72小时之间的时间段。
术语“第4天”意指将哺乳动物细胞接种入第一液体培养基后约72小时至约96小时之间的时间段。对于每个附加的天数的术语(“第5天”、“第6天”、“第7天”等等)意指从前一天结束时立即起算，范围涉及附加的约24小时时段的时间段。
术语“基本上没有”意指至少约90％没有(例如至少或大约95％、96％、97％、98％、或至少或大约99％没有，或约100％没有)特定物质(如哺乳动物细胞)的组合物(例如液体培养基)。
术语“0.5x体积/容积”意指约50％的体积/容积。术语“0.6x体积/容积”意指约60％的体积/容积。同样地，0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分别指70％、80％、90％、或100％的体积/容积。
术语“培养”或“细胞培养”意指受控的一组物理条件(controlled set ofphysical conditions)下的哺乳动物细胞的维持或生长。
“锥形容器”意指瘦长的器皿(例如无菌的器皿)，其包含至少一个大致锥形的活儿大致半球形的尾端，所述尾端具有至少一个透气性的表面(例如具有的至少一个透气性膜的尾端，所述透气性膜也可以起无菌屏障的作用)和/或至少一个通气帽。锥形容器的一个非限制性的例子是具有通气帽的50mL无菌EPPENDORFTM管，所述通气帽允许气体透过。其他锥形容器是本领域已知的并且是商业上可得到的。
术语“液体培养基”意指液体，其含有足够营养物以允许哺乳动物细胞体外生长。例如，液体培养基可以含有一种或多种：氨基酸(例如20种氨基酸)、嘌呤(例如次黄嘌呤)、嘧啶(例如胸腺嘧啶)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸腺嘧啶、氰钴胺素、丙酮酸盐、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、硫酸铁、硫酸铜、硫酸锌、和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可以含有来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不含血清或其他来自哺乳动物的提取物(限定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可含有痕量金属、哺乳动物生长激素、和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的非限制性例子在本文描述。液体培养基的其他例子是本领域已知的并且是商业上可得到的。液体培养基可含有任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所用，从容器去除的第一体积的第一培养基可为基本没有哺乳动物细胞的。
术语“第一液体培养基”意指适于哺乳动物细胞培养的体积的液体培养基。
术语“第二液体培养基”意指适于哺乳动物细胞培养的体积的液体培养基，其在第一和第二液体培养基进行任何混合之前与第一液体培养基体积是分开的。
术语“无动物来源组分的液体培养基”意指不含任何来源于哺乳动物的组分(例如蛋白或血清)的液体培养基。
术语“无血清的液体培养基”意指不含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“含血清的液体培养基”意指含有哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学上定义的液体培养基”意指其中所有化学组分均已知的液体培养基。例如化学上定义的液体培养基不含胎牛血清、牛血清白蛋白、或人血清白蛋白，因为这些制备物通常含有白蛋白和脂类的复杂混合物。
术语“无蛋白质的液体培养基”意指不含任何蛋白质(例如任何可检测到的蛋白)的液体培养基。
术语“搅拌”意指盛有液体培养基的容器的运动，以增加液体培养基中的溶解O2浓度。搅拌能用任何本领域已知方法进行，例如以圆形或椭圆形运动来移动容器的器械，例如旋转摇床(rotary shaker)。可替换地或此外，搅拌还能通过倾斜容器或滚动容器来进行。能用于搅拌容器的示例性的装置在本文描述。这些装置的其他例子也是本领域已知的且商业上可得到的。
术语“免疫球蛋白”意指含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列是免疫球蛋白(例如可变域序列、框架序列、或恒定域序列)的至少15个氨基酸(例如至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的序列。免疫球蛋白可例如包含轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸，例如重链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。所述免疫球蛋白可为分离的抗体(例如IgG、IgE、IgD、IgA、或IgM)。免疫球蛋白可为IgG的亚类，(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)。免疫球蛋白可为抗体片段，例如Fab片段、F(ab′)2片段、或scFv片段。免疫球蛋白还可以是双特异性抗体，或三特异性抗体，或二聚体、三聚体、或多聚体抗体，或双体抗体(diabody)、或免疫球蛋白还可为含有至少一个免疫球蛋白域的工程改造的蛋白(例如融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性例子在本文描述，且免疫球蛋白的其他例子是本领域已知的。
术语“蛋白片段”或“多肽片段”意指多肽序列的部分，其长度是至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸、或至少或约20个氨基酸，或超过20个氨基酸。重组蛋白片段可用任何本文所述方法来生产。
术语“经工程改造的蛋白”意指非经生物体(例如哺乳动物)中存在的内源性核酸天然地编码的多肽。经工程改造的蛋白的例子包括含有至少一个重组支架序列的酶(例如具有一个或多个氨基酸替换、缺失、插入或添加，其导致经工程改造的酶的稳定性和/或催化活性增加)、融合蛋白、抗体(例如二价抗体、三价抗体、或双体抗体)、以及抗原结合蛋白。
术语“流体剪切力”意指由液体大致平行于表面(例如细胞表面或容器表明)流动引起的压力。流体剪切力一般定义为施加的力除以材料的横截面积，所述材料具有与施加的力矢量平行的面积。计算流体剪切力的示例性的方法在本文描述，并且是本领域已知的。
术语“溶解O2浓度”或“溶解氧浓度”意指溶解在液体培养基(例如任何本文描述的或本领域已知的液体培养基)中的氧气的量。测量液体培养基中溶解O2浓度的非限制性的方法在本文描述，并且其他是本领域已知的。
术语“回收”意指从细胞培养基中存在的一种或多种其他组分(例如哺乳动物细胞或培养基蛋白)或从哺乳动物细胞裂解物中存在的一种或多种其他组分(例如DNA、RNA或其他蛋白)部分地纯化或分离(例如按重量计至少或约5％，例如至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或至少或约95％纯)重组蛋白。从液体培养基或从哺乳动物细胞裂解物回收蛋白的非限制性方法在本文描述，并且其他是本领域已知的。
术语“分泌的蛋白”或“分泌的重组蛋白”意指初始含有至少一种分泌信号序列的蛋白或重组蛋白，当其在哺乳动物细胞内被翻译并在哺乳动物细胞经过(至少部分地)分泌信号序列的酶切时，其被释放到细胞外空间中(例如液体培养基)。
短语“梯度灌注”指的是在培养期间随时段(例如约24小时时段、约1分钟和约24小时之间的时段、或大于24小时的时段)递增所去除的和增加的培养基体积的递进改变(例如增加或减少)(例如每天的培养基再补料速率)。例如，梯度灌注工艺的一个实施方案可需要如下的再补料方案：第1-3天再补料约0.5x反应者体积的培养基(reactor volume,RV)/天，第4-6天再补料约0.7x RV/天，并且第7天和自此起再补料约1.0x RV/天。这个具体例子能根据具有一定的再补料速率的天数而变化和/或根据任何具体的24小时时段内的再补料速率而变化。每天去除的和替代的基质的比例可依赖于具体培养的细胞、初始接种密度、和具体时间处的细胞密度而变化。“RV”或“反应者体积”意指在培养工艺开始处存在的培养基的体积(即接种后存在的培养基总体积)。
术语“分批补料培养”意指递增的或连续地添加第二液体培养基至初始细胞培养物，而基本没有或没有显著地从细胞培养物去除第一液体培养基。在分批补料培养的一些实施方案中，第二液体培养基与第一液体培养基是相同的。在分批补料培养的一些实施方案中，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在分批补料培养的一些实施方案中，第二液体培养基是作为干粉添加的。
术语“反应者角度”指的是从水平位置的偏离角，所述水平位置是盛有哺乳动物细胞的容器在本文所述培养方法期间所放置的位置。例如，当盛有哺乳动物细胞的容器是50mL圆锥管并且相对于实验台或地面垂直而立时，反应者角度是90o；而当盛有哺乳动物细胞的容器是50mL圆锥管并且相对于实验台或地面水平放置时，反应者角度是0o。在另一个例子中，当盛有哺乳动物细胞的容器是50mL圆锥管并且在垂直和水平间等距放置时(相对于实验台或地面)，反应者角度是45o。
本文使用的“比生产速率(specific productivity rate)”或“SPR”指的是每个哺乳动物细胞每天产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的SPR通常测量为质量/细胞/天。重组酶的SPR通常测量为单位/细胞/天或(单位/质量)/细胞/天。
本文使用的“体积生产速率”或“VPR”指的是每体积的培养物(例如没L的生物反应器、器皿、或管体积)每天产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的VPR通常测量为质量/L/天。重组酶的VPR通常测量为单位/L/天或质量/L/天。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有相同的含义，如本发明所述领域普通技术人员通常理解的那样。在此描述方法和材料用于在本发明中使用；还能使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法、和例子仅是说明性的，并非意在进行限定。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过提述以其整体并入。若发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其他特征和优势从如下具体描述和附图，以及从权利要求是明显的。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；和
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的。
2.项1的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
3.项1的方法，其中所述第一液体培养基占约20％的容器容积。
4.项1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.项4的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
6.项5的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
7.项1的方法，其中所述容器在距水平约40度至约55度温育。
8.项1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。
9.项1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。
10.项1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
11.项1的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
12.项11的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；
在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。
13.项1的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
14.项1的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。
15.项1的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
16.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
在梯度灌注方法中培养哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下悬于液体培养基中，所述条件在培养基中产生与占透气性的锥形容器容积的4％-40％的培养基中所达到的基本相同的溶解氧(O2)浓度和流体剪切力，此时所述容器以距水平约5度至约85度的反应者角度放置、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的频率搅拌。
17.项16的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
18.项16的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
19.项18的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
20.项19的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
21.项16的方法，其中所述液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
22.一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述细胞悬于占容器容积的约4％至约80％的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将所述容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；和
从哺乳动物细胞或从第一或第二培养基回收重组蛋白。
23.项22的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
24.项22的方法，其中所述第一液体培养基占约4％至约30％的容器容积。
25.项22的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
26.项22的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。
27.项22的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
28.项22的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。
29.项22的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。
30.项29的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
31.项22的方法，其中所述容器在距水平约40度至约55度进行温育。
32.项22的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。
33.项22的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续地进行的。
34.项22的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
35.项22的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
36.项35的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；
在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。
36.项22的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
37.一种产生重组蛋白的方法，所述方法包括：
在梯度灌注方法中培养含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下悬于液体培养基中，所述条件在培养基中产生与在占透气性的锥形容器容积的4％-40％的液体培养基体积中所达到的基本相同的溶解氧(O2)浓度和流体剪切力，此时所述容器以距水平约5度至约85度的反应者角度放置、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的频率搅拌；和
从哺乳动物细胞或液体培养基回收重组蛋白。
38.项37的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
39.项37的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从液体培养基回收的。
40.项37的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。
41.项40的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
42.项37的方法，其中所述液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
43.一种用于测试用于制作重组蛋白的制造工艺的方法，所述方法包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；
检测细胞中的或第一或第二培养基中的重组蛋白；和
将细胞中或第一或第二培养基中存在的重组蛋白量与重组蛋白的参考水平进行比较。
44.项43的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
45.项43的方法，其中所述重组蛋白的参考水平是用不同的培养方法产生的重组蛋白水平。
46.项45的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的第一和第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平、或锥形容器的不同反应者角度。
47.项45的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的原材料、抗成团剂(anti-clumping agents)、或化学上定义的液体培养基。
