CN108102938B - 一种基于药物缓、控释的载药微球防控生物乙醇发酵染菌的方法 - Google Patents

一种基于药物缓、控释的载药微球防控生物乙醇发酵染菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于药物缓、控释的载药微球防控生物乙醇发酵染菌的方法属于生物能源领域中的染菌防控领域。用pH＝3的柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液配制2mg/mL的氯霉素溶液，将悬浮聚合法制备的粒径在40～100μm聚4‑乙烯吡啶微球放在含氯霉素的酸性缓冲液中充分溶胀，用超纯水洗涤，抽滤、烘干得到载药微球；在发酵初始时将灭菌后的载药微球以2mg/mL的投入量添加到发酵体系中，在30℃，150rpm条件下培养，对酿酒酵母发酵过程中的污染进行防控。本发明成功地抑制了由于染菌造成的生物乙醇产量的减少，并将其恢复到染菌前水平，提升了乙醇产量。本发明通过实现药物在发酵体系中的pH响应性释放可减少抗生素用量，减缓由抗生素滥用造成的问题。

Description

一种基于药物缓、控释的载药微球防控生物乙醇发酵染菌的 方法
技术领域
本发明涉及一种防控酿酒酵母发酵染菌的方法，属于生物能源领域中的染菌防控领域。
背景技术
随着化石能源的迅速开采和耗竭，以及大气污染、温室效应、雾霾等环境问题的日益凸显，人们对可再生清洁能源的需求日益迫切。生物乙醇以其环保、能效高、可再生等优势受到各国专家学者的青睐。
目前，围绕着生物乙醇的非粮原料利用、酵母乙醇耐受性、杂菌污染防控等方面的研究正在广泛展开。其中，由于仪器渗漏、种子带菌等难以避免的问题，杂菌污染在工业规模生物乙醇发酵中经常发生，若得不到有效控制，将会严重影响乙醇产量，从而造成巨大的经济损失。乳酸菌因其耐低pH值、耐乙醇及高增殖速率等特点成为生物乙醇发酵中的主要污染菌，其主要通过分泌乳酸以及与酿酒酵母竞争营养物质和生存空间抑制酵母菌生长和乙醇终产量。针对其生理生化特性人们摸索出一系列方法抑制乳酸菌污染，其中最为广泛使用的是抗生素法。抗生素具有控制染菌效率高、成本低廉、杀灭彻底等优势，然而其过度使用存在着药物残留、耐药性等多方面问题。因此，通过智能防控来降低抗生素的用量、提高发酵效率将会是一个有意义的发明。
染菌有可能发生在发酵过程中的任何一个阶段，发酵开始阶段营养和生存空间充足，而且杂菌在某种程度上是一种有益的存在，因此没有必要在发酵初始阶段就去除杂菌，最好实现实时防控。目前工业上采用的实时防控过程费时费力，而发酵过程中由于副产物的积累逐渐降低的pH(从6到4)为实现智能防控提供了可能，可以降低实时防控的成本。
聚4-乙烯吡啶是一个等电点(pKa)为5左右的弱碱聚合物，具有pH响应性的特点。本发明采用其作为药物包裹材料制成微球应用于发酵体系中。当发酵体系的pH值在聚4-乙烯吡啶的pKa以上的时候，聚合物微球表面的吡啶基团不带电，收缩的形态把药物阻碍在微球里面。相反地，当发酵进程进行到了中期或者后期的时候，发酵体系的pH值小于聚合物微球的pKa时，聚合物微球表面的吡啶基团质子化，伸张的形态使得药物以更大的速率释放出来。另外，聚4-乙烯吡啶作为一种弱碱性的聚合物，对发酵体系中的有机酸有一种较好的吸附作用。因此还可以缓解发酵体系中的酸胁迫情况。
本发明针对目前滥用抗生素以及发酵实时防控过程费时费力的缺点，构建了基于pH响应性聚4-乙烯吡啶微球的药物缓、控释方法，可用于酿酒酵母发酵过程中杂菌的智能防控。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制生物乙醇发酵过程中杂菌污染的防控方法。其特点是以植物乳杆菌ATCC 8014作为污染杂菌，将其与酿酒酵母S288c共培养，以建立生物乙醇发酵的人工模拟染菌体系，然后采用悬浮聚合法合成pH响应性的聚4-乙烯吡啶微球，用其包裹氯霉素，从而对酿酒酵母发酵过程中植物乳杆菌ATCC 8014的污染进行防控。
本发明提供的一种防控酿酒酵母发酵过程中染菌的方法，包括如下步骤：
