CN108159402A - 重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中的应用 - Google Patents

Abstract

重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中的应用，涉及胸腺素α原。将重组ProTα应用于机械损伤的眼球表面，动物实验结果显示，低浓度ProTα能够有效促进正常小鼠眼球表面角膜组织受机械损伤后的修复。重组人胸腺素α原蛋白可在制备眼角膜损伤修复药物中应用。所述胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。所述胸腺素α原可在眼球表皮组织机械损伤修复中应用。所述胸腺素α原通过增加结膜杯状细胞数量以及抑制炎症达到促进伤口愈合作用。

Description

重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中的应用

技术领域

本发明涉及胸腺素α原，尤其是涉及重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中的应用。

背景技术

1984年，Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，由于其N端含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原。ProTα有明显的中心酸性区和亲核序列。ProTα具有广泛的生物学活性，在细胞增殖、免疫调控和生殖活性等多方面起重要作用(曹俊霞,金礼吉,王梅，等.胸腺素α原研究进展[J].细胞生物学杂志2003,25(1):21-25)。作为一类有效的免疫增强药物，ProTα对各种免疫缺陷病毒、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用，可用于治疗乙型、丙型肝炎和其他病毒性疾病，并可作一些肿瘤早期诊断的生物标签用于辅助治疗(张俊彦,龚兴国.胸腺素原α的分子结构与作用机制研究进展[J].医学分子生物学杂志2004,1(3):186-189)。有文献报道，应用ProTα治疗乙肝的疗效比IFN更具耐受性(Andreone,P.A.randomized controlled trial of thymosin-alpha1versus interferon alfa treatment in patients with hepatitis B eantigenantibody--and hepatitis B virus DNA-positive chronichepatitis B[J].Hepatology,1996,24(4):774-777)；对于慢性丙型肝炎患者，联合应用ProTα和IFN-α疗效优于单独应用IFN(Sherman,K.E.Combination therapy with thymosin alpha1and in-terferon for the treatment of chronic hepatitis C infection:arandomized,placebo-controlled double-blind trial[J].Hepatology,1998,27(4):1128-1135)。

从目前收集到的相关文献和报道及专利，涉及重组人胸腺素alpha蛋白在眼角膜机械损伤修复方面的应用还未见报道。

中国专利CN200810072084.4公开一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用。

本发明涉及的重组人胸腺素alpha蛋白其碱基和相应氨基酸组成见中国专利：重组人胸腺素alpha原蛋白的新用途.专利号:ZL2013 10168184.8。

发明内容

本发明的目的在于提供重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中的应用。

本发明将重组ProTα应用于机械损伤的眼球表面，动物实验结果显示，低浓度ProTα能够有效促进正常小鼠眼球表面角膜组织受机械损伤后的修复。实验结果为ProTα应用于制备眼睛角膜组织损伤快速修复的药物有重要意义。

由此可见，重组人胸腺素α原蛋白可在制备眼角膜损伤修复药物中应用。

所述胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。

所述胸腺素α原可在眼球表皮组织机械损伤修复中应用。

所述胸腺素α原通过增加结膜杯状细胞数量以及抑制炎症达到促进伤口愈合作用。

以下给出药效学动物实验：

1、显微镜观察及病理切片结果：

1)各浓度ProTα蛋白对小鼠角膜上皮机械损伤愈合影响的比较探究：用角膜上皮刮匙刮除整个角膜上皮制备眼球损伤模型，将正常的18只昆明小鼠用随机数字法分为A、B、C、D、E、F六组，每组3只。ABCD组分别用100ng/ml,300ng/ml，1μg/ml，10μg/ml ProTα蛋白溶液滴眼，滴眼次数3次/d，2滴/次；E组滴用等量的玻璃酸钠溶液，F组为空白对照组。通过荧光素钠染色观察角膜上皮缺损面积，分别于角膜上皮刮除后12、18、24、36、48、72h6个时间点裂隙灯观察拍照记录,观察小鼠眼球变化。

