JP2023011931A - 多能性細胞に関連する方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】効率、収率および／または品質が改善された多能性細胞の生成方法を提供する。【解決手段】本発明は、細胞からの多能性細胞の作製または生成に関する。本発明は、ストレスが、細胞に外来遺伝子も、転写産物も、タンパク質も、核成分も、細胞質も導入することを必要とせず、また細胞融合も必要とせずに細胞からの多能性幹細胞の産生を誘導し得るという本発明者らの発見に基づくものである。いくつかの実施形態では、ストレスが細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの量の減少を誘導し、脱分化過程を惹起して多能性細胞を生じさせる。【選択図】図５Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１４年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／９５５，３６２号、２０１４年３月１９日に出願された同第６１／９５５，３５８号および２０１４年８月２８日に出願された同第６２／０４３，０４２号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される技術は多能性細胞の作製に関するものである。
多能性細胞を得るために現在用いられている方法は主として、入手可能性が限られている組織（例えば、胚組織または臍帯血）または外来核酸を導入するリプログラミング因子の添加に依存するものである（Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ ２００８ １３３，２５０－２６４；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄ．ら，Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ２００８
３，３４６－３５３；Ｋｉｍ，Ｄ．ら，Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ２００９ ４，４７２－４７６；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ２００９ ４６１，６４９－６４３；Ｏｋａｂｅ，Ｍ．ら．Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１４，１７６４－１７６７）。外来リプログラミング因子の添加による合併症を起こさない幹細胞、特に自家幹細胞を容易に作製する方法があれば、細胞分化の研究および幹細胞ベースの治療法の開発が加速されるものと思われる。熱傷、化学傷害、外傷および放射線照射などの刺激への曝露により細胞が損傷を受けると、正常な体細胞が変化して癌細胞になる可能性があるという仮説が提唱されているが、リプログラミング因子を特異的に操作しなくても健常成体の体細胞が他の状態に変換され得ることを直接示す証拠はない。
これまでに、研究者は成体組織に「成体幹細胞」を発見したことを報告している（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｂ．Ａ．およびＷｅｉｓｓ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２ ２５５，１７０７－１７１０；Ｍｅｇｅｎｅｙ，Ｌ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９６ １０，１１７３－１１８３；Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１ ９，６４１－６５０；Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｍ．およびＳｕｎ，Ｔ．Ｔ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １９８３ ８１，１２１ｓ－１２７ｓ）。このような報告には未だ議論の余地がある。例えば、幹細胞マーカーであるＯｃｔ４を発現する細胞を探求している研究者で、ホメオスタシスが正常な成体骨髄にＯｃｔ４発現細胞を発見するには至っていない研究者がいる（Ｌｅｎｇｎｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ
Ｃｙｃｌｅ ２００８ ７，７２５－７２８；Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．およびＧｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．Ｃｅｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ２００７ １，３５９－３６０）一方、様々な成体組織からＯｃｔ４発現細胞を単離することが可能であることを報告している研究者もいる（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ２０１０ ４１８，４１－４９；Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ｇ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４ １１７，２９７１－２９８１；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ ２００５ １２２，３０３－３１５；Ｋｕｃｉａ，Ｍ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００６ ２０，８５７－８６９；Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．ら，ＰＮＡＳ ２０１１ １０７，８６３９－８６４３；Ｏｂｏｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２０１１ Ｐａｒｔ Ａ
１７，６０７－６１５；Ｒａｈｎｅｍａｉ－Ａｚａｒ，Ａ．ら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ １３，１７９－１９２；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１０ ８９，６７７－６８５；Ｚｕｂａ－Ｓｕｒｍａ，Ｅ．Ｋ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１１ １５，１３１９－１３２８；Ｐａｃｚｋｏｗｓｋａ，Ｅ．ら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１１ １６，５９－７１）。これらの細胞は、成体幹細胞の集団であるか、単に用いる技術による人為的影響であるかのいずれかであると仮定されてきた。いずれの場合も、このような細胞はまれであり、研究および治療を目的とする多能性細胞の十分な供給源にはならない。
本明細書には、国際公開第２０１３／１６３２９６号およびＯｂｏｋａｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ２０１４ ５０５：６４１－６４７（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている方法よりも効率、収率および／または品質が向上するよう改善された、多能性細胞、例えばＳＴＡＰ細胞の生成方法が記載される。本明細書にはこのほか、本発明の方法により生成した細胞に関連する方法および使用が記載される。
図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ａはストレス処理胞のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を示す。ストレス処理細胞がＯｃｔ４－ＧＦＰを発現するのに対し、未処理対照は発現しなかった。ストレス処理群の右上にはＯｃｔ４発現コロニーの拡大画像が示されている。スケールバーは１００μｍを表す。 図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｂはストレス処理細胞および未ストレス処理対照の集団解析を示す。ストレス処理群にのみ第５日にＧＦＰ発現細胞集団が観察される。 図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｃは、ストレス処理前およびストレス処理後第７日のＣＤ４５陽性細胞の細胞サイズ解析を示す。 図１Ａ～図１Ｄは、ＣＤ４５陽性体細胞からのＯｃｔ４発現細胞生成を示す図である。図１Ｄは、ストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。 図２Ａ～図２Ｂは、動物カルス細胞（ＡＣＣ）の特徴付けを示す図である。図２Ａは多能性マーカー遺伝子の経時的な発現の変化を示す。メッセンジャーＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図２Ａ～図２Ｂは、動物カルス細胞（ＡＣＣ）の特徴付けを示す図である。図２ＢはＯｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーター遺伝子のメチル化解析を示す。 図３Ａ～図３Ｄは、ストレス処理後の細胞改変を示す図である。図３Ａは、ＡＣＣ生成段階におけるストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３Ｂは総細胞内ＡＴＰ測定値を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３ＣはＲＯＳ測定値を示す。エラーバーはＳＤを表す。図３ＤはｍｔＤＮＡ複製因子の相対遺伝子発現量を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図３Ａ～図３Ｄは、ストレス処理後の細胞改変を示す図である。図３Ａは、ＡＣＣ生成段階におけるストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３Ｂは総細胞内ＡＴＰ測定値を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図３ＣはＲＯＳ測定値を示す。エラーバーはＳＤを表す。図３ＤはｍｔＤＮＡ複製因子の相対遺伝子発現量を示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図４Ａ～図４Ｂは、ＡＣＣからのキメラマウス形成を示す図である。図４Ａはキメラマウス形成のスキームを示す。パネル（ｉ）は、トリプシンによりＡＣを単一細胞に分離した後または（パネルｉｉ）ＡＣを小片に切り分けた後に胚盤胞に注入したことを示す。 図４Ａ～図４Ｂは、ＡＣＣからのキメラマウス形成を示す図である。図４Ｂはキメラ寄与解析を示す。９個体の仔の組織をＦＡＣＳにより解析した。 図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５Ａは、ＣＤ４５陽性細胞を様々なストレスに曝露し、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析したことを示す。ストレス処理後の生存細胞に含まれるＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の百分率（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５ＢはｐＨ条件の決定を示す。ＣＤ４５陽性細胞を様々なｐＨの溶液に曝露した。ストレス処理から３日後、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。 図５Ａ～図５Ｃは、ＡＣＣ生成条件を用いた実験を示す図である。図５Ｃは培養条件の決定を示す。ストレス処理細胞を様々な培地で培養した。第１４日、ＧＦＰ発現ＡＣの数をカウントした（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図６Ａ～図６Ｂは、ＩＣＲマウス由来のＣＤ４５陽性細胞からのＡＣＣ生成を示す図である。図６Ａはストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。ＦＡＣＳによりＥ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ－１の発現を解析した。図６Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲによりＥ－カドヘリン／ＳＳＥＡ１二重陽性細胞のＯｃｔ４遺伝子発現を確認したことを示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図７Ａ～図７Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＡＣＣ生成を示す図である。図７Ａはストレス処理後のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の割合を示す。様々な組織から体細胞を単離し、様々なストレスに曝露した。ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。 図７Ａ～図７Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＡＣＣ生成を示す図である。図７Ｂは、様々な組織に由来するＡＣＣの胚性遺伝子発現を示す。遺伝子発現をＧＡＰＤＨにより正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 最初の７日間のストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量を示す図である。ストレス処理後、第１日、第３日および第７日に細胞を収集し、遺伝子発現を天然のＣＤ４５陽性細胞と比較した。青のグラフは熱ショックタンパク質の遺伝子発現を表す。緑のグラフはＤＮＡ修復遺伝子の発現を表す。赤のグラフは酸化還元遺伝子の発現を表す。Ｙ軸は発現量の相対倍数を表す。 ＡＣＣの分化を示す図である。グラフはキメラ寄与解析を示す。様々な体細胞に由来するＡＣＣを用いて形成されたキメラ胚をＦＡＣＳにより解析した。グラフはＥ１３．５～Ｅ１５．５のキメラ胚５例の平均を示す。 ストレス処理が間葉－上皮転換（ＭＥＴ）を介して体細胞のリプログラミングを引き起こしたことを示す図である。天然の細胞ならびにストレス処理開始後３日目および７日目の細胞にＭＥＴ関連遺伝子の発現がみられる。ｙ軸は、その遺伝子の発現レベルを用いて試料中のレベルに対して正規化した％発現を示す。 ストレス前およびストレス後の細胞集団のＦＡＣＳ解析を示す図である。ＧＦＰ発現は明らかであり、各被験組織型由来のストレス後細胞集団に多能性細胞が生成されたことを示している。 図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－；下段：未処理ＣＤ４５＋細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５＋細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５＋細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。 図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－；下段：未処理ＣＤ４５＋細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５＋細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５＋細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。 図１２Ａ～図１２Ｅは、低ｐＨ処理が運命拘束された体細胞に運命転換を誘導したことを示す図である。図１２Ａは実験プロトコルの模式図を示す。図１２Ｂはフローサイトメトリー解析（上段：ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－；下段：未処理ＣＤ４５＋細胞）を示す。ｙ軸はＯｃｔ３／４：ＧＦＰ細胞の数であり、Ｘ軸はＣＤ４５＋細胞の数である。両軸とも主要単位である０、１００、１０００および１０，０００が記されている。図１２Ｃは、培養中の経時的なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋生存細胞数およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－生存細胞数のグラフを示す。図１２Ｄは、Ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞（左側のピーク）およびＣＤ４５＋細胞（右側のピーク）の細胞の大きさのグラフを示す。図１２Ｅは、単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成をゲノムＰＣＲにより解析した結果を示す。 図１３Ａ～図１３Ｂは、低ｐＨ誘導Ｏｃｔ３／４＋細胞が多能性を有することを示す図である。図１３Ａは、ｄ７の低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞のｑＰＣＲの遺伝子発現解析をＣＤ４５＋細胞と比較したグラフを示す（各組とも左から右に向かってｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ２、ｅｃａｔ１、ｅｓｇ１、ｄａｘ１およびｋｌｆ４の発現を表す）。第３日および第７日に試料を収集し、ＣＤ４５陽性細胞と比較した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。図１３Ｂは、バイサルファイトシーケンシングの結果がｏｃｔ３／４プロモーターおよびｎａｎｏｇプロモーター領域のものであることを示す。ＣＤ４５＋細胞は、追加の培養の有無に関係なく、両プロモーターに密にメチル化されたパターンを示した。 図１４Ａ～図１４Ｂは、他の組織供給源からもＳＴＡＰ細胞が得られることを示す図である。図１４Ａは、多数の組織（各組とも左から右に向かってＣＤ４５＋細胞、骨髄、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞、肝臓および軟骨細胞を表す）の培養ｄ７のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞生成の割合を示す。図１４Ｂは、ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞クラスターの遺伝子発現解析のグラフを示す（各組とも左から右に向かってＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＲｅｘ１の発現を表す）。 図１５Ａ～図１５Ｂは、ＳＴＡＰ細胞の多能性細胞としての特徴付けを示す図である。図１５ＡはＳＴＡＰ細胞におけるＥＳ細胞マーカーの遺伝子発現のグラフを示す（各組とも左から右に向かってＥＳ、ＥｐｉＳＣ、ＳＴＡＰおよびＣＤ４５を表す）。図１５ＢはＳＴＡＰ細胞におけるＸ染色体不活化の％のグラフを示す。 様々なストレスに曝露したＣＤ４５陽性細胞についてＦＡＣＳにより分析したＯｃｔ４－ＧＦＰ発現のグラフを示す図である。ストレス処理後の生存細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の百分率（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 ｐＨ条件決定のグラフを示す図である。ＣＤ４５陽性細胞を様々なｐＨの溶液に曝露した。ストレス処理から３日後、ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 培養条件決定のグラフを示す図である。ストレス処理細胞を様々な培地で培養した。第１４日、ＧＦＰを発現するストレス変化細胞塊の数をカウントした（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図１７Ａ～図１７Ｂは、ＩＣＲマウス由来のＣＤ４５陽性細胞からのＳＡＣ生成を示す図である。図１７Ａはストレス処理後のＣＤ４５陽性細胞の経時的変化を示す。ＦＡＣＳによりＥ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ－１の発現を解析した。図１７Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲによって確認したＥ－カドヘリン／ＳＳＥＡ１二重陽性細胞のＯｃｔ４遺伝子発現のグラフを示す（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。 図１８Ａ～図１８Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＳＡＣ生成を示す図である。図１８Ａはストレス処理後のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現細胞の割合のグラフを示す。様々な組織から体細胞を単離し、様々なストレスに曝露した。ＦＡＣＳによりＯｃｔ４－ＧＦＰ発現を解析した。各組とも左から右に向かってＢＭ、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞および肝臓を表す。 図１８Ａ～図１８Ｂは、ＧＯＦマウス由来の様々な組織からのＳＡＣ生成を示す図である。図１８Ｂは、様々な組織に由来するＳＡＣの胚性遺伝子発現のグラフを示す。ＧＡＰＤＨにより遺伝子発現を正規化した（ｎ＝３、平均＋Ｓ．Ｄ．）。各組とも左から右に向かってＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＥｃａｔ１を表す。 最初の７日間のストレス防御遺伝子の相対遺伝子発現量のグラフを示す図である。ストレス処理後、第１日、第３日および第７日に細胞を収集し、遺伝子発現を天然のＣＤ４５陽性細胞と比較した。Ｙ軸は発現量の相対倍数を表す。 ＳＡＣおよびＣＤ４５＋細胞由来のＳＡＣから誘導されたキメラマウスのＴＣＲβ鎖再編成解析を示す図である。２Ｎキメラマウス＃１、＃２、＃３、＃５、＃６、＃７、＃８および＃９に再編成ＤＮＡの発現がみられた。 ４Ｎキメラマウスのジェノタイピング解析を示す図である。ジェノタイピングを実施したところ、１２９／Ｓｖ×Ｂ６ＧＦＰ Ｆ１由来のＳＡＣを用いて形成した４ＮキメラマウスおよびＩＣＲ由来の４Ｎ胚盤胞がＳＡＣ（１２９／Ｓｖ×Ｂ６ＧＦＰ）特異的遺伝子を発現することが明らかになった。 ＳＴＡＰ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで胚組織および胎盤組織に寄与することを示す図である。