48.项43的方法，其中所述方法用于进行高通量细胞培养实验，以进行实验设计(design-of-experiment,DOE)或质量源于设计(quality-by-design,QBD)研究。
49.项43的方法，其中所述第一液体培养基占约4％至约30％的容器容积。
50.项43的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
51.项43的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于约2mL至约15mL的第一液体培养基中。
52.项43的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
53.项43的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段、或分泌的经工程改造的蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。
54.项43的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。
55.项54的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
56.项43的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是同时进行的。
57.项43的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是连续进行的。
58.项43的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和所述的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
59.项43的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
60.项59的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天经至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约50％；
在温育的第4天经至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的约100％。
61.项43的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
附图描述
图1是显示置于不同反应者角度、伴随旋转搅拌的不同容器的非限制性例子的示意图。
图2A是显示C02.31细胞的活细胞密度概貌的图，所述细胞在距水平45o和距水平90o放置的摇管(其分别对应于45o和90o的反应者角度)中培养经过18天。
图2B是显示C02.31细胞的体积生产速率概貌的图，所述细胞在距水平45o和距水平90°放置的摇管(其分别对应于45°和90°的反应者角度)中培养经过18天。
图2C是显示C02.31细胞的谷氨酰胺消耗速率的图，所述细胞在距水平45°和距水平90°放置的摇管(其分别对应于45°和90°的反应者角度)中培养经过18天。
图2D是显示C02.31细胞的乳酸盐产生的图，所述细胞在距水平45°和距水平90°放置的摇管(其分别对应于45°和90°的反应者角度)中培养经过18天。
图2E是显示C02.31细胞的比生产速率(SPR)概貌的图，所述细胞在距水平45°和距水平90°放置的摇管(其分别对应于45°和90°的反应者角度)中培养经过18天。
图2F是显示当C02.31细胞以距水平45°(反应者角度为45°)的角度和距水平90°(反应者角度为90°)的角度培养时的体积生产速率和比生产速率的平均百分比增加的图。
图3A是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系C02.31摇动悬浮培养物的体积生产速率的图，所述培养物在不同温度维持在CD CHO培养基中，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图3B是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系C02.31摇动悬浮培养物的比生产速率的图，所述培养物在不同温度维持在CD CHO培养基中，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图3C是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系C02.31摇动悬浮培养物的百分比细胞存活率的图，所述培养物在不同温度维持在CD CHO培养基中，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图3D是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系C02.31摇动悬浮培养物的活细胞密度的图，所述培养物在不同温度维持在CD CHO培养基中，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图4是显示各CO2暴露、搅拌频率(RPM)、和反应者角度对于活细胞数、百分比活细胞和重组蛋白活性或产生率的统计学影响的图。这些分析是用JMP软件进行的(参见JMP网站)。每个个体参数对于细胞生长和重组蛋白产生率的影响以0至1的值范围显示。0的值代表对于细胞生长和重组蛋白产生率的所期望的效果最小的条件。1的值代表对于细胞生长和重组蛋白产生率的所期望的效果最大的条件。
图5A是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的活细胞密度概貌的图，所述细胞系在CDCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图5B是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的活细胞密度概貌的图，所述细胞系在OptiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图5C是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的活细胞密度概貌的图，所述细胞系在FortiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图6A是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的综合活细胞密度(IVCD)概貌的图，所述细胞系在CD CHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图6B是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的IVCD概貌的图，所述细胞系在OptiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图6C是显示重组半乳糖苷酶克隆细胞系的IVCD概貌的图，所述细胞系在FortiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图7A是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的体积生产速率的图，所述细胞系在CDCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图7B是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的体积生产速率的图，所述细胞系在OptiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图7C是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的体积生产速率的图，所述细胞系在FortiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图8A是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的比生产速率的图，所述细胞系在CD CHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图8B是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的比生产速率的图，所述细胞系在OptiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图8C是四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的比生产速率的图，所述细胞系在FortiCHO培养基中摇动，并以距水平约45°(反应者角度为45°)放置。
图9A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31活细胞百分比的图，所述细胞在距水平约45°(反应者角度为45°)放置的摇管(ST)内或12-L生物反应器内的CDCHO培养基中。误差线代表n的标准差。
图9B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的活细胞密度概貌的图，所述细胞在距水平约45°(反应者角度为45°)放置的摇管(ST)内或12-L生物反应器内的CD CHO培养基中进行培养。误差线代表n的标准差。
图9C是重组半乳糖苷酶的产品滴度(单位/L)的图，所述重组半乳糖苷酶存在于重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的液体培养基中，所述细胞在距水平约45°(反应者角度为45°)放置的摇管(ST)内或12-L生物反应器内的CD CHO培养基中进行培养。误差线代表n的标准差。
图9D是显示重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的比生产速率(pg/细胞/天)的图，所述细胞在距水平约45°(反应者角度为45°)放置的摇管(ST)内或12-L生物反应器内的CDCHO培养基中进行培养。误差线代表n的标准差。
图10是显示重组半乳糖苷酶的活细胞密度的图，所述重组半乳糖苷酶在卫星锥形容器工艺运行(runs)中，以距水平约45°的角度(反应者角度约为45°)进行培养(“旋转管培养”)(n＝6)，或是在12-L生物反应器细胞培养工艺运行(“12L生物反应器”)(n＝2)中进行培养。显示了平均数据。
图11是重组人α-半乳糖苷酶随时间的滴度(单位/L)的图，所述重组人α-半乳糖苷酶在卫星锥形容器工艺运行中，以距水平约45°的角度(反应者角度约为45°)进行培养(“旋转管培养”)(n＝6)，或是在12-L生物反应器细胞培养工艺运行(“12L生物反应器”)(n＝2)中进行培养。显示了平均数据。
图12A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞随时间的活细胞密度的图，所述细胞在50mL摇管和600mL马克西管(maxi tube)内的CD CHO培养基中进行培养。误差线代表标准差(n＝2)。
图12B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的百分比细胞存活率的图，所述细胞在50mL摇管和600mL马克西管(maxi tube)内的CD CHO培养基中进行培养。误差线代表标准差(n＝2)。
图13是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在50mL摇管(n＝2)和600mL马克西管(n＝2)内的CD CHO培养基中进行培养，其与培养在50mL摇管内的CD CHO培养基中的重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的历史平均随时间的活细胞密度进行比较(“历史摇管”，n＝9)。
图14A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的体积生产速率(VPR)，所述细胞在50mL摇管(n＝2)和600mL马克西管(n＝2)内的CD CHO培养基中进行培养，其与培养在50mL摇管内的CD CHO培养基中培养的重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的VPR的历史平均值(“历史摇管”，n＝9)相比。
图14B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中比生产速率(SPR)的图，所述细胞在50mL摇管(n＝2)和600mL马克西管(n＝2)内的CD CHO培养基中培养。
图15A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图15B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图15C是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的百分比细胞存活率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图16是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图17A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合(integrated)活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图17B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图17C是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的滴定概貌对综合体积生产速率概貌的终点比较的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图18A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图18B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图19A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图19B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝3的标准差。
图20A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图20B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图20C是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的百分比细胞存活率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图21是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图22A是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图22B是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中随时间的综合体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图22C是重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞中滴定概貌对综合体积生产速率的终点比较的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数进行培养。误差线代表n＝2的标准差。
图23A是对活细胞密度进行模型预测的实时活细胞密度数据的拟合。
图23B是对体积生产速率数据进行模型预测的实时体积生产速率数据的拟合。
图24A是显示各参数对活细胞密度的效果的相互作用概貌的一套图。
图24B是显示各参数对体积生产速率的效果的相互作用概貌的一套图。
图25是显示最佳操作条件的一套图，其基于输入到所选的统计模型中的经验数据，并考虑到了标准差(用伴随响应趋势的虚线显示)。
图26A显示分组的重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的平均峰值活细胞密度的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数维持12-14天。误差线代表每组中条件的n＝数字的标准差。
图26B是显示分组的重组半乳糖苷酶克隆C02.31细胞的平均峰值体积生产速率的图，所述细胞在CD CHO培养基中用多种参数维持12-14天。
发明详述
本文提供改进的哺乳动物细胞培养方法。所述培养方法能达到大于10x106细胞/mL、大于15x 106细胞/mL、大于20x 106细胞/mL、大于25x 106细胞/mL、大于30x 106细胞/mL、大于35x 106细胞/mL、大于40x 106细胞/mL、大于45x 106细胞/mL、大于50x 106细胞/mL、大于55x 106细胞/mL、或大于60x 106细胞/mL的活哺乳动物细胞密度(例如在液体培养基中，例如第一液体培养基，或第一和第二液体培养基的组合)。例如，培养方法能达到10x106细胞/mL-30x 106细胞/mL、10x 106细胞/mL-25x 106细胞/mL、12x 106细胞/mL-20x 106细胞/mL、20x 106细胞/mL-65x 106细胞/mL、25x 10x 106细胞/mL-60x 106细胞/mL、25x 106细胞/mL-55x 106细胞/mL、25x 106细胞/mL-50x 106细胞/mL、或30x 106细胞/mL-50x 106细胞/mL的活哺乳动物细胞浓度。能用多种不同的方法来确定细胞密度或活细胞密度。例如，可以将细胞培养物的样品稀释于生理缓冲液中，将经稀释的细胞悬液置于血细胞计数器中，并用光学显微镜对细胞计数。在其他方法中，可以用类似的方法来确定活细胞密度，但包括在生理缓冲液中选择性地由非活细胞所占的染料(例如台盼蓝、如来自BeckmanCoulter的Vi-CELL方法(参见Beckman Coulter网站))。在另一个例子中，可以用荧光辅助的流式细胞术(例如来自Merck Millipore的GUAVA(参见Millipore网站))和其他细胞计数方法来确定细胞密度或活细胞密度。