荧光素钠染色裂隙灯显微镜观察结果显示：A到D组，随着用药浓度的增高，小鼠眼球修复愈合率降低；与空白组相比，A组0.1μg/ml蛋白对小鼠眼球机械损伤的修复效果较空白组好；E组玻璃酸钠与D组10μg/ml蛋白对小鼠的修复作用类似，作用不明显；因实验术后未用氧氟沙星消炎，本次实验发现各组小鼠均有炎症反应，玻璃酸钠用药组与空白组炎症反应明显。但是低浓度ProTα组炎症现象不明显，说明低浓度ProTα蛋白溶液对小鼠眼球机械损伤不仅有明显促进修复作用，同时还能够防止炎症感染，此外结果还发现，以市面上销售的玻璃酸钠滴眼液作为阳性对照，ProTα蛋白修复效果明显优于市面的玻璃酸钠滴眼液。

2)基于上述实验，低浓度蛋白(100ng/ml)对小鼠眼球机械损伤修复作用的验证：将6只昆明小鼠用随机数字法分为A、B、C三组，每组两只。按以上方法制备眼球损伤模型，术后滴用氧氟沙星眼液。A组左右眼滴用100ng/ml ProTα蛋白溶液，点眼次数3次/d，2滴/次；B组为空白对照组；C组为小鼠左眼用药，相对应右眼为对照，左眼滴用100ng/ml ProTα蛋白溶液，右眼作空白对照。通过荧光素钠染色观察角膜上皮缺损面积，分别于角膜上皮刮除后12、18、24、36、48、72h 6个时间点照相记录，观察小鼠眼球伤口变化。并于72h观察后颈椎脱臼处死小鼠，分别取各组小鼠左右眼球，用多聚甲醛固定，用于后续的组织切片观察。

荧光素钠染色裂隙灯显微镜观察结果显示：从A/B两组条件对照看，18h时，两组小鼠眼睛损伤程度类似；24h时，用药组眼睛恢复情况明显较空白组好；36h时，用药组修复效果好于空白组。从C组自身对照看，小鼠用药的左眼修复效果明显强于右眼不用药的空白组。综上，可明显看出，用药组小鼠眼睛机械损伤修复效果优于未用药组。

切片观察结果显示：A组小鼠眼球切片结膜杯状细胞(维持眼表健康，与眼表黏蛋白的合成分泌有关)数量较多，胶原纤维排列较整齐，而B组角膜基质层明显水肿，炎细胞浸润(炎细胞在炎症灶聚集的现象)较多；C组小鼠的左眼用药组基质层胶原纤维排列较整齐，炎细胞浸润较少，右眼空白组则基质层胶原纤维排列疏松紊乱，炎细胞浸润较多。结果证明：100ng/ml的ProTα蛋白溶液不仅能够有效修复受损的角膜组织，修复效果明显比空白对照组效果良好，此外还发现用药组能有效抑制眼球表面损伤后的炎症。

以上实验重复三次。

本发明公开了重组人胸腺素alpha原蛋白在角膜损伤修复中的应用，经过体内实验证明，人胸腺素alpha原(Prothymosin alpha,ProTα)蛋白能够有效促进正常动物眼角膜机械损伤后的修复，同时具备预防伤口感染的作用。可以用于制备眼睛角膜组织损伤快速修复的药物。

附图说明

图1为小鼠角膜上皮修复疗效示意图。

图2为不同用药组别随时间变化愈合率比较。横坐标表示时间(h)；纵坐标代表愈合率(％)；图中0.1、0.3、1、10分别表示不同ProTα浓度处理组(单位：μg/ml)，玻璃酸钠表示玻璃酸钠滴眼液处理组，空白为空白对照组。

