CN108184375A - 一种水稻种子的消毒方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种水稻种子消毒的方法，包括以下步骤：A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；B.对水稻种子进行消毒处理；C.将处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。本发明消毒方法，对细菌、真菌、芽胞、病毒均有效，不会给食用者内脏器官组织细胞造成受损。本发明消毒方法操作简单易行，杀菌效果理想且对种子的伤害小，其尾气经处理后，既不会伤害人体，也不会对环境造成影响。

Description

一种水稻种子的消毒方法
技术领域
本发明涉及分子生物植物育种学技术领域，特别涉及一种水稻种子消毒的方法。
背景技术
植物组织培养是上世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项植物繁殖技术，主要是根据植物细胞具有全能性的理论，将植物的离体器官、组织、细胞置于无菌条件下，诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整植株的过程。
随着科学技术的不断发展，研究领域的不断拓展与深入，植物组织培养技术的应用也越发的广泛。然而植物组织培养一些技术环节仍然存在不少问题，其中污染、褐化、玻璃化被认为是组织培养的三大杀手。与褐化、玻璃化相比，污染更易发生，给科研和生产实践带来巨大的危害。因此采取有效地防控措施，降低污染发生的机率，是组织培养成功的重要保障。在众多污染途径中，外植体污染是最常见且不易解决的问题。真菌污染和细菌污染是外植体污染的两种主要形式。其中，细菌污染是由各种细菌及内生菌引发的，潜伏期很长，有时继代几次后才表现出来。真菌污染易于发现，由霉菌和酵母菌引发，污染速度快，控制困难，一旦发生则损失较大(周俊辉等，2003)。
目前常用的外植体表面消毒剂有次氯酸盐、过氧化氢(双氧水)、溴水、硝酸盐、氯化汞(升汞)、抗菌素、酒精和异丙醇等。次氯酸盐主要有次氯酸钠和次氯酸钙(又名漂白粉)2种。但次氯酸钙在空气中易吸水潮解，影响灭菌效果，所以在外植体消毒中，次氯酸钠更为多见。该消毒剂高效广谱，但其杀菌效果并不理想，种子污染率高，不利于进行水稻种子尤其是珍贵种子的消毒处理。升汞是一种极为有效的杀菌剂，但其主要对细菌和真菌有效，对芽胞、病毒的效力差，甚至无效。此外，它也是一种剧毒药物，可造成内脏器官组织细胞受损。氯气价格低廉，消毒方法操作简单易行，杀菌效果理想且对种子的伤害小，其尾气经处理后，既不会伤害人体，也不会对环境造成影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种水稻种子的消毒方法，对细菌、真菌、芽胞、病毒均有效，不会给食用者内脏器官组织细胞造成受损。本发明消毒方法操作简单易行，杀菌效果理想且对种子的伤害小，其尾气经处理后，既不会伤害人体，也不会对环境造成影响。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻种子消毒的方法，包括以下步骤：
A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；
B.对水稻种子进行消毒处理；
C.将处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；
D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。
所述步骤B可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为6％的NaClO浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
所述步骤B也可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％乙醇浸泡消毒；
②将75％乙醇倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为0.1％的HgCl2浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
所述步骤B还可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中；
②通过分液漏斗向装有NaClO的干燥锥形瓶B中缓慢加入浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中；
③装置密封好后，对水稻种子进行灭菌；
④将已灭菌的种子接种到培养基上。
所述步骤B也可以进一步包括：⑤实验产生的多余气体通过玻璃导管连接到尾气吸收装置。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种水稻种子消毒方式的检测对比方法，包括以下步骤：
A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；
B.对水稻种子分为N组，分别用N种不同的方法平行消毒处理；
C.将处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；
D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。
所述步骤B可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为6％的NaClO浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
所述步骤B还可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％乙醇浸泡消毒；
②将75％乙醇倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为0.1％的HgCl2浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
所述步骤B也可以进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中；
②通过分液漏斗向装有NaClO的干燥锥形瓶B中缓慢加入浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中；
③装置密封好后，对水稻种子进行灭菌；
④将已灭菌的种子接种到培养基上。
所述步骤B还可以进一步包括：⑤实验产生的多余气体通过玻璃导管连接到尾气吸收装置。
本发明有益效果包括：提供了一种水稻种子的消毒方法，对细菌、真菌、芽胞、病毒均有效，不会给食用者内脏器官组织细胞造成受损。本发明消毒方法操作简单易行，杀菌效果理想且对种子的伤害小，其尾气经处理后，既不会伤害人体，也不会对环境造成影响。
附图说明
图1为本发明实施例所述水稻氯气消毒装置示意图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。
在本发明的一实施例中，提供了一种水稻种子消毒的方法。
其实验操作步骤包括：
A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；
B.采用3种方法对水稻种子进行消毒处理；
C.将通过3种方法处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；
D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。
上述步骤B中水稻种子的3种消毒方法如下：
方法1.次氯酸钠(NaClO)消毒法
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为6％的NaClO浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
方法2.升汞(HgCl2)消毒法
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为0.1％的HgCl2浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
方法3.氯气(Cl2)消毒法
①取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中；
②通过分液漏斗向装有NaClO的干燥锥形瓶B中缓慢加入一定比例的浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中；
③装置密封好后，对水稻种子进行灭菌；
④将已灭菌的种子接种到培养基上；
⑤实验产生的多余气体通过玻璃导管连接到尾气吸收装置。
在本发明另一实施例中，对采用3种不同消毒方法所得到的水稻种子污染率和发芽率的情况进行了统计。
以4个水稻品种为材料，每个品种分别采用3种不同的消毒方式，方法1为次氯酸钠消毒法，方法2为升汞消毒法，方法3为氯气消毒法。每个品种接种300粒，每皿20粒，接种15皿，每100粒采用1种消毒方法。接种后对培养皿进行密封及标记，然后分别放入28℃的恒温培养室内，每天观察种子的生长情况，10天后统计水稻种子的发芽率和污染率。结果如下：
重复该实验3次，对4个品种经氯气消毒后的污染率和萌发率进行统计。结果表明，氯气对于大多数基因型都是有效的，且效果都十分理想，平均污染率在1.5％，随着实验操作的熟练，基本上可以杜绝污染问题。除此之外，各水稻品种的萌发率也都很高，平均为94.3％。具体结果如下表所示：
表1.不同品种经氯气消毒后的效应
同时，我们对经3种不同消毒方法所得种子的污染率和萌发率进行统计，比较各方法的消毒效果，取3次实验结果的平均值，结果如表2、表3所示：
表2 3种消毒方法的污染率比较
表3 3种消毒方法的污染率比较
由表2、表3可知，与其他几种常用方法(方法1、方法2)相比，氯气消毒法(方法3)的杀菌效果更好，不然污染率降低，且萌发率也很高，即对种子的伤害最小。
在本发明另一实施例中，提供了一种水稻种子的消毒方法。
1.以粳稻品种日本晴、武育粳7号和籼稻品种云籼9号、明恢86的成熟种子为材料，挑选籽粒饱满、表面无病斑的种子并将其外壳用镊子小心剥掉，在剥壳的过程中注意小心别把种子的胚损伤。将所有的种子剥壳之后，放入干净的不带盖的培养皿内，然后再放入35℃恒温培养箱内烘干处理1-2天。
2.取4个品种的水稻种子，每个品种的水稻种子均分为3份，每份采用3种不同的方法进行消毒，具体操作如下：
方法1.次氯酸钠(NaClO)消毒法
取烘干后的水稻种子，用75％的无水乙醇浸泡消毒1min，无菌水清洗3-4次，然后加入浓度为6％的NaClO浸泡并于室温条件下，摇床震荡消毒20min，最后用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥备用。
方法2.升汞(HgCl2)消毒法
取烘干后的水稻种子，用75％的无水乙醇浸泡消毒1min，无菌水清洗3-4次，然后加入浓度为0.1％的HgCl2溶液，于室温条件下摇床震荡消毒20min，最后用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥备用。
方法3.氯气(Cl2)消毒法
取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中，约1-2层。
通过控制分液漏斗旋钮，向装有100mL NaClO溶液(浓度为6％)的干燥锥形瓶B中缓慢加入4mL浓度为12mol/L的浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中，对种子进行12小时灭菌。此外，锥形瓶A通过另一个玻璃导管与盛有稀碱溶液的烧杯相连，以吸收实验产生的多余氯气，以防对人体造成伤害。
3.将消毒处理后的种子分别接种到含有诱导培养基(MS培养基)的培养皿上，每个品种每种消毒处理各100粒，每皿20粒，然后于28℃培养箱内进行培养。
4.每天观察种子的生长情况及污染情况，10天后，对种子的污染率和发芽率情况进行统计记录。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

