CN105441384A - 一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途。本发明提供了制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法,所述方法包括使动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞与至少一种MAPK通路抑制因子,至少一种WNT信号通路调控因子,至少一种LIF/STAT3通路调控因子和至少一种FGF通路调控因子接触,由此产生动物和人类原始多潜能干细胞。本发明还涉及用于制备所述动物和人类原始多潜能干细胞的组合物、培养基或试剂盒,以及由此制备的原始多潜能干细胞及其用途。本发明的原始多潜能干细胞可用于例如制备不同动物和人类物种的嵌合体,其有望用于疾病模型的建立、药物测试和器官移植等。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途。
背景技术
(一)多潜能性干细胞的两种多潜能性状态:
在啮齿类动物(如小鼠和大鼠)上的研究表明,多潜能干细胞可以分为截然不同的两种多潜能性状态:以从着床前小鼠胚胎内细胞团建立的小鼠胚胎干细胞为代表的内细胞团样多潜能干细胞和以从着床后小鼠胚胎原始外胚层建立的小鼠原始外胚层干细胞为代表的原始外胚层样多潜能干细胞。这两种多潜能干细胞在基因表达谱,维持所需信号通路,以及嵌合能力上都有很多不同。例如:内细胞团样多潜能干细胞依赖LIF和抑制MAPK/ERK信号通路来维持其多能性,而原始外胚层样多潜能干细胞则依赖bFGF和TGF-β信号通路来维持其多能性。在多潜能性方面,原始外胚层样多潜能干细胞具有明显的胚层分化倾向性且不具备嵌合能力,而内细胞团样多潜能干细胞则没有明显的胚层分化倾向性且具备高嵌合能力。此外,在体外培养中,原始外胚层样多潜能干细胞会形成扁平形态的克隆,增殖缓慢且很难单细胞传代;而内细胞团样多潜能干细胞在体外会形成隆起形态的克隆,增殖迅速而且可以单细胞传代。而这些特性也使得内细胞团样多潜能性干细胞在研究转基因以及嵌合动物模型上具有得天独厚的优势。同时在小鼠和大鼠上发现的这两种多潜能性状态也催生出了干细胞与再生医学领域上的一个悬而未决的问题:那就是,除了啮齿类物种之外,在其它动物物种上是否在也存在这两种多潜能性状态,尤其是内细胞团样多潜能性状态。因为一旦这个问题得到解决,人类就有能力根据需求改造各种动物物种。
尽管这两种多潜能性状态在啮齿类动物(如小鼠和大鼠)上的研究比较清楚,但是之前已报道的其他动物的胚胎干细胞,尤其是以人和恒河猴为代表的灵长类胚胎干细胞,在性质上都与原始外胚层样多潜能干细胞接近。例如在体外会形成扁平的二维形式的克隆,其增殖速率为36小时左右,体外维持自我更新需要bFGF和TGFβ信号通路,而且不能嵌合到早期囊胚中。随着培养条件的进一步改进,干细胞体外建系上一个重要的里程碑式工作便是2008年由应其龙等人发现的通过结合LIF及两条信号通路GSK和MAPK的抑制剂,可以将小鼠多潜能性干细胞稳定在胚胎内细胞团样状态(YingQLetal.,2008)。而这个条件也同样可以获得大鼠胚胎内细胞团样多潜能干细胞系。然而尽管利用这个方法可以在啮齿类动物,如小鼠和大鼠上实现体外胚胎内细胞团样多潜能干细胞建系,它却无法广泛适用于其它物种的体外内细胞团样多潜能干细胞建系。所以到目前为止,只有在小鼠和大鼠上真正实现了体外内细胞团样多潜能干细胞建系。
(二)体细胞重编程技术:
要想在体外获得多潜能干细胞,除了直接从早期胚胎建系之外,另一种方法就是将体细胞利用重编程的技术在体外转变为多潜能性干细胞。简单来说,就是先将供体体细胞细胞核从细胞中取出,随后将这个细胞核植入一个去核卵细胞中,再将这枚卵细胞移植入代孕受体的子宫中进行发育,从而得到与供体体细胞来源个体一样的子代。这种技术又被称之为生殖性克隆。最早的体细胞重编程技术是在两栖动物中上进行的核移植实验(GurdonJB,1995)。随后第一只克隆羊多利的诞生(CampbellKHSetal.,1997),标志着核移植技术在动物上的成功实现。而在治疗性克隆中,通常得到的胚胎不会移回代孕母体中,而是经由体外发育并在饲养层细胞上建立多潜能干细胞系。通过这种方法理论上可以建出病人特异的多潜能干细胞系。而且这种方法已在小鼠和非人灵长类动物中实现(WakayamaTetal.,2001和ByrneJetal.,2007)。但在人上直到前不久才实现治疗性克隆(TachibanaMetal.,2013)。另一种有别于利用卵细胞重编程的方法是通过将已建立的多潜能干细胞系同体细胞进行细胞融合从而将体细胞转变成多潜能状态(Miller,R.A.andRuddle,F.H.,1976,Tada,Metal.,1997和Cowan,C.Aetal.,2005)。虽然融合后的细胞为多倍体,但它们的确具有多潜能性。
上述这些研究充分提示了在卵细胞或是多潜能性干细胞中存在着某些可以将体细胞重编程的物质,但是具体是什么还仍然不清楚。许多人尝试在这些细胞中寻找可以将体细胞重编程的物质,这其中就包括后来因可诱导多潜能干细胞技术获诺贝尔生理及医学奖的Yamanaka。Yamanaka早期的研究思路现在看起来非常简单和直接,首先他们根据之前的研究报道,判断这种重编程因子存在于多潜能细胞的细胞核中。随后他们筛选了24个在维持体内外多能性中起重要作用的转录因子,并在接下来的实验中将筛选范围最终缩小到4个转录因子:OCT4,SOX2,KLF4,cMYC。过表达这四个转录因子的组合可以将小鼠的成纤维细胞成功逆转为胚胎干细胞状态(TakahashiandYamanaka,2006)。早期的报告体系是基于一个名为Fbx15的基因表达,但这个基因并不是关键的多潜能干细胞决定因子,因此早期获得的可诱导多潜能干细胞并不是真正意义上的多能性干细胞,在体内它们无法整合进宿主的囊胚中去(TakahashiandYamanaka,2006)。接下来Yamanaka他们所选用的报告体系则是基于内源基因OCT4的启动表达,因为这个基因是一个不可或缺的关键多潜能干细胞决定因子(Nicholsetal.,1998)。在重编程过程中内源基因OCT4的启动表达是成功与否的一个主要标志,通过这个报告体系建立的小鼠可诱导多潜能干细胞同小鼠胚胎干细胞性质非常接近。更重要的是它们可以在体内发育成为三个胚层的组织并且可以整合进生殖系统中。另外由于用逆转录病毒介导的4个因子在重编程过程中会随机整合到基因组中,而体外多潜能干细胞会使这些逆转录病毒表达沉默,随后也有直接通过克隆形态和外源基因沉默两项指标进行多潜能性判读,这一点在人体细胞重编程上尤为重要(TakahashiandYamanaka,2006)。