本实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实验所用的酿酒酵母S288c(ATCC 204508)和植物乳杆菌ATCC 8014，均购买自中国微生物菌种保藏中心。
本实验针对植物乳杆菌的活化及发酵培养基均为MRS培养基，其配方为：1％(w/v,1L培养基中添加10g，下同)酵母浸粉，1％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)牛肉粉，0.2％(w/v)柠檬酸氢二铵，0.5％(w/v)乙酸钠，0.2％(w/v)磷酸氢二钾，0.058％(w/v)硫酸镁，0.025％(w/v)硫酸锰，0.1％(v/v)吐温80，以上为液体培养基配方。固体培养基继续添加0.75％(w/v)琼脂作为上层培养基或1.8％(w/v)琼脂作为下层培养基。
本实验针对酿酒酵母所用的活化及发酵培养基均为YPD培养基，其配方为：2％(w/v,1L培养基中加入20g，下同)葡萄糖，1％(w/v)酵母浸粉，2％(w/v)蛋白胨，以上为液体培养基配方。固体培养基继续添加0.75％(w/v)琼脂作为上层培养基或1.8％(w/v)琼脂作为下层培养基。
本实验针对实验材料的灭菌条件均为：115℃灭菌20分钟。
1.植物乳杆菌活化：配制MRS液体培养基，其中1瓶液体培养基用于活化植物乳杆菌ATCC8014。另外分别配制含0.75％(w/v)琼脂和1.5％(w/v)琼脂的固体培养基，留作第3步抗菌药物活性测定用。将分装完成的MRS培养基灭菌，灭菌完成后将培养基取出在超净台中冷却。在用作活化的MRS培养基中接种植物乳杆菌ATCC8014，将其放在恒温培养箱中恒温37℃条件下活化培养14个小时。
2.酵母菌活化：配制YPD液体培养基，其中1瓶液体培养基用于活化酿酒酵母S288c菌株，另外分别配制含0.75％(w/v)琼脂和1.5％(w/v)琼脂的固体培养基，留作第3步抗菌药物活性测定用。将分装完成的YPD培养基灭菌，灭菌完成后将培养基取出在超净台中冷却。在用作活化的YPD培养基中接种酿酒酵母S288c，将其放入恒温培养摇床中并在恒温30℃，150rpm条件下活化培养20个小时。
3.抗菌药物抑菌活性测试：配制等浓度的氯霉素、青霉素(现配现用)、克林霉素和乳酸链球菌素，以无菌水作为阴性对照。用双层平板法分别对抗菌药物对植物乳杆菌和酿酒酵母进行抑菌活性实验。
4.聚4-乙烯吡啶微球的合成：合成微球前先减压蒸馏除去单体4-乙烯吡啶中的阻聚剂。单体聚合的反应液由油相和水相组成。油相：4-乙烯吡啶(单体)、0.3％(w/v单体，1mL单体添加3mg)偶氮二异丁腈(引发剂)、3％(v/v单体，1mL单体添加30μL)二乙烯基苯(交联剂)；水相：去离子水(悬浮介质)、0.5％(w/v水，1mL去离子水添加5mg)羟乙基纤维素(分散剂)、7％(w/v水，1mL去离子水添加70mg)亚硝酸钠(盐析剂及水相去阻剂)、0.5％(w/v水，1mL去离子水添加5mg)氯化钠(盐析剂)。水相：油相＝2.5：1(v/v)。将上述两相反应液置于两口瓶内室温混合均匀，反复抽真空五次以除去瓶中原有的活性气体、充满氮气，在氮气保护下于磁力搅拌锅中60℃搅拌反应1小时，然后升温至80℃反应至固体产物堆积使得转子不再转动，立即从磁力搅拌锅中取出反应瓶、结束反应，防止出现微球过度交联、粘连。用大于反应液体积100倍以上的80℃～90℃热水洗涤上述产物，滤纸抽滤，60℃干燥。
5.聚4-乙烯吡啶微球的表征：微球的外观形态如图3所示。用扫描电镜和红外光谱仪对干燥的后的聚4-乙烯吡啶微球进行表征。扫描电镜下观察到的照片如图4所示，粒径在40～100μm。微球的红外谱图如图5所示。3419.8cm-1是聚4-乙烯吡啶(PVP)中–NH的伸缩振动，2924.8cm-1和2853.8cm-1是PVP中碳链的–CH伸缩振动。1599.3cm-1和1555.7cm-1是PVP中吡啶环的C＝N伸缩振动。1451.1cm-1和1416.0cm-1是PVP中吡啶环的C–C伸缩振动。1068.1cm-1和994.3cm-1是PVP中C–H的面内弯曲振动。825cm-1是PVP中C–H的面外弯曲振动。上述聚4-乙烯吡啶的特征峰表示聚4-乙烯吡啶被成功合成。