グラフは、注入した細胞が胚部分にのみ寄与した胎児ならびに胚部分に加えて胎盤および卵黄嚢組織にも寄与した胎児の割合を示す。 図２３Ａ～図２３Ｃは、ＦＧＦ４処理がＳＴＡＰ細胞に一部のトロホブラスト系列の特徴を誘導することを示す図である。図２３Ａは、ＳＴＡＰ細胞からＴＳ様（Ｆ４Ｉ）細胞を誘導するためのＦＧＦ４処理の模式図を示す。図２３Ｂはマーカー発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。図２３ＣはＦＡＣＳ解析による胎盤寄与の定量化のグラフを示す。Ｆ４Ｉ細胞とは異なり、ＥＳ細胞は検出可能なレベルで胎盤組織に寄与することはなかった。 図２４Ａ～図２４Ｄは、ＳＴＡＰ細胞からＥＳ細胞様幹細胞が誘導され得ることを示す図である。図２４ＡはＳＴＡＰ細胞からの幹細胞誘導の模式図を示す。図２４Ｂは、ＳＴＡＰ－Ｓ細胞が１２０日間にわたる維持培養で安定して増殖したことを示す。同様の結果が１６種類の独立した系統で得られた。これに対し、親ＳＴＡＰ細胞では急激に数が減少した。図２４Ｃはマーカー遺伝子発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。ＥＳ細胞およびＳＴＡＰ－Ｓ細胞は、ＣＤ４５＋細胞には発現しなかった多能性関連遺伝子を発現した。図２４Ｄは、バイサルフェートシーケンシングによるＤＮＡメチル化試験の略図を示す。 図２４Ａ～図２４Ｄは、ＳＴＡＰ細胞からＥＳ細胞様幹細胞が誘導され得ることを示す図である。図２４ＡはＳＴＡＰ細胞からの幹細胞誘導の模式図を示す。図２４Ｂは、ＳＴＡＰ－Ｓ細胞が１２０日間にわたる維持培養で安定して増殖したことを示す。同様の結果が１６種類の独立した系統で得られた。これに対し、親ＳＴＡＰ細胞では急激に数が減少した。図２４Ｃはマーカー遺伝子発現のｑＰＣＲ解析のグラフを示す。ＥＳ細胞およびＳＴＡＰ－Ｓ細胞は、ＣＤ４５＋細胞には発現しなかった多能性関連遺伝子を発現した。図２４Ｄは、バイサルフェートシーケンシングによるＤＮＡメチル化試験の略図を示す。 図２５Ａ～図２５Ｂは、ＳＴＡＰ幹細胞が多能性であり、生殖系列伝達および四倍体補完法に適合性があることを示す図である。図２５Ａは、胚盤胞注入アッセイ（２Ｎ）におけるキメラマウスの様々な組織へのＳＴＡＰＳ細胞の寄与率のグラフを示す。図２５Ｂは胎盤組織への寄与率のグラフを示す。親ＳＴＡＰ細胞およびＴＳ細胞とは異なり、ＳＴＡＰＳ細胞は胎盤寄与の能力をもはや保持していなかった。３種類の独立した系統を試験し、いずれも胚部分への実質的な寄与を示した。 酸洗浄により誘導された多能性を示す図である。 上：髄腔内ＳＳＰ－ＳＡＰで処置したラットではカプサイシン注射後の肢引っ込め閾値の低下によって示される機械的痛覚過敏が減少することを示す図である。差が最も大きくなるカプサイシン注射１０分後の反応をのちのグラフに示す。下：脊髄幹細胞を埋植してから５週間後、カプサイシン誘導性痛覚過敏が回復することを示す図である。 最初に、痛覚過敏状態を大幅に減少させるＳＳＰ－ＳＡＰをｉ．ｔ．注射したラットの足にカプサイシンを注射し（図２７を参照されたい）、次いで、幹細胞の腰髄ｉ．ｔ．注射により処置した後の触覚反応（上）および熱反応（下）を示す図である。「元の反応」は何らかの処置を実施する前のカプサイシンに対する痛覚過敏反応を示す。「ＢＬ１」は、２週間前にＳＳＰ－ＳＡＰまたは不活性なＢｌａｎｋ－ＳＡＰのいずれかで処置したラットにカプサイシン注射を実施する前のベースラインの反応を示す。「ＢＬ２」は、カプサイシン注射を実施せずに幹細胞を送達してから１～２日後のベースラインの反応を示す。幹細胞埋植物によりＳＳＰ－ＳＡＰ処置ラットの痛覚過敏反応を未処置ラットおよびＢｌａｎｋ－ＳＡＰ処置対照のものに戻すことが可能であることに注目されたい。 幹細胞埋植物によってカプサイシン感受性が回復したラットでは、ＮＫ１－Ｒの特異的アンタゴニストの効力が増大することを示す図である。未処置ラット（○、□；左パネル；およびＢｌａｎｋ－ＳＡＰを投与した後、幹細胞を送達したラット、不掲載）では、両型の痛覚過敏ともＬ－７３３，０６０のＩＣ５０が約０．３ｍＭ（３０μＬのｉ．ｔ．注射）であるのに対し、幹細胞回復ラット（右パネル）では、触覚痛覚過敏（■）のＩＣ５０が約３０μＭ、熱痛覚過敏（●）のＩＣ５０が約５μＭである。
（詳細な説明）
本明細書に記載される技術の諸態様は、細胞からの多能性細胞の作製または生成に関する。本明細書に記載される技術の諸態様は、ストレスが、細胞に外来遺伝子も、転写産物も、タンパク質も、核成分も、細胞質も導入することを必要とせず、また細胞融合も必要とせずに細胞からの多能性幹細胞の産生を誘導し得るという本発明者らの発見に基づくものである。いくつかの実施形態では、ストレスが細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの量の減少を誘導し、脱分化過程を惹起して多能性細胞を生じさせる。いくつかの実施形態では、ストレスが、例えばストレスに曝露した細胞の少なくとも１０％に細胞膜の破壊を引き起こす。これらの多能性細胞は、三胚葉のそれぞれに分化する能力（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ）、ｉｎ ｖｉｖｏでの奇形腫様細胞塊の生成ならびに生きた胚および／またはキメラマウスを生成する能力のうちの１つまたは複数を特徴とする。
本明細書には、特に限定されないが細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの量を減少させるストレスを含めた特定の環境ストレスで細胞を処理すると、ミトコンドリアの活性が低下し、脱分化に関連するゲノム領域が脱メチル化され、細胞が既知の脱分化経路のマーカーを示し得ることを示す実験が記載される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞から多能性細胞を生成する方法が本明細書に提供され、この方法は、細胞から細胞質および／またはミトコンドリアの少なくとも約４０％を除去することと、多能性細胞または多能性マーカーを示す細胞を選択することとを含み、細胞が組織中に存在しない。本明細書にはこのほか、細胞から多能性細胞を生成させ得るその他のストレス処理が記載される。
便宜上、本願の明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に使用する特定の用語をここにまとめる。別途記載されるか、文脈から読み取れない限り、以下の用語および語句は以下に記載する意味を包含する。別途明記されるか、文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、それと関係のある技術分野で付与されている意味を排除するものではない。定義は、特定の実施形態の説明に役立つよう記載されるものであり、また本発明の範囲は請求項によってのみ限定されることから、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される「含む」という用語は、組成物、方法およびその方法または組成物に必須の各構成要素（１つまたは複数）を指すのに使用されるが、必須であるかどうかに関係なく、明記されていない要素を包含する可能性もある。
本明細書で使用される「～から実質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基礎となる新規なまたは機能的な特徴（１つまたは複数）に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を認めるものである。
「～からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法およびその各構成要素を指し、実施形態の記載で言及されない要素は一切排除するものである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」と言う場合、本明細書に記載され、かつ／または当業者が本開示などを読んで明らかになる種類の１つまたは複数の方法および／または段階が包含される。「または（あるいは、もしくは）」という単語も同様に、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、「および（ならびに）」を包含するものとする。以下に適切な方法および材料を記載するが、本開示を実践または検証するにあたり、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を用いてもよい。「ｅ．ｇ．」という略語は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ（例えば）」に由来するものであり、本明細書では非限定的な例を示すのに使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ（例えば）」という用語と同義である。
細胞生物学および分子生物学でよく用いられる用語の定義については、２００６年にＭｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが刊行した「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」、第１９版（ＩＳＢＮ ０－９１１９１０－１９－０）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒら（編）；および１９９４年にＢｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ社が刊行したＴｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）にみることができる。分子生物学でよく用いられる用語の定義はほかにも、２００９年にＪｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社が刊行したＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｘ（ＩＳＢＮ－１０：０７６３７６６３２１）；１９９５年にＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社が刊行した、Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）およびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９にみることができる。
特に明記されない限り、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２００１ ）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）およびＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂｙ Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；第５版（２００５），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤａｖｉｄ Ｂａｒｎｅｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第１版，１９９８）（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている標準的方法を用いて実施したものである。
「減少（低下）（ｄｅｃｒｅａｓｅ、ｒｅｄｕｃｅ、ｒｅｄｕｃｅｄおよびｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語はいずれも、本明細書では概して、参照に比して統計的に有意な量だけ減少することを意味するよう使用される。しかし、不明確になるのを避けるため、「減少（ｒｅｄｕｃｅ、ｒｅｄｕｃｔｉｏｎまたはｄｅｃｒｅａｓｅ）」は通常、所与の処理を実施しない場合に比して少なくとも１０％減少することを意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の減少のほか、最大で例えば、所与の処理を実施しない場合に比して所与の実体もしくはパラメータが全く存在しない場合または所与の処理を実施しない場合に比して１０～９９％の任意の減少を包含し得る。
「増大（向上、増加、増強）（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ、ｉｎｃｒｅａｓｅまたはｅｎｈａｎｃｅ）」という用語はいずれも、本明細書では概して、静的に有意な量だけ増大することを意味し、不明確になるのを避けるため、用語「増大（向上、増加、増強）（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ、ｉｎｃｒｅａｓｅまたはｅｎｈａｎｃｅ）」は、参照レベルに比して少なくとも１０％の増大、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の増大または最大で１００％を含めた増大あるいは参照レベルに比して１０～１００％の任意の増大あるいは少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍の増大あるいは参照レベルに比して２～１０倍またはそれ以上の任意の増大を意味する。
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「改善」という用語は、疾患、障害または医学的状態に関連して使用される場合、ある状態の治療的処置を指し、その目的は、症状または状態の進行または重症度を逆行させる、緩和する、改善する、抑制する、遅らせる、または停止させることである。用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ある状態の少なくとも１つの有害作用または症状を軽減または緩和することを包含する。治療は一般に、１つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少すれば「有効である」とする。あるいは、治療は、ある状態の進行が低下または停止すれば「有効である」とする。つまり、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療を実施しない場合に予想される症状の進行または悪化を停止させるか、少なくとも遅らせることも包含する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、１つまたは複数の症状の緩和、障害の程度の軽減、健康状態の安定（すなわち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延または速度低下および症状の改善または寛解が挙げられる。治療はほかにも、死亡率が統計学的に予測される場合に対象がそれを生き延びることを含み得る。
本明細書で使用される「投与」という用語は、細胞の少なくとも一部を所望の部位に局在させる方法または経路により、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはそのような多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を対象の体内に入れることを指す。本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはそのような多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を含む医薬組成物は、対象に有効な治療をもたらす任意のしかるべき経路によって投与され得る。
本明細書で使用される「対象」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物とは、霊長類、げっ歯類、飼育動物または狩猟動物などの脊椎動物のことである。霊長類としては、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ類、例えば飼育用ネコ、イヌ類、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウおよび魚、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。患者または対象には、上記の動物の任意の組、例えば、上記の動物すべてが含まれる。ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、所与の細胞もしくは組織の欠損、機能不全および／または衰弱あるいは幹細胞区画の欠損、機能不全または衰弱による疾患の動物モデルとなる対象として有利に用いられ得る。さらに、本明細書に記載される方法を家畜および／またはペットの治療に用いることができる。対象は雄であっても雌であってもよい。対象は、細胞型、組織または幹細胞区画の欠損、機能不全および／または衰弱あるいはそのような状態を原因とする１つまたは複数の疾患または状態に罹患しているか、これを有すると予め診断されているか、確認されており、任意選択であって必須ではないが、既にそのような状態の治療を受けている対象であり得る。対象はこのほか、細胞型もしくは組織または幹細胞区画の欠損、機能不全および／または衰弱を含めた状態に罹患していると診断されているか、確認されているが、そのような状態の１つまたは複数の治療を受けた結果、既知の危険因子の改善がみられる対象であり得る。あるいは、対象は、これまでに上記のような状態を有すると診断されたことがない対象であってもよい。例えば、対象は、そのような状態の１つまたは複数の危険因子を示す対象であっても、そのような状態の危険因子を示さない対象であってもよい。
本明細書で使用される「選択する」という用語は、細胞または細胞集団に関して使用される場合、所望の特徴を有する１つまたは複数の細胞を選ぶこと、分離すること、隔離することおよび／または選択的に増殖させることを指す。本明細書で使用される「選択する」という用語は、所望の特徴を有さない細胞が与えられた条件下で繁殖することができないことを必ずしも意味するものではない。
本明細書で使用される「維持する」は、細胞または細胞集団の生存能を持続させることを指す。維持された集団には、代謝的に活性な細胞が多数存在する。このような細胞の数は、少なくとも１日間は概ね安定であり得るか、増加し得る。
本明細書で使用される「検出可能なレベル」は、試料の物質または活性のレベルであって、参照レベル、例えばストレスに曝露していない細胞の物質または活性のレベルと区別できる量を可能にするレベルを指す。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルは、参照レベルよりも少なくとも１０％高いレベル、例えば１０％、２０％、５０％、１００％、２００％もしくは３００％またはそれ以上高いレベルであり得る。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般に参照、例えばマーカー、例えば幹細胞マーカーまたは分化マーカーの濃度または量の上下２標準偏差（２ＳＤ）の差を意味する。この用語は、差が認められることの統計学的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際に真であるときに帰無仮説を棄却する決定が下される確率と定義される。この決定は多くの場合、ｐ値を用いて下される。
操作例または別途明記される場合を除き、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すあらゆる数値は、いずれの場合も「約」という用語によって修飾されているものと理解するべきである。用語「約」が百分率に関連して使用される場合、平均±１％を意味し得る。
その他の用語については、本明細書に記載される技術の様々な態様を説明する中で定義する。
本明細書に記載される技術の諸態様は、細胞から多能性細胞を生成する方法ならびにその多能性細胞の使用および使用方法に関するものである。多能性細胞（すなわち、人工多能性幹細胞またはｉＰＳ細胞）を生成する既存の方法は、例えば１つまたは複数のリプログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４）をコードする核酸構築物の導入によって、リプログラミング因子の発現を増大させることに依存するものであるのに対し、本明細書に記載される方法は、細胞をストレスに曝すが、外来リプログラムアクターの導入を必要としないものである。
いくつかの実施形態では、ストレスが細胞の細胞質の体積および／または細胞のミトコンドリア数を減少させる。細胞の細胞質の体積または細胞のミトコンドリア数の減少は、細胞が少なくとも多能性を獲得するストレス応答を誘導する。一態様では、多能性細胞を生成する方法であって、細胞から細胞質の少なくとも約４０％を除去することと、多能性を示す細胞を選択することとを含み、細胞が組織中に存在しない方法が本明細書に記載される。一態様では、本明細書に記載される本発明は、多能性細胞を生成する方法であって、細胞からミトコンドリアの少なくとも約４０％を除去することと、多能性を示す細胞を選択することとを含み、細胞が組織中に存在しない方法に関するものである。
本明細書に記載される方法、アッセイおよび組成物に使用する細胞は、任意の型の細胞、例えば成体細胞、胚細胞、分化細胞、幹細胞、前駆細胞および／または体細胞であり得る。細胞は、上記の用語の組合せによって表されるものであり得、例えば、細胞は胚性幹細胞または分化体細胞であり得る。本明細書に記載される方法、アッセイおよび組成物に使用する細胞は、対象から入手され得る。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は成体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は新生児細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は胎児細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は羊膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍帯血細胞である。
「成体」は、生後の任意の時点の動物対象に由来するか、その体内にある組織および細胞を指す。「胚（性）」は、出生前の任意の時点の動物対象に由来するか、その体内にある組織および細胞を指す。