由于考虑到介导外源基因的逆转录病毒存在着很大安全隐患,随后人们研发出诸如外源基因可诱导表达系统(Sommer,C.Aetal.,2009),转座子技术(Kaji,Ketal.,2009和Woltjen,Ketal.,2009),非整合腺病毒技术(Stadtfeld,Metal.,2008),表达外源基因的mRNA和蛋白技术(Kim,Detal.,2009)或借助化学小分子促进重编程效率。最终对体细胞重编程技术的改良发展到完全利用化学小分子即可高效安全实现小鼠体细胞的重编程(Houetal.,2013),这一里程碑式的研究也为体细胞无外源转录因子重编程开启了新的篇章。小鼠成纤维细胞是第一个被用来进行可诱导多潜能干细胞重编程的细胞,随后很快利用同样的4个转录因子:OCT4,SOX2,KLF4,cMYC可以在人和大鼠体细胞上实现可诱导多潜能干细胞重编程。而这些通过体细胞重编程得到可诱导多潜能干细胞同这些物种的胚胎干细胞在外观形态,基因表达和表观遗传修饰上基本毫无差别(LiWetal.,2009和TakahashiandYamanaka,2007)。此外JamesThomson等人通过另外4个转录因子OCT4,SOX2,NANOG,LIN28同样可以将人体细胞通过体细胞重编程得到可诱导多潜能干细胞,并且这些细胞与用Yamanaka的4个因子得到的可诱导多潜能干细胞无异。但是这些可诱导多潜能干细胞的多潜能性究竟如何并无定论,因为目前为止只有极少数建立的小鼠多潜能干细胞可以通过最严格的四倍体嵌合实验检测(BolandMJetal.,2009)。近年来有一些实验室对此进行了进一步的深入研究,结果发现印记基因的不正常表观遗传修饰是导致可诱导多潜能干细胞的多潜能性下降的一个重要因素(Stadtfeldetal.,2010)。筛选那些印记基因表观遗传修饰正常的细胞系可以提高四倍体嵌合成功率(Stadtfeldetal.,2010)。此外在人体细胞重编程的过程中,人们还发现体外获得的人可诱导多潜能干细胞在分子水平具有其初始来源细胞的记忆性,在体内和体外分化过程中,这些可诱导多潜能干细胞具有明显的分化倾向性,即更易于分化成为初始细胞来源的组织类型(PoloJMetal.,2010和Kimetal.,2010)。但是如果将这些可诱导多潜能干细胞进行体外长期传代则可以在一定程度上消除这种分化倾向性,从而使其更接近真正意义上的多潜能干细胞(PoloJMetal.,2010)。
尽管随后越来越多其他动物物种的可诱导多潜能干细胞被人们建立出来,其中包括由我们实验室首次建立的恒河猴可诱导多潜能干细胞(LiuHetal.,2009)。但是这些可诱导多潜能干细胞除了啮齿类动物的以外,无一例外都和它们的胚胎干细胞一样,与小鼠胚胎着床后原始外胚层(Epiblast)相近,而不具备胚胎内细胞团性质。而这也说明,如果没有一个合适的体外培养条件,除了啮齿类动物其它动物无论是从胚胎直接建系还是从体细胞重编程得到的多潜能干细胞,其体外既定命运是一种原始外胚层样多潜能状态(Ezashietal.,2009,HanXetal.,2011和KohSetal.,2012)。因此如何在体外获得其它物种的内细胞团样多潜能干细胞便成了干细胞研究领域最热门的问题之一。
(三)体外建立动物和人类内细胞团样干细胞研究现状
从2008年由应其龙等人在小鼠体系上发现LIF/2i这一内细胞团样多潜能干细胞体外维持条件后,人们一直好奇这个条件能否应用在体外建立其它动物物种的内细胞团样多潜能干细胞上。尽管之前在小鼠体系上积累了很多线索。例如,小鼠原始外胚层样多潜能干细胞在体外长期用LIF/2i(BaoSetal.,2009),或Kenpaullone/CHIR99021处理(HannaJetal.,2009),亦或是过表达Nanog,Klf2,Klf4,Stat3,Nr5a,cMyc,Tcfp2l1等转录因子的情况下可以转变为内细胞团样多潜能干细胞(HannaJetal.,2009,SilvaJetal.,2009,HallJetal.,2009,GuoGetal.,2009,YangJetal.,2010,GuoGandSmithA,2010和MartelloGetal.,2013)。而小鼠内细胞团样多潜能干细胞也可以在bFGF/ActivinA/TGF-β的作用下转变为原始外胚层样多潜能干细胞(BronsIGMetal.,2007)。此外用bFGF/ActivinA/TGF-β的条件也可以直接从小鼠胚胎内细胞团建立原始外胚层样多潜能干细胞,或者将小鼠体细胞重编程为原始外胚层样多潜能干细胞而不是内细胞团样多潜能干细胞(BronsIGMetal.,2007)。这些研究结果充分说明了胚胎内细胞团样多潜能性状态和原始外胚层样多潜能性状态是受外界培养环境所调控的。但是当人们花费了大量精力,尝试了种种条件,希望能在体外建立其它动物物种的内细胞团样多潜能干细胞,尤其是以人类为代表的灵长类物种内细胞团样多潜能干细胞时,结果却都以失败告终。例如一些实验室将人的着床前胚胎直接用LIF/2i体系进行体外培养,希望能够建立像小鼠胚胎干细胞一样的内细胞团样多潜能干细胞。然而简单的LIF/2i体系在人胚胎中并不能维系其多能性状态。尽管如此,人们仍试图通过将人的体细胞经由体外重编程,或是将已建立的人原始外胚层样多潜能干细胞直接转变为内细胞团样多潜能性状态(HannaJetal.,2009)。在这些努力中,有的通过过表达更多的内细胞团样多潜能性相关基因,如KLF4,KLF2,NANOG等(HannaJetal.,2009),并结合一些化学小分子,如A-83-01,forskolin等将人的体细胞或原始外胚层样多潜能干细胞转变为内细胞团样多潜能性状态(HannaJetal.,2009)。另外在同时加强RA信号通路下游RAR-γ,和一个核受体信号Nr5a2后,也可以使人的体细胞经重编程直接到达内细胞团样多潜能性状态(WangWetal.,2011)。还有些研究尝试避免引入外源转录因子,建立稳定的人内细胞团样多潜能干细胞系,这些研究中所使用的小分子诸如PD0325901和SB203580,丁酸钠,NM23-H1,Dznep等等,对维持内细胞团样多潜能性状态都有一定的效果(HannaJetal.,2009,XuYetal.,2010,WareCBetal.,2009和SmaggheBJetal.,2013)。另外还有利用一些如低氧等物理条件进行尝试的(LengnerCJetal.,2010)。但是所有以上尝试都无法在体外建立一个确定的培养方式来获得真正意义上的人内细胞团样多潜能干细胞。对外源基因的持续性依赖,分化缺陷,缺乏像小鼠胚胎干细胞一样的性状,以及重复性差都是体外建立真正意义上的人内细胞团样多潜能干细胞需要克服的障碍(HassaniSNetal.,2013)。直到最近,一些最新的研究结果使得在体外利用小分子建立稳定的不依赖外源基因的人内细胞团样多潜能干细胞系成为可能。但是这些研究中所使用的小分子条件与在小鼠内细胞团样多潜能干细胞上的条件差异很大,也给寻找从其它动物物种上建立体外内细胞团样多潜能干细胞的条件带来了困扰(GafniOetal.,2013,ChanYSetal.,2013和WareCBetal.,2013)。目前人们急需建立动物物种体外内细胞团样多潜能干细胞来帮助理解体外动物内细胞团样多潜能干细胞的建立及维持条件。
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发明内容
