CN108088997A - 利用细胞表面分子标志物鉴定人类原态多能性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用细胞表面分子ALPPL2鉴定人类态多能性的方法。步骤是：建立可诱导的2代重编程系统，利用特定的诱导培养体系从人的成纤维细胞中分别建立态及primed态iPSC系；分别提取所建立的态及primed态iPSCs中的细胞膜蛋白，通过iTRAQ标记及蛋白质谱定量技术，对两者的膜蛋白进行系统比较分析，筛选出相比于primed iPSCs，中高表达的膜蛋白库；3.在及primed重编程过程中分别选取特定时间节点进行细胞收样，结合RNAseq分析，获得及primed重编程过程转录组的动态变化，并将在重编程过程中特异性上调的基因与步骤2中筛选出的膜蛋白库进行综合比较。本发明找到了可特异指征人的态多能性的表面分子标志物ALPPL2。

Description

利用细胞表面分子标志物鉴定人类原态多能性的方法

技术领域

本发明涉及一种利用细胞表面分子ALPPL2鉴定人类态多能性的方法。

背景技术

多能性作为包括ESCs及iPSCs在内的多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSCs)的重要特性，是指单个细胞可分化成整个成体所有特化细胞类型的能力。在体内系统中，多能性状态随着受精卵到囊胚的发育过程产生，也随着胚胎的发育过程分成两种阶段。在囊胚晚期，内细胞团(Inner Cell Mass，ICM)表先出异质性(heterogeneity)，其部分细胞发育形成上胚层(epiblast)细胞，这些细胞以表达多能性分子标志物Nanog为特征，可发育成三个胚层的组织，并能够代表胚胎发育最初始的状态，处于“原态”(state，ground state)。状态在发育过程中较为短暂，随着胚胎的植入，这些上胚层细胞的多能性继续丢失，由状态转化为“始发态”(primed state)。

态”概念的提出，使得人们对多能性的认识提高到了一个新的高度。多能性的相关研究是近年来干细胞及重编程领域研究的热点及难点。与传统的primed状态相比，状态捕获了体内植入前(pre-implantation)胚胎发育的阶段，从某种意义上代表了更高的自我更新能力及多向分化潜能，因此在人类早期胚胎发育的研究中具有更强的优势；同时，处于状态的PSCs其单细胞传代的易操作性不仅显著地提高了干细胞的扩增和复苏效率，更大大增加了基因操作的可行性，因而与primed态PSCs相比，态PSCs在再生医学及个体化临床治疗方向上具有更为广阔的应用前景。

近年的研究通过过表达关键外源基因、添加特定小分子抑制剂以及改变培养条件等方法，可成功的将体细胞或者处于primed态的PSCs重编程至多能性状态，或从人的植入前囊胚直接建立ESCs。虽然通过与人类植入前胚胎的单细胞测序结果进行系统比较，研究者确立了是否类似于人类植入前胚胎是评价人的态PSCs的金标准，但对于直观指征态多能性的表面分子标志物的研究仍处于空白状态。目前仅发现人的ESCs表达primed ESCs表面抗原TRA-1-60/81，但不表达SSEA4。因此，寻找并鉴定态PSCs特异的表面分子标志物，不仅可以进一步了解态多能性区别于primed态多能性的特征，更有助于深入研究态多能性获得及建立的动态机制。

ALPPL2(Alkaline phosphatese,placental-like 2，胎盘样碱性磷酸酶)是一类组织特异性的定位于细胞膜表面的碱性磷酸酶，其主要在睾丸，胸腺及特定的生殖细胞肿瘤中表达，与胎盘及肠道形式的碱性磷酸酶密切相关；并在胚胎发育相关研究中被认为是植入前胚胎/滋养外胚层相关的分子标志物。我们在近期的研究中通过可诱导的人类2代重编程系统结合iTRAQ标记－蛋白质谱定量(iTRAQ-LC/MS)技术，发现ALPPL2蛋白高度富集于态多能干细胞的细胞膜表面，暗示ALPPL2在态多能性的指征中可能发挥重要作用。