6.药物包裹以及药物释放行为研究：在抗菌药物的抑菌活性测试中发现，氯霉素和青霉素的抑菌效果较好，但是由于青霉素在溶液中不稳定，而氯霉素稳定性较好且在278nm有最大吸收，可以用紫外可见分光光度法精确定量，因此选用氯霉素为本发明中的包裹药物对象。配制一系列浓度梯度氯霉素溶液，用紫外分光光度计的方法确定氯霉素含量线性范围，绘制氯霉素含量标准曲线。
微球包裹氯霉素：用pH＝3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制2mg/mL的氯霉素溶液，将微球放在含氯霉素的酸性缓冲液中充分溶胀，用超纯水洗涤，抽滤、烘干。然后用红外光谱仪对载药微球进行表征。载药微球的红外谱图如图7所示。谱图中增加的羰基的吸收峰证明氯霉素被成功包裹。载药微球在扫描电镜下的形貌如图8所示。可以看出微球在包裹药物后没有形态上的改变。
计算包封率和载药量。
pH响应释放曲线：将干燥后的载药微球置于初始pH为7的缓冲液中，释放一小时取样，然后迅速调节pH至下一个pH值(6,5.8,5.6,5.4,5.2,5和4)并记录调节后的缓冲液体积，在每个pH点释放一小时后取样测OD，计算氯霉素含量，分析微球的pH响应性释放规律。
7.模拟发酵染菌体系中载药微球的药物释放曲线：为模拟工业生产中发酵染菌体系，将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于YPD培养基中进行共培养。为研究载药微球在模拟发酵染菌体系中的药物释放曲线，在发酵初始时将灭菌后的载药微球以2mg/mL的投入量添加到发酵体系中，在恒温30℃，150rpm条件下培养24小时。每隔2小时定时取样测氯霉素含量。由于发酵液中成分复杂，因此不再使用分光光度法进行测定，而是采用高效液相色谱法测定氯霉素含量。
8.载药微球在模拟发酵染菌体系中的抑菌效果验证：本步骤实验有6组：
①酿酒酵母纯培养体系为对照组S：将酿酒酵母以4×105/mL的接种量接种于YPD培养基中培养；
②模拟染菌组SL：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于YPD培养基中进行共培养；
③微球副作用评价组SP：将酿酒酵母以4×105/mL的接种量接种于YPD培养基中，以2mg/mL的投入量添加未包裹药物的空白微球，微球投入前经灭菌处理；
④模拟染菌体系中添加载药微球作为处理组SLM：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于YPD培养基中，以2mg/mL的投入量添加载药微球，微球投入前经灭菌处理；
⑤模拟染菌体系下的阴性对照组SLP，将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于YPD培养基中，以2mg/mL的投入量添加未包裹药物的空白微球，微球投入前经灭菌处理；
⑥模拟染菌体系下的阳性对照组SLC：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于YPD培养基中，添加经0.22μm水系滤膜过滤除菌的、含药量等同于步骤④中微球载药量的氯霉素溶液。
将以上六组放入恒温培养摇床中并在恒温30℃，150rpm条件下培养24小时后用高效液相色谱的方法测定发酵液中产物乙醇含量。
9.微球的重复利用性研究：基于成本考虑，对微球的重复利用性进行了简单的测试，将实施例6中药物释放完全后的微球抽滤、称重，记录湿微球质量，将其60℃烘干后，再次称重，记录干燥微球质量。将烘干后的微球再次置于pH＝4的酸性缓冲液中充分溶胀，抽滤，称重，记录湿微球质量。微球仍然保持有良好的吸水性能，说明微球可被用以重复包裹药物。
本发明具有以下优点：
(1)本发明将药剂学的方法应用到生物发酵领域，为更多交叉学科的发展提供了参考。
(2)本发明成功地抑制了由于染菌造成的生物乙醇产量的减少，并将其恢复到染菌前水平，甚至提升了乙醇产量。