图3为低浓度0.1μg/ml ProTα促进眼球损伤修复作用验证实验荧光素钠染色结果图。A为用药组、B为空白对照组。18H、24H、36H分别代表18h，24h和36h。

图4为低浓度0.1μg/ml ProTα促进眼球损伤修复作用验证实验荧光素钠染色结果图。其中L为左眼，用药；R为右眼，未用药。

图5为低浓度0.1μg/ml ProTα对小鼠眼球损伤修复作用组织切片图(HE染色)。

A组用药组0.1μg/ml，左右眼都用药

B组空白组；其中R代表右眼，L代表左眼

其中A-1(L)代表用药组小鼠A1左边眼；A-1(R)代表用药组A1右边眼；A-2(L)代表用药组A2左边眼；A-2(R)代表用药组A2左边眼。

图6为低浓度0.1μg/ml ProTα对小鼠眼球损伤修复作用组织切片图(HE染色，相同小鼠左右眼实验)。左眼用药，右眼空白；图中C-1(L)表示左眼用药；C-1(R)代表右眼，未用药；C-2(L)表示左眼用药；C-2(R)代表右眼，未用药。

具体实施方式

具体步骤如下：

1.角膜上皮机械损伤动物模型制备：以0.1ml/10g剂量，对体重相当的健康小鼠给予5％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉5min，倍诺喜点眼两次，用角膜上皮刮匙刮除整个角膜上皮。损伤制作后将小鼠按组分别放在鼠笼饲养，各鼠笼给予标准饲料和饮水。第一次实验(各浓度ProTα蛋白对小鼠角膜上皮机械损伤愈合的影响与较适修复浓度的探究)将正常的18只昆明小鼠用随机数字法分为A、B、C、D、E、F 6组，每组3只。ABCD组分别用100ng/ml,300ng/ml，1μg/ml，10μg/ml，ProTα蛋白溶液滴眼，滴眼次数3次/d，2滴/次；E组滴用等量的玻璃酸钠溶液，F组为空白对照组。通过荧光素钠染色观察角膜上皮缺损面积，分别于角膜上皮刮除后12、18、24、36、48、72h 6个时间点裂隙灯观察拍照记录，观察小鼠眼球变化。结果见图1～3。

以图1为小鼠角膜上皮修复疗效的判断依据，统计小鼠各观察时段的有效愈合率；在图1中，A：无效，缺损面积修复<25％，角膜点染无明显改变；B：有修复效果，缺损面积修复25％～75％，角膜点染+++～++，或++～；C：修复效果显著，缺损面积修复>75％，荧光素点染+++～+，或++、+～极少±；D：完全痊愈，上皮缺损痊愈，荧光素染色转为阴性。痊愈与显效合计为有效，进步与无效合计为无效。各组别处理小鼠眼球的有效愈合率参见表1。

表1

由图2结果可以看到，和空白对照组以及市场滴眼液对照组相比，低浓度的ProTα蛋白溶液对小鼠眼球表面的机械损伤修复有一定的促进作用，并且浓度越低，其修复促进作用越好。由图3的随时间变化的愈合率比较，低浓度用药组的疗效显然快于空白组，说明其促进作用不仅在愈合率方面也体现在愈合速率方面，这说明其有很好的应用价值。

2.低浓度蛋白对小鼠眼球机械损伤修复作用的验证实验：以0.1ml/10g剂量，对体重相当的健康小鼠给予5％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉5min，倍诺喜点眼两次，用角膜上皮刮匙刮除整个角膜上皮，术毕滴用氧氟沙星眼液。将6只昆明小鼠用随机数字法分为A、B、C三组，每组两只。A组左右眼滴用100ng/ml ProTα蛋白溶液，点眼次数3次/d，2滴/次；B组为空白对照组；C组为小鼠本身左右眼的对照，左眼滴用100ng/ml ProTα蛋白溶液，右眼作空白对照。通过荧光素钠染色观察角膜上皮缺损面积，分别于角膜上皮刮除后12、18、24、36、48、72h 6个时间点拍照记录,观察小鼠眼球变化。并于72h观察后颈椎脱臼处死小鼠，分别取各组小鼠左右眼球，用多聚甲醛固定，后做切片观察。荧光素钠染色裂隙灯观察结果由图4可以看出，A、B两组小鼠间的对照，虽然小鼠可能存在差异，但总的来说，实验组的小鼠修复情况会优于对照组，尤其在36h时段两个组别的修复效果已有明显差别；而C组小鼠的自身对照效果则更为明显地看到用药组修复效果由于空白对照组。