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、生殖細胞、着床前の胚に存在するか、そこから得られた細胞またはそのような細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖して生じる細胞以外の任意の細胞を指す。換言すれば、体細胞は、生殖系列細胞に対して、生物体を形成している任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られる）とは精子と卵子のことであり、この２つが受精時に融合して接合子と呼ばれる細胞となり、そこから哺乳動物胚全体が発生する。哺乳動物体内にある細胞型は、精子と卵子、それが生じる細胞（生殖母細胞）および未分化幹細胞を除き、いずれも体細胞である。つまり、内臓、皮膚、骨、血液および結合組織はいずれも体細胞で構成されている。いくつかの実施形態では、体細胞は、胚に存在するものでもそこから得られるものでもなく、またそのような細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖して生じるものでもない体細胞を意味する「非胚体細胞」である。いくつかの実施形態では、体細胞は、胚または胎児以外の生物体に存在するか、そこから得られる細胞またはそのような細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖して生じる細胞を意味する「成体体細胞」である。成体細胞と新生児細胞または胚細胞は、構造上の差、例えば、メチル化パターンなどのエピジェネティック機構によって区別され得ることが注目される。いくつかの実施形態では、体細胞は哺乳動物体細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞はヒト体細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は成体体細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は新生児体細胞である。
本明細書で使用される「分化細胞」は、その発生過程の前の時点よりも運命または機能が特化している細胞を指し、終末分化した細胞および終末までは分化していないが、その発生過程の前の時点よりも特化している細胞の両方を包含する。未拘束の細胞（例えば、幹細胞）が特定の分化細胞型への拘束が強くなった細胞になり、最終的には終末分化細胞になるという細胞の発生は、前進的分化または前進的拘束として知られている。細胞の個体発生との関連では、形容詞「分化した」または「分化している」は相対的な用語である。「分化（した）細胞」とは、発生経路に沿って比較の対象となる細胞よりも前進した細胞のことである。したがって、幹細胞は、系列に拘束された前駆細胞（中胚葉幹細胞など）に分化することが可能であり、次の段階では、経路をさらに進んで他の型の前駆細胞（心筋前駆細胞など）に分化し、次いで、特定の組織型において特徴的な役割を果たす最終段階の分化細胞に分化することが可能であり、この分化細胞は、さらに増殖する能力を保持していることもあれば、保持していないこともある。
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、未分化状態または一部分化した状態にあり、自己複製の特性を有し、より分化した細胞型に自然に分化する発生能を有する細胞を指し、この場合、発生能は特定の意味（すなわち、全能性、多能性、複能性など）を表すものではない。自己複製は、幹細胞がその発生能を維持したまま増殖し、そのような幹細胞をさらに生じさせることが可能であることを意味する。したがって、用語「幹細胞」は、特定の状況下でより特化または分化した表現型に分化する発生能を有し、特定の状況下で実質的に分化せずに増殖する能力を保持している、任意の細胞の組を指す。「体性幹細胞」という用語は、胎児、幼若体および成体の組織を含めた非胚性組織に由来する任意の幹細胞を指すのに使用される。血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋および心筋を含めた多種多様な成体組織から天然の体性幹細胞が単離されている。例示的な天然に存在する体性幹細胞としては、特に限定されないが、間葉系幹細胞および造血幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は胚性幹細胞であり得る。本明細書で使用される「胚性幹細胞」は、前胚組織（例えば、胚盤胞など）、胚組織または妊娠中、必ずしもというわけではないが通常、妊娠第１０～１２週前後よりも前の任意の時点で採取した胎児組織を含めた受精後から妊娠終了前の間に形成される組織に由来する幹細胞を指す。胚性幹細胞は、初期胚または胚盤胞に由来する全能性細胞であることが最も多い。胚性幹細胞は、特に限定されないがヒト組織を含めた適切な組織または確立された胚細胞系列から直接入手することができる。一実施形態では、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号および同第６，２００，８０６号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５（全体が参照により本明細書に組み込まれる））によって記載されている通りに胚性幹細胞を入手する。
例示的な幹細胞としては、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、筋肉前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞などが挙げられる。幹細胞の単離および培養の方法を含めた幹細胞に関する記載は、特にＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｕｒｋｓｅｎ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｗｅｉｓｍａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７：３８７ ４０３；Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３ ４７，１９９９；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｓｔｅｒｓ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ｊａｃｋｓｏｎら，ＰＮＡＳ ９６（２５）：１４４８２ ８６，１９９９；Ｚｕｋら，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：２１１ ２２８，２００１（「Ｚｕｋら」）；Ａｔａｌａら，特に第３３～４１章；ならびに米国特許第５，５５９，０２２号、同第５，６７２，３４６号および同第５，８２７，７３５号にみられる。間質細胞の単離方法を含めた間質細胞に関する記載は、特にＰｒｏｃｋｏｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：７１ ７４，１９９７；Ｔｈｅｉｓｅら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３１：２３５ ４０，２０００；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０００（２００２年３月の最新版を含む）；および米国特許第４，９６３，４８９号にみられる。
本明細書で使用される「前駆細胞」は、未分化状態または一部分化した状態にあり、少なくとも１種類のより分化した表現型に分化する発生能を有し、自己複製の特性を有する細胞を指し、この場合、発生能は特定の意味（すなわち、全能性、多能性、複能性など）を表すものではない。したがって、用語「前駆細胞」は、特定の状況下でより特化または分化した表現型に分化する発生能を有する、任意の細胞の組を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は全能性幹細胞である。
「全能性」という用語は、体内の任意の組織または細胞型を生じ得る幹細胞を指す。「多能性」幹細胞は、体内の生殖系列細胞以外の任意の型の細胞を生じ得るものである。生じ得る異なる細胞型の数がこれより少ないか、限定されている幹細胞を一般に「複能性」と呼ぶ。したがって、全能性細胞は、胎児発生に必要な組織の全部ではないがほとんどを生じ得る多能性細胞に分化する。多能性細胞はさらに分化して、特定の機能を有する細胞を生じるよう拘束された複能性細胞になる。例えば、複能性造血幹細胞から、血液中の赤血球、白血球および血小板が生じる。
本明細書で使用される「多能性」という用語は、様々な条件下で３種類の胚細胞層（すなわち、内胚葉（例えば、消化管組織）、中胚葉（例えば、血液、筋肉および血管）および外胚葉（例えば、皮膚および神経））に特有の細胞型のいずれにも分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて、主として３種類すべての胚葉に分化する能力によって特徴付けられる。多能性はこのほか、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によって示されるが、多能性を検討するのに好ましいのは、３種類の胚葉それぞれの細胞に分化する能力を明らかにすることである。
本明細書の実施例に記載される「ＡＣＣ」細胞および「ＳＴＡＰ」細胞は多能性細胞の非限定的な例である。「ＳＴＡＰ幹細胞」は多能性幹細胞の非限定的な例である。多能性細胞という用語と多能性幹細胞という用語は、両細胞とも本発明の目的に適する形で使用することができるため、本明細書では互換的に使用され得る。
本明細書で使用される「多能性」または「多能性状態」という用語は、３種類の胚葉：内胚葉（消化管組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）および外胚葉（皮膚および神経など）のいずれにも分化する能力を有する細胞を指す。
「複能性細胞」に関連して使用される「複能性」という用語は、全３種類の胚葉に由来するすべてではないが一部の細胞に分化することができる細胞を指す。したがって、複能性細胞は一部分化した細胞である。複能性細胞は当該技術分野で周知であり、複能性細胞の非限定的な例としては、成体幹細胞、例えば造血幹細胞および神経幹細胞などを挙げ得る。複能性は、幹細胞が所与の系列の多数の型の細胞を形成し得るが、他の系列の細胞は形成しないことを意味する。例えば、複能性血液幹細胞は多数の異なる型の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することができない。「複能性」という用語は、発生の多能性が全能性および多能性には及ばない細胞を指す。
「全能性」という用語は、成体のほかにも、胎盤を含めた胚体外組織のあらゆる細胞を形成する能力を示す程度に分化した細胞を指す。受精卵（接合子）は全能性であり、初期分割細胞（割球）も同じく全能性である。
本明細書に記載される方法に使用する細胞は、組織中に存在しない細胞であり得る。本明細書で使用される「組織」は、少なくとも１つの特定の機能を遂行するよう同じように特化した細胞がまとまって組織化された生体材料（例えば、グループ、層または集合体）を指す。細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する組織化された上位構造から取り出されるか、別の方法で上位構造から分離されると、その細胞は組織中に存在することにはならない。例えば、血液試料を２つ以上の異なる画分に分離した場合、あるいは脾臓を細切し、パスツールピペットで機械的に解離させた場合、その細胞は組織中に存在することにはならない。いくつかの実施形態では、組織中に存在しない細胞は、単離された細胞である。本明細書で細胞に関連して使用される「単離された」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏでは通常結合している別の細胞のグループから機械的または物理的に分離されている細胞を指す。１つまたは複数の細胞を別の細胞のグループから単離する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（第３版），１９９４，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（編），Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（第１巻），１９９８，Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ（編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａ，１９９４，Ｄ．Ｃ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄを参照されたい。単離された細胞は任意選択で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば他の細胞の存在下で培養されたものである。
いくつかの実施形態では、細胞は組織中には存在しないが、細胞集団の中に存在する。いくつかの実施形態では、細胞集団は細胞集団である。本明細書で使用される「細胞集団」は、少なくとも２個の細胞、例えば２個の細胞、３個の細胞、４個の細胞、１０個の細胞、１００個の細胞、１０００個の細胞、１０，０００個の細胞、１００，０００個の細胞またはこれらの個数の間の任意の個数もしくはそれ以上の個数の細胞からなるグループを指す。任意選択で、細胞集団は起源が同じ細胞であってよく、例えば細胞は、同じ親細胞の子孫であっても、クローンであっても、同じ組織から単離された細胞またはその子孫であっても、あるいは同じ組織試料から単離された細胞またはその子孫であってもよい。細胞集団は、１種類以上の細胞型、例えば１種類以上の細胞型，２種類以上の細胞型、３種類以上の細胞型、４種類以上の細胞型またはそれ以上の細胞型を含み得る。細胞集団は、不均一であっても均一であってもよい。細胞集団は、同じ細胞型を少なくとも９０％含む場合、例えば、集団の９０％、９２％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の細胞が同じ細胞型である場合、実質的に均一であり得る。細胞集団は、集団中に存在する細胞の９０％未満が同じ細胞型である場合、不均一であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、多能性の表現型を呈する非多能性細胞（例えば、分化細胞）の作製に関するものであり得る。いくつかの実施形態では、多能性細胞の生成は、より高い多能性の表現型を有する細胞を生成すること、すなわち、細胞が分化能の幅が広くなった表現型を呈するようにすることを含み得る。非限定的な例を挙げれば、極小胚様細胞（ＶＳＥＬ）細胞は、多能性ではなく単能性であり、かつ／または特定の分化細胞型に分化する能力が限定されたものであり得る（ＶＳＥＬのエピジェネティック状態が胚性幹細胞よりも分化細胞に類似していることに起因する可能性が考えられる）。本明細書に記載される方法に従って、単能性細胞および／または分化能の限定された細胞がより高い多能性の表現型を呈するようにすることができる。より高い多能性の表現型は、より多くの分化細胞型に分化することができる表現型であってよく、例えば、２つの単能性細胞のうち、その系列のより多くの分化細胞型に分化することのできる方が多能性が高く、かつ／または多能性細胞は単能性細胞よりも多能性が高い。
本明細書に記載される多能性細胞（またはより多能性の高い細胞）の生成方法は、例えば、細胞から細胞質の一部を除去することおよび／または細胞からミトコンドリアを除去することを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞から細胞質またはミトコンドリアの一部を除去することにより、細胞のエピジェネティック調節が一部除去される。いくつかの実施形態では、細胞質の少なくとも約４０％を除去し、例えば、細胞の細胞質の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上を除去する。いくつかの実施形態では、細胞の細胞質の６０％～８０％を除去する。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアの少なくとも約４０％を除去し、例えば、細胞のミトコンドリアの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上を除去する。いくつかの実施形態では、細胞のミトコンドリアの５０％～９０％を除去する。
細胞をストレスに曝し、かつ／または細胞から細胞質もしくはミトコンドリアを除去する方法は、細胞膜に致死閾値未満のポアおよび／または破裂を生じさせる任意の環境刺激であり得る。ストレスは組織または細胞培養物の非生理的ストレスを含み得る。適切な環境刺激の非限定的な例としては、外傷、機械的刺激、化学物質曝露、超音波刺激、酸素欠乏、栄養欠乏、放射線照射、極端な温度への曝露、解離、研和、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極端なイオン濃度、活性酸素、ＵＶ曝露、強い可視光、必須栄養素の欠乏または非生理的酸性環境が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞に１種類の環境刺激を加え得る。いくつかの実施形態では、細胞に複数の環境刺激を加えてもよく、例えば２種類の刺激、３種類の刺激、４種類の刺激またはそれ以上の刺激を加えてもよい。複数の環境刺激は同時に加えても別個に加えてもよい。
いくつかの実施形態では、ストレスは、曝露した細胞の少なくとも１０％に膜破壊を引き起こすストレスであり得る。本明細書で使用される「膜破壊」は、特に限定されないがミトコンドリアおよびＤＮＡを含めた検出可能な量の細胞小器官および／または細胞内物質を細胞外環境中に放出させるのに十分なポアまたはギャップが形成されるよう膜を損なう、破裂させる、または破壊することを指す。細胞内物質、例えばミトコンドリアの放出を検出する方法は当該技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載する。放出される細胞内物質は遊離していても、膜により封入されていても、膜の取り囲まれていてもよい。
ストレスは、ストレスに曝露した細胞の少なくとも１０％、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上に膜破壊を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、ストレスに曝露する細胞は、本明細書に記載される通りに多能性を高める細胞と同じ型および特徴の細胞であってよく、例えば、ある型の細胞に適したストレスが別の型の細胞には適さないことがある。
細胞をストレスに曝露する時間の長さは、用いる刺激によって異なり得る。例えば、本明細書に記載される方法に従い低栄養条件を用いて細胞にストレスを加える場合、細胞を低栄養条件下で１週間以上、例えば１週間、２週間もしくは３週間またはそれ以上培養し得る。いくつかの実施形態では、細胞を低栄養条件下で約３週間培養する。別の非限定的な例では、本明細書に記載される方法に従って低ｐＨまたは低酸素条件に曝露する細胞を、例えば数時間を含めた数分間以上、例えば少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも２０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間またはそれ以上曝露し得る。
多能性細胞の生成を誘導する機械的刺激としては、膜の完全性を機械的に崩壊させるよう任意の形態で物質または表面と細胞膜とを接触させることを挙げ得る。機械的刺激は、細胞をずり応力および／または高圧に曝露することを含み得る。機械的刺激の例示的な形態には研和がある。研和とは、粒子の表面を摩擦により研磨および／または研削する工程のことである。細胞を研和する工程の非限定的な例には、細胞の大きさよりも小さい開口部を有する装置に細胞を通すことがある。例えば、吸引圧および／または流体の流れにより、内部空間の少なくとも一部の直径が細胞の直径よりも小さいピペットに細胞を通すことができる。いくつかの実施形態では、細胞の大きさよりも小さい開口部を有する少なくとも１つの装置に細胞を通す。いくつかの実施形態では、次第に小さくなる開口部を有する複数の装置に細胞を通す。いくつかの実施形態では、細胞を５分間以上、例えば５分間、１０分間、２０分間、３０分間または６０分間、研和し得る。いくつかの実施形態では、細胞を内径５０μｍのパスツールピペットに通すことにより研和し得る。いくつかの実施形態では、細胞を内径５０μｍのパスツールピペットに２０分間通すことにより研和し得る。
細胞に多能性細胞を生成させるのに必要なストレスを加える方法としてはほかにも、例えば、特定の化学物質または物理化学的条件（例えば、高ｐＨまたは低ｐＨ、浸透圧ショック、極端な温度、酸素欠乏など）への曝露が挙げられる。多能性細胞の生成を誘導するこの種のものをはじめとする処理については以下にさらに記載する。化学的曝露としては、例えば、ｐＨ、浸透圧および／または細胞膜の完全性を崩壊させるか損なう孔形成化合物の任意の組合せを挙げ得る。非限定的な例を挙げれば、細胞を非生理的酸性環境もしくは低ｐＨ、ストレプトリジンＯまたは蒸留水（すなわち、浸透圧ショック）に曝露し得る。
低ｐＨとしては、６．８未満、例えば６．７、６．５、６．３、６．０、５．８、５．４、５．０、４．５、４．０またはそれ以下のｐＨを挙げ得る。いくつかの実施形態では、低ｐＨは約３．０～約６．０である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは約４．５～約６．０である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは５．４～５．８である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは５．４～５．６である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは約５．６である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは約５．７である。いくつかの実施形態では、低ｐＨは約５．５である。いくつかの実施形態では、細胞を最大で数日間、例えば６日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、１２時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、２０分以内または１０分未満の間、低ｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を３日以内の間、５．４～５．６のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を３日以内の間、約５．６～６．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を１時間以内の間、約５．６～６．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約３０分間、約５．６～６．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２０分間、約５．６～６．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を３日以内の間、約５．６～５．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を１時間以内の間、約５．６～５．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約３０分間、約５．６～５．８のｐＨに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２０分間、約５．６～５．８のｐＨに曝露し得る。