(3)本发明通过实现药物在发酵体系中的pH响应性释放可减少抗生素用量，减缓由抗生素滥用造成的一系列问题。
(4)本发明通过实现药物在发酵体系中的缓慢释放和pH响应性释放可避免或减少工业中实时防控的人力物力，从而降低经济成本。
(5)本发明中的聚4-乙烯吡啶微球经测试可重复利用，节约防控成本。
附图说明
图1为本发明中，常见抗菌药物对植物乳杆菌的抑菌活性测定和比较。
图2为本发明中，常见抗菌药物对酿酒酵母的抑菌活性测定和比较。
图3为本发明中，制备的聚4-乙烯吡啶微球的外观形貌。
图4为本发明中，制备的聚4-乙烯吡啶微球在扫描电子显微镜下的形态。
图5为本发明中，制备的聚4-乙烯吡啶微球的红外光谱图。
图6为本发明中，氯霉素含量的标准曲线。
图7为本发明中，包裹有氯霉素的聚4-乙烯吡啶微球的红外光谱图。
图8为本发明中，包裹有氯霉素的聚4-乙烯吡啶微球在扫描电子显微镜下的形态。
图9为本发明中，载药微球的pH响应释放规律曲线，a为累积释放量-时间曲线，b为释放速率-时间曲线。
图10为本发明中，载药微球在模拟染菌发酵体系中的药物量-时间曲线。
图11为本发明中，载药微球在模拟发酵体系中的抑菌效果验证。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实验所用的酿酒酵母S288c(ATCC 204508)和植物乳杆菌ATCC 8014，均购买自中国微生物菌种保藏中心。
本实验针对植物乳杆菌的活化及发酵培养基均为MRS培养基，其配方为：1％(w/v)酵母浸粉，1％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)牛肉粉，0.2％(w/v)柠檬酸氢二铵，0.5％(w/v)乙酸钠，0.2％(w/v)磷酸氢二钾，0.058％(w/v)硫酸镁，0.025％(w/v)硫酸锰，0.1％(v/v)吐温80，以上为液体培养基配方。固体培养基继续添加0.75％(w/v)琼脂作为上层培养基或1.8％(w/v)琼脂作为下层培养基。
本实验针对酿酒酵母所用的活化及发酵培养基均为YPD培养基，其配方为：2％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)酵母浸粉，2％(w/v)蛋白胨，以上为液体培养基配方。固体培养基继续添加0.75％(w/v)琼脂作为上层培养基或1.8％(w/v)琼脂作为下层培养基。
本实验针对实验材料的灭菌条件均为：115℃灭菌20分钟
实施例1：植物乳杆菌活化
1.植物乳杆菌活化：配制300mL MRS培养基，取3个250mL锥形瓶，每个瓶中分装100mL培养基，其中1瓶标记为“活化MRS”用于活化植物乳杆菌ATCC8014。其余2瓶分别加入0.75g琼脂和1.5g琼脂制成固体培养基，留作第3步抗菌药物活性测定用。将分装完成的MRS培养基放入高温蒸汽灭菌锅，115℃条件下灭菌20分钟；灭菌完成后将培养基取出在超净台中冷却。在标记为“活化”的MRS培养基中接种植物乳杆菌ATCC8014，将其放在恒温培养箱中恒温37℃条件下活化培养14个小时。
实施例2：酵母菌活化
2.酵母菌活化：配制300mL YPD培养基，取3个250mL锥形瓶，每个瓶中分装100mL培养基，其中1瓶标记为“活化YPD”用于活化酿酒酵母S288c菌株，其余2瓶分别加入0.75g琼脂和1.5g琼脂制成固体培养基，留作第3步抗菌药物活性测定用。将分装完成的YPD培养基放入高温蒸汽灭菌锅，115℃条件下灭菌20分钟；灭菌完成后将培养基取出在超净台中冷却。在标记为“活化”的YPD培养基中接种酿酒酵母S288c，将其放入恒温培养摇床中并在恒温30℃，150rpm条件下活化培养20个小时。
实施例3：抗菌药物抑菌活性测试