在一些实施方案中,本文提供了一种制备动物和人类诱导原始多潜能干细胞的方法。在本文中,原始多潜能干细胞是指比原始外胚层样多潜能干细胞的多潜能状态更“原始”的多潜能干细胞,例如内细胞团样多潜能干细胞。本文所述原始多潜能干细胞可通过检测其所具备的一种或多种性质进行鉴定(参见下文详细描述)。在本文的一些实施方案中,所述原始多潜能干细胞包括具有内细胞团样多潜能干细胞特征的比原始外胚层样多潜能干细胞的多潜能状态更“原始”的多潜能干细胞。在本文的一些实施方案中,所述原始多潜能干细胞包括例如内细胞团样多潜能干细胞。
在一些实施方案中,制备动物和人类诱导原始多潜能干细胞的方法包括使动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞与至少一种MAPK通路抑制因子,至少一种WNT信号通路调控因子,至少一种LIF/STAT3通路调控因子和至少一种FGF通路调控因子接触,由此产生动物和人类原始多潜能干细胞。
在一些实施方案中,所述方法还包括使动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞与至少一种TGF家族通路调控因子例如TGF-beta受体抑制剂,至少一种ROCK信号通路调控因子例如ROCK抑制剂和/或至少一种PKC信号通路调控因子例如PKC激活剂接触。
在一些实施方案中,所述MAPK通路抑制因子抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的任意一条或多条通路。
在一些实施方案中,所述MAPK通路抑制因子为MAPK抑制剂,包括AEG3482,BI78D3,CEP1347,c-JUNpeptide,IQ3,JIP-1(153-163),SP600125,SU3327,TCSJNK5a,TCSJNK6o,AMG548,CMPD-1,EO1428,JX401,ML3403,RWJ67657,SB202190,SB203580,SB203580hydrochloride,SB239063,SCIO469hydrochloride,SKF86002dihydrochloride,SX011,TAK715,VX702,VX745,Arctigenin,10Z-Hymenialdisine,PD0325901,PD184352,PD198306,PD334581,PD98059,SL327,U0124和U0126中的任意一种或多种。
在一些实施方案中,所述MAPK通路抑制因子可以为抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的任一条的抑制因子;或者可以为分别抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的两条或三条不同通路的抑制因子,例如PD0325901(抑制ERK通路),SB203580(抑制p38通路),SP600125(抑制JNK通路)中的两种或三种抑制剂。令人吃惊地发现,同时抑制MAPK下游3个分支信号通路(P38,JNK和ERK)中的两种或三种通路能够提高动物和人类诱导原始多潜能干细胞的转变效率。因此,在一些实施方案中,所述MAPK通路抑制因子为多个MAPK抑制剂,其分别抑制MAPK下游3个分支信号通路(P38,JNK和ERK)中的两个或三个通路。
在一些实施方案中,所述WNT信号通路调控因子可以是GSK3抑制剂,包括CHIR99021,CHIR98014,SB216763,TWS119,SB415286,LY2090314,Tideglusib,TDZD-8,CBM1078,TD114-2,3F8,AR-A014418,FRATide,Indirubin-3′-oxime,L803,Kenpaullone,BIO。
在一些实施方案中,所述LIF/STAT3通路调控因子可以为LIF/STAT3通路激活剂如LIF。
在一些实施方案中,所述FGF通路调控因子可以为FGF通路激活剂如成纤维细胞生长因子(FGF)超家族成员(FGF1-FGF18),包括bFGF。
在一些实施方案中,所述动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞为已建成的动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞,例如直接从早期胚胎建立的原始外胚层样多潜能干细胞。在一些实施方案中,所述动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞为重编程而来的原始外胚层样多潜能干细胞,例如通过外源基因介导的重编程或由化学小分子不依赖外源基因的方法介导的重编程从分化的细胞(成体细胞)获得的外胚层样多潜能干细胞。这样的外胚层样多潜能干细胞可以通过例如在动物和人类成体细胞中表达重编程因子OCT4和KLF4,然后与至少一种HDAC抑制剂,至少一种GSK3抑制剂、至少一种TGF-beta受体抑制剂和至少一种组蛋白去甲基化酶抑制剂接触,诱导形成的原始外胚层样多潜能干细胞。将恒河猴的成体成纤维细胞体外成功诱导成为原始多潜能细胞。例如,可以通过逆转录病毒介导在恒河猴的成体成纤维细胞中过表达重编程因子OCT4和KLF4,在包含下列小分子组合:VPA,CHIR99021,616452,Tranylcypromine的培养基(DMEM/F12及20%的血清替代物)中培养30-40天,诱导成体成纤维细胞形成原始外胚层样多潜能干细胞,再将这种原始外胚层样多潜能干细胞传代后用小分子例如CHIR99021,PD0325901,SB203580,SP600125和细胞因子LIF,bFGF共同处理7-10天即可将80%的原始外胚层样多潜能干细胞诱导形成原始多潜能细胞,这种恒河猴原始多潜能细胞可具有体内及体外多潜能性并具有同小鼠及人内细胞团样多潜能细胞相似的各种性质。在一些实施方案中,通过成体细胞重编程获得的外胚层样多潜能干细胞也可以通过已知的方法构建(参见例如本文背景部分的方法)。在通过分化的细胞重编程获得的外胚层样多潜能干细胞的方法中,可以应用的分化细胞不受特别限制,其中所述分化的细胞例如可以是来源于动物如小鼠或人类的体细胞。例如,所述分化的细胞可以是成纤维细胞,皮肤细胞,脂肪细胞,肝细胞,胃细胞,角质细胞或血液细胞。
在一些实施方案中,本文所述原始多潜能干细胞包括内细胞团样多潜能干细胞。在一些实施方案中,所述动物包括哺乳动物,鸟类如鸡,鸭,丹顶鹤,鱼类如中华鲟等,特别的,所述动物包括灵长类如恒河猴,金丝猴,啮齿类如小鼠和大鼠,家畜如猪,羊,马,和牛,所述动物还包括大熊猫等。在本文中,当动物和人类并称时,所述动物一般不包括人类;在其它情况下提及动物时也可包括人类,除非另有明确说明。