发明内容

本发明旨在提供细胞表面分子ALPPL2特异指征人类态多能性的方法。

本发明的一个目的是提供一种寻找并鉴定可特异性指征人类态多能性的表面分子标志物的分析方法。

本发明的另一个目的是提供由上述方法获得的表面标志物ALPPL2来鉴定人类多能性状态的方法，从而研究态多能性获得及建立的动态机制。

本发明的第一方面提供一种寻找并鉴定可特异性指征人类态多能性的表面分子标志物的分析方法，该方法包括下述步骤：

1.建立可诱导的2代重编程系统，利用特定的诱导培养体系从人的成纤维细胞中分别建立态及primed态iPSC系；

2.分别提取所建立的态及primed态iPSCs中的细胞膜蛋白，通过iTRAQ标记及蛋白质谱定量(iTRAQ-LC/MS)技术，对两者的膜蛋白进行系统比较分析，筛选出相比于primed iPSCs，中高表达的膜蛋白库(fold change>1.5)；

3.在及primed重编程过程中分别选取特定时间节点进行细胞收样，结合RNAseq分析，获得及primed重编程过程转录组的动态变化，并将在重编程过程中特异性上调的基因与步骤2中筛选出的膜蛋白库进行综合比较。

根据本发明所述的分析步骤，所获得的态细胞表面分子标志物须具备以下两个指标：

1)在而非primed iPSC或人成纤维细胞的细胞膜表面高表达；

2)相比于primed重编程过程，其在态重编程过程中该蛋白对应的基因表达水平逐渐升高，并在终态中具有较高的RNA表达水平。

在此发明中，利用上述方法并参考上述指标，我们筛选并鉴定出态多能性特异的表面分子标志物——ALPPL2膜蛋白(图1)。

本发明的第二方面提供利用细胞表面分子ALPPL2鉴定人类态多能性的方法。具体包括以下几个方面：

1.通过免疫荧光染色及报告基因系统，确定ALPPL2定位于态细胞膜表面，而在primed态细胞中难以检测到表达；

2.运用报告基因系统，在上述人类2代重编程系统中，追踪ALPPL2在及primed重编程过程中以及转化至primed多能性状态过程中的表达动态，验证ALPPL2在多能性诱导系统中的特异性；

3.运用CRISPR/CAS9基因编辑系统，在态多能干细胞中敲除ALPPL2后对态多能性的影响；

4.运用CRISPR/CAS9基因编辑系统，在人成纤维细胞分别重编程至及primed多能性状态过程中，敲除ALPPL2对细胞命运决定的影响，验证ALPPL2在多能性诱导及维持系统中的特异性。并进一步验证通过本发明中第一方面提供的寻找并鉴定可特异性指征人类态多能性的表面分子标志物的分析方法的正确性和实用性。

本发明的有益效果为利用可诱导的人类2代重编程系统及iTRAQ-MS技术相结合筛选的方法，找到了可特异指征人的态多能性的表面分子标志物ALPPL2。同时，本发明提供利用该表面分子ALPPL2鉴定人类态多能性的方法，证明其对人类态指征的特异性及广谱性。

本项研究有助于填补重编程研究领域的空白，并可以深化对态多能性建立及维持机理的理解，从而为态多能干细胞诱导、培养和分化体系的优化及其在未来临床医学上的应用提供理论指导作用。

附图说明

图1中a表示通过可诱导的2代重编程系统将人成纤维细胞分别诱导至及primed iPSCs的示意图；b表示通过iTRAQ-MS技术筛选出的中高表达的候选膜蛋白(与primed iPSCs相比，fold change>1.5)；c表示ALPPL2基因在及primed重编程过程中的表达动态；

图2中a表示通过免疫荧光检测ALPPL2在及primed iPSCs中的表达及定位；b表示通过ALPPL2-promoter-GFP(ALPPL2::GFP)报告系统鉴定ALPPL2在的表达及定位；

图3中a表示通过免疫荧光检测ALPPL2在及primed重编程晚期的表达及定位；b表示由ALPPL2::GFP报告系统，追踪ALPPL2在诱导重编程过程中的动态表达及定位；

图4表示在ALPPL2::GFP中敲除ALPPL2对克隆形态及态多能性的影响；

图5表示在OCT4-ΔPE-GFPiPSCs中敲除ALPPL2，对态多能性的影响；

图6表示敲除ALPPL2对态多能性诱导过程的影响；

图7表示通过ALPPL2::GFP报告系统，将iPSCs从态诱导分化至primed态时，ALPPL2、SSEA-3、SSEA-4及TRA-1-60等细胞表面marker的动态变化。