3.抗菌药物抑菌活性测试：配制1mg/mL的氯霉素、青霉素(现配现用)、克林霉素和乳酸链球菌素，以无菌水作为阴性对照。在超净台中向灭菌的平板中倒入中低火熔化的含1.8％(w/v)琼脂的MRS固体培养基，等待干燥后，放上灭菌的牛津杯，将200μL活化后的植物乳杆菌的菌液和10mL中低火熔化的含0.75％(w/v)琼脂的MRS固体培养基混合倒入平板中。待上层培养基干燥后用灭菌的镊子移除牛津杯，分别将100μL的1mg/mL的氯霉素、青霉素、克林霉素、乳酸链球菌素、无菌水加入到移除牛津杯形成的小洞中。把平板放入恒温培养箱中恒温37℃条件下培养24个小时观察抑菌圈。酿酒酵母按照同样的方法，处理后的平板放入恒温培养箱中恒温30℃条件下培养24个小时观察抑菌圈。抗菌药物对植物乳杆菌的抑菌活性结果如图1，对酿酒酵母的抑菌活性结果如图2。
实施例4：聚4-乙烯吡啶微球的合成
4.聚4-乙烯吡啶微球的合成：合成微球前先减压蒸馏除去单体4-乙烯吡啶中的阻聚剂。单体聚合的反应液由油相和水相组成。油相：5mL 4-乙烯吡啶(单体)、15mg偶氮二异丁腈(引发剂)、150μL二乙烯基苯(交联剂)；水相：12.5mL去离子水(悬浮介质)、62.5mg羟乙基纤维素(分散剂)、875mg亚硝酸钠(盐析剂及水相去阻剂)、62.5mg氯化钠(盐析剂)。将上述两相反应液置于两口瓶内室温混合均匀，反复抽真空五次以除去瓶中原有的活性气体、充满氮气，在氮气保护下于磁力搅拌锅中60℃搅拌反应1小时，然后升温至80℃反应至固体产物堆积使得转子不再转动，立即从磁力搅拌锅中取出反应瓶、结束反应，防止出现微球过度交联、粘连。用1.5L 80～90℃热水洗涤上述产物，滤纸抽滤，60℃干燥。得到3.6254g微球，产率为72.5％。
实施例5：聚4-乙烯吡啶微球的表征
5.聚4-乙烯吡啶微球的表征：微球的外观形态如图3所示。用扫面电镜和红外光谱仪对干燥的后的聚4-乙烯吡啶微球进行表征。扫描电镜下观察到的照片如图4所示，粒径在40～100μm。微球的红外谱图如图5所示。3419.8cm-1是聚4-乙烯吡啶(PVP)中–NH的伸缩振动，2924.8cm-1和2853.8cm-1是PVP中碳链的–CH伸缩振动。1599.3cm-1和1555.7cm-1是PVP中吡啶环的C＝N伸缩振动。1451.1cm-1和1416.0cm-1是PVP中吡啶环的C–C伸缩振动。1068.1cm-1和994.3cm-1是PVP中C–H的面内弯曲振动。825cm-1是PVP中C–H的面外弯曲振动。上述聚4-乙烯吡啶的特征峰表示聚4-乙烯吡啶被成功合成。
实施例6：药物包裹以及药物释放行为研究
6.药物包裹以及药物释放行为研究：配制0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5μg/mL一系列浓度梯度氯霉素溶液，绘制氯霉素含量标准曲线，如图6所示。
微球包裹氯霉素：用pH＝3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制2mg/mL的氯霉素溶液，将200mg微球放在5mL的含药缓冲液中充分溶胀，用超纯水洗涤，抽滤、烘干。然后用红外光谱仪对载药微球进行表征。载药微球的红外谱图如图7所示。谱图中增加的羰基的吸收峰证明氯霉素被成功包裹。载药微球在扫描电镜下的形貌如图8所示。可以看出微球在包裹药物后没有形态上的改变。
计算包封率和载药量：载药微球的包封率是40.13％，载药量是2％，由于本发明中用于包裹的药物是过量的，所以，若将总药量调整到合适的数值，包封率会提高。
pH响应释放曲线：将200mg干燥后的载药微球置于50mL初始pH为7的缓冲液中，释放一小时取样，然后迅速调节pH至下一个pH值(6,5.8,5.6,5.4,5.2,5和4)并记录调节后的缓冲液体积，在每个pH点释放一小时后取样测OD，计算氯霉素含量。药物释放规律曲线如图9所示。图9中a图为累积释放量-时间曲线，图b为释放速率-时间曲线，由图可看出初始阶段有药物突释现象，之后趋于平稳，直到pH降到5.2时释放速率增大，体现了药物缓释和pH响应性释放的特点。
实施例7：模拟发酵染菌体系中载药微球的药物释放曲线