Claims (10)

1.一种水稻种子消毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；
B.对水稻种子进行消毒处理；
C.将处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；
D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。
2.根据权利要求1所述水稻种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为6％的NaClO浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
3.根据权利要求1所述水稻种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％乙醇浸泡消毒；
②将75％乙醇倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为0.1％的HgCl2浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
4.根据权利要求1所述水稻种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中；
②通过分液漏斗向装有NaClO的干燥锥形瓶B中缓慢加入浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中；
③装置密封好后，对水稻种子进行灭菌；
④将已灭菌的种子接种到培养基上。
5.根据权利要求4所述水稻种子消毒的方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：⑤实验产生的多余气体通过玻璃导管连接到尾气吸收装置。
6.一种水稻种子消毒方式的检测对比方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.挑选粒大、饱满、表面无病斑的成熟水稻种子，手工去壳后进行烘干处理；
B.对水稻种子分为N组，分别用N种不同的方法平行消毒处理；
C.将处理过的水稻种子分别进行接种，然后放入28℃恒温培养室内进行培养；
D.每天观察种子的污染情况，10天后观察并记录种子的污染率和发芽率。
7.根据权利要求1所述水稻种子消毒方式的检测对比方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％无水乙醇浸泡消毒；
②将酒精倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为6％的NaClO浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
8.根据权利要求1所述水稻种子消毒方式的检测对比方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，用75％乙醇浸泡消毒；
②将75％乙醇倒出，用无菌水清洗3-4次；
③将无菌水倒出，加入浓度为0.1％的HgCl2浸泡并摇床震荡消毒；
④用无菌水冲洗4-5次后，将种子平铺于无菌滤纸上干燥后，进行接种。
9.根据权利要求1所述水稻种子消毒方式的检测对比方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：
①取烘干后的水稻种子，平铺于置于通风橱内的无菌、干燥锥形瓶A中；
②通过分液漏斗向装有NaClO的干燥锥形瓶B中缓慢加入浓盐酸，产生的氯气通过玻璃导管进入锥形瓶A中；
③装置密封好后，对水稻种子进行灭菌；
④将已灭菌的种子接种到培养基上。
10.根据权利要求9所述水稻种子消毒方式的检测对比方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括：⑤实验产生的多余气体通过玻璃导管连接到尾气吸收装置。
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