在一些实施方案中，计数方法导致了显著提高的比生产速率。例如，通过本文提供的方法所达到的比生产速率比培养条件基本相同、但反应者角度设为0°时所达到的比生产速率至少大2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、或200倍。通过本方法达到的生产率可为至少10,000单位/L、至少15,000单位/L、至少20,000单位/L、至少25,000单位/L、至少30,000单位/L、至少35,000单位/L、或至少40,000单位/L(在第一和/或第二液体培养基中)。在一些实施方案中，通过本方法达到的生产率可为至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L、或至少5.0g/L。
重组蛋白的生物学活性能用多种本领域已知方法来评估，并且依赖于具体重组蛋白的活性。例如，免疫球蛋白(例如抗体或抗体片段)这种重组蛋白的生物学活性能通过测量抗体结合其特异性表位的亲和力来确定(例如用Biocore或竞争性酶联免疫吸附测定法)。重组蛋白可为酶(例如重组半乳糖苷酶，例如重组α-半乳糖苷酶)，并且其生物学活性可以通过测量酶的活性来确定(例如通过测量可检测底物浓度的减少或可检测产物浓度的增加(例如用分光光度法或光发射法)来确定酶的催化速率常数)。例如，重组半乳糖苷酶的生物学活性能通过测量神经酰胺三己糖苷(globotriasylceramide,GL-3)或半乳二糖基神经酰胺(galabiosylceramide)水平的降低或神经酰胺二己糖苷或半乳糖水平的增加来检测
哺乳动物细胞的培养方法
在本文所述方法的示例性方法中，锥形容器是首先提供的。将第一液体培养基添加到锥形容器，以使培养基占约4％至约80％(例如约4％至约70％、约4％至约60％、或约4％至约30％)的容器容积。向第一液体培养基添加至少一种哺乳动物细胞，即在向容器添加培养基之前或之后。将容器在约31℃至约40℃温育一段时间，并使其处于距水平约5度至约85度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约5度至约65度、或约35至约50度)的反应者角度并搅拌，例如在旋转摇动装置上以约20RPM至约1000RPM(例如约20RPM至约400RPM、约120RPM至约240RPM、约140RPM至约220RPM、约160RPM至约180RPM、约400RPM至约600RPM、约600RPM至约800RPM、或约800RPM至约1000RPM)进行搅拌。可以将细胞温育，例如在温育箱中温育，如具有约3mm至约50mm的投掷(轨道)直径的旋转温育箱。在温育期间，在时间段内连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基(例如包含任何哺乳动物细胞浓度的，例如基本无哺乳动物细胞的或基本被制成基本无哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。典型地，第一和第二体积是大致相等的，但可以有少量差别，例如当第一和第二体积相比时，其差别多至约10％。在一些实施方案中，添加的第二体积的第二液体培养基少于(例如至多约少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％)去除的第一体积的第一液体培养基。如本领域所知，术语温育能包括短时间段(例如至多10分钟、至多20分钟、至多30分钟、至多40分钟、至多50分钟、或至多1小时)，在所述时间段内将盛有哺乳动物细胞和液体培养基的容器从温育箱移走，以去除第一体积的第一液体培养基并添加第二体积的第二液体培养基。
下文描述这些培养方法的各方面的多种非限制性例子。本文提供的方法的这些示例性的方面能无限制地用于任何组合中。
哺乳动物细胞
本文提供的方法能用于培养多种不同的哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是在悬液中生长的细胞或贴壁细胞。可用本文所述任何方法培养的哺乳动物细胞的非限制性例子包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO DG44细胞、CHO-K1s细胞、C02.31克隆细胞、A14.13克隆细胞、C02.57克隆细胞、和F05.43克隆细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如NS/0)、B-细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚胎肾(HEK)细胞(例如HEK 293E和HEK 293F)、非洲绿猴肾上皮(Vero)细胞、和Madin-Darby Canine(Cocker Spaniel)肾上皮细胞(MDCK)细胞。其他能用本文所述方法培养的哺乳动物细胞是本领域已知的。
哺乳动物细胞能含有编码重组蛋白的重组核酸(例如稳定整合于哺乳动物细胞基因组中的核酸)。编码示例性重组蛋白的重组核酸的非限制性例子在下文描述，即可用本文所述方法生产的重组蛋白。在一些例子中，置于容器中用于培养的哺乳动物细胞来源于较大的培养物。例如，容器中的哺乳动物细胞可以来源于大规模生物反应器培养物，即卫星培养物能用所述方法来制备。
培养基
液体培养基是本领域已知的。第一和/或第二组织培养基能用哺乳动物血清(例如胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、和表皮生长因子)来补充。或者或此外，第一和/或第二液体培养基可为化学上定义的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基、或含血清的液体培养基。化学上定义的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基、和含血清的液体培养基的非限制性例子是商业上可得到的。
液体培养基典型地含有能量源(例如碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如20个氨基酸的基本集合加上半胱氨酸)、维生素和/或其他有机化合物(其在低浓度处是需要的)、游离脂肪酸、和/或微量元素。第一和/或第二液体培养基能(如果需要的话)用例如哺乳动物激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如钙、镁、和磷酸盐)、核苷和碱基(如腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷和次黄嘌呤核苷)、蛋白和组织水解产物、和/或任何这些添加剂的组合来补充。
具体在当前所述方法中有用的液体培养基的非限制性例子包括例如CDCHO、OptiCHO、和Forti CHO(均可从Life Technologies；Grand Island,NY获得)、Hycell CHO培养基(Thermo Fisher Scientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cell CD CHO Fusion培养基(Sigma-Aldrich Co.；St.Louis,MO)、和PowerCHO培养基(Lonza Group,Ltd.；Basel,Switzerland)。同样可在本方法中有用的培养基组分包括但不限于化学上定义的(CD)水解产物，例如CD蛋白胨、CD多肽(两个或更多氨基酸)、和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的其他例子是本领域已知的。
技术从业者会知道本文所述的第一液体培养基和第二液体培养基可以是同类培养基或不同的培养基。
容器
容器可以是无菌的锥形容器(例如600mL容器，50mL、40mL、30mL、25mL、20mL、15mL、10mL、或5mL容器)。容器可具有至少2mL(例如约2mL至约600mL、约2mL至约2L、或约2mL至约3L(例如约5mL-约500mL、约2mL-约10mL、约2mL-约5mL、约5mL-约15mL、约15mL-约50mL、约40mL-约100mL、约100mL-约600mL、约200mL-约600mL、约250mL-约500mL、约50mL-约3L、约50mL-约2.5L、约50mL-约2L、约50mL-约1.5L、约50mL-约1L、或约50mL-约800mL，包括端点)的容积)的容积。容器能包含至少一个透气性表面(例如至少一个具有透气性膜的表面，所述膜也可以起无菌屏障的作用)和/或至少一个通气帽。容器可以是无菌组织培养瓶。或者，容器可以是具有大体平的或平整的末端的无菌管，其具有至少一个透气性表面(例如至少一个透气性膜)和/或至少一个通气帽。容器可以具有这样的外表面，所述外表面可让管以距水平约5度至约85度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约5度至约65度、或约35度至约50度)稳定地置于组织培养温育箱中。
容器的内表面可具有至少一层涂层(例如至少一层明胶、胶原、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯、和层粘连蛋白的涂层)。容器可为例如来自Techno Plastic Products AG,Switzerland,的Bioreactors 50、或来自Sartorius AG,Goettingen,Germany的50mL CultiFlask。容器(例如不同形状和尺寸的容器)和容器内表面涂层的其他例子是本领域已知的，并能用于本方法中。
反应者角度
可以将容器以距水平约5度至约85度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约5度至约65度、或约35度至约50度)的反应者角度(参见图1中所示非限制性例子)温育。可以将容器以距水平约60度至约85度、距水平约70度至约85度、约15度至约60度、距水平约30度至约55度、距水平约40度至约55度、或距水平约40度至约50度的反应者角度温育。容器可以置于距水平约45度至距水平约50度、或距水平约40度至距水平约45度。容器可以置于装置中，所述装置将容器特别且安全地置于距水平约5度至约85度的反应者角度(特别是置于距水平约10度至约85度、约15度至约85度、约25度至约85度、约25度至约55度、或约40度至约55度的反应者角度)。容器的放置能用任何本领域已知的方式来进行，例如通过使用支持或锁定元件的来进行。
搅拌
本文描述的方法需要对含有哺乳动物细胞和第一和/或第二液体培养基的培养物进行搅拌。搅拌可以以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的频率进行(例如以约20RPM至约400RPM、以约120RPM至约220RPM、以约140RPM至约220RPM、以约以约160RPM至约180RPM、以约140RPM至约150RPM、以约150RPM至约160RPM、以约160RPM至约170RPM、以约170RPM至约180RPM、以约180RPM至约190RPM、以约190RPM至约200RPM、以约200RPM至约210RPM、以约210RPM至约220RPM、以约140RPM至约180RPM、以约140RPM至约160RPM、以约160RPM至约200RPM、以约180RPM至约220RPM、以约220RPM至约300RPM、以约300RPM至约350RPM、以约350RPM至约400RPM、以约400RPM至约600RPM、以约600RPM至约800RPM、或以约800RPM至约1000RPM的频率)(例如在温育箱中，如在具有3mm至约50mm的投掷(轨道)直径的摇动温育箱中进行)。
如本领域所知，搅拌水平(例如RPM速度)可以是变化的，这取决于容器的尺寸和形状(例如容器直径)和用于进行温育的温育箱的投掷(轨道)直径。例如，较小的投掷(轨道)直径可以需要较高水平的搅拌来达到相似的流体剪切力水平和溶解O2浓度。在另一个例子中，具有较大直径的容器可以需要较低的RPM速度，而具有较小直径的容器可以需要较高的RPM速度来达到相似的流体剪切力水平和溶解O2浓度。在一些实施方案中，用摇管温育箱以约25mm至约50mm的投掷(轨道)直径和约20RPM至约400RPM(例如约120RPM至约240RPM、140RPM至约220RPM、160RPM至约180RPM)的搅拌来进行温育。在一些实施方案中，用摇管温育箱以约1mm至约25mm的投掷(轨道)直径和约20RPM至约1000RPM(例如约100RPM至约1000RPM、约200RPM至约1000RPM、约100RPM至约200RPM、约200RPM至约300RPM、约300RPM至约400RPM、约400RPM至约500RPM、约500RPM至约600RPM、约600RPM至约700RPM、约700RPM至约800RPM、约800RPM至约900RPM、约900RPM至约1000RPM)的搅拌来进行温育。
如本领域所知，采用的搅拌的类型取决于容器的结构。例如，容器可为锥形容器(例如具有大于2mL容积的锥形容器，例如约2mL至约600mL锥形容器，或约2mL至约50mL锥形容器)，而搅拌可以用旋转圆形(circular)摇动以约120RPM至约400RPM(例如约120RPM至约220RPM、约140RPM至约220RPM、或约160RPM至约180RPM)的频率进行。或者或此外，可以用容器的椭圆形摇动、或水平和/或垂直摆动来搅拌容器。搅拌可以连续地或定时地进行。
对容器的搅拌能导致与透气性锥形容器中所达到的基本相同的溶解氧(O2)浓度，所述锥形容器盛有占容器容积的4％-80％(例如4％至40％或4％至30％)的培养基，此时所述容器置于距水平约5度至约85度的反应者角度(例如置于约10度至约85度、约15度至约85度、约25度至约85度、或约40度至约55度的反应者角度)、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20RPM至约1000RPM(例如约20RPM至约400RPM、约120RPM至约240RPM、约140RPM至约220RPM、约160RPM至约180RPM、约400RPM至约600RPM、约600RPM至约800RPM、或约800RPM至约1000RPM)的频率搅拌。使用距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约25度至约85度、或约40度至约55度的反应者角度)导致第一和/或第二液体培养基中溶解O2浓度升高和/或更好的气体混合(与使用距水平约90度的反应者角度相比)。
可以用湿空气控制的温育箱(例如大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的湿度，或100％的湿度)，并用提供一个或多个容器的搅拌的机械装置进行搅拌，所述容器盛有哺乳动物细胞和液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)。
温度
本文所述培养方法可在约31℃至约40℃的温度进行。技术从业人员知道在培养方法的具体时间点处(例如在每小时或每天的基础上)可改变温度。例如，在用哺乳动物细胞首次接种容器后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、或约20天或更多可变化或转变(例如提高或降低)温度。例如，可将温度上移(例如多至或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或多至约20℃的变化)。例如可将温度下移(例如多至或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或多至约20℃的变化)。
示例性的条件组合
这部分描述的是能用于任何本文所述方法的示例性的条件的组合，其具有体积为例如约30mL至约100mL，例如约50mL的容器(例如透气性锥形容器)。在一些例子中，所述方法使体积为约30mL至约60mL的透气性锥形容器，以约5°至约15°(例如约3°至约7°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的约2％至约10％(例如约2％至约8％或约2％至约6％)，并且搅拌为至少150RPM(例如约220RPM-300RPM，例如约240RPM-约280RPM)，或此时液体培养基体积是容器容积的至少10％(例如容器容积的约10％-约40％，例如约10％-约30％或约15％-约25％)，而搅拌是约50RPM-约150RPM(例如约65RPM-约105RPM)。
在一些实施方案中，所述方法使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约5°-约25°(例如约18°-约22°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的至少25％(例如至少30％或至少35％，或约35％-约45％，或约37％-约43％)，并且搅拌为至少250RPM(例如至少300RPM或至少320RPM，或约300RPM-约360RPM)。
在一些实施方案中，所述方法用使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约25°-约35°(例如约27°-约33°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的约2％-约15％(例如约2％-约12％、约2％-约10％、或约2％-约8％)，而搅拌为约20RPM-约160RPM(例如约60RPM-约160RPM，约80RPM-约160RPM，或约100RPM-约140RPM)；或此时液体培养基体积是容器容积的约20％-约40％(例如约25％-约40％、约25％-约35％、或约30％-约34％)，而搅拌是至少200RPM(例如至少220RPM或至少240RPM，或约200RPM-约300RPM、约220RPM-约280RPM、或约235RPM-约275RPM)。
在一些实施方案中，所述方法使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约35°-约55°(例如约40°-约50°或约42°-约48°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的约2％-约30％(例如约4％-约28％、约6％-约28％、约10％-约25％、约15％-约25％、或约18％-约22％)，而搅拌为约100RPM-约220RPM(例如约120RPM-约200RPM、约120RPM-约180RPM、或约140RPM-约180RPM)。
在一些例子中，所述方法使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约55°至约62°(例如约58°至约62°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的约2％至约20％(例如约2％至约15％、约2％至约10％、或约2％至约6％)，搅拌是至少230RPM(例如至少240RPM、至少250RPM、至少260RPM、或约230RPM至约280RPM、或约240RPM至约270RPM)；或此时液体培养基体积是容器容积的至少40％(例如至少45％、至少50％、至少55％、或至少60％、或约40％至约80％、约45％至约75％、约50％至约70％、约55％至约65％、或约58％和62％)，搅拌是约100RPM至约230RPM(例如约120RPM至约210RPM、约140RPM至约190RPM、约150RPM至约210RPM、约160RPM至约210RPM、或约178RPM至约198RPM)。