7.模拟发酵染菌体系中载药微球的药物释放曲线：为模拟工业生产中发酵染菌体系，将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中进行共培养。为研究载药微球在模拟发酵染菌体系中的药物释放曲线，将200mg含有约4mg氯霉素的微球115℃灭菌20分钟后于发酵初始时投入到发酵体系中，在恒温30℃，150rpm条件下培养24小时。每隔2小时定时取样测氯霉素含量。由于发酵液中成分复杂，因此不再使用分光光度法进行测定，而是采用高效液相色谱法测定氯霉素含量。药微球在模拟发酵体系中的药物释放曲线如图10所示。由图可看出药物缓释的特点，在发酵前期释放缓慢，直到发酵中间阶段释放速率有略微的增加，之后药物含量呈现下降趋势。此步实验中由于药物在释放的过程中也会消耗，所以微球的pH响应性释放特点被掩盖。
实施例8：载药微球在模拟发酵染菌体系中的抑菌效果验证
8.载药微球在模拟发酵染菌体系中的抑菌效果验证：本步骤实验有6组：
①酿酒酵母纯培养体系为对照组S：将酿酒酵母以4×105/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中培养；
②模拟染菌组SL：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中进行共培养；
③微球副作用评价组SP：将酿酒酵母以4×105/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中，添加200mg未包裹药物的空白微球，微球投入前经115℃灭菌20分钟；
④模拟染菌体系中添加载药微球作为处理组SLM：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中，添加200mg含有约4mg氯霉素的载药微球，微球投入前经115℃灭菌20分钟；
⑤模拟染菌体系下的阴性对照组SLP，将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中，添加200mg未包裹药物的空白微球，微球投入前经115℃灭菌20分钟；
⑥模拟染菌体系下的阳性对照组SLC：将植物乳杆菌和酿酒酵母分别以4×105/mL和1×108/mL的接种量接种于100mLYPD培养基中，添加经0.22μm水系滤膜过滤除菌的2mL2mg/mL氯霉素溶液。
将以上六组放入恒温培养摇床中并在恒温30℃，150rpm条件下培养24小时后用高效液相色谱的方法测定发酵液中产物乙醇含量，结果如图11所示。由图可看出空白微球对酿酒酵母发酵没有副作用，染菌降低了酿酒酵母发酵产乙醇的产量。而载药微球成功地抑制了由于染菌造成的生物乙醇产量的减少，并将其恢复到染菌前水平，甚至提升了乙醇产量。仅添加氯霉素组的乙醇产量虽也达到了染菌前水平，但相比于仅添加药物，载药微球缓、控释的特点可以节省实时防控的人力物力。
实施例9：微球的重复利用性研究
9.微球的重复利用性研究：基于成本考虑，对微球的重复利用性进行了简单的测试，将实施例6中药物释放完全后的微球抽滤、称重，湿微球质量为454.6mg，将其60℃烘干后，再次称重，干燥微球质量为210.4mg。将烘干后的微球再次置于pH＝4的酸性缓冲液中溶胀6小时，抽滤，称重，微球质量为505.5mg，以上结果显示微球仍然保持有良好的吸水性能，说明微球可被用以重复包裹药物。

Claims (2)

1.一种基于药物缓、控释的载药微球防控生物乙醇发酵染菌的方法，其特征在于：
用pH＝3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制2mg/mL的氯霉素溶液，将悬浮聚合法制备的粒径在40～100μm聚4-乙烯吡啶微球放在含氯霉素的酸性缓冲液中充分溶胀，用超纯水洗涤，抽滤、烘干得到载药微球；在发酵初始时将灭菌后的载药微球以2mg/mL的投入量添加到发酵体系中，在恒温30℃，150rpm条件下培养，从而对酿酒酵母发酵过程中的污染进行防控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，载药微球进行重复利用。
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