在一些实施方案中,提供了用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的组合物、培养基或试剂盒,其包括在上述方法中使用的各种因子的组合。在一些实施方案中,上述调控因子(包括抑制因子和激活因子等)可以组合在一起用于产生动物和人类原始多潜能干细胞。所述组合物可以包括本发明中使用的调控因子或其组合,以及载体、稀释剂、缓冲剂。所述组合的调控因子可以例如以添加到培养基中一起在合适的阶段提供给培养中的细胞,用于产生动物和人类原始多潜能干细胞。本发明涵盖了混合物和培养物,所述混合物和培养物可以包括一种或多种所述调控因子、培养基以及其中培养的细胞。本发明的调控因子可以以试剂盒的形式方便地提供。所述试剂盒可以包括不同的容器,分别根据例如方便不同阶段使用而存放不同的调控因子和/或组合物。所述试剂盒还可以包括如何使用各组分的说明书。
(1)在一些实施方案中,提供了用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的培养基。在一些实施方案中,可以使用的基础培养液包括D/F12,K-DMEM,KSR,FBS,N2,B27等适用于常规干细胞培养的培养液。其中常用浓度配比为D/F12∶KSR=9∶1-3∶1,K-DMEM∶KSR=9∶1-3∶1,D/F12∶FBS=9∶1-3∶1,K-DMEM∶FBS=9∶1-3∶1。N2,B27按生产厂家建议的常规用量添加。在一些实施方案中,所述培养基可以是例如:85%K-DMEM+15%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),N2培养基添加物,4ng/mlbFGF,10ng/mlhLIF,3μMCHIR99021,0.5μMPD0325901,10μMSB203580,10μMSP600125。其中所使用的最简化条件为:85%K-DMEM+15%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),N2培养基添加物,4ng/mlbFGF,10ng/mlhLIF,3μMCHIR99021,0.5μMPD0325901。所述动物和人类原始干细胞培养基可以用于:动物和人类原始多潜能干细胞如内细胞团样干细胞诱导,包括从早期胚胎建系,从已建成的动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞系诱导以及在体细胞重编程后阶段处理。处理时间一般为7-14天。动物和人类原始干细胞常规培养,包括有饲养层体系和无饲养层培养体系。
在一些实施方案中,提供了在所公开的用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法中使用的各种因子用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的用途,例如所述原始多潜能干细胞可用于制备不同动物物种的嵌合体,包括制备组织器官人源化的动物,优选的,这样的人源化动物可用于疾病模型的建立、药物测试和器官移植等用途。所述原始多潜能干细胞还可以经体外培养诱导分化可制备功能细胞或有功能的组织、器官,进而用于疾病模型、药物测试开发或细胞(器官)移植。
在一些实施方案中,提供了本文所述的方法或组合物、培养基或试剂盒制备的动物和人类原始多潜能干细胞。在一些实施方案中,所述的动物原始多潜能干细胞如内细胞团样多潜能干细胞具备以下一种或多种性质:
(1)表达多潜能性相关标志基因,如内源OCT4,SOX2,NANOG,SALL4,DNMT3B,DPPA2,CRIPTO等等;
(2)碱性磷酸酶染色强阳性,表达多种细胞内和细胞膜表面多潜能性相关标志蛋白,如细胞内的OCT4,SOX2,NANOG,细胞膜表面的TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4等;
(3)具有形成畸胎瘤的能力,畸胎瘤可检测到三胚层细胞;
(4)多次传代后仍具正常核型;
(5)容易单细胞传代成克隆;
(6)高表达早期内细胞团样多潜能性特异性基因,如PRDM14,KLF5,ZFP42(REX1),LIFR,TBX3,NANOG等等;
(7)分化相关基因下调,如MIXL1,CDX2,ZIC1,HAND1,EOMES,SOX1,PAX6,DLL1,ZNF521等等;
(8)维持自我更新依赖的主要信号通路是LIF/STAT3,MAPK抑制,可选择的包括bFGF,TGF-β信号相关调控因子;
(9)具同种嵌合能力;
(10)生长速度平均为为4-5d传代一次;
(11)雌性细胞中两条X染色体保持激活状态;
(12)区别于已报道的其它类型原始多潜能干细胞,我们获得的原始多潜能干细胞可与其他动物胚胎嵌合得到异种嵌合体;
其中符合(6)、(8)、(9)、(11)、(12)条中的至少一条。
在一些实施方案中,本文提供动物和人类原始多潜能干细胞的用途,包括例如用于下述一种或多种用途:
(1)在制备用于克隆不同种类动物的多潜能干细胞或试剂盒中的用途,包括品种改良,濒危物种克隆繁育,或获得基因修饰动物模型等;
(2)通过对所述细胞进行体外诱导分化得到不同类型的分化细胞的用途,以及应用所述分化细胞进行的研究或临床应用,例如,通过将原始多潜能干细胞诱导形成胰岛β细胞进行糖尿病相关研究的用途;
(3)通过将所述细胞与同种或异种,正常或组织器官缺陷胚胎进行嵌合,生成嵌合体的实验,所述嵌合体可被应用于生产人造组织或器官;
(4)利用这种细胞或这种细胞来源的分化细胞制备携带恒河猴来源或人来源组织或器官的小鼠,进行体内药物筛选。
在一些实施方案中,调控因子类型可以是细胞因子,化学小分子,转录因子,胞外基质等可以作用于上述信号通路的物质。
例如,本发明可以使用下述GSK3抑制剂:
例如,本发明可以使用下述MAPK抑制剂:
附图说明
图1为整体设计方案。
图2为建立恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞的方法,其中:
(A)恒河猴多潜能干细胞在20%KSR+bFGF下呈现原始外胚层样,在2i/hLIF无克隆,在2i/hLIF+bFGF,下呈现内细胞团样。鉴定方法为ALP染色和OCT4与TRA-1-81的免疫荧光。标尺,100μm
(B)在同时抑制MAPK下游3个分支信号通路(P38,JNK和ERK)后转变效率达到最高。TGF-beta抑制这一过程。
(C)在最优化的条件下建立的内细胞团样干细胞同时表达TRA-1-81和典型的内细胞团样干细胞标志物TBX3。标尺,100μm
(D)在最优化的条件下建立的内细胞团样干细胞的典型形态。鉴定方法为ALP染色和OCT4与TRA-1-81的免疫荧光。标尺,100μm
(E)内细胞团样干细胞单细胞传代能力测试。鉴定方法为ALP染色和TRA-1-81的免疫荧光。标尺,100μm
(F)恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞自我更新不依赖ROCK抑制和PKC抑制。标尺,100μm。
图3为恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞性质鉴定,其中:
(A)单细胞成克隆能力测试,胚胎内细胞团样多潜能干细胞单细胞成克隆能力明显优于原始外胚层样多潜能性干细胞。
(B)RT-PCR鉴定结果说明胚胎内细胞团样多潜能干细胞表达多潜能性相关基因.(N1,N2,N3:3株胚胎内细胞团样多潜能干细胞系;ES-7.5:恒河猴胚胎干细胞系.)