在一些例子中，所述方法使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约60°至约70°(例如约62°至约68°)的反应者角度进行培养，液体培养基体积是容器容积的至少70％(例如至少75％或至少80％、或约60％至约90％、约70％至约90％、或约75％至约85％)，而搅拌是至少200RPM(例如至少220RPM、至少240RPM、或至少250RPM、或约210RPM至约290RPM、约230RPM至约270RPM、或约240RPM至约260RPM)。
在一些例子中，所述方法使用容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器，以约70°至约85°(例如约75°至约85°或约80°至约85°)的反应者角度进行培养，并且此时液体培养基体积是容器容积的约30％至约55％(例如约35％至约50％或约40％至约45％)，搅拌是约280RPM至约380RPM(例如约290RPM至约370RPM、约280RPM至约360RPM、约290RPM至约350RPM、约300RPM至约340RPM、约320RPM至约340RPM)；或此时液体培养基体积是容器容积的约60％至约90％(例如约60％至约80％、约65％至约85％、约65％至约80％、或约65％至约75％)，搅拌是约280RPM至约380RPM(例如约290RPM至约370RPM、约280RPM至约360RPM、约290RPM至约350RPM、约300RPM至约340RPM、约320RPM至约340RPM)。
在一些例子中，容器(例如容积为约30mL至约60mL(例如约50mL)的透气性锥形容器)盛有体积是容器容积的约40％至约60％(例如约45％至约55％)的液体培养基，所述容器置于约45°至约70°(例如约45°至约60°)的反应者角度，并以至少200RPM(例如至少220RPM、至少240RPM、至少260RPM、或至少280RPM)进行搅拌。
总体而言，容器中较低体积的液体培养基往往在低反应者角度时生长最佳，而较大体积往往在较高搅拌速率时生长最佳。
培养基去除和更换
本文所述方法包括从容器去除第一体积的第一培养基(例如含有任何浓度的哺乳细胞的，例如基本没有哺乳动物细胞的第一体积的第一培养基)，并向第一培养基添加第二体积的第二培养基。去除和添加能同时地或序贯地进行，或二者的结合。进一步地，去除和添加能连续地进行(例如以去除或更换容器容积或第一培养基体积的0.1％-800％(例如1％-700％、1％-600％、1％-500％、1％-400％、1％-350％、1％-300％、1％-250％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％、和4％-30％)的体积的速率在任何给定时间段(例如24小时时段、约1小时至约24小时递增的时段，或大于24小时的递增的时段))进行，或定时地进行(例如每三天1次，每两天1次，每天1次，每天2次，每天3次，每天4次或每天5次)，或按其任何组合来进行。当定时地进行时，去除或更换的体积(例如在24小时时段内、在约1小时至约24小时递增的时段内，或在大于24小时的递增的时段内)可为例如容器容积或第一培养基体积的0.1％-800％(例如1％-700％、1％-600％、1％-500％、1％-400％、1％-300％、1％-200％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％、和4％-30％)。去除的第一体积的第一培养基和添加的第二体积的第二培养基在一些情况下可以在整个或部分培养期内的每24小时时段(或者，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内保持在大约相同。如本领域所知，第一体积的第一培养基的移除速率(体积/时间单位)和第二体积的第二培养基的添加速率(体积/时间单位)是可以变化的。第一体积的第一培养基的移除速率(体积/时间单位)和第二体积的第二培养基的添加速率(体积/时间单位)可为大约相同的或可为不同的。
或者，去除的和添加的体积可以在培养期间的每24小时时段(或者，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内变化(例如逐渐增加)。包括逐渐增加体积的方法的非限制性例子在本文描述。例如，培养期间的每24小时时段(或者，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内去除的第一液体培养基的体积和添加的第二培养基的体积可以随培养期从容器容积或第一培养基体积的0.5％至约20％的体积增加(如逐渐地或交错地递增)至容器容积或第一培养基体积的约25％至约150％。
技术从业人员知道，第一液体培养基和第二液体培养基可为同类的培养基。在另一个例子中，第一液体培养基和第二液体培养基可为不同的。
第一体积的第一液体培养基可以通过如下方式去除，例如对容器的离心(例如低速吊桶式离心)和从上清去除基本不含哺乳动物细胞第一体积的第一液体培养基。或者或此外，第一体积的第一液体培养基可以通过使第一体积的第一液体培养基的重力流经过无菌膜来去除，所述无菌膜具有排除哺乳动物细胞的分子量截留。
可以将第二体积的第二液体培养基通过例如灌注泵添加至第一培养基。可以手动地(例如通过移液将第二体积的第二液体培养基移至第一培养基上)或用自动化方式将第二液体培养基添加至第一培养基。
在一些例子中，去除第一体积的第一液体培养基(例如基本没有哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基不在用哺乳动物细胞接种容器的至少1小时内(例如2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内、或96小时后)进行。
CO2
本文所述方法能进一步包括在含有至多或约15％CO2(例如至多或约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2、或至多或约1％CO2)的空气中温育容器。此外，任何本文所述方法都能包括在湿空气(例如至少或约20％、30％、40％、50％、60％、70％、85％、80％、85％、90％、或至少或约95％湿度，或约100％湿度)中温育容器。
示例性的装置
能用于进行本文所述的培养方法的装置的非限制性例子包括：AppropriateTechnical Resources(Maryland,USA)分配INFORS Multiron摇动温育箱(INFORS；Basel,Switzerland)，和Kuhner摇动温育箱(Kuhner AG；Basel,Switzerland)。能用于进行本文所述的培养方法的装置的非限制性例子包括具有投掷(轨道)直径为约3mm至约50mm的(例如约1mm至约25mm，或约25mm至约50mm)旋转温育箱。摇动温育箱和旋转培养温育箱的其他例子是本领域已知的。
溶解O2和流体剪切力
还提供了培养方法，包括在梯度灌注方法中培养哺乳动物细胞，所述细胞在这样的条件下被悬浮于液体培养基中，所述条件在培养基中产生流体剪切力和与在透气性的锥形容器中所达到的相同(或基本相同)的溶解氧(O2)浓度，所述透气性的锥形容器盛有4％-80％(例如4％-40％或4％-30％)容器容积的液体培养基，此时所述容器置于距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约25度至约85度、或约40度至约55度)、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM(例如约20RPM至约400RPM、约120RPM至约240RPM、约140RPM至约220RPM、约160RPM至约180RPM、约400RPM至约600RPM、约600RPM至约800RPM、或约800RPM至约1000RPM)的频率搅拌。
本领域已知，可以调整多种细胞培养参数以达到特定的溶解O2浓度和特定的流体剪切力。这些能够调整的参数的非限制性例子包括：容器容积、液体培养基体积、容器形状、搅拌类型(例如涡旋、摆动和/或旋转)、搅拌频率、和液体培养基温度。这些培养参数的其他例子是本领域已知的。本文所述的或本领域已知的培养参数的任何组合都能结合到任何方式中，所述方式是为了在培养基中达到与在透气性的锥形容器中所达到的相同(或基本相同)的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度，所述透气性的锥形容器盛有4％-80％(例如4％-70％、4％-60％、或4％-30％)容器容积的液体培养基，此时所述容器置于距水平约5度至约85度的反应者角度(例如约10度至约85度、约15度至约85度、约25度至约85度、或约40度至约55度)、于约31℃至约40℃的温度温育、并以约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM(例如约20RPM至约400RPM、约120RPM至约240RPM、约140RPM至约220RPM、约160RPM至约180RPM、约400RPM至约600RPM、约600RPM至约800RPM、或约800RPM至约1000RPM)的频率搅拌。
液体培养基中的溶解O2水平能用多种不同的方法来检测。例如溶解O2能用溶解O2电极或探针(例如，可从Eutech Instruments WD-35201-80 Dissolved Oxygen Probe、Rosemount Analytical 499Series Dissolved Oxygen/Ozone Sensor、和ExtechDO705Dissolved Oxygen Electrode获得的溶解O2电极和探针)来测量。校准和使用O2电极和探针的方法能用制造商的说明书来进行。
液体培养基中的流体剪切力能用本领域已知方法进行计算。描述了液体培养基中流体剪切力计算方法的合适的教材的非限制性例子如Fluid Mechanics,RobertA.Granger,1995,Dover Publications,Inc.,Mineola,NY，和Fundamentals of FluidMechanics,Bruce R.Munson等,John Wiley&Sons,Inc.,2009中所述。
生产重组蛋白的方法
本文还提供生产重组蛋白的方法，其包括用本文所述方法培养能够产生重组蛋白的细胞。按照该方法的进行，可从哺乳动物细胞和/或从第一或第二培养基回收重组蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白是在培养方法期间的任何给定时间点处从第一和/或第二液体培养基回收的(例如在培养第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100天、或培养大于100天后的一天或多天从第一和/或第二液体培养基回收)。这些方法的一些实施方案进一步包括添加一定体积的第三培养基或一定体积的第四液体培养基，但在每个例子中容器里液体培养基的总体积应当约与第一液体培养基体积相等或更少。
技术从业人员知晓，任何各种参数(例如容器、体积、培养基更换速率或频率、搅拌频率、温度、培养基、和CO2浓度)都能以任何组合形式用于实施这些方法。进一步地，本文所述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞都能用于生产重组蛋白。
可用多种已知分子生物学和分子遗传学方法将编码重组蛋白的核酸引入哺乳动物细胞。非限制性的例子包括转染转染(例如脂质体转染)、转导(例如慢病毒、腺病毒、或逆转录病毒感染)、和电穿孔。在一些例子中，编码重组蛋白的核酸不是稳定整合到哺乳动物细胞染色体中的(瞬时转染)，而在其他例子中核酸是经整合的。或者或此外，编码重组蛋白的核酸能存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体中(例如人的人工染色体)。或者或此外，可以用病毒载体(例如慢病毒、逆转录病毒、或腺病毒载体)将核酸引入细胞。能将核酸可操作地连接到启动子序列(例如强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子，或可诱导的启动子)。如果需要的话，含有核酸的载体还能含有可选择的标志(例如赋予哺乳动物细胞潮霉素、嘌呤霉素、或新霉素抗性的基因)。
在一些例子中，重组蛋白是分泌的蛋白，并且由哺乳动物细胞释放到细胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基)中。例如，编码可溶重组蛋白的核酸序列能含有编码分泌信号肽的序列，所述分泌信号肽位于重组蛋白的N-或C-末端，其被存在于哺乳动物细胞中的酶所切割，并随后释放到细胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基)中。在一些例子中，重组蛋白是不分泌的可溶蛋白，并且重组蛋白是从哺乳细胞内回收的。
能用本文提供的方法生产的重组蛋白的非限制性例子包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如本文所述的任何抗体片段))、酶(例如半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶)、或)、蛋白质(例如人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、或干扰素α或β)、或免疫原性的或抗原性的蛋白或蛋白片段(例如用于在疫苗用途的蛋白)。能通过本文提供的方法生产的重组蛋白的其他例子，以及用各示例性重组蛋白治疗的不同疾病，在表1中列出。在一些实施方案中，重组蛋白是经基因工程改造的抗原结合多肽，其含有至少一种多功能重组蛋白支架(参见例如Gebauer等,CurrentOpin.Chem.Biol.13:245-255,2009和美国专利公开号No.2012/0164066中所述重组抗原结合蛋白(在此通过提述以其整体并入))。作为抗体的重组蛋白的非限制性例子包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、actoxumab、阿达木单抗(adalimumab)、adecatumumab、阿非莫单抗(afelimomab)、afutuzumab、alacizumab、alacizumab、阿仑单抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫单抗(altumomab)、amatuximab、anatumomab、阿泊珠单抗(apolizumab)、atinumab、托珠单抗(tocilizumab)、basilizimab、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达利珠单抗(daclizumab)、densumab、eculizumab、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、ertumaxomab、etaracizumab、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、和曲妥珠单抗(trastuzumab)。能通过本文所述方法生产的治疗性抗体的其他例子是本领域已知的。重组蛋白的其他非限制性例子包括：阿糖苷酶α(alglucosidase alfa)、拉罗尼酶(laronidase)、阿巴西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黄体素α、抗血友病因子、半乳糖苷酶β(agalsidase beta)、干扰素β-1a、阿法达贝泊汀α(darbepoetin alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、依那西普(etanercept)、凝血因子IX、促卵泡激素、干扰素β-1a、伊米苷酶(imiglucerase)、链道酶α(dornasealfa)、依泊亭α(epoetin alfa)、和阿替普酶(alteplase)。
表1.示例性重组蛋白和用各示例性蛋白治疗的疾病的列表
*MPS＝粘多糖贮积症(mucopolysaccaridosis)
通过去除或是物理性从哺乳动物细胞分离液体培养基，可以从液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)回收一种分泌的可溶重组蛋白。用于从哺乳动物细胞去除液体培养基的多种不同方法是本领域已知的，包括例如离心、过滤、移液、和/或吸引术(aspiration)。然后可以回收分泌的重组蛋白，并进一步用多种生物化学技术从液体培养基纯化所述重组蛋白，所述技术包括多种类型的色谱法(例如亲和色谱法、分子筛色谱法、阳离子交换色谱法、或阴离子交换色谱法)和/或过滤(例如分子量截留过滤)。
为了回收细胞内重组蛋白，可以将哺乳动物细胞裂解。本领域已知很多种裂解哺乳动物细胞的方法，包括例如声处理(sonication)和/或去污剂、酶、和/或化学裂解。用多种本领域已知的生物化学方法，可以从哺乳动物细胞裂解物纯化重组蛋白，所述方法典型地是以离心步骤开始，以去除细胞碎片然后是一个或多个附加步骤(例如一种或多种类型的色谱法(例如亲和色谱法、分子筛色谱法、阳离子交换色谱法、或阴离子交换色谱法)和/或过滤(例如分子量截留过滤))。
在一些实施方案中，回收的重组蛋白是至少或约50wt％纯的，例如至少或约55wt％纯、至少或约60wt％纯、至少或约65wt％纯、至少或约70wt％纯、至少或约75wt％纯、至少或约80wt％纯、至少或约85wt％纯、至少或约90wt％纯、至少或约95wt％纯、至少或约96wt％纯、至少或约97wt％纯、至少或约98wt％纯、或至少或约99wt％纯，或大于99wt％纯。
用于测试制造工艺的方法
本文还提供用于测试重组蛋白制造工艺的方法。这些方法包括实施上述生产重组蛋白的方法，并在方法期间和/或之后检测或测量至少一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)培养物读出信息(readout)(例如细胞或第一和/或第二培养基中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸盐产量、体积生产率、比生产率、来自葡萄糖的乳酸盐产量、谷氨酰胺浓度、谷氨酸盐浓度、培养基pH、溶解CO2分压或浓度、溶解O2分压或浓度、代谢物质量转移、和代谢物物料平衡)，并比较至少一个培养物读出信息与至少一个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个)培养物读出信息的参考水平(例如细胞或第一和/或第二培养基中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸盐产量、体积生产率、比生产率、来自葡萄糖的乳酸盐产量、谷氨酰胺浓度、谷氨酸盐浓度、培养基pH、溶解CO2分压或浓度、溶解O2分压或浓度、代谢物质量转移、和代谢物物料平衡的参考水平)。