3.角膜组织HE染色，实验步骤为：

1)取出眼球置于塑料片凹槽内，滴入OCT包埋剂至液面与槽边等高；

2)用镊子夹持置于液氮上方冷冻，待冷冻成块状放入液氮中深度冷冻10min；

3)在冷冻切片机舱内放入冰盒保持温度在-20℃，将从液氮中取出的塑料片放于机舱内软化20min；

4)在速冰冷锤上滴上包埋剂，从塑料片上取出冷冻块安在速冰冷锤上，等待包埋剂冷冻；

5)使用切片机调节系统切下厚度为6μm的切片，吸附在粘附型载玻片上，作染色用；

6)取组织标本的冰冻切片，晾干，用1×PBS洗1次，未固定的组织冰冻切片放入冷丙酮中，与-20℃，固定10min，用1×PBS洗3次，每次5min；

7)苏木素试剂染色，5min；

8)浸于自来水中洗去浮色后，浸于1％盐酸酒精中分化1-2s；

9)缓慢流动自来水中反蓝，15min；

10)浸于伊红试剂染色20s；

11)自来水稍漂洗，洗去浮色；

12)分别浸于70％、80％、95％、100％的酒精中。每个2min，进行梯度酒精脱水；

13)二甲苯中透明两次，每次2min；

14)放于生物安全柜内吹干二甲苯后，中性树胶封片(H-5000)；

15)于倒置显微镜下观察结果。

结果见图4和5。

从图4可以看出，用药组A-1(L,R),A-2(R)角膜上皮细胞数量较多，主要分布区域靠近角膜上皮层，A-2(L)空孔较多，可能是由角膜发炎程度比较深，但仍能看到少量角膜上皮细胞；而对照组B-1(L,R)角膜上皮细胞较少，主要分布区域靠近基质层，同时有一定数量空孔存在，B-2(L)仅有极少数空孔存在，但基本看不到角膜上皮细胞，B-2(R)基本看不到角膜上皮细胞，且空孔数量众多。

从图5可以发现，用药的左边C-1(L),C-2(L)基本没有空孔存在，可以看到少量角膜上皮细胞，而对照的右边C-2(R)基本看不到角膜上皮细胞,且空孔数量较多。

通过组织学水平可以看出，A组小鼠眼球切片和C组用药的左眼眼球切片染色效果都显示较其相应的对照眼球切片的结膜杯状细胞数量较多，胶原纤维排列较整齐，炎细胞浸润较少，基质层胶原纤维排列也比较整齐。用药后的眼球角膜恢复情况优于空白组，ProTa能够促进眼球表面角膜上皮细胞的生长，抑制炎细胞的浸润，在促进伤口愈合，减少感染，促进眼球机械损伤快速修复方面具有重要的生物学功能。因此，ProTa能够用于眼睛角膜组织损伤快速修复的药物。

结论：100ng/ml的ProTα蛋白溶液能有效抑制眼球表面损伤后的炎症，对小鼠眼球机械损伤有较好的修复作用。

Claims (4)

1.重组人胸腺素α原蛋白在制备眼角膜损伤修复药物中应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述胸腺素α原在眼球表皮组织机械损伤修复中应用。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于所述胸腺素α原通过增加结膜杯状细胞数量以及抑制炎症达到促进伤口愈合作用。