(C)ALP染色和免疫荧光鉴定结果说明胚胎内细胞团样多潜能干细胞为ALP阳性且表达多潜能性相关基因OCT4,SOX2,NANOG,TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4,不表达SSEA-1.标尺,50μm.
(D)胚胎内细胞团样多潜能干细胞在15代后仍具正常核型。
(E)畸胎瘤实验表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞具有体内分化形成三胚层能力。标尺,100μm。
图4为比较恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞和原始外胚层样多潜能干细胞性质的异同,其中:
(A)维持自我更新所需要的信号通路的比较,维持恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞自我更新需要LIF,bFGF,不依赖TGF-β。N1,2,3:内细胞团样多潜能干细胞系。P1,2,3:原始外胚层样多潜能干细胞系
(B)和(C)H3K27me3染色及XIST表达结果表明雌性恒河猴来源的胚胎内细胞团样多潜能干细胞具备两条X染色体激活状态。标尺,50μm
(D)和(E)RNA-seq全基因组表达谱分析结果表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞和原始外胚层样多潜能干细胞是两类不同的细胞。
(F)和(G)恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞高表达早期干性标志基因,低表达分化相关基因。
图5为鉴定恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞的嵌合能力,其中:
(A)对E10.5天嵌合胚胎进行全胚免疫荧光检测表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞(绿色)具备异种嵌合能力。
(B)对E16天嵌合胚胎进行全胚免疫荧光检测表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞(绿色)具备异种嵌合能力,注:高比例嵌合在心脏部位。
图6为补充鉴定恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞的性质,以及非整合方法建立的恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞的整合情况,其中:
(A)RT-PCR检测结果表明恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞表达一系列多潜能性标志基因。(OK-1,2,3:三株恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞系,EV-1,-2,-3:三株非整合方法建立的恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞系)
(B)ALP染色和免疫荧光鉴定结果说明恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞为ALP阳性且表达多潜能性相关基因SOX2,NANOG和TRA-1-60。标尺,100μm.
(C)恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞中外源基因是沉默的。“Exo”指代外源基因。
(D)定量PCR检测结果说明恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞中外源基因是不表达的。
(E)基因组PCR检测结果表明,恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞中有OCT4,KLF4和GFP插入。
(F)畸胎瘤实验结果表明恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞具有三胚层分化能力。标尺,100μm。
图7为直接从成纤维细胞得到的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞和利用非整合方法建立的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞的性质,其中:
(A)直接从成纤维细胞得到的胚胎内细胞团样多潜能干细胞的形态及外源GFP沉默情况。标尺:100μm.
(B)RT-PCR检测结果表明直接从成纤维细胞得到的胚胎内细胞团样多潜能干细胞和利用非整合方法建立的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞表达一系列多潜能性标志基因。(DRN-1,2,3:三株直接建立的恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞系;EVN-1,-2,-3:三株非整合方法建立的恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞系)
(C)ALP染色和免疫荧光鉴定结果说明直接从成纤维细胞得到的胚胎内细胞团样多潜能干细胞和利用非整合方法建立的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞为ALP阳性且表达多潜能性相关基因OCT4,SOX2,NANOG,TRA-1-81,TRA-1-60和SSEA-4。标尺,100μm。
(D)直接从成纤维细胞得到的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞和雌性恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞在8代后仍具正常核型。
(E)畸胎瘤实验表明直接从成纤维细胞得到的胚胎内细胞团样多潜能干细胞具有体内分化形成三胚层能力。标尺,100μm。
图8补充其它信号通路对恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞的影响以及RNA-seq结果深入分析,其中:
(A)正常条件下(2i/LIF+bFGF+SP600125+SB203580)的恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞形态如右上。TGF-β加入后克隆变扁平,右中。TGF-β和其抑制剂同时加入时恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞形态正常隆起。标尺,100μm
(B)和(C)恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞自我更新依赖PI3K-Akt信号通路。标尺,100μm
(D)GO分析相对于原始外胚层样多潜能性干细胞而言,恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞上调或下调的信号通路相关基因。
(E)本研究与YanL等人、TheunissenTW等人、GafniO等人研究的比较结果。
图9为补充检测嵌合胚胎情况,其中:
(A)检测免疫荧光所用抗体的特异性。上图为小鼠成纤维细胞染色,中图为猴成纤维细胞染色,下图为人成纤维细胞染色。抗体可以很好区分灵长类和小鼠细胞。标尺,100μm
(B)对E10.5天嵌合胚胎进行全胚免疫荧光检测表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞(绿色)具备异种嵌合能力。
(C)对E16天嵌合胚胎进行全胚免疫荧光检测表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞(绿色)具备异种嵌合能力且失去干性基因表达。
(D)嵌合情况统计。
图10为E13.5天嵌合胚胎进行全胚免疫荧光检测表明恒河猴胚胎内细胞团样多潜能干细胞(绿色)具备异种嵌合能力。左:内胚层(FOXA3染色);右:外胚层(SYN染色)
图11为用优化条件(2i/LIF+bFGF+SP600125+SB203580)建立的人胚胎内细胞团样可诱导多潜能干细胞。左上为形态图;右上为OCT4免疫荧光染色;左下为NANOG免疫荧光染色;右下为SOX2免疫荧光染色。
具体实施方式