技术从业人员知晓，任何本文所述的各种培养参数(例如容器、体积、更换培养体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基、CO2浓度、和反应者角度)能以任何组合形式用于实施这些方法。进一步地，本文所述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞都能在方法中使用。
至少一个培养物读出信息的参考水平(例如细胞或第一和/或第二培养基中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸盐产量、体积生产率、比生产率、来自葡萄糖的乳酸盐产量、谷氨酰胺浓度、谷氨酸盐浓度、培养基pH、溶解CO2分压或浓度、溶解O2分压或浓度、代谢物质量转移、和代谢物物料平衡的参考水平)可以是用不同培养方法产生的水平，例如利用至少一个不同培养参数(例如不同的第一和/或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的搅拌频率和/或类型、放置锥形容器的不同反应者角度、不同的批次的再补料或灌注速率(例如24小时时间段或其他递增时间段内的容器容积或第一液体培养基体积的10％-200％))的培养方法、以及本文所述的任何其他培养参数)。重组蛋白的参考水平可以是例如用一套培养参数生产的重组蛋白，所述培养参数导致不同水平的溶解O2和/或不同水平的流体剪切力。
本文所述方法能用于测试制造工艺的任何组分或特征的效果。例如本文所述方法能用于测试不同原材料、搅拌水平、容器、抗成团剂、培养基(例如化学上定义的培养基)、或营养元素或化合物对于至少一个培养物读出信息的效果(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如对重组蛋白生产和/或哺乳动物细胞生长的效果)。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中原料组分或补充物、或哺乳动物来源的功效的方法，所述功效是对于在产生重组蛋白方法中用途的功效，所述测试方法包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测或确定至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白)；将至少一个培养物读出信息与用不同培养方法产生的至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白)的参考水平进行比较，所述不同培养方法使用一种或多种不同的第一或第二液体培养基或不同的哺乳动物细胞来源；和在至少一个培养物读出信息中鉴定与有益变化(例如增加或减少)相关的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料组分或补充物、或哺乳动物细胞来源(例如重组蛋白增加量)，与生产重组蛋白的方法中有效使用的参考水平进行比较。例如，与参考水平相比重组蛋白水平的增加、活细胞浓度的增加、体积生产率的增加、比生产率的增加、和葡萄糖消耗增加，说明第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料组分或补充物、或哺乳动物细胞来源在生产重组蛋白的方法中使用是有效的。
本文所述方法还可以用于测试本文所述的或本领域已知的任何各种细胞培养参数变化的效果(例如容器容积或形状、搅拌频率、剪切力、培养物接种密度、第一或第二液体培养基的pH、溶解O2浓度或分压、容器内表面涂层、液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)中的各种内容物、搅拌量或类型、哺乳动物细胞类型或细胞系、CO2暴露或溶解CO2浓度或分压、温度、液体培养基体积(例如第一和/或第二液体培养基体积)、和/或去除第一体积的第一液体培养基和向第一液体培养基添加第二体积的第二培养基的速率或频率)。所述方法还可用于测试用于制备液体培养基的水的质量，和/或不同微量金属在液体培养基中对于至少一个培养物读出信息的效果(例如任何本文所述的培养物读出信息，例如对重组蛋白生产和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于测试生长因子或生长激素对于至少一个培养物读出信息的效果(例如任何本文所述的培养物读出信息，例如对重组蛋白生产和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于测试用于制备第一和/或第二液体培养基的过滤工艺或过滤器。所述方法还可用于测试液体培养基稳定性和液体培养基对于生物学功能的效果(例如任何本文所述培养物读出信息中的至少一个，例如对重组蛋白生产和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于筛选多种哺乳动物细胞系和细胞库产生所需重组蛋白的能力(例如所需的分泌的治疗性蛋白)。本文应注意的是，所述方法还可用于筛选任何细胞培养工艺参数，包括但不限于搅拌类型和频率、剪切力、灌注速率和体积、培养接种密度，以及其他。
本文所述方法还能用于测试第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源中污染物的存在。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法，包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测或确定至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白)；将至少一个培养物读出信息与用不同培养方法产生的至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量)的参考水平进行比较，所述不同培养方法使用一种或多种不同的第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的不同原材料、或不同的哺乳动物细胞来源；和当至少一个培养参数与参考水平相比出现不利变化(例如增加或减少)时，则鉴定第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源为含有污染物。例如，重组蛋白产量(例如细胞中或第一和/或第二培养基中重组蛋白的减少)、体积生产率、或活细胞浓度与参考水平相比的减少，是指示第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源中存在污染物的不利变化。一些方法进一步包括一种或多种用于确定第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源中存在污染物的鉴定结果的测定法。污染物可为生物污染物(例如分枝杆菌、真菌、细菌、病毒、或不想要的哺乳动物细胞)。污染物还可为物理上无特征的物质。
所述方法可用于进行高通量细胞培养实验，以进行细胞培养方法的实验设计(design-of-experiment,DOE)或质量源于设计(quality-by-design,QBD)优化。例如，本文提供优化生产重组蛋白的制造工艺的方法，包括提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述细胞悬于占约4％至约80％容器容积的第一液体培养基中；在约31℃至约40℃，以距水平约5度至约85度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约20次转动/每分钟(RPM)至约1000RPM的旋转搅拌；在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；检测或确定至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白量)；将至少一个培养物读出信息与用不同培养方法产生的至少一个培养物读出信息(例如本文所述的任何培养物读出信息，例如细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量)的参考水平进行比较；和在制造工艺中鉴定并去除或改变任何与本文所述至少一个培养物读出信息(例如本文所述任何培养物读出信息，例如产生的重组蛋白量)中的不利变化(例如增加或减少)相关的培养组分或参数，或鉴定并向制造工艺添加任何与本文所述至少一个培养物读出信息(例如本文所述任何培养物读出信息，例如产生的重组蛋白量)中的有益变化相关的培养组分或参数；上述变化是与至少一个培养物读出信息(例如本文所述任何培养物读出信息，例如产生的重组蛋白量)的参考水平相比。例如，产生的重组蛋白量、体积生产率、比生产率、或活细胞浓度的增加是培养物读出信息中的有益变化，而产生的重组蛋白量、体积生产率、比生产率、或活细胞浓度的减少是养物读出信息中的不利变化。在一些例子中，所述方法用于以高通量方式鉴定优化的细胞培养条件，所述条件能用于扩大规模(例如生物反应器)的重组蛋白生产。
在本部分所述方法的任一个中，至少一个培养物读出信息的参考水平可以来自大规模培养(例如灌注生物反应器，例如2000-L灌注生物反应器、40-L灌注生物反应器、或12-L灌注生物反应器)。在本部分所述任一方法的一些实施方案中，用本文所述任一方法将哺乳动物细胞培养在锥形容器中与大规模培养进行相同的时间(平行培养)。例如，本文所述任一方法中用于接种锥形容器的接种物也用于在大约相同的时间接种大规模灌注生物反应器。
在一个实施方案中，用于接种锥形容器的接种物是从大规模培养(例如大规模灌注生物反应器)获得的。例如，将来自大规模培养任何时间点处(例如在生长期、过渡期(例如当培养正在过渡到一套不同生长条件时的任选时期，例如不同的液体培养基和/或温度)或收获期去除)的小份用于接种锥形容器(例如用于开始卫星锥形容器培养)。在生长期期间可以从大规模培养移走小份，并将其用于接种或种植盛有液体培养基的锥形容器，然后在与大规模培养中利用的生长期条件相似或完全相同的条件下接种锥形容器。或者或此外，可以在过渡期期间从大规模培养移走小份，并用于接种或种植盛有液体培养基的锥形容器，然后在与大规模培养中利用的过渡期条件相似或完全相同的条件下接种锥形容器。或者或此外，可以在收获期期间从大规模培养移走小份，并用于接种或种植盛有液体培养基的锥形容器，然后在与大规模培养中利用的收获期条件相似或完全相同的条件下接种锥形容器。在这些方法的任一个中，可以在用于在锥形容器中培养哺乳动物细胞的方法中改变一种或多种培养参数(与用于在大规模培养中培养哺乳动物细胞的培养参数或组分相比)，测量至少一个培养物读出信息，并且将至少一个培养物读出信息与确定的大规模培养的至少一个培养物读出信息进行比较。如本领域技术人员所知，这些方法能用于测试具体培养参数或组分在培养工艺中的一个或多个具体时期期间对至少一个培养物读出信息的效果(例如一个或多个培养参数和/或培养组分在生长期、任选的过渡期、和/或收获期期间对于至少一个培养物读出信息的效果)。
在一些实施方案中，还可以实施这些方法来确定大规模生物反应器中是否存在污染物，所述方法通过如下所述来实施：确定或检测锥形容器培养物中的至少一个培养物读出信息、将至少一个培养物读出信息与至少一个培养物读出信息的参考水平进行比较(例如来自基本没有污染的培养基的至少一个培养物读出信息的水平)、和当摇瓶培养物中的至少一个培养物读出信息与至少一个培养物读出信息的参考水平相比指示出摇瓶中存在污染时，则将大规模生物反应器鉴定为含有污染物。污染物可以是例如生物污染物，如病毒、真菌、不想要的哺乳动物细胞、或细菌，如分枝杆菌。污染物可以是例如囊泡状病毒。
实施例
本发明在如下实施例中进一步描述，所述实施例并不限制权利要求中所述发明的范围。
实施例1.示例性的培养方法的有益特性
本文提供在培养基中培养哺乳动物细胞的方法，其达到较高的活哺乳动物细胞密度并提供改进的体积生产速率。在下述的细胞培养工艺运行中，用重组的半乳糖苷酶细胞培养物来确定提供反应者角度和灌注速率，所述反应者角度和灌注速率提供显著改进的高细胞密度哺乳动物细胞培养方法。本文提供的数据显示，通过将培养管以距水平约45°的反应者角度放置并以约160RPM的频率搅拌培养物进行灌注培养，与通过将培养管以距水平约90°的反应者角度(在下文的细胞培养工艺运行为90°中描述)放置并以约220RPM的频率搅拌培养物来进行的类似培养方法(例如相同的培养基)相比提供了预料不到的优势(例如改进的体积生产率、较高的活细胞密度和更有效的细胞代谢)。
下文描述的数据还说明包括将培养管以距水平约45°的反应者角度放置并以约160RPM的频率搅拌培养物的具有梯度灌注速率的培养方法能用于在三种生产培养基(CDCHO、CD OptiCHO、和CD FortiCHO)中有效筛选四种重组半乳糖苷酶候选克隆细胞系(A14.13、C02.31、C02.57、和F05.43)，从而基于细胞生长、重组蛋白生产率、和重组蛋白(生产)质量来确定最佳细胞系和培养基。
最后，下文所述的数据显示，本文提供的示例性的培养方法与12-L灌注生物反应器中培养的重组半乳糖苷酶克隆细胞系的性能是密切相当的，所述性能是在细胞生长、生产率、和生产质量方面的性能。综上，数据显示，当前提供的培养条件能用于筛选克隆和细胞系、开发和筛选基质制剂、测试工艺参数对于的细胞培养性能的效果、以及保持卫星培养以用于工艺优化和制造支持。用于进行这些细胞培养工艺运行的通用方法在下文描述。
材料和设备
重组半乳糖苷酶悬浮细胞培养
每个细胞培养工艺运行中使用的细胞在表2中列出。创建了研究细胞库(RCBs)以确保所有RCB小瓶(无论来源)都具有近似相同的群体倍增水平(population doublinglevel,PDL)，其根据等式1(如下)来计算。
Xv1：在时间Tn-1处测得的活细胞密度(106细胞/mL)
Xv2：在时间Tn处测得的活细胞密度(106细胞/mL)
设备
如下器材用于进行本文所述的细胞培养工艺运行：
Multitron Shaker温育箱(Appropriate Technical Resources,Inc.)，型号AJ125；
Beckman Coulter Vi-Cell细胞存活率分析仪(Beckman Coulter,Inc.)，XR型；
Beckman Coulter Allegra离心机，型号X-22R；
YSI生化分析仪(Yellow Springs Instruments,Inc.)，型号2700Select；
渗透压计(Advanced Instruments,Inc.)，型号2020；和
血液气体分析仪(Bayer AG)，型号248。
培养维持
除另有规定外，用于摇管的启动培养物产生自摇瓶中扩大的种子培养，随后是具体RCB的小瓶复苏/融化(thaw)(表2)。将来自每个RCB的一个小瓶用于每个种子培养(seedtrain)。将摇管或是以5x 105或是以1.5x 106活细胞/mL进行接种，恒定工作体积为10mL/管。将细胞细胞维持在摇动温育箱中5％CO2、37℃、和80％相对湿度的受控环境中，以距水平约45°的反应者角度或距水平约90°的反应者角度放置和分别为160和220RPM的摇动速率，或是如给定的细胞培养工艺运行中所确定的那样。
表2.研究中使用的重组半乳糖苷酶研究细胞库
ω1：180RPM的摇动速率
r1：50mm的摇动直径(投掷或轨道直径)
ω2：25mm摇动直径处的摇动速率(RPM)r2：25mm的摇动直径
Glccons＝([Glc]m-[Glc]c)*PR 等式3
Glncons＝([Gln]m-[Gln]c)*PR 等式4
VPR＝效价*PR 等式5
[Glc]m：基质中的葡萄糖浓度(g/L)
[Glc]c：培养物中的葡萄糖浓度(g/L)
[Gln]m：基质中的谷氨酰胺浓度(mmol/L)
[Gln]c：培养物中的谷氨酰胺浓度(mmol/L)
PR：灌注速率
VPR：体积生产率(U/L/d)
效价：rhα-Gal活性(U/L)
SPR：比生产速率(U/E9细胞/d)
Xv：活细胞计数(1x 106细胞/mL)
根据等式2(如上所示)，将制造商为距水平约90°搅拌管所推荐的设置(参见例如Sartorius网站)调整以适于所用的摇动温育箱。在接种1天后，开始将培养物每日取样(0.5mL)，以通过ViCELL方法确定活细胞密度。具体而言，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释细胞至1-2x 106细胞/mL的密度。将培养物取样并在涡旋速度设为1.5的涡旋器上混合以增加均匀性。按照细胞计数，将管于约233x g离心5分钟，并将去除的用过的(spent)基质直接用于测定葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率以及细胞代谢物(乳酸盐和谷氨酸盐)，所述测定是使用YSIBiochemistry Analyzer进行的，或储存在-80℃直至进行rhα-Gal活性测定以确定产物滴度。以表3中所述比率更换培养基，并用等式3-6(如上所示)来计算葡萄糖和谷氨酰胺消耗速率以及rhα-Gal体积和比生产率。
如下表3显示了细胞培养工艺运行I、III、和IV所遵照的梯度灌注分批再补料方案。第0天(细胞培养接种日称为第0天)的种子密度是5x 105细胞/mL。RV代表培养基的反应者体积。
表3.梯度灌注分批再补料方案
细胞培养工艺运行 接种后的培养日 再补料速率
I、III和IV 第1–3天 0.5RV/天
第4–6天 0.7RV/天
第7天及以后 1.0RV/天a
a第7天后(细胞培养工艺运行I和II)，通过周末覆盖轮换(用于通过周末期间不同操作者的简单操作和一致性)进行0.8RV/d的再补料速率。
克隆细胞系和基质评级(ranking)
半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，其从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基基团(moiety)。例如α-半乳糖苷酶(alpha-galactoside)能水解神经酰胺三己糖苷(ceramidetrihexoside)和能将蜜二糖转换为半乳糖和葡萄糖。分泌的α-半乳糖苷酶通常是由甘露糖-6-磷酸基团翻译后修饰的，并具有结合甘露糖-6-磷酸受体的能力(例如可溶的不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体)。
在细胞培养工艺运行II期间，将培养物每周取样3次以进行细胞密度、重组人α-半乳糖苷酶(rhα-Gal)活性、和质量的确定，以及代谢物测量。此外，在研究期间从各培养物收集样品4次，以进行基于高效液相色谱的Fast ABC测定(Fast ABC assay)，以及收集样品5次以进行Biacore测定，从而分别评估的培养物中出现的rhα-Gal剪切的量，以及结合到可溶的依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(sCIM6PR)的rhα-Gal的百分比。对于每个培养取样时间点，除了葡萄糖和谷氨酰胺消耗速率及rhα-Gal体积和比生产率(等式3-6)，还用等式7(下文提供)来计算具体的乳酸盐产生速率。分别地，在每个培养的运行结束时根据等式8A和8B(下文提供)来计算其累积活细胞密度，并且用等式9(下文提供)来计算种子培养阶段期间的培养物倍增时间(Td)。为了进行基质评级，在研究结束时测量来自每个培养的第4天所去除的用过的培养物的培养物pH和渗透性(osmolarity)，所述测量是在各自峰值密度和其运行结束处进行的，并保存在-80℃。