いくつかの実施形態では、細胞をＡＴＰに曝露して多能性細胞の生成を誘導し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２０μΜ～約２００ｍＭの濃度のＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２００μΜ～約２０ｍＭの濃度のＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２．４ｍＭの濃度のＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞をＨＢＳＳで希釈したＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を１分間以上、例えば少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間またはそれ以上の間、ＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約５分～約３０分間、ＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１５分間、ＡＴＰに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１５分間、約２．４ｍＭのＡＴＰに曝露し得る。
いくつかの実施形態では、細胞をＣａＣｌ２に曝露して多能性細胞の生成を誘導し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２０μΜ～約２００ｍＭの濃度のＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２００μΜ～約２０ｍＭの濃度のＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２ｍＭの濃度のＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞をＨＢＳＳで希釈したＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を１日間以上、例えば少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間またはそれ以上の間、ＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１週間～３週間、ＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２週間、ＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２週間、約２ｍＭのＣａＣｌ２に曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１週間、約２ｍＭのＣａＣｌ２に曝露し得る。
孔形成化合物の例としては、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、サポニン、ジギトニン、フィリピン、Ａｅ Ｉ、イソギンチャクの細胞溶解素、アエロリジン、アマトキシン、アメーバポア、エントアメーバ・ディスパー（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｄｉｓｐａｒ）由来のアメーバポアホモログ、ブレビニン－１Ｅ、ブレビニン－２Ｅ、バルバトリジン、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）の細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリア毒素、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＥ１ Ｔｏｒ細胞溶解素、エキナトキシン、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）のエンテロトキシン、エスクレチン、グラニュリシン、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の溶血素、ストレプトコッカス・インターメディンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｎｓ）のインターメディリシン、レンチウイルス溶菌ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のロイコトキシン、マガイニン、メリチン、膜関連リンホトキシン、Ｍｅｔ－エンケファリン、ネオキョートルフィン、ネオキョートルフィンフラグメント１、ネオキョートルフィンフラグメント２、ネオキョートルフィンフラグメント３、ネオキョートルフィンフラグメント４、ＮＫリジン、パラダキシン、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のアルファ細胞溶解素、クロストリジウム・セプティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｐｔｉｃｕｍ）のアルファ細胞溶解素、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素、コリシン、補体、デフェンシン、ヒストリシン、リステリオリシン、マガイニン、メリチン、ニューモリシン、酵母キラートキシン、バリノマイシン、ピーターソンのクラウンエーテル、パーフォリン、パーフリンゴリジンＯ、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のシータ毒素、ファロリジン、ファロトキシンをはじめとする分子、例えばＲｅｇｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９８９ １５９：５６６－５７１（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている分子などが挙げられる。孔形成化合物の精製または合成方法は当業者に周知である。さらに、孔形成化合物は、例えばストレプトリジンＯ（カタログ番号Ｓ５２６５；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｎｃｈ社：セントルイス、ミズーリ州）が市販されている。非限定的な例を挙げれば、細胞を約５分間以上、例えば少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間少なくとも２時間、少なくとも３時間またはそれ以上の間、ＳＬＯに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約３０分～２時間、ＳＬＯに曝露する。いくつかの実施形態では、細胞を約５０分間、ＳＬＯに曝露する。非限定的な例を挙げれば、細胞を約１０ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＬＯに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度のＳＬＯに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１０μｇ／ｍＬのＳＬＯに曝露し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約５０分間、約１０μｇ／ｍＬのＳＬＯに曝露し得る。
多能性細胞の生成を誘導する酸素欠乏条件としては、低酸素条件下で細胞を培養すること、例えば１０％以下の酸素下で細胞を培養することを挙げ得る。いくつかの実施形態では、細胞を５％以下の酸素下で細胞を培養する。低酸素条件下での培養期間は、１時間以上、例えば１時間、１２時間、１日間、２日間、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を１週間～１か月間、低酸素条件下で培養し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約３週間、低酸素条件下で培養し得る。
多能性細胞の生成を誘導する栄養欠乏条件としては、細胞増殖に有益な任意の因子または栄養素の不足を挙げ得る。いくつかの実施形態では、栄養欠乏条件は、基本培地、例えばＦ１２またはＤＭＥＭで、ほかにＦＢＳまたは成長因子などを添加せずに細胞を培養することを含む。栄養欠乏条件での培養期間は、１時間以上、例えば１時間、１２時間、１日間、２日間、１週間、２週間、３週間、１か月間、２か月間またはそれ以上の間であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を１週間～１か月間、栄養欠乏条下で培養し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２週間、栄養欠乏条下で培養し得る。いくつかの実施形態では、細胞を約３週間、栄養欠乏条下で培養し得る。いくつかの実施形態では、栄養欠乏条件として、成長因子を含まない条件または所与の細胞型の１つもしくは複数の成長因子を標準濃度の５０％未満含む条件を挙げ得る。
多能性細胞の生成を誘導する極端な温度への曝露としては、低温度または高温のいずれかへの曝露を挙げ得る。哺乳動物細胞では、極端な低温は３５℃未満、例えば３４℃、３３℃、３２℃、３１℃またはそれ以下の温度であり得る。いくつかの実施形態では、極端な低温は氷点下の温度であり得る。細胞を凍結させると、氷晶により膜に穿孔を生じさせることができ、細胞質を減少させる手段となる。哺乳動物細胞では、極端な高温は４２℃を上回る温度、例えば４３℃、４４℃、４５℃、４６℃またはそれ以上の温度であり得る。いくつかの実施形態では、極端な高温は約８５℃以上の温度であり得る。極端な温度下での培養期間は２０分以上、例えば２０分、３０分、１時間、１２時間、１日、２日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月またはそれ以上であり得る。温度が高くなるほど、一般に多能性細胞を生成させるのに許容される曝露期間が短くなるのは明らかである。
本明細書に記載される方法に用い得るストレスの例としてはほかにも、特に限定されないが、超音波刺激および放射線照射による処理が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞をストレスに曝露した後、本明細書でのちに記載する方法に従って選択する前に細胞を培養し得る。細胞を選択前に少なくとも１時間培養してよく、例えば、ストレス刺激を除去し、本明細書に記載される通りに選択する前に、細胞を少なくとも１時間，少なくとも２時間，少なくとも６時間，少なくとも１２時間，少なくとも１日間，少なくとも２日間，少なくとも７日間またはそれ以上の間培養する。非限定的な例を挙げれば、細胞をＳＬＯに約５０分間曝露した後、選択前に約７日間、ＳＬＯを含まない培地で培養し得る。いくつかの実施形態では、選択前に細胞を培養するのに使用する培地は、分化因子を含有することも、分化を促進することもないものである。いくつかの実施形態では、培地は幹細胞および／または多能性細胞の培養に適したものである。このような培地の例については、本明細書でのちに記載する。
いくつかの実施形態では、細胞の細胞質の量を減少させる。細胞の細胞質の減少は、細胞の大きさをモニターすることにより判定され得る。細胞の大きさを求める方法は当業者に周知であり、非限定的な例としては細胞蛍光定量分析が挙げられる。簡潔に述べれば、単一の細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、例えば、ＤＡＫＯ ＧＡＬＡＸＹ（商標）（ＤＡＫＯ社）分析機にＦＬＯＭＡＸ（商標）ソフトウェアを用い、フィルターをかけて測定する。次いで、細胞蛍光定量分析を実施して細胞の大きさを確認し得る。予め大きさの定められたマイクロビーズを等張リン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に再懸濁させ、細胞蛍光定量分析を用いて球状で含まれる細胞の大きさを比較する際の基準として使用する。細胞およびビーズはともに、同じ機器の設定（細胞およびビーズの大きさを示す前方散乱ならびに細胞の粒度を示す側方散乱）を用いて分析する。ビーズ径をｘ軸とし前方散乱の値をｙ軸とする曲線から細胞の大きさを算出することができる。
いくつかの実施形態では、細胞のミトコンドリアの量を減少させる。細胞のミトコンドリアの数を求める方法は当業者に周知であり、このような方法としては、ミトコンドリア特異的色素で染色し、顕微鏡観察下で１細胞当たりに視認できるミトコンドリアの数をカウントすることが挙げられる。ミトコンドリア特異的色素は、例えばＭＩＴＯＴ ＡＣＫＥＲ（商標）（カタログ番号Ｍ７５１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；グランドアイランド、ニューヨーク州）が市販されている。いくつかの実施形態では、本明細書の上記の方法を用いる処理により、ミトコンドリアの数またはミトコンドリア特異的色素からのシグナルの強度が少なくとも４０％減少し得る。いくつかの実施形態では、本明細書の上記の方法を用いる処理によりミトコンドリアの数またはミトコンドリア特異的色素からのシグナルの強度が少なくとも４０％減少した細胞を選択する。
ほかにも、細胞外環境の酸化還元活性を測定することにより、ミトコンドリアの量および／または膜破壊の破壊を検出することができる。本明細書に記載されるストレスによってミトコンドリアが細胞外環境中に放出されると細胞外環境中のＲＯＳレベルが増大し、これを所与のストレスの効果の測定に用いることができる。
本明細書に記載されるいずれかの態様のいくつかの実施形態では、ＬＩＦ（白血病抑制因子）の下で細胞をストレスに曝し得る。
いくつかの態様では、細胞の細胞質および／またはミトコンドリアの一部を除去した後、この方法はさらに、多能性を示す細胞を選択することを含む。多能性細胞の表現型または機能を示す細胞を選択することにより、多能性細胞を選択することができる。細胞の選択は、所望の特徴を示す細胞を単離し増殖させること、あるいは所望の特徴（１つまたは複数）を有する細胞の方が所望の特徴（１つまたは複数）を有さない細胞よりも生存率および／または増殖率が高くなる条件下で、特徴が明らかでない細胞集団を培養することを含み得る。多能性細胞のマーカーおよび特徴の非限定的な例については、本明細書でのちに記載する。いくつかの実施形態では、多能性による細胞の選択は少なくとも一部に、Ｏｃｔ４を発現する細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、多能性による細胞の選択は少なくとも一部に、Ｎａｎｏｇを発現する細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、多能性による細胞の選択は少なくとも一部に、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｅ－カドヘリンおよび／またはＳＳＥＡを発現する細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＥＡ－１およびＥ－カドヘリンに特異的な抗体とＦＡＣＳとを用いて、これらのマーカーを発現する細胞を選択することにより多能性細胞を選択し得る。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳあるいは当該技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されるその他の細胞分取装置を用いて、細胞を大きさに基づいて選択し得る。このほか、培養皿に付着することができないことにより細胞を選択し得る。
このほか、ストレスに曝した後に大きさが小さくなっていることに基づいて細胞を選択し得る。つまり、ストレスを受けて多能性細胞まで進む細胞は、その非多能性体細胞前駆細胞よりも小さい。いくつかの実施形態では、直径が８μｍ未満の細胞、例えば直径が８μｍ以下、７μｍ以下、６μｍ以下、５μｍ以下またはそれより小さい細胞を選択する。ストレス処理後、短期間（例えば、数分から数日間）培養してから、あるいは休息させてから、大きさに基づいて細胞を選択し得る。いくつかの実施形態では、ストレス処理直後に大きさに基づいて細胞を選択し得る。当該技術分野で公知の任意の方法、例えばフィルターの使用またはＦＡＣＳにより細胞を選択し得る。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って生成した多能性細胞を培養して、その多能性細胞を増殖させ得る（すなわち、幹細胞の増殖）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って生成した多能性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持し得る。一態様では、本明細書に記載される技術は、多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫を含む組成物に関するものである。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫をｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば細胞系として維持し得る。細胞系は、本明細書でのちに記載するように、候補薬剤、例えば、所与の疾患の治療剤および／または幹細胞を調節する薬剤のスクリーニングおよび／または試験に使用することができる。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫は、疾患を有する対象、例えば、天然に存在する細胞型もしくは組織型または天然に存在する多能性細胞および／または複能性細胞の衰弱による疾患（本明細書でのちに記載する）ならびに／あるいは遺伝子変異を有する細胞が関与する疾患、例えば癌を有する対象から得られた細胞に由来するものであり得る。本明細書に記載される組成物は、例えば疾患のモデル化、創薬、診断および個別化治療に用いることができる。
幹細胞および／または多能性細胞の増殖および／または維持に適した条件は当該技術分野で公知である。幹細胞の増殖により、実質的に分化を誘導することも、分化させることもなく細胞数の拡大が可能になる。非限定的な例には、多能性細胞の増殖に適した条件として、２％のＢ２７、２０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子および１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子を添加したＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１、ｖ／ｖ）に細胞を１×１０６細胞／ｃｍ２で播くことが挙げられる。培養期間中、２～３日毎に培地の約５０％を交換し得る。いくつかの実施形態では、幹細胞および／または多能性細胞の増殖に適した条件は、Ｈｉｔｏｓｈｉ，Ｓら，Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００４ １８，１８０６－１８１１（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｂ２７－ＬＩＦ（すなわち、ＬＩＦ（１×１０３単位／ｍＬ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社；カタログ番号ＥＳＧ１１０７、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州）とＢ２７サプリメント（カタログ番号００８００８５－ＳＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；グランドアイランド、ニューヨーク州）とを含有する無血清培地）で細胞を培養することを含む。本明細書に記載される細胞を培養するのに適したその他の培地、例えばＥＳ樹立培地、２ｉ、３ｉおよびＡＣＴＨ、ＥＳ培養条件、ＥＳ－ＬＩＦ、胚性神経幹細胞培養条件およびＥｐｉＳＣ培養条件については本明細書の実施例に記載する。いくつかの実施形態では、多能性細胞の増殖または維持の条件は、ＬＩＦ（白血病抑制因子）の存在下で細胞を培養することを含み得る。
増殖中、本明細書に記載される方法に従って生成した多能性細胞は、同じ多能性幹細胞マーカー（１つまたは複数）を発現し続ける。多能性幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－２、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４（本明細書ではまとめてＳＳＥＡと呼ぶ）、ＡＰ、Ｅ－カドヘリン抗原、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｅｃａｔ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、ＧＤＦ３、Ｄｐｐａ３、Ｄｐｐａ４、Ｄｐｐａ５、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｒｂ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３１、Ｕｔｆ１、Ｔｅｌ１、Ｂａｔ１、Ｆｇｆ４、Ｎｅｏ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｃｄｘ２およびＳｌｃ２ａ３が挙げられる。細胞が多能性幹細胞マーカーを発現しているかどうかを判定する方法は当業者に周知であり、このような方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、レポーター遺伝子構築物の使用（例えば、本明細書に記載されるＯｃｔ４－ＧＦＰ構築物の発現とＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡とを組み合わせる）および目的とする細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いるＦＡＣＳまたは蛍光顕微鏡が挙げられる。