下面以内细胞团样多潜能干细胞作为原始多潜能干细胞的实例,对本发明实施方案进行具体说明。应当指出,下述具体实验方案仅为示例性说明的目的,而非具体限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
(一)原代恒河猴成体成纤维细胞分离培养
主要使用的试剂:
DMEM-HG+10%FBS(普通)+1%双抗(青/链霉素)
5mg/mlDispaseII:0.5gDispaseII粉末溶于100mlPBS中,过滤除菌。
0.25%胰酶
PBS缓冲液
实验步骤:
1)将检疫合格的成年恒河猴外耳缘用碘伏棉球进行消毒,用酒精棉球擦拭两遍后,再用解剖剪剪取约0.5公分厚度的一小块组织,置于含10%双抗(青/链霉素)的PBS中。
2)将恒河猴外耳缘组织取出后置于10cm培养皿中,用碘伏棉球仔细擦拭消毒后,置于装有75%酒精的50ml离心管中脱碘2-3次,每次时间不多于30秒。之后用含10%双抗(青/链霉素)的PBS洗3-5遍。
注:酒精脱碘时间非常重要,一定不能太长,否则会严重影响分离得到的细胞质量。
3)将PBS洗过的耳缘组织用解剖剪剪若干个2-5毫米长小口,具体数目依组织大小而定。然后置于5mg/mlDispaseII中在4度条件下消化过夜。
4)取出消化好的耳缘组织于新的10cm培养皿中,用10%双抗PBS洗三遍。用解剖镊轻轻撕去表皮,表皮可用于分离角质细胞,这里弃之不用。将下层真皮组织用解剖剪剪碎,约1-3mm直径大小。加入Trypsin于37度消化约15-30分钟直至肉眼看不到明显组织块为止。用含10%FBS的DMEM-HG培养基终止消化。
5)如果步骤4中的组织块太大,可采用二次或三次消化方法。即消化约15-30分钟后,使组织块自然沉降。取上部细胞悬液于一新的15ml离心管中。下部剩余组织块继续用胰酶消化。
6)重复步骤4-5,直至充分消化完成后,将收集到的所有上部细胞悬液进行离心。离心条件:1000rpm,5分钟。
7)离心后去上清,将剩余的细胞用含10%FBS的DMEM-HG培养基重悬。计数后按2-5×10^6/10cm培养皿的密度接种于10cm培养皿中,置于37度培养箱中进行培养。培养基:DMEM-HG,10%FBS
8)培养约24小时后进行观察,此时大部分细胞都应处于贴壁状态,更换新鲜培养基(DMEM-HG,10%FBS)。之后依据细胞生长状况每隔一天更换一次新鲜培养基。
9)大约3-5天后细胞可长满整个培养皿,此时细胞代数记作P0。可将其消化继续传代或冻存。细胞冻存密度:每只冻存管约3-5×10^6细胞。冻存液配制:DMEM,20%FBS,10%DMSO
(二)恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养和传代
主要使用的试剂:
恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基:80%D/F12+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF。
1mg/mlDispaseII:0.1gDispaseII粉末溶于100mlPBS中,过滤除菌。
PBS缓冲液
实验步骤:
1)观察恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞克隆,待其长至约接近70-80%培养皿密度后即可进行消化传代。
2)吸出原10cm培养皿中的培养基,用PBS洗2遍,以除去上层死细胞。加入3ml左右DispaseII于37度消化10-15分钟。其间不断轻轻拍打晃动培养皿。
3)待约50%以上的克隆从饲养层细胞上脱落后,加入约8-10ml恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基稀释以终止消化。
4)用移液枪轻轻将未脱落的克隆从饲养层细胞上吹落,一并转移至15ml离心管中,自然沉降或400rpm离心3分钟。
5)弃上清,加入约2-3ml恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基清洗,自然沉降或400rpm离心3分钟。
6)弃上清,加入约2-3ml恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基重悬,用移液枪轻轻吹打克隆,使之成为小块。
注:吹打动作要轻,否则可能会影响克隆存活。
7)将提前准备好的饲养层细胞用PBS洗一遍,换液为恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基。
8)将恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞克隆悬液按适当密度接于饲养层细胞上并摇匀,置于37度培养箱中进行培养。之后每天更换培养基至下次传代(5天后)或冻存。
实验结果见图6,恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞具备典型的原始外胚层样多潜能性。
(三)逆转录病毒假病毒的制备和感染
逆转录病毒假病毒的制备
主要使用的试剂:
2×HBS:称取16.4gNaCl,11.9gHEPES,0.21gNa2HPO4溶入800ml18Ω水,之后用5MNaOH调PH值至7.05~7.12,然后加18Ω水定容至1L。分装于-20度保存。
实验步骤:
1)提前一天将靶细胞(293T)按要求接于10cm培养皿中,细胞密度5-6×106/皿。
2)准备两个1.5ml离心管,其中一个加入0.5ml2×HBS。另一个加入0.5ml质粒混合液。混合液成分如下:
PMX逆转录病毒假病毒包装体系
3)将500μl质粒混合液逐滴加入HBS中,一边加入一边轻弹混匀,振荡若干下,在室温静置约3分钟,可见到白色浑浊。
4)观察事先准备好的293T细胞,待其长至约70%满时,将步骤3)中混合悬液小心地逐滴加入到培养皿中。轻轻晃动培养皿混匀。
5)在转染后12至18小时左右,对转染后的293T细胞进行换液。
6)在转染48小时之后,收集293T细胞的培养皿中含毒粒的上清,3000转离心10分钟去除细胞碎片,再用0.4um的滤器过滤。
7)使用孔径为100K的超滤管对原始上清溶液3000rpmx30min超滤浓缩至200ul。浓缩后的上清进行冻存或直接使用。
逆转录病毒假病毒的感染
主要使用的试剂:
polybrene1000x
实验步骤:
1)提前一天将靶细胞(恒河猴成纤维细胞)按比正常密度略低些的密度接于六孔板中,细胞密度3-4×104/孔。
2)将病毒上清液用成纤维细胞培养基混合后,加入polybrene,然后加入培养皿进行感染。
3)在感染后8-12小时更换新鲜培养基。
4)亦可选择进行离心感染,即把毒液加入靶细胞后,将培养皿于离心机中2000rpm离心30-40分钟。在感染后立即更换新鲜培养基。
恒河猴原始外胚层样可诱导多潜能干细胞的重编程
主要使用的试剂:
两因子体系诱导培养基:80%k-DMEM+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF,0.5mMVPA,3μMCHIR99021,1μM616452,5μMtranylcypromine。
恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基:80%D/F12+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF。
实验步骤:
1)将感染PMX-OCT4和PMX-KLF4两因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为两因子体系诱导培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
2)对于三因子体系,则将感染PMX-OCT4,PMX-SOX2和PMX-KLF4三因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
3)直到25-30天典型的扁平克隆出现,更换为恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基。约7-8天后挑克隆传代。
(四)恒河猴原始外胚层样可诱导多潜能干细胞的重编程
主要使用的试剂:
两因子体系诱导培养基:80%k-DMEM+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF,0.5mMVPA,3μMCHIR99021,1μM616452,5μMtranylcypromine。
恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基:80%D/F12+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF。
实验步骤:
1)将感染PMX-OCT4和PMX-KLF4两因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为两因子体系诱导培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
2)对于三因子体系,则将感染PMX-OCT4,PMX-SOX2和PMX-KLF4三因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
3)直到25-30天典型的扁平克隆出现,更换为恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞培养基。约7-8天后挑克隆传代。
实验结果见图2,图6和图7,建立的恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞具备典型的原始外胚层样多潜能性。
(五)恒河猴内细胞团样可诱导多潜能干细胞的重编程
主要使用的试剂:
两因子体系诱导培养基:80%K-DMEM+20%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),4ng/mlbFGF,0.5mMVPA,3μMCHIR99021,1μM616452,5μMtranylcypromine。
恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基:85%K-DMEM+15%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),N2培养基添加物,4ng/mlbFGF,10ng/mlhLif,3μMCHIR99021,0.5μMPD0325901,10μMSB203580,10μMSP600125。
实验步骤:
1)将感染PMX-OCT4和PMX-KLF4两因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为两因子体系诱导培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
2)对于三因子体系,则将感染PMX-OCT4,PMX-SOX2和PMX-KLF4三因子后的靶细胞(恒河猴成纤维细胞)进行换液,换液为恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。
3)直到25-30天典型的扁平克隆出现,更换为恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。约7-8天后出现隆起克隆。进行挑克隆传代。
亦可对恒河猴原始外胚层样多潜能干细胞系进行直接转化,方法为除去培养基后直接加入恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基。之后每隔一天更换一次新鲜培养基。约7-8天后出现隆起克隆。进行挑克隆传代。
实验结果见图2-图5,图7,建立的恒河猴内细胞团样多潜能干细胞具备典型的内细胞团样多潜能性。
(六)恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养和传代
主要使用的试剂:
恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基:85%K-DMEM+15%KSR,1%双抗(青/链霉素),0.1mMβ-巯基乙醇,1mM谷氨酰胺,1%非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids),N2培养基添加物,4ng/mlbFGF,10ng/mlhLif,3μMCHIR99021,0.5μMPD0325901,10μMSB203580,10μMSP600125。
0.25%胰酶
PBS缓冲液
实验步骤:
1)观察恒河猴内细胞团样多潜能干细胞克隆,待其长至对数期(3-5天)即可进行传代。
2)吸出原10cm培养皿中的培养基,用PBS洗2遍,以除去上层死细胞。加入1-2ml0.25%胰酶于37度消化2-5分钟。其间不断轻轻拍打晃动培养皿。
3)待恒河猴内细胞团样多潜能干细胞克隆开始散开且有约50%以上的克隆从饲养层细胞上脱落时,加入约2-3ml恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基终止消化。
4)用移液枪轻轻将未脱落的克隆从饲养层细胞上吹落,一并转移至15ml离心管中。
5)用移液枪轻轻吹打,使克隆成为单细胞。900rpm离心3分钟后弃上清,加入约2-3ml恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基清洗,900rpm离心3分钟。
6)将提前准备好的饲养层细胞用PBS洗一遍,换液为恒河猴内细胞团样多潜能干细胞培养基。
7)将恒河猴内细胞团样多潜能干细胞克隆悬液按适当密度接于饲养层细胞上并摇匀,置于37度培养箱中进行培养。之后每天更换培养基至下次传代(3-5天后)或冻存。
实验结果见图2-图5,图7,建立的恒河猴内细胞团样多潜能干细胞具备典型的内细胞团样多潜能性。
(七)常规鉴定方法
1.碱性磷酸酶活性染色鉴定
主要使用的试剂:
AlkalinePhosphataseDetectionKit
PBS缓冲液
实验步骤:
1)除去细胞培养基之后,用PBS洗3遍。
2)按Kit使用说明操作。(http://www.millipore.com/catalogue/item/SCR004#)
2.细胞免疫荧光鉴定
主要使用的试剂:
PBS缓冲液
4%多聚甲醛
封闭液:PBS缓冲液中加入0.2%TritonX100和终浓度为5%二抗血清
抗体稀释液:PBS缓冲液+0.1%的BSA
DAPI溶液:1μg/ml
实验步骤:
1)除去细胞培养基之后,用PBS洗3遍。
2)用4%多聚甲醛进行固定。(室温20分钟或4度过夜)
3)吸出多聚甲醛,用PBS缓冲液洗3遍,每遍5分钟。
4)加入封闭液封闭。(室温60分钟或4度过夜)
5)吸出封闭液,用PBS缓冲液洗3遍,每遍5分钟。
6)加入一抗(按1∶50-1∶200进行稀释)。(37度2小时或4度过夜)
7)吸出一抗,用抗体稀释液洗洗3遍,每遍5分钟。
8)加入二抗(按1∶50-1∶200进行稀释)。(于避光处37度2小时或4度过夜)
9)吸出二抗,用抗体稀释液洗3遍,每遍5分钟。
10)加入DAPI溶液染细胞核,于室温染1-5分钟。
11)吸出DAPI溶液,用抗体稀释液洗3遍,每遍5分钟。
12)加入抗体稀释液,荧光显微镜下观察或于4度避光保存。
3.细胞总RNA提取
主要使用的试剂:
Trizol试剂
异丙醇
氯仿
DEPC水
75%乙醇:DEPC水配制
无水乙醇
实验步骤:
1)除去细胞培养基之后,用PBS洗3遍。
2)加入与培养基等体积的Trizol试剂,室温放置10分钟。将细胞裂解液转移至1.5ml离心管中。
3)加入氯仿(体积为Trizol的1/4)剧烈震荡约15秒。室温放置2-3分钟。
4)于4度离心10分钟,离心力为12000g。
5)转移上清至新的1.5ml离心管中,加入等体积的异丙醇,室温放置10分钟。
6)于4度离心10分钟,离心力为12000g。
7)弃去上清,加入75%乙醇0.5ml洗1-2次
8)于4度离心5分钟,离心力为7500g。
9)弃去上清,将离心管倒置于吸水纸上晾干乙醇。
10)加入DEPC水10μl于37度溶解。
4.RNA反转录为cDNA
主要使用的试剂:
cDNA反转录试剂盒A3500(Promega)
实验步骤:
1)配置反应体系(20μl)
2)将此体系混合液在室温放置10分钟,然后放入PCR仪,42度孵育15分钟,95度5分钟。
3)反应终止后将得到的cDNA溶液测定浓度后置于-20度保存。
5.细胞基因组DNA提取
主要使用的试剂:
细胞裂解液:100ml体系含蛋白酶K100μg/ml,0.2%SDS,20mMEDTA,10mMTris,0.1MNaCl
实验步骤:
1)将细胞用胰酶消化后重悬于预冷PBS中。
2)于4度离心10分钟收集细胞。离心力为1500rpm
3)加入细胞裂解液400μl,50度震荡1小时