IVC0＝vol*Xv0 等式8A
Lac：比乳酸盐生产率(mM/x109细胞/d)
[lac]n：时间Tn处的乳酸盐浓度测量值(g/L)
Fwlac：乳酸盐分子量(g/mol)
PR：灌注速率
Td：倍增时间(h)
(Tn–Tn-1)：不同天数的两个细胞计数之间的时间差异(h)
Xvn：时间Tn处测量的活细胞密度(106细胞/mL)
Xvn-1：时间Tn-1处测量的活细胞密度(106细胞/mL)
对四个重组半乳糖苷酶克隆细胞系基于它们的生长和代谢物概貌、存活率、生产率和产物品质(从三个生产基质各自获得)来进行评级。当把培养在一个基质中的所有克隆细胞系视为一个整体(评估所述整体的基质性能)时，对基质单独进行分开评级。评级因素的列表在表4中呈现。
给每个评级因素分配一个权重(weight)，所述权重按照因素支持有利细胞培养性能的重要性成比例地下降。根据其针对给定因素的性能(±标准差)，将每个克隆细胞系从1-4点数进行分配(对于基质是1-3)，其中4(或3)表示最佳，而1表示性能最差。然后用因素的权重来计算每个克隆细胞系或基质的分数(等式10)。
对于终点(end)结果，计算了每个基质中每个克隆细胞系的、或仅每个基质的个体评级的算术平均数。分别地，具有最高平均值的克隆细胞系和基质评级为1，而具有最低平均值的那些则评级为4或3。
分数＝权重*点数 等式10
分数：克隆细胞系或基质的分数
权重：给定因素的权重
点数：增加的点数
表4.评级因素列表
(*)仅应用于克隆细胞系评级；(+)仅应用于基质评级。
a重组半乳糖苷酶可接受的Biocore结合活性范围：68–125％；2000L制造平均数和1个标准差范围：96％±7.8。
b峰值B的2000L制造平均数和2个标准差范围：69.4％(64.1–77.4)。
c重组半乳糖苷酶可接受的比活性：58–83U/mg；2000L制造平均数和2个标准差范围：73U/mg(65–81)。
d研究中所用的Invitrogen基质的pH规格指标：6.9–7.4(CD CHO)、6.9–7.3(CDOptiCHO)、6.6–7.3(CDFortiCHO)。
e研究中所用的Invitrogen基质的渗透性规格指标：305–345(CD CHO)、260–290(CD OptiCHO)、275–295(CD FortiCHO)mOsm/kg。
细胞培养工艺运行I
这项研究的目的是确定何种摇动速度和反应者角度在峰值密度和更高处产生改进的细胞培养性能。在当前的细胞培养工艺运行中，基质再补料方案限于每天1个反应者体积(1RV/天)。这些细胞培养工艺运行的目标是开发出长时期得到40x 106细胞/mL浓度的细胞培养方法。这项研究的起始培养物产生自摇瓶种子培养物，所述种子培养物在小瓶复苏后扩大培养3天(RCBp7v10,10/14/11AV)。
生长概貌
观察到了C02.31的18天培养的活细胞密度概貌，所述C02.31在不同的摇动参数下维持在CD CHO中。以距水平约90°的反应者角度或距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物中测出了相似的活细胞密度，尽管以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物在后峰值(post-peak)密度期的最后5天期间获得了比以距水平约0°的反应者角度搅拌的培养物稍微更高的活细胞计数。在整个研究期间，在两个反应者角度处搅拌的培养物均保持了相似的85-90％的存活率(图2A)。
代谢物概貌
两种培养条件之间的葡萄糖消耗概貌是相似的，但以距水平约90°的反应者角度(90°)搅拌的培养物在研究的最后5天期间消耗的葡萄糖(约5g/L/天)比以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物消耗的葡萄糖(6g/L/天)更少。两种培养条件的乳酸盐生产概貌直到第11天都是相似的，此时以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物检测出了较低的乳酸盐浓度(图2D)。两种培养条件的谷氨酰胺消耗速率直到研究的第11天都未观察到显著差异，此时以距水平约90°的反应者角度(90°)搅拌的培养物中的谷氨酰胺消耗开始逐渐降低至约2mmol/L/天(在运行结束时)，而以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物中谷氨酰胺消耗维持在约3-3.5mmol/L/天直至研究的第18天(图2C)。两种培养条件在培养的18天全程中未观察到谷氨酰胺产量的显著差异。
生产率概貌
两种培养条件的体积生产率(VPR)概貌直到第11天都是完全相同的，此时在两种培养条件中测出的生产率都是约30,000U/L/d。从第12天(峰值生产期)开始，以距水平约90°的反应者角度(90°)搅拌的培养物的VPR逐渐降低至约50％(运行结束时)，然而以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物中的VPR则从第12天直到第18天维持在30,000U/L水平(图2B)。类似地，以距水平约45°的反应者角度搅拌的培养物的比活性从第11天开始增加，然而以距水平约90°的反应者角度(90°)搅拌的培养物中的比活性则维持恒定(图2E)。数据显示，与通过0°的反应者角度搅拌培养物所达到的体积生产速率和比生产速率相比，以45°的反应者角度搅拌培养的培养物的体积生产速率增加了50％，而培养物的比生产速率增加了30％(图2F)。
细胞培养工艺运行II
进行下文所述的细胞培养工艺运行，以确定细胞培养温度对重组半乳糖苷酶克隆细胞系C02.31在CD CHO中生长、生产率和产物品质的影响。在经历轻度低温(28-33℃)的重组CHO细胞的分批补料和灌注培养中观察到了比生产率的提高。然而，发现温度影响的量级是两种细胞系依赖性和重组蛋白依赖性的。因此进行了一系列三个独立的细胞培养培养工艺以评估重组半乳糖苷酶克隆细胞系C03.21在一系列温度设定值的CD CHO(MTX库DWCBNB17594)灌注培养中的性能，所述培养进行两周，然后是小瓶复苏/融化和在37℃、7-8天的生长期。当培养物达到20x 106/mL的细胞密度时，进行温度轮换。在每个实验中，用37℃的培养温度作为对照。双相工艺的细节概括于表5中。从细胞培养物收获的材料分析细胞培养温度对于细胞生长、存活率、代谢物流动率、生产率、和产物品质的影响。研究是用摇管高通量模型进行的，其中培养物在5％CO2和80％相对湿度处温育，并以160RPM和距水平约45°的反应者角度搅拌。
表5.用于摇管中双相细胞培养工艺的细胞培养工艺运行条件总结
采用0.5反应者体积/天(RV/d)的基质再补料速率(1.0x RV代表培养期开始时每个容器中液体培养基的量)用于接种后的工艺前三天，然后接下来三天是0.7x RV/d的再补料(灌注)速率，并且从第7天(在约20x 106细胞/ml处的温度轮换)开始以1.0x RV/d直到运行结束。从第7-8天开始，每天在取样时间对所有密度超过17x 106细胞/ml的培养物进行细胞渗出(cell bleeding)，以将高密度培养期延长至14天且保持存活率>90％。
来自这些细胞培养工艺运行的数据显示，通常，常规的细胞渗出使培养物的整个生长期间(温度≤37℃)其存活率维持>90％(图3C)。温度轮换后，维持在温度>37℃的培养物的存活率分别在第4天(40℃)和第9天(38℃，39℃)降至90％以下，然后继续降低直到运行结束(图3C)。细胞在33℃和35℃生长得比对照培养物中(37℃)更好，但在31℃和>37℃的温度处，细胞生长得比对照培养物中(图3D)中更慢。在40℃处生长严重受损，导致培养在第13天提前终止(图3D)。在温度轮换后第二周期间，维持在>37℃温度的细胞比对照培养物中的细胞显著更小，而在<37℃温度处生长的细胞直径一般仅减少了2％。培养在35℃的细胞具有与培养在37℃的细胞相同的尺寸。
此外数据表明，维持在31、33、和40℃的培养物中，细胞代谢与对照(37℃)相比显著改变。与对照培养物和维持在35℃的培养物相比，在31和40℃观察到的代谢活动降低与体积和比生产率的显著降低是一致的。通常，生产率在37和35℃处都是最高的(图3A和3B)。通常，在Biacore测定中，在收集自细胞培养物的产物测出了最高的且状态稳定的比活性和M6P结合，所述细胞培养物维持在37和35℃；并且维持在31、39和和40℃的培养物观察到了产物品质的显著下降。
总之，在>37℃的温度处细胞生长和存活率降低了，而在<37℃的培养温度则导致细胞存活率和生长的提高。然而，在31℃处细胞代谢似乎低至无法支持细胞生长。<36和>37℃的培养温度也导致细胞直径减少。出人意料的是，在37-39℃的范围细胞代谢似乎是最佳的，所述温度范围得到了最高的生产率，以及在Biacore测定中最高的sCIMPR结合，其在37℃达到顶峰。重组半乳糖苷酶比活性在33-39℃的范围是相当的。>37℃的培养温度对产生的重组半乳糖苷酶的完整性没有负面影响，正如通过基于HPLC的Fast ABC测定所确定的；而在细胞培养收获物中测得了片段化分子的量的增加，所述细胞培养收获物是从维持在>37℃温度的培养物获得的。
将多种单独培养参数(CO2、搅拌频率、和反应者角度)的影响进行了统计学比较，以确定它们对活细胞浓度、百分比细胞存活率、以及细胞活性的单独影响，所述比较是用部分析因(partial factorial)实验设计(DOE)进行的。JMP统计学分析(参见JMP网站)显示，反应者角度单独对活细胞浓度、百分比细胞存活率、和细胞生产率具有显著影响(图4)。
细胞培养工艺运行III
将细胞培养工艺运行II中建立的摇管模式应用于筛选4种重组半乳糖苷酶克隆细胞系和用于细胞生长、生产率和产物品质的3种生产基质，以挑选最佳的克隆细胞系和基质用于开发商用的细胞培养工艺。还通过将培养时间延长至1个月但不超过1RV/天的基质更换速率，从而评估了每种基质的容纳力(capacity)。RV代表容器中的第一培养基体积。在这个细胞培养工艺运行中，1RV等于10mL。经历研究的克隆细胞系在表6中描述。克隆：C02.31和C02.57(C克隆)来源于与重组半乳糖苷酶工艺开发的初级(primary)候选者相同的亲代细胞系；并选择克隆细胞系A14.13(A克隆细胞系)和F05.43(F克隆细胞系)作为备用克隆。初始小规模细胞生长工艺运行显示，在Biacore测定中C克隆细胞系趋于达到较高的总体生产率和较高的M6P结合，然而，它们的生产率在延长的培养中趋于降低。F克隆细胞系与C克隆细胞系表现相似，而A克隆细胞系趋于具有较低但随时间更稳定的生产率。
表6.在摇管中筛选出的重组半乳糖苷酶克隆细胞系
出于有意义对比的考虑，所有克隆细胞系首先在三种基质中适应生长，然后是以相似的群体倍增水平(PDL)进行细胞建库(cell banking)(表2)。然后将这项研究中使用的研究细胞库复苏并在摇瓶中扩大培养3周，直到以0.5x 106细胞/mL接种到35个摇管中。用相同的克隆细胞系并在一式三份的相同条件下并行地测试三种基质。根据此前的发现，以距水平约45°的反应者角度和160RPM搅拌所有培养物，然后是表3中所述的分批-再补料(梯度灌注)方案。
细胞生长概貌
三种生长培养基中的四种克隆细胞系的重组半乳糖苷酶悬浮培养物的生长和存活率概貌在表5中显示。对于另外两种培养基和所有剩余的克隆，均以一式三份接种摇瓶。在一个月的时期测量细胞存活率和生长(图5A-5C)。CD CHO培养基在18天的培养期间对全部4种克隆细胞系均支持>90％的细胞存活率，而运行结束时存活率是约60％。参见图5A。CDOptiCHO中的细胞存活率从第9天的约100％急剧下降至第12天的约10％(对于克隆C02.31和A14.13)，以及在第18天和第23天分别降至约20％和10％(对于克隆C02.57和F05.43)。参见图5B。CD FortiCHO培养基仅在16天能支持>90％的存活率(并且仅针对克隆细胞系F05.43)；对于所有其他克隆细胞系，细胞存活率在研究的第14天降至约70％，并且在运行结束时对于克隆C02.31和A14.13分别接近50％和70％。参见图5C。C02.57在CD FortiCHO培养基中的培养物在第23天被终止，这是由于其细胞存活率接近20％。CD CHO(克隆细胞系C02.31)和CD FortiCHO(克隆细胞系F05.43)中分别在第14天达到最高的活细胞密度(约45x 106细胞/mL)。然而，克隆细胞系F05.43在CD FortiCHO基质中没有存活到运行结束(图5C)。在所有基质中，在第28天所有存活的克隆细胞系的最终细胞密度是约10x 106细胞/mL(图5A-5C)。在所有基质中，克隆细胞系A14.13达到了近似最大的细胞密度，为约10x 106细胞/mL(图5A-5C)。CD OptiCHO中的最大细胞密度记录是约30x106细胞/mL(克隆细胞系C02.57，第9天)，但所有培养都因为活细胞计数低而提前终止了(图5B)。还评估了总活细胞质量(参见图6)。图6中的数据显示，CD OptiCHO基质对所有四种测试的克隆细胞系都得到了最低的总活细胞质量，CD CHO基质对所有四种测试的克隆细胞系都得到了良好的总活细胞质量，而CD Forti CHO基质对C02.31克隆细胞系得到了最高的总活细胞质量。
代谢物概貌
在培养物质量开始下降之前，所有3种基质中的四种克隆之间的葡萄糖消耗概貌是非常类似的，然而，仅有两种C克隆的乳酸盐积累概貌是相似的，而A和F克隆细胞系则是遵循着不同但匹配的模式。有趣的是，当高细胞密度期没有葡萄糖的时候，如果下一次基质再补料是在晚于前一次后22-24h进行的，则细胞开始消耗乳酸盐。CD FortiCHO中测得的乳酸盐产量通常是低于0.5g/L/天的，而在CD CHO和CD OptiCHO中记录到的最高乳酸盐产量分别是1.5和2.5g/L/天。在所有3种基质中消耗的最大谷氨酰胺量大约相同(约3.5mM/天)。相对于葡萄糖消耗，所有基质中四种克隆细胞系的谷氨酰胺消耗趋势是相似的，除了在CDCHO中；两种C克隆细胞系从培养的第14天起均具有与众不同的消耗速率。谷氨酸盐生产概貌在克隆细胞系和基质之间也是非常相似的，然而，分别地，按平均值，CD CHO基质中谷氨酸盐是以2.5mM/天来产生的，CD OptiCHO中是1.7mM/天，而CD FortiCHO是3.5mM/天。
生产率概貌
在CD CHO中，A14.13克隆细胞系具有最稳定的约20x 103U/L/天(第12-28天)的生产率，而两种C克隆细胞系和F05.43克隆细胞系在第12天达到约30-35x 103U/L/天，但生产率随后在第28天降至约20-25x 103U/L/天(图7A)。CD OptiCHO中的总生产率是最低的(所有4种克隆都小于25x 103U/L/天)，并且不能维持到研究结束(图7B)。在CD FortiCHO中(克隆C02.57和F05.43)测得了最高的总生产率，接近40x 103U/L/天，但其不能维持超过4天(图7C)。在CD FortiCHO中，克隆细胞系A14.13具有20x 103U/L/天的稳定的生产率，并且克隆细胞系C02.31显示了相对稳定的生产率，处于约30x 103U/L/天的水平(第12-25天)(图7C)。在所有3种基质中的所有4种克隆细胞系都具有相似的比生产率，约为1000-1500U/109细胞/天(图8A-C)。
重组产物的品质
对各基质中各克隆细胞系产生的重组蛋白的品质进行了评估，所述评估是通过测定酶的比活性、相对于对照(纯化的重组半乳糖苷酶)与sCIMPR的结合、和通过Fast ABC测定测得的完整性来进行的。总体而言，CD CHO培养基中的比活性和sCIMPR结合是最好的，然而CD CHO和CD FortiCHO这两种培养基中的M6P结合百分比相对于对照在相同的规格范围内。在CD CHO和CD FortiCHO这两种培养基中，克隆细胞系C02.31和F05.43之间的比活性是接近相当的，然而发现在所有3种基质中C02.31克隆细胞系的sCIMPR结合都优于F05.43克隆细胞系。在整个培养工艺中CD CHO培养基中所有克隆细胞系的sCIMPR结合也是最一致的，而CD OptiCHO培养基中则是最差的，这与比活性和Fast ABC结果类似。在CD FortiCHO基质中对四种克隆观察到的剪切量最低。通常，观察到比活性和sCIMPR结合的降低以及剪切形式重组蛋白的量的增加是伴随着细胞存活率降低的。
基质中的pH、渗透性和细胞聚集
测定了培养基pH和渗透性的变化，所述测定是在各培养期间的三个时间点处去除的基质上进行的。在CD CHO培养基中，所有克隆的培养物pH在前两周停留在规格(specified)范围内。一旦培养物达到其峰值密度，F05.43克隆细胞pH开始降低至6.6这么低(在运行结束时)。其对于克隆细胞A14.13培养物保持相对稳定，所述培养物没有长到高于20x 106细胞/mL的密度。所有CD OptiCHO培养物中的pH是相对不稳定的，C02.31和A14.13培养物的pH降至约6.4这么低(在第12天结束)，而另外两种培养物则高达7.6(分别在第18天(C02.57)和第23天(F05.43)结束)，表明这种基质中pH控制较差。CD FortiCHO中所有培养物的pH保持在规格范围内，然而，四种培养物中有两种必须提前终止培养。第14天后，CD CHO培养物的渗透性开始降低至约250mOsm/kg(在运行结束时)，而在第12天A14.13培养物中其降至低于200mOsm/kg。F05.43克隆细胞培养物在第23天其渗透性约为250mOsm/kg，所述培养物在基质中维持时间在基质中是最长的。CD FotiCHO中所有所有四种克隆的培养渗透性保持在接近250mOsm/kg。
三种基质每一种中的各克隆细胞系的细胞培养图像通过Vi-Cell镜头拍摄，用于对细胞聚集的评估。在CD CHO和CD FortiCHO基质中观察到了相当量的细胞聚集，而在CDOptiCHO整个培养中未记录到任何细胞成团。细胞聚集伴随培养物的培养时龄(age)而增加。
重组半乳糖苷酶克隆细胞系和生产基质的评级
针对一个列表的评级因素来评估了三种商业上可得到的基质中四种重组半乳糖苷酶克隆细胞系的性能，用于公正的最终结果，从而能够选择最佳重组半乳糖苷酶克隆/基质组合用于最稳健的工艺开发。对克隆细胞系和基质进行分开评级。克隆细胞系评级在表7中展示，基质评级在表8中展示。根据评级，发现克隆细胞系C02.31性能最佳，而克隆细胞系C02.57是第二好的。克隆细胞系C02.57性能平均比C02.31差10％(表7)。CD CHO是最稳健的基质，而CD OptiCHO是最不稳健的基质(表8)。
表7.三种生产基质中的重组半乳糖苷酶克隆细胞系评级
表8.重组半乳糖苷酶生产基质评级
细胞生长工艺运行IV：高通量(HT)模型与12L生物反应器的比较
从维持在摇瓶中(距水平约45°的反应者角度和160RPM搅拌)的克隆细胞系C02.31悬浮培养物获得的细胞生长、生产率、和产物品质与维持在12-L灌注生物反应器中的相同克隆细胞系的性能进行比较。两种培养体系的主要差异在表9中概括。因为在摇管培养物中观察到了养分限制(由于比12L生物反应器中更低的基质交换速率)，所以摇管培养物仅采用到第18天(此时细胞存活率仍大于90％)，以比较相同状态的培养物用于模型验证。
表9.研究中所比较的培养体系
HT模型 12L生物反应器
环境控制 没有在线(online)控制 受控环境