多能性細胞マーカーとしてはほかにも、細胞と比較したテロメアの伸長が挙げられる。テロメア長は、例えばゲノムＤＮＡを単離し、Ｈｉｎｆ１およびＲｓａ１などの制限酵素でｇＤＮＡを消化し、テロメア長アッセイ試薬でテロメアを検出することにより決定することができる。このような試薬は当該技術分野で公知であり、例えばＴＥＬＯＴＡＧＧＧ（商標）ＴＥＬＯＭＥＲＥ ＬＥＮＧＴＨ ＡＳＳＡＹキット（カタログ番号１２２０９１３６００１、Ｒｏｃｈｅ社；インディアナポリス、インディアナ州）が市販されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処理した細胞を、本開示の方法に従って処理する前よりも胚性幹細胞のエピジェネティック状態に一層類似した状態に変化させ得る。細胞のエピジェネティック状態は、ゲノムのヌクレオチド配列の変化ではなく、ゲノムの化学標識を指す。エピジェネティック標識は、ＤＮＡメチル化（刷り込み）のほか、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質のメチル化およびアセチル化を含み得る。「ＤＮＡメチル化」という用語は、ＤＮＡの特定の塩基にメチル（ＣＨ３）基が付加することを指す。哺乳動物では、メチル化はもっぱら、グアニンが隣接しているシトシン（ＣｐＧ）の５位に起こるのがほとんどである。いくつかの実施形態では、エピジェネティック状態は、エピジェネティックなメチル化パターン、例えばＤＮＡメチル化パターンを含み得る。エピジェネティック標識の存在および位置を明らかにするアッセイは当該技術分野で公知であり、このようなアッセイとしては、例えば、本明細書の実施例２に記載するバイサルファイトシーケンシングを挙げ得る。簡潔に述べれば、ＤＮＡをＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、テメキュラ、カリフォルニア州）で処理し、目的とする領域（例えば、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＯｃｔ４遺伝子）を増幅して、配列を決定する。
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、本明細書に記載される方法によって作製した多能性幹細胞を用いるアッセイに関するものである。例えば、本明細書に記載される方法によって作製した多能性幹細胞を用いて、多能性幹細胞の生存能、分化または増殖を調節する薬剤をスクリーニングおよび／または同定することができる。このようなアッセイは、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞と候補薬剤とを接触させることと、その候補薬剤と接触させた多能性細胞の生存能、分化および／または増殖が、候補薬剤と接触させなかった多能性細胞の生存能、分化および／または増殖と異なるかどうかを判定することとを含み得る。いくつかの実施形態では、薬剤は多能性幹細胞の生存能、分化および／または増殖を増大させ得る。いくつかの実施形態では、薬剤は多能性幹細胞の生存能、分化および／または増殖を低下させ得る。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞と複数の候補薬剤とを接触させて、例えば、相乗作用もしくは拮抗作用を明らかにする、またはプールの候補薬剤をスクリーニングし得る。
ある候補薬剤の存在下の方がその非存在下よりも生存可能な多能性細胞、すなわち生きた多能性細胞の数が多い、または少ない場合、その候補薬剤は、作製した多能性細胞の生存能を調節する薬剤として同定される。細胞の生存能を判定する方法は当該技術分野で周知であり、このような方法の非限定的な例としては、生細胞マーカーからのシグナルの強度を検出することによって少なくとも２つの時点での生存細胞数を決定すること、または生細胞マーカーによって染色される細胞の数もしくは割合を決定することが挙げられる。生細胞マーカーは、例えばＰＲＥＳＴＯ ＢＬＵＥ（商標）（カタログ番号Ａ－１３２６１；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；グランドアイランド、ニューヨーク州）が市販されている。ある候補薬剤の存在下で多能性細胞の増殖速度が変化する、すなわち、所与の時間の間に生じる子孫細胞数の増加または減少がみられる場合、その候補薬剤は、作製した多能性細胞の増殖を調節する薬剤として同定される。細胞の増殖速度を決定する方法は当該技術分野で公知であり、このような方法の非限定的な例としては、経時的な生細胞数の増大を判定することが挙げられる。
ある候補薬剤の存在下で多能性細胞の分化の速度または特徴に増大または低下がみられる場合、その候補薬剤は、多能性細胞の分化を調節する薬剤として同定される。細胞の分化の速度または特徴を決定する方法は当該技術分野で公知であり、このような方法の非限定的な例としては、特定の系列のマーカーまたは形態を検出し、そのようなマーカーまたは形態を有する細胞の数および／または出現速度を、候補薬剤と接触させた集団と、候補薬剤と接触させていない集団とで比較することが挙げられる。様々な細胞運命の系列および成熟細胞型のマーカーおよび形態学的特徴は当該技術分野で公知である。非限定的な例を挙げれば、中胚葉細胞は、アクチン、ミオシンおよびデスミンの発現によって多能性細胞と識別される。軟骨細胞は、サフラニン－Ｏおよび／またはＦＡＳＴＧＲＥＥＮ（商標）色素（Ｆｉｓｈｅｒ社；ピッツバーク、ペンシルベニア州；Ｆ９９）で染色することにより、その前駆細胞型と識別することができる。骨細胞は、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ社；セントルイス、ミズーリ州：カタログ番号Ａ５５３３）で染色することにより、その前駆細胞と識別することができる。
いくつかの実施形態では、候補薬剤は有望な腫瘍幹細胞の阻害剤であってよく、例えば、本明細書に記載される方法を成熟腫瘍細胞からの多能性細胞の生成に使用し得るほか、腫瘍細胞の生成および／または生存能を阻害する薬剤のスクリーニングに使用し得る。本明細書に記載される方法はほかにも、成熟腫瘍細胞には殺作用を示すが、腫瘍幹細胞の発生および／または生存は促進しない薬剤のスクリーニングに使用することができる。
いくつかの実施形態では、多能性細胞を１つまたは複数の候補薬剤と接触させ、特定の細胞系列または成熟細胞型の分化を促進する条件下で培養する。分化に適した条件は当該技術分野で公知である。非限定的な例を挙げれば、中胚葉系列への分化に適した条件として、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭを３日毎に交換するというものがある。非限定的な例をさらに挙げれば、神経系列への分化に適した条件として、２％Ｂ２７、１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍ ＬＥＧＦを添加したＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１、ｖ／ｖ）中、オルニチンでコートしたチャンバースライドに細胞を播くというものがある。培地は３日毎に交換し得る。
本明細書で使用される「候補薬剤」は、通常は存在しないか、細胞、組織または対象に投与されるレベルでは存在しない任意の実体を指す。候補薬剤は、化学物質；有機または無機小分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；アプタマー；ペプチド模倣物、ペプチド誘導体、ペプチド類似体、抗体；細胞内抗体；生体高分子、細菌、植物、真菌または動物細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物；天然または合成の組成物もしくはその機能的フラグメントを含む群より選択され得る。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、合成および天然の非タンパク質性の実体を非限定的に含めた任意の化学物質または化学的部分である。ある特定の実施形態では、候補薬剤は化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分としては、マクロライド、レプトマイシンおよびこれに関連する天然生成物またはその類似体を含めた非置換もしくは置換アルキル部分、芳香族部分またはヘテロシクリル部分が挙げられる。候補薬剤は、所望の活性および／または特性を有することが知られているものであっても、多様な化合物のライブラリーから選択されるものであってもよい。
多能性細胞の生存能、増殖および／または分化を調節することができるかどうかで候補薬剤をスクリーニングすることができる。一実施形態では、本明細書で上および実施例に記載される生存能、分化および／または増殖のアッセイを用いて候補薬剤をスクリーニングする。
化合物は一般に、細胞機能、遺伝子発現またはタンパク質活性を調節し得る任意の濃度で、しかるべき時間にわたって対照と比較して試験され得る。いくつかの実施形態では、化合物を約０．１ｎＭ～約１０００ｍＭの範囲の濃度で試験する。一実施形態では、化合物を約０．１μΜ～約２０μΜ、約０．１μΜ～約１０μΜまたは約０．１μΜ～約５μＭの範囲で試験する。
候補薬剤または被験薬剤は、実施する具体的な実施形態に応じて、溶液中に遊離した形で準備しても、担体または固体支持体、例えばビーズに結合させてもよい。被験薬剤の固定化に使用することができる適切な固体支持体は多数存在する。適切な固体支持体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして市販されているもの）カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、カラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン－マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが挙げられる。さらに、本明細書に記載される方法では、被験薬剤を個別に、またはグループもしくはプールでスクリーニングし得る。グループスクリーニングは、有効な被験薬剤のヒット率が低いことが予想され、所与のグループにポジティブな結果が２つ以上得られないことが予想されるような場合に特に有用である。
小分子、ポリマーおよびゲノムをベースとするライブラリー開発する方法が、例えば、Ｄｉｎｇら，Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１５９４－１５９６（２００２）およびＬｙｎｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１５５－８１５６（２００１）に記載されている。市販の化合物ライブラリーは、例えばＡｒＱｕｌｅ社（ウォバーン、マサチューセッツ州）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバド、カリフォルニア州）、Ｒｙａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（マウントプレザント、サウスカロライナ州）およびＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ファーミングデール、ニューヨーク州）から入手することができる。これらのライブラリーのメンバーについて、多能性幹細胞の生存能、増殖および／または分化を調節することができるかどうかをスクリーニングすることができる。候補薬剤は、天然のタンパク質またはそのフラグメントであってもよい。このような候補薬剤は、天然源、例えば細胞または組織のライセートから入手することができる。このほか、例えば市販されているか、ルーチンの方法で作製したｃＤＮＡライブラリーから、ポリペプチド薬剤のライブラリーを調製してもよい。候補薬剤はほかにも、ペプチド、例えば約５～約３０アミノ酸、好ましくは約５～約２０アミノ酸、特に好ましくは約７～約１５アミノ酸のペプチドであってもよい。ペプチドは天然のタンパク質の消化産物であっても、ランダムペプチドの消化産物であっても、「バイアスをかけた」ランダムペプチドの消化産物であってもよい。いくつかの方法では、候補薬剤はポリペプチドまたはタンパク質である。ペプチドライブラリー、例えばペプチドをはじめとする化合物のコンビナトリアルライブラリーを完全にランダム化して、配列のいずれの位置にも選好性も一定性もないようにし得る。あるいは、ライブラリーにバイアスをかける、すなわち、配列内のいくつかの位置を一定にするか、限られた数の可能性から選択されるようにし得る。例えば、いくつかの場合には、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ－３ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくはヒスチジンまたはプリンが生じるように立体的にバイアス（大小を問わない）をかけた残基の定められたクラス内で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基をランダム化する。
候補薬剤はこのほか、核酸であってもよい。核酸候補薬剤は天然の核酸であっても、ランダム核酸であっても、「バイアスをかけた」ランダム核酸であってもよい。例えば、原核ゲノムまたは真核ゲノムの消化産物をタンパク質について上で述べたのと同じように用いることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従ってスクリーニングされ、多能性細胞の生存能、増殖および／または分化を調節するものとして同定される候補薬剤は、多能性細胞の生存能、増殖および／または分化を未処理対照に比して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上増大させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従ってスクリーニングされ、多能性細胞の生存能、増殖および／または分化を調節するものとして同定される候補薬剤は、多能性細胞の生存能、増殖および／または分化を未処理対照に比して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上低下させ、最大で完全に減少させ得る（すなわち、生存能、増殖または分化をゼロにする）。
いくつかの実施形態では、候補薬剤は、投与される形態で直接機能する。あるいは、候補薬剤は、所望の活性を調節する形態になるよう修飾されているか、細胞内で利用されてもよく、例えば、細胞内に核酸配列を導入し、それが細胞内で転写されて遺伝子発現またはタンパク質活性の阻害物質または活性化因子が産生されてもよい。
本明細書に記載される方法および組成物を、例えば癌ワクチンの開発に用い得ることが企図される。本明細書に記載される通りに（例えば、本明細書に記載される方法に従って成熟腫瘍細胞を処理することにより）得られる多能性腫瘍細胞の少なくとも一部が分化した子孫を生成すれば、より強力なＡＰＣ（抗原提示細胞）ベースの癌ワクチンの開発を可能にする多様で変化する抗原プロファイルを得ることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞の形質転換効率を高めることに関するものである。細胞にストレスを加える、例えば本明細書に記載される通りに多能性を誘導することにより、特に限定されないが、導入遺伝子挿入、ウイルスベクターおよび／または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼを含めた遺伝子改変方法に対する細胞の受容性を高めることができる。本明細書に記載される方法は、得られた多能性細胞の形質転換に裸のＤＮＡを使用することが可能になるよう細胞を遺伝的に受容性の状態に改変することを可能にし得ることが企図される。
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、細胞治療を必要とする対象に本明細書に記載される方法によって作製した多能性細胞またはそのような細胞の少なくとも一部が分化した子孫を投与することを含む、細胞治療の方法に関するものである。いくつかの実施形態では、治療有効量の多能性細胞または多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を提供する。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫は自家性である。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫は同種性である。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫は自家性である。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫はＨＬＡ適合同種性である。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫は同系である。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその子孫は異種性である。いくつかの実施形態では、細胞治療は自家治療であってよく、例えば、対象の細胞を用い、本明細書に記載に記載される方法に従って多能性細胞を生成し、多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を対象に投与し得る。本明細書で使用される「細胞治療を必要とする対象」は、天然の細胞または組織型あるいは天然の多能性細胞および／または複能性細胞（例えば、幹細胞）の衰弱による疾患を有する、あるいはこれを有するか発症するリスクがあると診断された対象を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、例えば本明細書に記載される通りに得られた同種多能性細胞および／またはその子孫を投与することにより、遺伝性障害、例えばテイ・サックス病または血友病を治療することができる。
一態様では、対象に実施する細胞治療に適合性のある細胞または組織を調製する方法が本明細書に記載され、この方法は、本明細書に記載される方法に従って細胞から多能性細胞（またはより多能性の高い細胞）を生成することを含み、細胞は自家細胞またはＨＬＡ適合同種細胞である。いくつかの実施形態では、対象に細胞または組織を投与する前に、多能性細胞（またはより多能性の高い細胞）を予め定められた細胞系列に沿って分化させ得る。
本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞、例えば多能性幹細胞を癌治療に使用することができる。例えば、高用量化学療法に骨髄造血系を再生させる造血幹細胞移植を加えれば、本明細書に記載される通りに作製した多能性細胞の使用による利益がもたらされ得る。
天然の細胞または組織型あるいは天然の多能性細胞および／または複能性細胞の衰弱による疾患の非限定的な例としては、再生不良性貧血、ファンコニ貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）が挙げられる。ほかにも、例えば：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性二表現型白血病および急性未分化白血病を含めた急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＪＣＭＬ）および若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）を含めた慢性白血病；急性骨髄線維症、血管新生骨髄様化生（骨髄線維症）、真性赤血球増加症および本態性血小板血症を含めた骨髄増殖性疾患；ムコ多糖症（ＭＰＳ）、ハーラー症候群（ＭＰＳ－ＩＨ）、シャイエ症候群（ＭＰＳ－ＩＳ）、ハンター症候群（ＭＰＳ－ＩＩ）、サンフィリッポ症候群（ＭＰＳ－ＩＩＩ）、モルキオ症候群（ＭＰＳ－Ｆ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ－ＶＩ）、スライ症候群、ベータ－グルクロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ－ＶＨ）、副腎白質ジストロフィー、ムコ脂質症ＩＩ（Ｉ－細胞病）、クラッベ病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、ウォルマン病および異染性白質ジストロフィーを含めたリソソーム蓄積症；家族性赤血球貪食性リンパ組織球症、組織球症－Ｘおよび血球貪食を含めた組織球障害；チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、好中球アクチン欠損症および細網異形成症を含めた食細胞障害；無巨核球症／先天性血小板減少症を含めた先天性血小板異常症；多発性骨髄腫、形質細胞白血病およびワルデンストレームマクログロブリン血症を含めた形質細胞障害が挙げられる。幹細胞治療で治療可能な悪性疾患としてはほかにも、特に限定されないが、乳癌、ユーイング肉腫、神経芽腫および腎細胞癌が特に挙げられる。幹細胞治療で治療可能なものとしてほかにも、ＣＯＰＤおよび気管支喘息を含めた肺障害；運動失調－毛細血管拡張症、コストマン症候群、白血球接着不全症、ディジョージ症候群、裸リンパ球症候群、オーメン症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症を伴うＳＣＩＤ、Ｔ細胞とＢ細胞の欠如がみられるＳＣＩＤ、Ｔ細胞が欠如しＢ細胞が正常なＳＣＩＤ、分類不能免疫不全症およびＸ連鎖リンパ球増殖性疾患を含めた先天性免疫障害；レッシュ・ナイハン症候群、軟骨毛髪低形成症、グランツマン血小板無力症および大理石骨病を含めたその他の遺伝性障害；急性および慢性脳卒中、外傷性脳損傷、脳性麻痺、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および癲癇を含めた神経学的病態；アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全および心筋梗塞を含めた心病態；糖尿病を含めた代謝障害；ならびに黄斑変性症および視神経萎縮を含めた眼障害がある。このような疾患または障害は、多能性細胞そのものを投与し、所望の分化を促進する薬剤を投与するか、投与せずにｉｎ ｖｉｖｏで所望の細胞型に分化させることおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の細胞型に分化させるか、少なくとも一部を分化させた多能性細胞を投与することのいずれかにより治療することができる。上記の病態を診断する方法は、当該技術分野の通常の技能を備えた医師に周知である。いくつかの実施形態では、対象は、放射線療法をはじめとする治療法で治療し、細胞または幹細胞の集団を除去した対象であってよく、例えば、対象は、癌を有し放射線療法により骨髄を除去した対象であってよい。