具体实施方式

实施例1:ALPPL2蛋白定位检测。

一、目的：确定ALPPL2蛋白的表达定位。

二、方法：

1.运用抗体免疫荧光检测方法，分别检测ALPPL2在及primed iPSC中的表达及定位；

2.运用抗体免疫荧光检测方法，分别检测及primed重编程过程中ALPPL2的表达及定位；

3.运用ALPPL2-promoter-GFP(ALPPL2::GFP)报告系统，检测ALPPL2在及重编程过程中的表达动态。

三、结果及结论：ALPPL2特异性表达于细胞表面(图2)；并且，在态多能性诱导过程中，随重编程过程的进行，ALPPL2蛋白表达水平逐渐升高，其阳性细胞比例逐渐增多，而在primed系统中无法检测到ALPPL2蛋白的显著表达(图3)，说明ALPPL2在系统的特异性。

实施例2:敲除ALPPL2对态多能性

一、目的：验证ALPPL2对态多能性建立及维持的重要性和特异性。

二、方法：

1.运用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在ALPPL2::GFP中特异敲除ALPPL2，通过观察克隆形态及态多能性分子的表达水平，检测ALPPL2对态多能性的重要作用；

2.运用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在OCT4-ΔPE-GFPiPSC中特异敲除ALPPL2，通过观察克隆形态及检测GFP荧光表达水平，检测ALPPL2对态多能性的重要作用；

3.运用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在重编程过程中特异敲除ALPPL2，通过观察克隆形态，检测ALPPL2对态重编程的重要作用；

三、结果及结论：在中特异敲除ALPPL2，ALPPL2荧光水平显著下降，克隆形态发生剧烈变化，由之前的典型的鹅卵石状变成扁平克隆状，并可见单个细胞发生核质比降低，特异多能性marker如DPPA3、TFCP2L1表达显著降低(图4)。而在中特异敲除ALPPL2后，GFP信号显著降低(图5)，说明OCT4远端增强子的活性显著降低；而在成纤维细胞中敲除ALPPL2后再进行重编程，此过程中始终无法观察到GFP信号的出现，并发现诱导过程中的细胞无法形成特异的态克隆(图6)。以上结果均说明ALPPL2对态多能性的维持起到了重要作用。

实施例3:向primed态转变过程中ALPPL2的表达

一、目的：验证ALPPL2对于态多能性而非primed态多能性的特异性。

二、方法：运用ALPPL2::GFP报告系统，通过将5iLAF培养系统换成经典的primed细胞培养系统(DMEM/F12+20％KSR+4ng/ml bFGF)，使定向分化至primed iPSC，通过流式分析检测ALPPL2的表达动态。

三、结果及结论：使用经典的primed细胞培养系统培养使之分化成primed iPSC，在分化10天后，可以看到典型扁平状primed克隆出现；同时，随着primediPSC特异的表面分子marker SSEA-3及SSEA-4表达水平的上升，ALPPL2表达水平显著下降，细胞基本由ALPPL2::GFP全阳性转化为全阴性，从而进一步证明了ALPPL2指征态多能性的特异性。

这里本发明的描述和应用是说明性的，并非想将本发明的范围限制在上述实施例中。这里所披露的实施例的变形和改变是可能的，对于那些本领域的普通技术人员来说实施例的替换和等效的各种部件是公知的。本领域技术人员应该清楚的是，在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其它形式、结构、布置、比例，以及用其它组件、材料和部件来实现。在不脱离本发明范围和精神的情况下，可以对这里所披露的实施例进行其它变形和改变。

Claims (1)

1.一种利用细胞表面分子ALPPL2鉴定人类态多能性的方法，其特征在于：该方法包括下述步骤：

A、建立可诱导的2代重编程系统，利用特定的诱导培养体系从人的成纤维细胞中分别建立态及primed态iPSC系；

B、分别提取所建立的态及primed态iPSCs中的细胞膜蛋白，通过iTRAQ标记及蛋白质谱定量(iTRAQ-LC/MS)技术，对两者的膜蛋白进行系统比较分析，筛选出相比于primediPSCs，中高表达的膜蛋白库(fold change>1.5)；

C、在及primed重编程过程中分别选取特定时间节点进行细胞收样，结合RNAseq分析，获得及primed重编程过程转录组的动态变化，并将在重编程过程中特异性上调的基因与步骤B中筛选出的膜蛋白库进行综合比较；根据分析，所获得的态细胞表面分子标志物须具备以下两个指标：

1)在而非primed iPSC或人成纤维细胞的细胞膜表面高表达；

2)相比于primed重编程过程，其在态重编程过程中该蛋白对应的基因表达水平逐渐升高，并在终态中具有较高的RNA表达水平。