混合方法 轨道摇动 搅拌釜
基质体积 0.01L 12L
基质再补料方法 分批再补料 灌注
基质再补料体积 1RV/d 2RV/d
两个体系中CD CHO中克隆细胞系C02.31培养物的存活率概貌接近相当，其生长概貌也如是(图9A和9B)。两个体系培养基中的葡萄糖消耗和乳酸盐浓度概貌未观察到主要差异，然而，12-L反应器中的细胞生长比维持在摇管中的细胞消耗了两倍的葡萄糖和几乎多得多的谷氨酰胺，这是由于其高出两倍的每日基质交换速率(灌注速率)。对比之下，在取自摇管培养物的用过的基质中测得了比生物反应器中的基质稍高的谷氨酸盐浓度。然而发现，两个体系的比生产速率是相当的(图9D)。在摇管培养物和反应器培养物中都获得了相同的产物比活性，以及对于发现的产物具有相似的M6P结合概貌。总体而言，摇管中所有基质里克隆细胞系的性能与12-L生物反应器中所观察到的是接近相当的，并且在CD CHO培养基中测得了最佳的产物品质，而在CD OptiCHO培养基中测得了最差的产物品质；在CD CHO培养基中测得了比CD FortiCHO培养基中更高的乳酸盐产量；在CD CHO培养基中测得了最高的VPR，在CD OptiCHO培养基中测得了最低的VPR；所有三个基质中测得的SPR相似；并且在CD CHO培养基中测得了最高程度的细胞聚集。
总之，本文提供多个数据显示，本文提供的培养方法就细胞生长、生产率和产物品质而言，与12-L灌注生物反应器培养方法的性能是接近相当的，并且能达到其水平。基于这些发现，目前提供的灌注培养方法能用于开发和筛选基质制剂、测试多种培养参数对细胞培养性能的效果、和维持卫星培养物用于工艺优化和制造支持。
实施例2.来自12-L生物反应器培养物的卫星摇管培养物
进行了实验来测试来自12-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器培养物的卫星摇管培养物是否能复制12-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器培养物的生长和生产率。
材料和方法
卫星摇管培养物是用取自12-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器培养物的样品接种的，其在培养第3天获取(例如在生物反应器细胞培养工艺运行的生长期)。接种后每个摇管终浓度为11-15x 106细胞/mL。每个卫星摇管培养物(接种后)中液体培养基的体积是10mL。用于盛装每个卫星培养物的摇管的容积是50mL。从两个12-L生物反应器获得了两套一式三份的卫星摇管培养物。将卫星摇管培养物养到生物反应器细胞培养工艺运行结束。卫星摇管培养物在37℃、80％相对湿度和5％CO2下生长，并且在距水平45度的反应者角度以160RPM的频率搅拌。在卫星摇管细胞培养工艺运行中实施细胞渗出方法，从而维持细胞密度恒定。卫星摇管细胞培养工艺运行中使用的细胞渗出方法与12-L生物反应器细胞培养工艺运行中使用的细胞渗出方法是相似的。具体而言，一旦卫星摇管培养物达到40-45x106细胞/mL的密度，就实施细胞渗出方法，伴随着从每个卫星摇管定时去除约10％-15％的液体培养基(含有细胞)体积，并用约相等体积的新鲜液体培养基更换。
每天对各摇管进行两管体积的基质的基质交换(如实施例1中所述(在每24小时时段期间两次去除1X体积的基质(基本没有细胞)并用新鲜培养基更换，典型的是清晨一次和午后一次))。对于卫星摇管细胞培养工艺运行中细胞生长、培养物代谢、生产率和产物品质的取样是以与12-L生物反应器细胞培养工艺运行相同的时间表进行的。每个细胞培养工艺运行是用维持在CD CHO基质中的C02.31克隆细胞进行的。
结果
数据显示卫星摇管细胞培养工艺运行和12-L生物反应器细胞培养工艺运行具有相似的活细胞密度概貌(图10)。在大多数的培养期间，采用细胞渗出方法，将卫星旋转管细胞培养工艺运行的achieves a viable cell density of greater维持在35x 106细胞/mL-45x 106细胞/mL(图10)。卫星摇管细胞培养工艺运行和12-L生物反应器细胞培养工艺运行的生产率(滴度)概貌显示了在整个培养期间相似的趋势(图11)。这些数据显示重组人α-半乳糖苷酶卫星摇管细胞培养工艺运行能复制12-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器细胞培养工艺运行的生长和生产率。
实施例3.600mL摇管培养
进行了实验以测试用本文所述方法培育在600mL摇管中的细胞培养物的生长特性和体积生产率(称为“马克西管”)。将这些600mL细胞培养物的生长特性和体积生产率与用本文所述方法培育的50mL摇管培养物进行比较。
材料和方法
在每个实验中，用5x 105细胞/mL的起始细胞浓度接种带有通气帽的50mL摇管或600mL马克西管(Techno Plastic Products(TPP)AG,Trasadingen,Switzerland)，所使用的细胞来自种子培养物，所述种子培养物在摇瓶中扩大培养14和3代，然后是细胞培养工艺运行I和II中分别的C02.31细胞的小瓶复苏/融化(下文中描述)。将相同细胞系(重组细胞系C02.31表达和分泌人重组α-半乳糖苷酶)的不同细胞库复苏/融化，用于细胞培养工艺运行I和II。将细胞培养物维持在摇动温育箱中的5％CO2、37℃和80％相对湿度的受控环境中。早前建立的50mL摇管控制条件以每个摇管10mL的工作体积与每个实验一起运行。这些50mL摇管控制条件和每300mL马克西管(600mL尺寸)都是以(距水平)45°的反应者角度和160RPM的摇动速度进行培养的。
进行细胞培养工艺运行I以比较摇管中和马克西管中末批培养物的细胞生长。从初始接种后第1天开始，每天对培养物取样(0.5mL)持续11天，从而用Beckman Coulter Vi-Cell细胞存活率分析仪(Beckman Coulter,Inc.)确定活细胞密度(VCD)。
用分批再补料工艺进行细胞培养工艺运行II。从初始接种后第1天开始，每周一、周三和周五对培养物进行取样(0.5mL)，从而通过ViCell确定VDC，并且确定生产率15天。细胞计数后，将摇管以约223x g离心5分钟，并且将马克西管以约300x g离心8分钟。通过用等式11来设置与摇管的比例，来确定对马克西管的离心时间。离心后去除用过的基质，并储存于-80℃直至进行rhα-Gal活性测定，以确定产物滴度。培养基以表9和10中所述比率进行更换，并用等式12和13来计算rhα-Gal体积生产率和比生产率。
表10.用于摇管的分批再补料方案。第0天的接种密度：5x 105细胞/mL，RV/d：反应者体积/天
接种后培养日 再补料速率
第1–3天 0.5RV/d
第4–6天 0.7RV/d
第7天起 1.0RV/d
表11.用于马克西管的分批再补料方案。第0天的接种密度：5x 105细胞/mL，RV/d：反应者体积/天
接种后培养日 再补料速率
第1–3天 0.5RV/d
第4–6天 0.7RV/d
第7天起 1.0RV/d
ln(Ro/R)＝ω2t 等式11
Ro：从离心机中心到容器底部的距离
R：从离心机中心到液体顶端的距离
ω：角速度
t：时间
VPR＝滴度*PR 等式12
PR：灌注速率
VPR：体积生产率(U/L/d)
滴度：rhα-Gal活性(U/L)
SPR：比生产速率(U/109细胞/d)
Xv：活细胞计数(106细胞/mL)
结果：细胞培养工艺运行I
在小瓶复苏/融化后第34天，在两种不同条件下将产生重组人α-半乳糖苷酶的细胞系用于接种摇管(表12)。在11天中评估这些培养物的分批培养性能。
表12.测试的细胞培养工艺运行I条件
容器类型 总体积 工作体积
摇管 50mL 10mL
马克西管 600mL 300mL
维持在CD CHO中11天的培养物活细胞密度概貌在图12A中显示。直到第4天都展示出相似的生长概貌。第4天后，摇管开始进入静止生长期，而马克西管培养物则继续指数增长。生长在摇管中的培养物在第5和第6天达到4.5x 106细胞/mL的峰值活细胞密度。生长在马克西管中的培养物在第7天达到9.0x 106的峰值活细胞密度。两种培养物都维持着相似的存活率概貌(图12B)，在两种培养物中都观察到了大于90％的存活率，直至进入衰退期。这些数据显示马克西管在高细胞密度期能够支持更好地细胞生长。
结果：细胞培养工艺运行II
基于上述细胞培养工艺运行I中的数据，一种灌注样(perfusion-like)的工艺应用到马克西管培养物中，以观察它们对用前面实施例中所述50mL摇管培养的类灌注的工艺是否具有相似的生长特性。在这项细胞培养工艺运行中，在小瓶复苏后第7天，用表达人重组α-半乳糖苷酶的细胞系接种复制的马克西管和摇管。在15天分批再补料工艺中评估细胞培养物性能(细胞生长和生产率)。
15天培养物的活细胞密度概貌在表13中显示。在第10天在两种培养容器中观察到了类似的生长概貌，此时在实验控制(摇管)生长中的细胞生长达到峰值活细胞密度为25x106细胞/mL的平台期。马克西管中的培养物在第13天开始进入平台期，达到35x 106细胞/mL的峰值活细胞密度。然而，当使用50mL摇管模型中培养物历史数据的平均活细胞密度(n＝9)时，其生长模式与马克西管生长模式完全匹配。
由于离心的限制，马克西管在理想年前不能达到0°的角度(水平)。因此，马克西管的离心导致形成松散的沉淀物。松散的沉淀物引起马克西管培养物再补料参数的变化。也就是说，将再补料方案中第7天开始的1.0RV/天的去除修改为0.8RV/天的去除。此外，可以通过无菌操作将用过的基质从马克西管培养物中倒光，所述用过的基质必须通过移液器去除，以防止细胞损失。
从第6天开始测量体积生产速率(VPR)(图14A)。马克西管和摇管的培养物具有相似的生产率，而马克西管据哟稍微较高的生产率。两种容器之间的生产率差异是不显著的，最大差异是在第15天的约25％。两种培养物都在第13天达到峰值生产率，其VPR差异约为15％。马克西管培养物具有47,000U/L/天的峰值VPR，而摇管培养物具有40,000U/L/天的峰值VPR。实验对照(摇管培养物)与收集的历史数据(n＝9)密切对应。对比之下，马克西管中生长的培养物的比生产速率(SPR)比摇管中生长的培养物低(图14B)。经第13天，马克西管培养物的SPR维持在约1400U/109细胞/天，相比之下摇管中生长的培养物的SPR是约1900U/109细胞/天。第13天后，摇管培养物和马克西管培养物的SPR展示出显著的SPR差异。摇管培养物具有约两倍马克西管的SPR(分别是2300U/109细胞/天对比1200U/109细胞/天)，这是由于与摇管培养物中低细胞密度有关的缓慢生长。
总之，这些数据显示，在使用马克西管(600mL体积)、45°(距水平)的反应者角度、和160RPM的搅拌频率的分批培养物中能达到高细胞密度。使用类似的一套梯度基质再补料速率和培养条件，马克西管中培养的培养物与50mL摇管中生长的对照培养物相比具有相当的生长和生产率。在分批再补料培养物中，马克西管和摇管培养物都具有相似的生产率(VPR大于40,000U/L/天)，尽管马克西管培养物具有显著高于摇管培养物的细胞密度。第10天后，摇管培养物具有比马克西管培养物更高的比生产速率，这是由于摇管培养物中细胞生长缓慢。将增加的摇管尺寸应用到基于灌注的细胞培养工艺的分批再补料模型，使我们能够得到用于药物物质分析的纯化的产物样品，并供用于与从较大生物反应器获得的产品直接比较。
实施例4.摇管模型的多参数研究
进行了一组实验以确定50mL摇管中在许多种培养条件和参数下的细胞生长和生产率。在这些多参数实验中，测得的参数的范围是：反应者角度是5°-85°，旋转速度是20RPM-330RPM，工作体积是2mL-40mL。
材料与方法
如下文具体讨论的，细胞培养工艺运行I和II的设计目的是测试每个变量(一式三份)的极值，而细胞培养工艺运行III则设计了比此前确定的对照50mL摇管细胞培养工艺运行较窄的范围(一式三份检测)。
细胞培养工艺运行III是用JMP软件的定制设计工具设计的。该模型是用两种响应(峰值活细胞密度和体积生产速率)和三种连续变量(摇动速度、反应者角度和工作体积)，并考虑了二级相互作用(second order interactions)设计而成的。下限和上限根据表13设置。将设计定制为具有2的效力/指数(power)以说明变量之间的非线性关系。最后将本研究设计为具有总计18个条件，一式三份运行。
表13.JMP中使用的连续变量设置
用克隆C02.31细胞以5x 105细胞/mL的浓度接种所有摇管，所述C02.31细胞来自种子培养物，所述种子培养物经小瓶复苏后在摇瓶中扩大培养3代(细胞培养工艺运行I)和8代(细胞培养工艺运行II和III)。将细胞培养物维持在摇动温育箱中的5％CO2、37℃和80％相对湿度的受控环境中。早先建立的控制条件与每个实验一起运行，所述运行是以10mL/管的工作浓度、45°的反应者角度和160RPM的摇动速度进行的。
对于细胞培养工艺运行I和III，从接种后第1天开始，对培养物进行取样(0.5mL)，从而用Beckman Coulter Vi-Cell细胞存活率分析仪(Beckman Coulter,Inc.)来确定活细胞密度。对于细胞培养工艺运行II，每天对培养物进行取样(20μL)，从而用台盼蓝拒染法通过手动计数确定活细胞密度。对细胞培养工艺运行II进行手动计数以将低培养体积的细胞渗出最小化。细胞计数后，将管以约233x g离心5分钟，并将去除的用过的基质立即储存于-80℃直到进行rhα-Gal活性测定以确定产物滴度。以表14中所述比率更换培养基，并用等式12和13(如上文)计算rhα-Gal体积生产率和比生产率。此外，用等式14和15来计算综合活细胞密度(IVCD)和综合体积生产速率(IVPR)。
表14.用于摇管的分批再补料方案。第0天的接种密度：5x 105细胞/mL，RV/d：反应者体积/天
接种后培养日 再补料速率
第1–3天 0.5RV/d
第4–6天 0.7RV/d
第7天起 1.0RV/d
PR：灌注速率
VPR：体积生产速率(U/L/d)
效价：rhα-Gal活性(U/L)
SPR：比生产速率(U/109细胞/d)
Xv：活细胞密度(106细胞/mL)
IVCD：综合活细胞密度(细胞-d/mL)
t：时间(d)
IVPR：综合体积生产速率(U/L)
用血细胞计数盒和异丙醇(IPA)清洁过的盖玻片进行手动细胞计数。盖玻片的角上用IPA湿润并贴在血细胞计数器上。将细胞样品与台盼蓝1:1均匀混合。将混合物的10-μL小份转移到血细胞计数盒上。对四个大的外围正方形中的细胞进行计数，每个大的外层正方形含有16个较小正方形的网格。处于较大正方形的边界上的细胞仅在四条边中的两条上计算。未着色的细胞计为活细胞，染上蓝色的细胞视为死亡细胞。用等式16和17分别计算百分比存活率和活细胞密度。
总细胞：活细胞和死细胞的总数
这些实验中的统计学分析是用JMP软件进行的。使用的响应是峰值细胞密度(VCD或Xv)和峰值体积生产速率(VPR)，合意度最大化。统计学模型是经过“适合模型(FitModel)”功能评估的，并伴随影响筛选报告。“分选参数评估”报告了被显著影响的响应变量，其通过t检验进行统计学确定。“交互作用分析器”报告了交互作用(或其缺少)引起对响应变量的影响的趋势。最终，“预测分析器”绘出参数对响应变量的影响的独立趋势，并用模型通过将合意度功能最大化来预测最佳条件。
结果：细胞培养工艺运行I
在小瓶复苏后第9天，用表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞系(克隆细胞系C02.31)在16个不同条件下接种摇瓶(表15)。通过在12天分批再补料工艺中确定细胞生长和生产率来评估细胞培养物性能。在16个测试的条件中，条件#3、#4、#5、#9、#10、和#11无法支持生长，正如其测量到活细胞密度(Xv)降低25％(图15A)。六个失败的条件中，有5个经历了30％或更大的存活率下降(图15C)。
图15.测试的细胞培养工艺运行I条件
12天细胞培养的活细胞密度概貌在图15A中显示，所述细胞是表达重组人α-半乳糖苷酶的细胞，其在不同参数下维持在CD CHO中。7种条件(条件#2、#8、#12、#13、#14、#15、和#16)表现出相似的生长概貌，直至第4天。第4天后，生长模式开始出现分歧，两种条件(条件#12和#14)在第5天达到峰值密度。7种条件的余下5种(鉴定为性能良好的)在第12天达到了相似的20x106细胞/mL的活细胞密度，条件#2和#15达到了高达25x 106细胞/mL。条件#7显示出较慢的生长速率，在第12天达到约2x 106细胞/mL(图15B)。条件#1和#6也生长较慢，并且起始活细胞密度仅增加了1.4倍。整个研究过程中，所有支持细胞生长的条件的活细胞百分比均保持在90％-100％(图15C)。
培养条件中观察到的无法支持细胞生长的体积生产速率常常过低而无法检测。生长培养物的VPR概貌直到第5天都是相似的，此时测得的生产率是约3000U/L/天(图16)。从第8天开始，培养物的VPR出现显著变化。经历相似生长模式的培养物并没有相似的生产率。五种最佳条件(条件#2、#8、#13、#15、和#16)中，条件#16具有最低的峰值密度，但却与条件#15一起有40,000U/L/天的最高活性。
将生长和生产率概貌进行整合，以更好地用于条件比较。多种条件的概貌在生长/生产速率上时不同的，并且在不同的天数达到峰值。因此累积概貌允许整个12天工艺中总生长和生产率的分析。
12天细胞培养的综合活细胞密度(IVCD)概貌在图17A中显示，所述细胞是表达重组人α-半乳糖苷酶的细胞，其在不同参数下维持在CD CHO中。IVCD的终点分析导致相同的7个条件鉴定为与余下的条件相比具有显著的生长。然而，在12天工艺中经历了最多生长的条件发生了变化。具有最高峰值细胞密度的条件#12和#14不是理想的操作条件，因为其细胞培养物早早达到顶峰继而死亡。相比之下，条件#8和#15具有最高的ICVD，意味着12天工艺中的活细胞密度是累积较高的，说明其是更好的操作条件。
12天培养的综合体积生产速率(IVPR)概貌在图17B中显示。IVPR概貌遵循与VPR结果相似的趋势，然而条件#15在12天与那些在第12天有相似VPR的条件相比，表现出近乎双倍的总生产率(图17C)。
结果：细胞培养工艺运行II
在小瓶复苏后第32天，用表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的C02.31细胞在六中不同条件下接种摇管(表16)。在14天分批再补料工艺中，对通过细胞生长和生产率测得的细胞培养性能进行评估。六种测试的条件中，条件#5由于机械原因无法支持生长，这与差的条件相反。条件#5中反应者角度(5°)和高搅拌速度(330 RPM)的组合无法将相应的管子保持在轨道中。
表16.测试的细胞培养工艺运行II条件
条件 摇动速度 反应者角度 工作体积
1 20RPM 65° 2mL
2 125RPM 85° 2mL
3 160RPM 45° 10mL
4 260RPM 5° 2mL
5 330RPM 5° 2mL
6 330RPM 20° 20mL
不同参数下的14天细胞培养的活细胞密度概貌在图18A中显示，所述细胞是表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞。有五种测试的条件(#1、#2、#3、#4、和#6)被认为是性能良好的。条件#1和#2表现出生长缓慢，其在第14天分别达到1 x 106细胞/mL和4 x 106细胞/mL的峰值活细胞密度。另外三种条件(条件#3、#4、和#6)达到约20 x 106细胞/mL或更高的峰值活细胞密度，而对照(条件#3)达到55 x 106细胞/mL的活细胞密度。条件#6经历了污染，导致在第11天活细胞密度大幅下降(然后终止了这个培养)。