いくつかの実施形態では、多能性細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも一部が分化した細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、細胞治療の方法は、多能性細胞を投与する前に予め定められた細胞系列に沿って細胞を分化させることをさらに含み得る。幹細胞を所望の細胞系列に沿って分化させる方法は当該技術分野で公知であり、本明細書にその例が記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って得られた多能性細胞またはその多能性細胞の子孫である少なくとも一部が分化した細胞を含む組成物を対象に投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って得られた多能性細胞またはその多能性細胞の子孫である少なくとも一部が分化した細胞を含む組成物は、任意選択でＧ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦをさらに含んでよく、かつ／またはＧ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳを別個の組成物として既に投与したか、投与する予定である対象に投与してよい。Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦの投与は、例えば、器官再生ならびに組織の残骸、老廃物および蓄積物の除去に好ましい炎症の状態を誘導し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って多能性細胞を培養して作製した後、比較的時間のうちに（例えば、作製から１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間または４８時間後に）多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の投与を実施し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って多能性細胞を培養して分化させた後、比較的短時間のうちに（例えば、作製から１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間または４８時間後に）少なくとも一部が分化した子孫の投与を実施し得る。いくつかの実施形態では、多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫を投与前に極低温で保存し得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を含む組成物に関するものである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫と、任意選択で薬学的に許容される担体とを含む。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。
医薬組成物は、適切な賦形剤または安定剤を含んでよく、例えば液剤、懸濁剤、ゲル剤または乳剤であってよい。組成物は通常、担体とともに細胞を約０．０１～９９パーセント、好ましくは約５～９５パーセント含有する。細胞を薬学的または生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と組み合わせる場合、これを非経口的に、皮下に、埋植により、または注射により投与することができる。ほとんどの治療目的には、細胞液体形態の溶液または懸濁液として注射により投与することができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を投与するための担体を指す。このような担体としては、特に限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロールおよびその組合せが挙げられる。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容される」ものでなければならず、例えば、担体は対象に対する薬剤の影響を低下させるものではない。換言すれば、担体は薬学的に不活性であり、生細胞と適合性がある。
適切な製剤としてはほかにも、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および製剤を意図するレシピエントの体液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性の無菌注射溶液が挙げられる。水性および非水性の無菌懸濁剤は懸濁化剤および増粘剤を含み得る。製剤は、単回投与容器に入れて提供しても、複数回投与容器に入れて提供してもよい。
非経口剤形の例としては、特に限定されないが、注射できる状態の液剤、注射できる状態の懸濁剤および乳剤が挙げられる。非経口剤形は、例えば、本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫を保持する生体吸収性の足場材料を用いて調製することができる。
「エピジェネティック修飾」という用語は、ゲノムの化学標識を指す。エピジェネティック標識は、ＤＮＡメチル化（刷り込み）のほか、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質のメチル化およびアセチル化を含み得る。哺乳動物には多くの場合、片親起源特異的遺伝子発現（母親または父親のいずれかの染色体に由来するもの）がみられ、これはエピジェネティック修飾によるものである。親の生殖系列では、エピジェネティック修飾により安定な遺伝子サイレンシングまたは活性化が起こり得る。
本明細書で使用される「投与」または「移植」という用語は、所望の効果が得られるよう所望の部位に細胞の少なくとも一部を局在させる方法または経路により、細胞を対象の体内に配置することを指す。
本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫は、臨床医が適切であると考える任意の方法で投与することができ、このような方法として、例えば細胞懸濁液の注射による局所投与または例えば埋植可能な足場もしくは支持体の上もしくは内部に細胞を沈着もしくは増殖させた調製物の埋植による局所投与を挙げ得る。埋植可能な足場としては、多数存在する分解性または吸収性のポリマーのいずれかまたは例えば、特に絹の足場を挙げ得る。本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫を含む医薬組成物の投与に適した経路としては、特に限定されないが、局所投与、例えば腹腔内、非経口、腔内または皮下投与が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、経腸投与および局所投与以外で、通常は注射による投与様式を指し、特に限定されないが、腹腔内、真皮内、皮下への注射および注入がこれに含まれる。投与には、注射または外科的埋植に適した針、カテーテルおよびシリンジを使用することができる。所望の臨床的効果を得るために複数の送達手段の組合せの使用および複数の送達部位が企図される。
「エピジェネティック修飾」という用語は、ゲノムの化学標識を指す。エピジェネティック標識は、ＤＮＡメチル化（刷り込み）のほか、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質のメチル化およびアセチル化を含み得る。哺乳動物には多くの場合、片親起源特異的遺伝子発現（母親または父親のいずれかの染色体に由来するもの）がみられ、これはエピジェネティック修飾によるものである。親の生殖系列では、エピジェネティック修飾により安定な遺伝子サイレンシングまたは活性化が起こり得る。
一実施形態では、治療有効量の本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫を対象に投与する。「治療有効量」とは、本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の量であって、治療する病態の症状またはマーカーに測定可能な改善をもたらすのに十分な量のことである。治療用組成物中の実際の細胞の投与レベルは、特定の対象に所望の治療応答を得るのに有効な量の細胞が投与されるよう変化し得る。選択される投与レベルは、特に限定されないが、治療用組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または治療法との組合せ、治療する病態の重症度、対象の健康状態、治療する対象のそれまでの既往歴ならびに治療を実施する臨床医または開業医の経験および判断を含めた様々な因子に左右される。投与量および投与計画は一般に、病態の進行を遅らせ、好ましくは阻害するほかにも、好ましくは病態の１つまたは複数の症状またはマーカーを減少させるものであるべきである。治療有効量の決定および調節ならびにそのような調節を実施する時機および方法は、医学分野の当業者に公知である。
本明細書に記載される方法に従って投与する本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の量は、医師が決定し、必要に応じて、観察される治療効果に適するよう調節することができる。治療の期間および頻度に関しては、治療が治療利益をもたらす時点を判定し、同じ投与量の細胞をさらに投与するかどうか、投与量を増加もしくは減少させるかどうか、治療を中止するかどうか、治療を再開するかどうか、または治療レジメンに別の変更を加えるかどうかを決定するために、熟練された臨床医が対象をモニターするのが典型的である。投与する細胞が生着して中長期間生存することが予想される場合、反復投与が必要となり得る。しかし、必要に応じて、対象に耐容性があれば、投与を反復してもよい。投与量は、実質的な有害副作用を引き起こすほど多くするべきではない。このほか、何らかの合併症が生じた場合には、個々の医師が投与量を調節してもよい。しかし、投与量は通常、成人ヒトに対し、本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫が１００～１×１０９個、例えば１００～１０，０００個、１，０００～１００，０００個、１０，０００～１，０００，０００個または１，０００，０００～×１０９個の範囲になり得る。有効量は、例えば動物モデル試験のバイオアッセイまたはシステムにより得られた用量反応曲線から外挿することができる。
任意選択で、本明細書に記載される通りに調製した本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫を含む治療用組成物を当該技術分野で周知の方法に従い、ＳＣＩＤマウスモデルなどの１つまたは複数のしかるべきｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ疾患動物モデルで試験して、有効性を確認し、移植細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を評価し、投与量を推定する。具体的には、最初に、関連するアッセイで未治療時と比較した治療時の活性、安定性をはじめとする適切な尺度（例えば、治療動物モデルと未治療動物モデルとの比較）によって投与量を決定し得る。本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の有効量を決定する際には、医師は様々な基準の中でも特に、移植細胞の増殖および体積ならびに治療する病態の進行を評価する。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路によって異なり得る。
本明細書に記載される治療法に関して、本明細書に記載される多能性幹細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の投与は、特定の投与様式、投与量または投与頻度に限定されないものとする。筋肉内、静脈内、腹腔内、膀胱内、関節内、病巣内、皮下をはじめ、治療する病態を治療するに足る投与量をもたらすのに十分なあらゆる経路を含めたあらゆる投与様式が企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、多能性細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成することができ、例えば、対象の体内に存在する細胞を本明細書に記載されるストレスに曝して多能性の表現型を獲得させることができる。細胞に本明細書に記載されるストレスをｉｎ ｖｉｖｏで加える方法は容易に明らかになるものであり、例えば、組織に注射および／または直接塗布することにより弱酸溶液を導入してもよく、周囲の組織を加熱もしくは冷却することができるプローブまたは非侵襲的方法、例えば集束ビーム照射により温度を変化させてもよい。多能性のｉｎ ｖｉｖｏ調節を用いて、例えば組織再生または創傷治癒を増大させてもよい。非限定的な例としては、関節炎の膝関節内に弱酸を注射して多能性の表現型を呈する膝関節細胞（例えば、滑膜細胞または軟骨細胞）を誘導し、新たな組織を生成することを挙げ得る。非限定的な例としてさらに、脳卒中または中枢神経系損傷（例えば、脊髄損傷）の対象の治療を挙げ得る。炎症が消失した後、損傷領域に隣接する細胞を本明細書に記載されるストレスで処理し、損傷組織を再増殖させかつ／または損傷組織を再生もしくは修復し得る多能性細胞を生成することができる。
さらなる非限定的な例では、（例えば、デメチラーゼ処理により）エピジェネティック状態を変化させることにより、非インスリン分泌細胞（例えば、膵臓のアルファグルガゴン（ｇｌｕｇａｇｏｎ）細胞）をインスリン分泌細胞（例えば、ベータ細胞）に変換させることができる。したがって、非インスリン分泌細胞（例えば、膵臓のアルファグルガゴン（ｇｌｕｇａｇｏｎ）細胞）を本明細書に記載される方法に従って処理することにより、インスリン分泌細胞になる細胞、例えばベータ様細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで生じさせることができる。
さらに、本明細書に記載される多能性細胞は、他の細胞（すなわち、「レシピエント細胞」）、例えば本明細書に記載される方法に従って処理していない細胞、非多能性細胞、成熟細胞、悪性細胞および／または損傷細胞と融合し得ることが企図される。細胞の融合により、レシピエント細胞の細胞修復酵素の発現および／または活性のレベルが融合前に比べて増大し得る。これにより例えば、レシピエント細胞の細胞損傷、変異および／またはエピジェネティック状態の修飾の修復が増大することによって、レシピエント細胞の健康状態および／または機能が向上し得る。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞の多能性を増大させることにより、その細胞のエピジェネティックマーカー（例えば、ＤＮＡメチル化、脱メチル化および／またはヒドロキシメチル化状態）を調節することができる。エピジェネティックマーカーの調節は、例えば悪性疾患、関節炎、自己免疫疾患、加齢などに関与するものと考えられており、本明細書に記載される方法に従ってこのようなエピジェネティクスに関連する病態を治療することが企図される。
いくつかの実施形態では、複数の組織をｉｎ ｖｉｖｏで同時に治療し得る。例えば、複数の器官に、例えば連続的または同時に（例えば、脳、心臓、肝臓、肺および／または甲状腺）弱酸性状態を誘導して、広範囲にわたる損傷または加齢を治療することが可能であると考えられる。
さらに、本明細書に記載される細胞のｉｎ ｖｉｖｏ治療と、本明細書に記載される通りに作製した多能性細胞および／またはその少なくとも一部が分化した子孫の投与とを組み合わせ得ることが企図される。
本明細書では、本明細書に記載される方法を用いて、例えば子宮内の胎児または胚を治療し得ることが企図される。
治療の有効性は、例えば、本明細書に記載される治療する病態のマーカー、指標、症状もしくは発生率または他の測定可能な任意のしかるべきパラメータ、例えば多能性細胞の子孫の数を測定することにより評価することができる。このようなパラメータのいずれか１つまたはパラメータの組合せを測定することにより治療または予防の有効性をモニターすることは、当業者の能力の範囲内に十分含まれる。
治療する病態の１つまたは複数のマーカー、指標または症状に統計的に有意な改善が認められる場合、あるいは、治療しない場合に予想される症状の悪化も発現も認められないことにより、有効な治療が明らかになる。例として、測定可能な病態のパラメータに少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％またはそれ以上の好ましい変化が、有効な治療の指標となり得る。本明細書に記載される方法に従って作製した多能性細胞および／またはその多能性細胞の少なくとも一部が分化した子孫の有効性はこのほか、本明細書に記載される病態の当該技術分野で公知の実験動物モデルを用いて判断することができる。実験動物モデルを用いる際には、マーカー、例えば、骨髄を除去し、本明細書に記載される多能性細胞で治療した後にマウス体内に存在する造血細胞の数に統計的に有意な変化が認められる場合、治療の有効性が示される。
一態様では、胎盤細胞に分化することが可能な多能性細胞を作製する方法が記載され、この方法は、本明細書に記載される方法に従って得られた多能性細胞をＦＧＦ４の存在下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞は胚性幹細胞に分化することが可能である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４の濃度は約１ｎＭ～約１μＭである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４の濃度は１ｎＭ～１μＭである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４の濃度は約５ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ４の濃度は約１０ｎＭ～約１００ｎＭである。
いくつかの態様では、本明細書に記載される技術は、細胞から多能性細胞を生成するシステムであって、細胞から一部の細胞質および／またはミトコンドリアを除去することを含むシステムに関するものである。
本明細書に記載される方法に従って細胞から多能性細胞を生成するシステムは、細胞をストレスに曝す容器を含み得る。容器は、例えば、本明細書に記載される方法に従って細胞質および／またはミトコンドリアの量を減少させるため、細胞を低酸素条件下で数日間以上培養する場合のように、体細胞および／または多能性細胞を培養するのに適したものであり得る。あるいは、容器は、例えば、細胞を狭い開口部を有する装置で短時間、例えば１時間未満研和する場合のように、細胞にストレスをかけるのには適しているが、細胞を培養するのには適していないものであり得る。容器は、例えば導管、チューブ、マイクロ流体デバイス、ピペット、バイオリアクターまたは細胞培養皿であり得る。容器は、体細胞および／または多能性細胞の培養に適した条件をもたらす環境で保持しても（例えば、インキュベーターの中に入れても）、細胞に環境ストレスを引き起こす環境で保持しても（例えば、酸素含有量の低い環境をもたらすインキュベーターの中に入れても）よい。容器は、本明細書で上に記載した環境ストレスのうち１種類以上、例えば１種類、２種類、３種類またはそれ以上のストレスをもたらすよう設計されたものであってよい。体細胞および／または多能性細胞の操作および／または培養に適した容器は当業者に周知であり、市販されている（例えば、カタログ番号ＣＬＳ４３０５９７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社；セントルイス、ミズーリ州）。いくつかの実施形態では、容器はマイクロ流体デバイスである。いくつかの実施形態では、容器は細胞培養用の皿、フラスコまたはプレートである。
いくつかの実施形態では、システムはさらに、多能性細胞を選択する手段を含んでよく、例えば、システムは、多能性マーカー（例えば、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ）を発現する細胞を選択するか、本明細書で上に記載したように大きさによって選択することができるＦＡＣＳシステムを含み得る。細胞を選択する方法および装置は当業者に周知であり、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（フランクリンレイクス、ニュージャージー州）製のＢＤ ＬＳＲＩＦ（商標）およびＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウェアと組み合わせたＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＳＯＲＰ（商標）（カタログ番号６４３６２９）が市販されている。
いくつかの実施形態では、組織中に存在しない細胞をシステムに供給する。いくつかの実施形態では、組織をシステムに供給し、システムは１つまたは複数の型の細胞を単離する手段をさらに含む。非限定的な例を挙げれば、システムは細胞ホモジナイザーを含み得る。細胞ホモジナイザーおよびその使用方法は当該技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ＦＡＳＴＨ２１（商標）、カタログ番号２１－８２０４１、Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社；ケネソー、ジョージア州）。あるいは、システムは血液または体液試料を処理する遠心機を含み得る。
いくつかの実施形態では、システムを自動化し得る。細胞単離、細胞培養および選択装置を自動化する方法は当該技術分野で公知であり、市販されている。例えば、ＦＡＳＴＨ２１（商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（カタログ番号２１－８２０４１、Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社；ケネソー、ジョージア州）およびＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＳＯＲＰ（商標）がある。
いくつかの実施形態では、システムは無菌状態であってよく、例えば、システムを無菌環境で稼働させてもよく、またシステムを閉鎖無菌システムとして稼働させてもよい。