4)待体系冷却到室温后,加入1/10体积饱和NaCl,反复颠倒混匀约10分钟。
5)将离心管置于冰上冷却约20-30分钟。
6)于4度离心15分钟。离心力为4000g
7)将上清转移至新的1.5ml离心管中,加入等体积预冷的无水乙醇,混匀。
8)将离心管置于冰上冷却约20分钟。
9)于4度离心15分钟。离心力为13000rpm
10)吸出上清,于室温通风干燥基因组DNA沉淀。
11)加入30-50ul无菌水进行过夜溶解。
6.多聚酶链式反应(PCR)分析
主要使用的试剂:
2×EasyTaqPCRSupermix(全式金)
实验步骤:
1)配置反应体系(200μl)
2)设定反应条件
3)PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验
7.实时定量多聚酶链式反应(RT-PCR分析)
主要使用的试剂:
细胞裂解液:100ml体系含蛋白酶K100μg/ml,0.2%SDS,20mMEDTA,10mMTris,0.1MNaCl
实验步骤:
PCR在ABIPrism7300SequenceDetectionSystem上用PowerGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)体系完成.数据分析采用delta-deltaCt法。
8.畸胎瘤实验
实验步骤:
1)将欲进行畸胎瘤注射的靶细胞重悬于D/F12培养基中,按一块6cm培养皿的细胞对应一个位点注射入NOD/SCID免疫缺陷小鼠腹腔或皮下。
2)待移植部位出现明显畸胎瘤生成后将小鼠断颈处死。用解剖键和解剖镊分离取出畸胎瘤。
3)将畸胎瘤置于4%多聚甲醛中进行固定,石蜡包埋切片染色观察。
9.恒河猴内细胞团样可诱导多潜能干细胞在小鼠8细胞期胚胎嵌合实验
实验步骤:
7-10个内细胞团样可诱导多潜能干细胞显微注射到小鼠8细胞胚胎中(交配后2.5天(2.5dpc)雌鼠中分离得到)或者10-15个内细胞团样可诱导多潜能干细胞显微注射到小鼠囊胚中(3.5dpc雌鼠中分离得到),培养一天后,囊胚或8细胞胚胎分别移植到2.5dpc或0.5dpcCD-1假孕雌鼠体内(每个输卵管或子宫角内6-8个胚胎)其继续发育,在发育特定阶段进行剖检。
10.小鼠全胚免疫荧光鉴定
主要使用的试剂:
PBS缓冲液
4%多聚甲醛
封闭液:PBS缓冲液中加入0.2%TritonX100和终浓度为10%二抗血清
抗体稀释液:PBS缓冲液+10%二抗血清+5%DMSO
DAPI溶液:1μg/ml
Anti-NucleiAntibody,clone235-1:1:200
实验步骤:
1)取出E8.5d-E10.5d小鼠胚胎置于4度预冷PBS中尽量去除不必要的组织。
2)将胚胎置于4%多聚甲醛进行固定。(4度下2-3天)中途经常晃动混匀
3)胚胎完全固定好后会沉在试管底部,此时除去多聚甲醛,用含0.2%TritonX100的PBS洗3遍,每遍30分钟。
4)加入封闭液封闭。(4度下1-2天)
5)除去旧的封闭液,用新的封闭液洗2遍,每遍30分钟。
6)加入一抗(按1∶50-1∶200进行稀释)。(4度下2-3天)
7)吸出一抗,用封闭液洗3遍,每遍30分钟。
8)加入二抗(按1∶50-1∶200进行稀释)。(于避光处4度下2-3天)
9)吸出二抗,用封闭液洗3遍,每遍30分钟。
10)加入DAPI溶液染细胞核,于避光处4度下1天。
11)吸出DAPI溶液,用封闭液洗3遍,每遍30分钟。
加入抗体稀释液,共聚焦荧光显微镜下观察或于4度避光保存。
表1所用试剂仪器列表
表2所用全部引物列表
表3恒河猴胚胎内细胞团样干细胞系统计
Claims (10)
1.制备动物和人类原始多潜能干细胞的方法,所述方法包括使动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞与至少一种MAPK通路抑制因子,至少一种WNT信号通路调控因子,至少一种LIF/STAT3通路调控因子和至少一种FGF通路调控因子接触,由此产生动物和人类原始多潜能干细胞。
2.权利要求1所述的方法,其中还包括使动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞与至少一种TGF家族通路调控因子,至少一种ROCK信号通路调控因子和/或至少一种PKC信号通路调控因子接触。
3.权利要求1或2所述的方法,其中所述MAPK通路抑制因子抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的任意一条或多条通路。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述MAPK通路抑制因子为MAPK抑制剂,包括AEG3482,BI78D3,CEP1347,c-JUNpeptide,IQ3,JIP-1(153-163),SP600125,SU3327,TCSJNK5a,TCSJNK6o,AMG548,CMPD-1,EO1428,JX401,ML3403,RWJ67657,SB202190,SB203580,SB203580hydrochloride,SB239063,SCIO469hydrochloride,SKF86002dihydrochloride,SX011,TAK715,VX702,VX745,Arctigenin,10Z-Hymenialdisine,PD0325901,PD184352,PD198306,PD334581,PD98059,SL327,U0124和U0126中的任意一种或多种;例如所述MAPK通路抑制因子可以为抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的任一条的抑制因子;或者可以为分别抑制MAPK下游ERK,P38和JNK通路中的两条或三条不同通路的抑制因子,例如PD0325901(抑制ERK通路),SB203580(抑制p38通路),SP600125(抑制JNK通路)中的两种或三种抑制剂;其中所述WNT信号通路调控因子可以是GSK3抑制剂,包括CHIR99021,CHIR98014,SB216763,TWS119,SB415286,LY2090314,Tideglusib,TDZD-8,CBM1078,TD114-2,3F8,AR-A014418,FRATide,Indirubin-3′-oxime,L803,Kenpaullone,BIO;所述LIF/STAT3通路调控因子可以为LIF/STAT3通路激活剂如LIF;所述FGF通路调控因子可以为FGF通路激活剂如成纤维细胞生长因子(FGF)包括bFGF。
5.权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞为已建成的动物和人类原始外胚层样多潜能干细胞,例如直接从早期胚胎建立的原始外胚层样多潜能干细胞,或者重编程而来的原始外胚层样多潜能干细胞,例如通过外源基因介导的重编程或由化学小分子不依赖外源基因的方法介导的重编程从分化的细胞(成体细胞)获得的外胚层样多潜能干细胞,例如通过在动物和人类成体细胞中表达重编程因子OCT4和KLF4,然后与至少一种HDAC抑制剂,至少一种GSK3抑制剂、至少一种TGF-beta受体抑制剂和至少一种组蛋白去甲基化酶抑制剂接触,诱导形成的原始外胚层样多潜能干细胞。
6.权利要求1-5任一项所述的方法,其中所述原始多潜能干细胞包括内细胞团样多潜能干细胞,特别的,其中所述动物包括哺乳动物,鸟类如鸡,鸭,丹顶鹤,鱼类如中华鲟等,特别的,所述动物包括灵长类如恒河猴,金丝猴,啮齿类如小鼠和大鼠,家畜如猪,羊,马,和牛,所述动物还包括大熊猫等。
7.用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的组合物、培养基或试剂盒,其包括权利要求1-6任一项中定义的因子的组合。
8.通过权利要求1-6中任一项所述的方法或权利要求7所述的组合物、培养基或试剂盒制备的动物和人类原始多潜能干细胞。
9.权利要求8所述的动物和人类原始多潜能干细胞的用途,例如所述原始多潜能干细胞可用于制备不同动物和人类物种的嵌合体,包括制备组织器官人源化的动物,优选的,这样的人源化动物可用于疾病模型的建立、药物测试和器官移植等用途。所述原始多潜能干细胞还可以经体外培养诱导分化可制备功能细胞或有功能的组织、器官,进而用于疾病模型、药物测试开发或细胞(器官)移植。
10.权利要求1-6任一项中定义的因子的组合在用于制备动物和人类原始多潜能干细胞的用途。
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