没有分析活细胞密度维持在3 x 106细胞/mL以下的培养条件的体积生产速率，因为浓度低于检测阈值(条件#1)。性能良好的培养条件的VPR概貌遵循其生长概貌(图18B)。正如条件#2所表现出的生长缓慢，其也表现出最小的VPR，仅达到700U/L/天。条件#3、#4和#6分别具有42,000U/L/天、24,000U/L/天、和10,000U/L/天的峰值VPR。条件#3和#6的这些峰值VPR都是在第7天达到的，而条件#4则是在第11天达到的。
不同参数下14天细胞培养的综合活细胞密度(IVCD)概貌在图19A中显示，所述细胞是表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞。IVCD的终点分析得到了与生长概貌分析相同的观察结果，对照条件(条件#3)得到了最佳结果，然后是条件#4和#6。
14天细胞培养的IVPR概貌在图19B中显示。与VPR概貌和生长及IVCD概貌相比，综合体积生产速率概貌表现出相似的趋势。条件#3具有最佳的总生产率，在14天工艺达到了稍高于300,000U/L，然后是条件#4和#6，具有约一半的生产率(分别为150,000U/L和100,000U/L)。
结果：细胞培养工艺运行III
在细胞复苏后第21天(所述细胞是表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞)，用CDCHO基质中的细胞接种摇管，在18种不同条件下生长(表17)。测试的条件是用JMP软件产生的，如本实施例中所述。通过测量14天分批再补料工艺中培养物的生长和生产率来来确定细胞培养性能。18种测试的条件中，#2、#3、#4、#6、#7、和#11无法支持生长，因为测得了50％(或更大)的细胞密度(Xv)降低(图20A和20B)。所有这6种条件还经历了50％或更大的百分比细胞存活率的下降(图20C)。
表17.测试的细胞培养工艺运行III条件
14天细胞培养的活细胞密度概貌在图20A中显示，所述细胞是表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞，其在不同参数下维持在CD CHO培养基中。从第3天开始，不同条件的生长模式开始出现分歧，两种条件(条件#13和#14)在第7天分别达到14x 106细胞/mL和20x106细胞/mL峰值活细胞密度。
大多数余下的培养条件在第14天达到峰值活细胞密度，除了条件#10、#17和#18，其分别在第9天达到22x 106细胞/mL的峰值活细胞密度，在第11天达到30x 106细胞/mL和19x 106细胞/mL的峰值活细胞密度(图20A)。条件#5和#12表现出较缓慢的生长速率，导致活细胞密度增加1.6倍。在整个工艺运行中，所有支持细胞生长的条件都维持着90％-100％的相似的百分比存活率(图20C)。
无法支持细胞生长、或活细胞密度维持在低于3x 106细胞/mL的培养条件，其体积生产速率未提交分析，因为浓度低于检测阈值。性能良好的培养条件的VPR概貌遵循其生长概貌。三种条件具有相似的最大VPR，约为30,000U/L/天(图20A-C)。排除三种具有高VPR的条件，大多数培养条件具有相似的VPR，达到约20,000U/L/天的峰值。
将生长和生产率概貌进行整合，以更好地进行条件比较。14天工艺中的累积概貌遵循总生长和生产率的分析。14天细胞培养的综合活细胞密度(IVCD)概貌在图22A中显示，所述细胞是表达并分泌重组人α-半乳糖苷酶的细胞，其在不同参数下维持在CD CHO培养基中。IVCD的终点分析导致与生长概貌分析相似的观察结果，相同的10种条件与其余条件相比具有显著的生长。条件#16和#17具有最高的峰值活细胞密度，然而，考虑到整个14天工艺，条件#16表现出比条件#17更低的的总VCD。这表明条件#17更适合14天工艺，然而条件#16可能更适合于更长的工艺，因为其指数生长期发生较晚。条件#8、#10和#18对于活细胞密度也表现良好。
14天培养的综合体积生产率(IVPR)概貌在图22B中显示。IVPR概貌遵循与VPR结果相似的趋势。考虑到第14天的终点分析，条件#1和#8表现出较高的性能，约为30,000U/L/d，然而，条件#1的在14天内的总生产率低(图22C)。条件#8和#17具有最高的总生产率，约为225,000U/L。
使用JMP实验设计(如本实施例中所述)中收集的数据，预测了最佳操作条件。用两种响应来预测操作条件，所述响应为：峰值活细胞密度(VCD)和峰值体积生产速率(VPR)。所有响应限制都经设置来将结果最大化的。
首先，将数据调整到适合图23中所示模型。为活细胞密度收集的数据(图23A)和体积生产速率(图23B)分别以0.69和0.77的R方值(R-square value)适于所述模型。统计分析(t检验)揭示角度、角度与摇动速度之间的相互作用，以及摇动速度和工作体积显著影响了响应。
用参数相互作用概貌来观察响应的影响以及因素之间相互作用的趋势(图24A和24B)。基于斜率(slope)，计算出所有条件对细胞生长都具有影响(图24A)。反应者角度(摇动角度)和摇动速度具有轻微的相互作用。在所有角度处，RPM的增加提高了响应(图24A；中栏，顶行)，在接近中心点的角度(60°)处产生最佳结果(图24A；左栏，中行)。对于所有工作体积的培养物，较高的反应者角度产生更好的结果(图24A；右栏，顶行)。不管摇动速度如何，低体积都产生相似的结果，然而高体积受到RPM的大幅影响(图24A；中栏，底行)。在对VPR的影响中观察到了相似的结果(图24B)。
用JMP预测概貌评估最佳操作条件。基于分析，当以30mL的工作体积在58°处进行操作并以255RPM进行搅拌时，得到最佳的细胞生长(图25)。用概貌来确定最佳操作范围：20-30mL的工作体积，45°-70°的角度，并以大于200RPM进行搅拌。
在对产生的数据的各自分开的统计学分析中，如果培养物在研究期间经历了至少1.5倍的活细胞密度增加(VCD≥0.7x 106细胞/mL，而接种密度为5x105细胞/mL)并维持85％或更大的百分比细胞生产率，则将实验条件归类为“工作的(working)”(数据未显示)。将三个实验的结果进行了分组，并通过峰值活细胞密度进行分类。总共产生了6类(表18)。
表18.通过峰值活细胞密度分类的工作条件
工作条件的活细胞密度范围是0.7x 106细胞/mL-30x 106细胞/mL(图26A)。生产率遵循与活细胞密度相似的趋势，但组间差异并不明显。一般而言，活细胞密度低于5x 106细胞/mL的条件经历了低生产率，而具有高活细胞密度的培养物具有高生产率(图26B)。获得高于15x 106细胞/mL的活细胞密度的条件削弱了关系-平台期细胞的平均性能。
总而言之，这些数据显示了能通过广范围的培养条件组合，用本文所述的方法来达到具有高活细胞密度和生产率的培养物。
其他实施方案
应当理解，当本发明已连同其具体说明书进行了描述时，前述描述意在阐述但非限制本发明的范围，本发明的保护范围由所附的权利要求限定。其他的方面、优点、和修改在所附权利要求的范围内。

Claims (53)

1.一种测试第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充物、或哺乳动物细胞来源的用于产生重组蛋白的方法中的功效的方法，其中所述方法包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述哺乳动物细胞悬于占约10％至约30％容器容积的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约40度至约50度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约140次转动/每分钟(RPM)至约180RPM的搅拌；
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；
检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；
将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同的方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用一种或多种不同的第一和第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的不同的原料成分或补充物、或不同的哺乳动物细胞来源；以及
将与和参考水平相比重组蛋白量增加有关的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充物、或哺乳动物细胞来源鉴定为有效用于产生重组蛋白的方法。
2.权利要求1的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
3.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基占约2％的容器容积。
4.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
6.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
7.权利要求1的方法，其中所述容器在距水平约45度温育。
8.权利要求1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。
9.权利要求1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。
10.权利要求1的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
11.权利要求1的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
12.权利要求11的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的50％；
在温育的第4天至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的100％。
13.权利要求1的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
14.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于5mL至15mL的第一液体培养基中。
15.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
16.权利要求1的方法，其中所述方法在第一液体培养基中或在第一和第二液体培养基的组合中达到大于10x 106细胞/mL的活细胞密度。
17.一种优化用于产生重组蛋白的制造工艺的方法，其中所述工艺包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述哺乳动物细胞悬于占约10％至约30％容器容积的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约40度至约50度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约140次转动/每分钟(RPM)至约180RPM的搅拌；
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；
检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；
将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较；以及
鉴定并去除或改变制造工艺中与和参考水平相比产生的重组蛋白量减少相关的任何培养组分或参数；或鉴定并向制造工艺添加与和参考水平相比产生的重组蛋白量增加相关的任何培养组分或参数。
18.权利要求17的方法，其中所述方法包括鉴定并去除或改变制造工艺中与和参考水平相比产生的重组蛋白量减少相关的任何培养组分或参数。
19.权利要求17的方法，其中所述方法包括鉴定并向制造工艺添加与和参考水平相比产生的重组蛋白量增加相关的任何培养组分或参数。
20.权利要求17的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
21.权利要求17的方法，其中所述第一液体培养基占约20％的容器容积。
22.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
24.权利要求23的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
25.权利要求17的方法，其中所述容器在距水平约45度温育。
26.权利要求17的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。
27.权利要求17的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。
28.权利要求17的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
29.权利要求17的方法，其中去除的第一体积的第一培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
30.权利要求29的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的50％；
在温育的第4天至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的100％。
31.权利要求17的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
32.权利要求17的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于5mL至15mL的第一液体培养基中。
33.权利要求17的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
34.权利要求17的方法，其中所述方法在第一液体培养基中或在第一和第二液体培养基的组合中达到大于10x 106细胞/mL的活细胞密度。
35.一种测试在第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法，其中所述方法包括：
提供盛有哺乳动物细胞的锥形容器，所述哺乳动物细胞悬于占约10％至约30％容器容积的第一液体培养基中；
在约31℃至约40℃，以距水平约40度至约50度的反应者角度将容器温育一段时间，并伴随约140次转动/每分钟(RPM)至约180RPM的搅拌；
在这段时间期间连续地或定时地去除第一体积的第一液体培养基，并向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中第一和第二体积是约为相等的；
检测细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；
将细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白量与通过不同方法产生的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同方法使用一种或多种不同的第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的不同原材料、或不同的哺乳动物细胞来源；和
当产生的重组蛋白的水平低于参考水平时，将第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的原材料、或哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。
36.权利要求35的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本没有哺乳动物细胞的。
37.权利要求35的方法，其中所述第一液体培养基占约20％的容器容积。
38.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
40.权利要求39的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或经工程改造的蛋白。
41.权利要求35的方法，其中所述容器在距水平约45度温育。
42.权利要求35的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。
43.权利要求35的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。
44.权利要求35的方法，其中第一体积的第一液体培养基的去除和第二体积的第二液体培养基的添加是定时地进行的。
45.权利要求35的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是随时间增加的。
46.权利要求45的方法，其中：
将容器温育一段大于7天的时间，并在温育的第1天至第3天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的50％；
在温育的第4天至第6天，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的70％；和
温育第7天和自此起，在每24小时的时期内，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基是第一液体培养基体积的100％。
47.权利要求35的方法，其中所述锥形容器是透气性的50mL至600mL的锥形容器。
48.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞悬于5mL至15mL的第一液体培养基中。
49.权利要求35的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上定义的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、和无蛋白质的培养基。
50.权利要求35的方法，其中所述方法在第一液体培养基中或在第一和第二液体培养基的组合中达到大于10x 106细胞/mL的活细胞密度。
51.权利要求35的方法，其中所述污染物为生物污染物。
52.权利要求51的方法，其中所述污染物为分枝杆菌属(mycobacterium)、真菌、细菌、病毒、或不合意的哺乳动物细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述病毒为囊泡状病毒(vesivirus)。
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