一態様では、多能性細胞の自己複製能を増大させる方法が本明細書に記載され、この方法は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で細胞を培養することを含む。本明細書で使用される「自己複製能」は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し継代することができる時間の長さ、例えば、細胞およびその子孫が経て生細胞を産生し続けることができる継代数を指す。本明細書に記載される方法に従って自己複製能を増大させる細胞は、例えば、全能性細胞および／または本明細書の他の箇所にされるストレスに曝露することによって作製した細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、ＡＣＴＨの存在下での培養は、約０．１μΜ～約１，０００μΜ、例えば約０．１μΜ～約１００μΜ、約０．１μΜ～約１０μΜまたは約１０μΜを含む細胞培地で細胞を培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＨの存在下での培養は、ＡＣＴＨを含むＬＩＦ培地で細胞を培養することを含み得る。ＬＩＦ、ＡＣＴＨ、２ｉおよび３ｉは市販され、当該技術分野で周知であり、例えば、ＡＣＴＨはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（カタログ番号Ａ０６７３；セントルイス、ミズーリ州）から購入することができ、ＬＩＦ培地はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社（例えば、カタログ番号ＥＳＧ１１０７；ビレリカ、マサチューセッツ州）から購入することができ、３ｉはＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ社（例えば、カタログ番号ＳＣＳ－ＳＦ－ＥＳ－０１の「ｉＳＴＥＭ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ」として；ニューアーク、カリフォルニア州）から購入することができる。
いくつかの実施形態では、培養を少なくとも３日間、例えば少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間またはそれ以上進行させ得る。培養段階の後、本明細書の他の箇所に記載されるように、多能性細胞を維持するのに適した条件下で細胞を維持し得る。
いくつかの実施形態では、培養段階の後、細胞は、検出可能で、かつ／または増大したレベルの幹細胞マーカーを発現し得る。幹細胞マーカーおよびその検出方法については本明細書の他の箇所に記載する。いくつかの実施形態では、幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ３／４；Ｎａｎｏｇ；Ｒｅｘ１；Ｋｌｆ４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ２；Ｅｓｒｒ－ベータ；Ｔｂｘ３；およびＫｌｆ５からなる群より選択され得る。
一態様では、多能性細胞またはＳＴＡＰ細胞を生成する方法であって、これまでの方法が改善された方法、例えば効率、品質および／または収率の向上をもたらす方法が本明細書に提供される。
一実施形態では、例えば細胞懸濁および／または組織培養条件から多能性細胞またはＳＴＡＰ細胞を生成する方法が本明細書に提供される。
第一段階として、懸濁液中の最初の細胞（例えば、出発材料）をペレット化し、かつ／または溶液から除去し得る。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約８００ｒｐｍ～約１６００ｒｐｍで約１分～約２０分間遠心分離することによりペレット化し得る。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレット化し得る。いくつかの実施形態では、懸濁液中の細胞をペレット化し、かつ／または溶液から除去する前に、トリプシンなどの消化酵素と接触させ得る。単なる１つの例として、細胞の入った組織培養皿に約０．０１％～約０．５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社：２５３００－０５４）を約１～約２０分間加えて付着細胞を剥離してから遠心管に加え得る。単なる１つの例として、細胞の入った組織培養皿に０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社：２５３００－０５４）を約３～５分間加えて付着細胞を剥離してから遠心管に加え得る。遠心分離を含む実施形態では、遠心分離後、細胞ペレットの高さまで上清を吸引し得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１００万個の生細胞からなる集団に第一段階を実施する。いくつかの実施形態では、少なくとも５００万個の生細胞からなる集団に第一段階を実施する。いくつかの実施形態では、少なくとも１，０００万個の生細胞からなる集団に第一段階を実施する。
第二段階として、細胞を生理食塩水、例えばＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）（例えば、ＨＢＳＳ Ｃａ＋Ｍｇ＋Ｆｒｅｅ：Ｇｉｂｃｏ社、１４１７０－１１２）に再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１×１０３細胞／ｍＬ～約１×１０９細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１×１０５細胞／ｍＬ～約１×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を約１×１０６の濃度で再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を５０ｍＬチューブで再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、５０ｍＬチューブに入れた２～３ｍＬのＨＢＳＳに細胞を再懸濁させ得る。
第三段階として、懸濁液／溶液の細胞を研和し得る、例えば、例えばずり応力が生じる程度に小さい開口部、穴および／または内腔に通し得る。本明細書でのちに記載する例示的な実施形態では、開口部、穴および／または内腔は、本明細書でのちに記載する大きさの穴を有するガラスピペットにより構成されるものである。研和は、多数の代替手段によって実施され得る。非限定的な例としては、マイクロ流体デバイスの開口部、内腔または流路、ポンプと管とを有する細胞処理装置、細胞懸濁液を格子またはフィルターに通すこと、細胞懸濁液を関門または粒子に流して通すことなどを挙げ得る。当業者であれば、本開示に基づく様々な研和システムに適した圧力、流速、ずり応力などを実験的に決定することができる。流体応力およびそのような応力に関連する計算をさらに論じたものを例えば、Ｆｏｕｍｉｅｒ 「Ｂａｓｉｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」 Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９９（全体が参照により本明細書に組み込まれる）にみることができる。
いくつかの実施形態では、研和を約１０分～約２時間、例えば約２０分～約１時間または約３０分の間継続し得る。いくつかの実施形態では、研和を少なくとも１０分、例えば１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上または６０分以上の間継続し得る。いくつかの実施形態では、懸濁液が容易に穴または内腔を通って研和されるようになるまで研和を継続し得る。いくつかの実施形態では、最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続し得る。いくつかの実施形態では、各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続し得る。
いくつかの実施形態では、研和は、穴または内腔の系列、例えば、次第に小さくなる穴または内腔の系列に通す研和を含み得る。いくつかの実施形態では、穴または内腔の系列は、少なくとも２個の穴または内腔、例えば２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個またはそれ以上の穴または内腔を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の穴または内腔を、例えばＨＢＳＳまたは水で予めコートし得る。
単なる例示的実施形態として、複数の穴または内腔、例えば３個の穴または内腔に通して細胞を研和し得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約１．１ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施し得る。いくつかの実施形態では、１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施し得る。単なる例示的実施形態として、１番目の穴または内腔を標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペット（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ社銘柄の９”Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｉｐｅｔｔｅｓ：１３－６７８－２０Ｄ）により構成されるものとし、細胞を相当量の力で５分間、ピペットで吸引・吐出して懸濁液を研和し、細胞集塊および結合したあらゆる残骸を解離し得る。
いくつかの実施形態では、系列の最後の２つの開口部または内腔は、内径が約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、系列の最後の２つの開口部または内腔は、内径が約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、研和は、２番目から最後までの開口部または内腔までの約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含み得る。いくつかの実施形態では、研和は、２番目から最後までの開口部または内腔までの１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含み得る。
単なる例示的実施形態として、最後の２つの穴または内腔は、以下のように改変したピペットにより構成されるものであり得る：開口部が極めて小さい先端熱加工したピペットを２つ、以下のように作製する：標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを例えばブンゼンバーナーで加熱し、次いで、ピペットの遠位（溶解している）端を内腔が潰れ先端がちぎれるまで引っ張って伸ばし、ガラスの先端が穴の閉じた尖った状態にする。ピペットが冷めるまで待った後、穴の閉じた先端を極めて小さい内腔が確認できるまでちぎる。これと同じ工程を２本目のピペットにも繰り返すが、先端は１本目よりもやや近位のところでちぎり、遠位側の内腔を若干大きくする。大きい方の内腔は直径を約１００～１５０ミクロンにするべきであるのに対し、他方のピペットの内腔はこれより小さい約５０～７０ミクロンにするべきである。細胞懸濁液を内腔が大きい方のピペットで１０分間研和し得る。この後、内腔の小さい方（５０～７０ミクロン）のピペットでさらに１５分間研和し得る。懸濁液が内径の小さい方の先端熱加工したピペットの中を容易に上下するようになるまで研和を続ける。各ピペットは培地で予めコートしてもよい。このほか、研和する際には、空気を吸引することおよび細胞懸濁液に泡または気泡を生じさせることを避けなければならない。
いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約１～約２００サイクルの速度で実施してよく、例えば、懸濁液全体を開口部、内腔または穴に１分当たり１～１００回通す。いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約１０～約６０サイクルの速度で実施し得る。いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約４０サイクルの速度で実施し得る。いくつかの実施形態では、研和にピペットを使用する場合、懸濁液を１分当たり約２０回、ピペットで吸引・吐出し得る。
次の段階では、研和した細胞を懸濁液から単離し得る。いくつかの実施形態では、研和した懸濁液に約０～５０体積のＨＢＳＳを加え、懸濁液を約８００～１６００ｒｐｍで約１分～約３０分間遠心分離した後、上清を吸引し得る。いくつかの実施形態では、研和した懸濁液に約９体積のＨＢＳＳを加え、懸濁液を約１２００ｒｐｍで約５分間遠心分離した後、上清を吸引し得る。
次の段階では、細胞をＨＢＳＳに再懸濁させ、得られる懸濁液のｐＨを約５．０～約６．０にし得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．４～約５．８であり得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．６～約５．７であり得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．６であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．０～約５．７であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．３～約５．６であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．４であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０８細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を２×１０６の濃度で再懸濁させ得る。
単なる例示的な具体例として、前段落の再懸濁段階を以下のように実施することができる：溶液を酸性にする場合、ハンクス液に酸を加えた後直ちに、５ｍｌピペットを用いて溶液を１０秒間穏やかにピペッティングする。ＨＢＳＳは緩衝能が極めて低いため、前の懸濁液の上清から移った溶液が少しでもあると、ＨＢＳＳのｐＨが大幅に影響を受ける。以下の指示は、この実験の実施形態によるＳＴＡＰ細胞生成に最適なｐＨ５．６～５．７のＨＢＳＳを作製する方法を示すものである。最初に、予め冷却したＨＢＳＳ（４℃）のｐＨを１２ＮのＨＣｌでｐＨ５．６まで滴定する。この滴定は、ＨＢＳＳ ５０ｍｌに１２ＮのＨＣ１ １１．６μｌを徐々に加えることにより実施する。このｐＨを確認した後、溶液を０．２ミクロンのシリンジフィルターまたはボトルトップフィルターに通して保管用の新たな無菌容器に入れることにより滅菌する。例えば、しかるべき数の細胞を用いて最初の試験的実験を終えた時点で最終ｐＨが５．６～５．７であることを確認されたい。ＨＢＳＳのｐＨは極めて重要であるため、使用前にはその都度、溶液のｐＨを確認し、再度滴定し、再度滅菌する。
次の段階では、ＨＢＳＳ懸濁液の細胞をそのｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートし得る。例えば、哺乳動物細胞であれば約３７℃でインキュベートし得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約５分～約３時間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約１０分～約１時間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約１５分～約４０分間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約２５分間であり得る。
次の段階では、酸性ＨＢＳＳ溶液から細胞を単離する。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約８００ｒｐｍ～約１６００ｒｐｍで約１分～約２０分間遠心分離することによりペレット化し得る。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約１２００ｒｐｍで約５分間遠心分離することによりペレット化し得る。いくつかの実施形態では、次いで上清を吸引し得る。
次の段階では、細胞を多能性細胞の維持および／または選択に適した培地に再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、培地はスフィア培地である。本明細書で使用される「スフィア培地」は、１％の抗生物質および２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社、１２５８７－０１０）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を指す。いくつかの実施形態では、培地は、成長因子、例えばｂ－ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（０．２％、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０７９８０）をさらに含み得る。これらの因子は使用する細胞型に合わせて調整する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞がマウスの細胞である場合、ＬＩＦ（１０００Ｕ）を添加し得る。いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヘパリンなどの補給が必要であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を１０５細胞／ｃｃの濃度で培地に再懸濁させ得る。
次の段階では、細胞を培養および／または維持し得る、例えば５％ＣＯ２、３７℃で培養し得る。いくつかの実施形態では、細胞を培養／維持する間、細胞培養容器に付着するのを防ぐために攪拌し得る。いくつかの実施形態では、最初の１週間、細胞が皿の底に付着しないように１日２回、例えば５ｍｌピペットを用いて細胞を２分間穏やかにピペッティングし得る。いくつかの実施形態では、これにより良好なスフィア形成が促進され得る。いくつかの実施形態では、任意選択でサプリメントを含有するスフィア培地を１日置きに添加し得る。例えば、１０ｃｍの培養皿であれば１日当たり１ｍｌ／添加し、あるいは、６ｃｍの皿であれば１日当たり０．５ｍｌ添加する。
第二の実施形態では、例えば赤血球（ＲＢＣ）を含み得る軟部組織から多能性細胞またはＳＴＡＰ細胞を生成する方法が本明細書に提供される。このような組織としては、特に限定されないが、肝臓、脾臓および肺を挙げ得る。
第一の段階では、軟部組織（例えば、切り出して洗浄した無菌の器官組織）を機械的に薄切し、細切し、剥離し、かつ／または浸軟させる。いくつかの実施形態では、この段階を消化酵素および／またはＥＣＭを分解する酵素の存在下で実施し得る。いくつかの実施形態では、酵素はコラゲナーゼであり得る。本明細書では、組織のＥＣＭおよび結合組織の構成成分に基づき、消化に適したコラゲナーゼまたは酵素の種類が器官組織によって異なることを考慮する。当業者であれば、各組織型に適した酵素を容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、組織は脾臓であり、酵素を必要としない。単なる例示的な具体例として、解剖用のメスおよび／または鋏を用いて約１分～約３０分間、組織が一様にゼラチン状になったように見えるまで細切して剥離し、コラゲナーゼに曝露する表面積を増大させ得る。単なる例示的な具体例として、解剖用のメスおよび／または鋏を用いて約１０分間、組織を細切して剥離し得る。いくつかの実施形態では、追加の酵素を添加し、組織を任意選択で攪拌しながら酵素とインキュベートし得る。単なる１つの例として、組織を３７℃、９０ＲＰＭで３０分間、インキュベーター／振盪器に保管し得る。いくつかの実施形態では、酵素曝露および／または機械的破壊の後、組織をＨＢＳＳで希釈し得る。
次の段階では、懸濁液の細胞を研和し得る、例えば、例えばずり応力が生じる程度に小さい穴または内腔に通し得る。いくつかの実施形態では、研和を約１０分～約２時間、例えば約２０分～約１時間または約３０分の間継続し得る。いくつかの実施形態では、研和を少なくとも１０分、例えば１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上または６０分以上の間継続し得る。いくつかの実施形態では、懸濁液が容易に穴または内腔を通って研和されるようになるまで研和を継続し得る。いくつかの実施形態では、最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続し得る。いくつかの実施形態では、各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続し得る。
いくつかの実施形態では、研和は、穴または内腔の系列、例えば、次第に小さくなる穴または内腔の系列に通す研和を含み得る。いくつかの実施形態では、穴または内腔の系列は、少なくとも２個の穴または内腔、例えば２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個またはそれ以上の穴または内腔を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の穴または内腔を、例えばＨＢＳＳまたは水で予めコートし得る。
単なる例示的実施形態として、３個の穴または内腔に通して細胞を研和し得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の穴または内腔は内径が約１．１ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施し得る。いくつかの実施形態では、１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施し得る。単なる例示的実施形態として、１番目の穴または内腔を標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペット（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ社銘柄の９”Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｉｐｅｔｔｅｓ：１３－６７８－２０Ｄ）により構成されるものとし、細胞を相当量の力で５分間、ピペットで吸引・吐出して懸濁液を研和し、細胞集塊および結合したあらゆる残骸を解離し得る。
いくつかの実施形態では、系列の最後の２つの開口部または内腔は、内径が約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、開口部または内腔の系列の最後の２つの開口部または内腔は、内径が約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンであり得る。いくつかの実施形態では、研和は、２番目から最後までの開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含み得る。いくつかの実施形態では、研和は、２番目から最後までの開口部または内腔まで通す１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含み得る。
単なる例示的実施形態として、最後の２つの穴または内腔は、以下のように改変したピペットにより構成されるものであり得る：開口部が極めて小さい先端熱加工したピペットを２つ、以下のように作製する：標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットをブンゼンバーナーで加熱し、次いで、ピペットの遠位（溶解している）端を内腔が潰れ先端がちぎれるまで引っ張って伸ばし、ガラスの先端が穴の閉じた尖った状態にする。ピペットが冷めるまで待った後、穴の閉じた先端を極めて小さい内腔が確認できるまでちぎる。これと同じ工程を２本目のピペットにも繰り返すが、先端は１本目よりもやや近位のところでちぎり、遠位側の内腔を若干大きくする。大きい方の内腔は直径を約１００～１５０ミクロンにするべきであるのに対し、他方のピペットの内腔はこれより小さい約５０～７０ミクロンにするべきである。細胞懸濁液を内腔が大きい方のピペットに通して１０分間研和し得る。この後、内腔の小さい方（５０～７０ミクロン）のピペットに通してさらに１５分間研和し得る。懸濁液が内径の小さい方の先端熱加工したピペットの中を容易に上下するようになるまで研和を続ける。各ピペットは培地で予めコートしてもよい。このほか、研和する際には、空気を吸引することおよび細胞懸濁液に泡または気泡を生じさせることを避けなければならない。
いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約１～約２００サイクルの速度で実施してよく、例えば、懸濁液全体を開口部、内腔または穴に１分当たり１～１００回通す。いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約１０～約６０サイクルの速度で実施し得る。いくつかの実施形態では、研和を１分当たり約４０サイクルの速度で実施し得る。いくつかの実施形態では、研和にピペットを使用する場合、懸濁液を１分当たり約２０回、ピペットで吸引・吐出し得る。
次の段階では、非ＲＢＣ研和細胞を赤血から単離し得る。いくつかの実施形態では、研和した懸濁液に約０～５０体積のＨＢＳＳを加え、次いで、０．１～２０体積のＲＢＣ単離溶液を加え得る。当業者であれは、ＲＢＣを単離するための溶液、例えばｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅまたはＲＢＣ特異的抗体を有するビーズを知っている。
単なる例示的な実施形態として、研和終了後、細胞にＨＢＳＳを加え、次いで、チューブの底に１体積のＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅを加えて、良好な二重層を生じさせ得る。いくつかの実施形態では、２つの溶液が混ざらないようにするべきである。この混合物を１０００ｇで１０分間遠心分離し得る。チューブを１８０°回転させ、１０００ｇでさらに１０分間、再び遠心分離する。これにより、赤血球がチューブの底にペレットを形成する。標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを用いて、ＨＢＳＳとＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅとの間にある細胞懸濁液を吸引し、新たな５０ｍｌチューブに入れる。この懸濁液にＨＳＢＢの総体積が２０ｍｌになるまでＨＳＢＢを加え、次いで、５ｍｌピペットで１分間ピペッティングすることによって懸濁液をかき混ぜ得る。
次の段階では、ＨＢＳＳ溶液から細胞を単離する。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約８００ｒｐｍ～約１６００ｒｐｍで約１分～約２０分間遠心分離することによりペレット化し得る。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約１２００ｒｐｍで約５分間遠心分離することによりペレット化し得る。いくつかの実施形態では、次の段階で細胞をＨＢＳＳに再懸濁させ、得られる懸濁液のｐＨを約５．０～約６．０にし得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．４～約５．８であり得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．６～約５．７であり得る。いくつかの実施形態では、得られる懸濁液のｐＨは約５．６であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．０～約５．７であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．３～約５．６であり得る。いくつかの実施形態では、細胞と混合する前のＨＢＳＳ溶液のｐＨは約５．４であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を約２×１０４細胞／ｍＬ～約２×１０８細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を２×１０６の濃度で再懸濁させ得る。
単なる例示的な具体例として、前段落の再懸濁段階を以下のように実施することができる：溶液を酸性にする場合、ハンクス液に酸を加えた後直ちに、５ｍｌピペットを用いて溶液を１０秒間穏やかにピペッティングする。ＨＢＳＳは緩衝能が極めて低いため、前の懸濁液の上清から移った溶液が少しでもあると、ＨＢＳＳのｐＨが大幅に影響を受ける。以下の指示は、この実験の実施形態によるＳＴＡＰ細胞生成に最適なｐＨ５．６～５．７のＨＢＳＳを作製する方法を示すものである。最初に、予め冷却したＨＢＳＳ（４℃）のｐＨを１２ＮのＨＣｌでｐＨ５．６まで滴定する。この滴定は、ＨＢＳＳ ５０ｍｌに１２ＮのＨＣ１ １１．６μｌを徐々に加えることにより実施する。このｐＨを確認した後、溶液を０．２ミクロンのシリンジフィルターまたはボトルトップフィルターに通して保管用の新たな無菌容器に入れることにより滅菌する。しかるべき数の細胞を用いて最初の試験的実験を終えた時点で最終ｐＨが５．６～５．７であることを確認されたい。ＨＢＳＳのｐＨは極めて重要であるため、使用前にはその都度、溶液のｐＨを確認し、再度滴定し、再度滅菌する。
次の段階では、ＨＢＳＳ懸濁液の細胞をそのｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートし得る。例えば、哺乳動物細胞であれば約３７℃でインキュベートし得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約５分～約３時間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約１０分～約１時間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約１５分～約４０分間であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは約２５分間であり得る。
次の段階では、酸性ＨＢＳＳ溶液から細胞を単離する。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約８００ｒｐｍ～約１６００ｒｐｍで約１分～約２０分間遠心分離することによりペレット化し得る。単なる１つの例として、細胞を遠心管に入れ約１２００ｒｐｍで約５分間遠心分離することによりペレット化し得る。いくつかの実施形態では、次いで上清を吸引し得る。
次の段階では、細胞を多能性細胞の維持および／または選択に適した培地に再懸濁させ得る。いくつかの実施形態では、培地はスフィア培地である。本明細書で使用される「スフィア培地」は、１％の抗生物質および２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社、１２５８７－０１０）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を指す。いくつかの実施形態では、培地は、成長因子、例えばｂ－ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（０．２％、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０７９８０）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、細胞がマウスの細胞である場合、ＬＩＦ（１０００Ｕ）を添加し得る。いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヘパリンなどの補給が必要であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を１０５細胞／ｃｃの濃度で培地に再懸濁させ得る。
次の段階では、細胞を例えば５％ＣＯ２、３７℃で培養および／または維持し得る。いくつかの実施形態では、細胞を培養／維持する間、細胞培養容器に付着するのを防ぐために攪拌し得る。いくつかの実施形態では、最初の１週間、細胞が皿の底に付着しないように１日２回、５ｍｌピペットを用いて細胞を２分間穏やかにピペッティングし得る。いくつかの実施形態では、これにより良好なスフィア形成が促進され得る。いくつかの実施形態では、任意選択でサプリメントを含有するスフィア培地を１日置きに添加し得る。例えば、１０ｃｍの培養皿であれば１日当たり１ｍｌ添加し、あるいは、６ｃｍの皿であれば１日当たり０．５ｍｌ添加する。
一態様では、脊椎動物の神経学的損傷を治療する方法が本明細書に記載され、この方法は、神経学的損傷の治療を必要とする脊椎動物に本明細書に記載される脊椎動物の多能性細胞（本明細書に記載される「より多能性の高い」細胞を含む）細胞またはＳＴＡＰ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与する細胞は、本明細書に記載される改善された方法、例えば、すぐ上の２つの態様および／または実施例５の方法によって生成した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞を足場、ヒドロゲルまたは遅延放出製剤の形で投与し得る。いくつかの実施形態では、細胞は脊椎動物に対して自家性であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を神経組織から生成する。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、神経毒曝露、急性神経損傷、慢性神経損傷および／または神経変性疾患の治療を必要とするものである。いくつかの実施形態では、神経学的損傷は、脊髄、神経および／または脳への損傷を含み得る。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットであり得る。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、イヌ科の動物、ネコ科の動物、イヌ、ネコ、飼育動物、ウマまたは霊長類、例えばヒトであり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、反復投与、例えば２回以上、３回以上、４回以上またはそれ以上の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、損傷部位に細胞を投与し得る、例えば外科的に埋植し、かつ／または注射し得る。
一態様では、穴の直径が約９０～約２００ミクロンのピペットおよび／または穴の直径が約２５ミクロン～約９０ミクロンのピペットを含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第一のピペットは穴の直径が約１００～約１５０ミクロンであり、第二のピペットは穴の直径が約５０ミクロン～約７０ミクロンである。
いくつかの実施形態では、キットは、穴の直径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍの追加のピペットをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ピペットは、穴の直径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、ピペットは、穴の直径が１．１ｍｍであり得る。
いくつかの実施形態では、別法として、ピペットに関して上に記載した直径の開口部および／または内腔を有する装置、例えば、記載される内径の開口部または内腔を有するマイクロ流体デバイスを有する、キットが提供され得る。
いくつかの実施形態では、キットはＨＢＳＳをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＢＳＳはｐＨが約５．０～約５．７であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＢＳＳはｐＨが約５．３～約５．６であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＢＳＳはｐＨが約５．４であり得る。いくつかの実施形態では、コットは、ＨＢＳＳのｐＨを滴定する酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、酸はＨＣ１である。いくつかの実施形態では、キットは、スフィア培地と、任意選択で成長因子とをさらに含み得る。
キットは、本明細書の様々な実施形態による多電極アレイを少なくとも１つ含む任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）であり、この製品は、本明細書に記載される方法またはアッセイを実施する単位として促進、配布または販売される。本明細書に記載されるキットは、多能性細胞の生成、培養および／または選択を可能にする試薬および／または構成要素を含む。本明細書に記載されるキットは任意選択で、本明細書に記載される方法およびアッセイを実施するのに有用な追加の構成要素を含み得る。このような試薬としては、例えば細胞培地、成長因子、分化因子、緩衝液、標識、イメージング試薬などを挙げ得る。このような成分は当業者に公知であり、具体的な細胞および実施する方法またはアッセイに応じて異なり得る。さらに、キットは、取扱説明パンフレットを含むものであってもよく、かつ／または得られる結果の妥当性に関する情報を提供するものであってもよい。
本開示の実施形態に関する記載は、網羅的なものでも、本開示を開示される正確な形態に限定するものでもないことが意図される。本明細書には例示目的で本開示の特定の実施形態および実施例が記載されるが、当業者に理解される通り、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の段階または機能が所与の順序で記載されるが、代替的実施形態では、異なる順序で機能を実施してもよく、または実質的に同時に機能を実施してもよい。本明細書に提供される本開示の教示を必要に応じて、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態を組合せて、また別の実施形態とすることができる。本開示の態様を必要に応じて、上記の参考文献および出願の組成物、機能および概念を用いるよう修正して、本開示のまた別の実施形態とすることができる。「詳細な説明」を踏まえれば、本開示に上記のものをはじめとする改変を施すことができる。
上記のいずれかの実施形態の特定の要素を他の実施形態の要素と組み合わせるか、これに置き換えることができる。さらに、本開示の特定の実施形態に付随する利点がその実施形態に関連して記載されているが、それ以外の実施形態もそのような利点を示すことがあるほか、本開示の範囲内に収まるのに必ずしもすべての実施形態がそのような利点を示す必要はない。
特定される特許をはじめとする刊行物はいずれも、例えばそのような刊行物に記載され本発明に関連して用い得る方法論の説明および開示を目的として参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、単に本願の出願日よりも前に開示されているという理由で記載するものである。これに関するいかなる事柄も、そのような開示が先行発明であるという理由またはそれ以外の何らかの理由で、本発明者らにはそれに先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文献の日付および内容の表示に関する記載はいずれも、本出願者が入手可能な情報に基づくものであって、これらの文献の日付および内容が正確であることを何ら認めるものではない。
本発明を以下の例によって説明するが、これらは限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号を付した項のいずれかによって定義され得る：
１．細胞をストレスに曝すことを含む、多能性細胞を生成する方法。
２．外来遺伝子も、転写産物も、タンパク質も、核成分も、細胞質も導入せず、細胞融合も実施せずに多能性細胞を生成する、項１に記載の方法。
３．多能性を示す細胞を選択することをさらに含む、項１～２のいずれかに記載の方法。
４．細胞が組織の一部として存在しない、項１～３のいずれかに記載の方法。
５．細胞が、体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、項１～４のいずれかに記載の方法。
６．細胞が単離細胞である、項１～５のいずれかに記載の方法。
７．細胞が、不均一な細胞集団に存在する、項１～６のいずれかに記載の方法。
８．細胞が、均一な細胞集団に存在する、項１～７のいずれかに記載の方法。
９．多能性を示す細胞を選択することが、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを含む、項１～８のいずれかに記載の方法。
１０．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、項９のいずれかに記載の方法。
１１．多能性を示す細胞を選択することが、付着性でない細胞を選択することを含む、項１～１０のいずれかに記載の方法。
１２．ストレスが、組織または細胞培養物の非生理的ストレスを含む、項１～１１のいずれかに記載の方法。
１３．ストレスが、外傷、機械的刺激、化学物質曝露、超音波刺激、酸素欠乏、放射線照射、極端な温度への曝露、解離、研和、物理的ストレス、高浸透圧、低浸透圧、膜損傷、毒素、極端なイオン濃度、活性酸素、ＵＶ曝露、強い可視光、必須栄養素の欠乏または非生理的酸性環境から選択される少なくとも１つの環境刺激に細胞を曝露することを含む、項１～１２のいずれかに記載の方法。
１４．ストレスが、細胞を約３．０～約６．８のｐＨに曝露することを含む、項１～１３のいずれかに記載の方法。
１５．ストレスが、細胞を約４．５～約６．０のｐＨに曝露することを含む、項１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．ストレスが、細胞を約５．４～約５．８のｐＨに曝露することを含む、項１５に記載の方法。
１７．細胞を２～３日間曝露する、項１２～１６のいずれかに記載の方法。
１８．細胞を１日以下の間曝露する、項１２～１７のいずれかに記載の方法。
１９．細胞を１時間以下の間曝露する、項１２～１８のいずれかに記載の方法。
２０．細胞を約３０分間曝露する、項１２～１９のいずれかに記載の方法。
２１．極端な温度への曝露が、細胞を３５℃未満または４２℃超の温度に曝露することを含む、項１３に記載の方法。
２２．極端な温度への曝露が、細胞を氷点もしくは氷点下の温度に曝露することまたは細胞を少なくとも約８５℃の温度に曝露することを含む、項２１に記載の方法。
２３．機械的刺激が、細胞をずり応力または／および高圧に曝露することを含む、項１３に記載の方法。
２４．機械的刺激が、細胞を細胞の大きさよりも小さい開口部を有する少なくとも１つの装置に通すことを含む、項２３に記載の方法。
２５．機械的刺激が、細胞を次第に小さくなる開口部を有する複数の装置に通すことを含む、項２３に記載の方法。
２６．多能性細胞を培養して多能性細胞を増殖させることをさらに含む、項１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、項１～２６のいずれかに記載の方法。
２８．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、項２７に記載の方法。
２９．細胞が哺乳動物細胞である、項１～２８のいずれかに記載の方法。
３０．細胞がヒト細胞である、項１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．細胞が、成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊膜細胞または臍帯血細胞である、項１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．多能性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することをさらに含む、項１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．細胞のエピジェネティック状態を変化させて、胚性幹細胞のエピジェネティック状態にさらに類似させる、項１～３２のいずれかに記載の方法。
３４．エピジェネティック状態がメチル化パターンを含む、項３３に記載の方法。
３５．ストレスが、細胞から細胞質の少なくとも約４０％を除去することを含む、項１～３４のいずれかに記載の方法。
３６．細胞から細胞質の少なくとも約５０％を除去することを含む、項３５に記載の方法。
３７．細胞から細胞質の少なくとも約６０％を除去することを含む、項３６に記載の方法。
３８．細胞から細胞質の６０～８０％を除去することを含む、項３７に記載の方法。
３９．細胞から細胞質の少なくとも約８０％を除去することを含む、項３７に記載の方法。
４０．細胞から細胞質の少なくとも約９０％を除去することを含む、項３９に記載の方法。
４１．ストレスが、細胞からミトコンドリアの少なくとも約４０％を除去することを含む、項１～４０のいずれかに記載の方法。
４２．細胞質の一部の除去により、細胞質からミトコンドリアの少なくとも約５０％が除去される、項４１に記載の方法。
４３．細胞質またはミトコンドリアの除去により、細胞質からミトコンドリアの約５０％～９０％が除去される、項４２に記載の方法。
４４．細胞質またはミトコンドリアの除去により、細胞質からミトコンドリアの９０％超が除去される、項４２に記載の方法。
４５．ストレスが、それに曝露した細胞の少なくとも１０％の細胞膜を崩壊させるのに十分なものである、項１～４４のいずれかに記載の方法。
４６．項１～４５のいずれかに記載の方法により作製した多能性細胞と候補薬剤とを接触させることを含む、アッセイ。
４７．多能性細胞の生存能、分化、増殖のうちの１つまたは複数に影響を及ぼす薬剤を特定するために用いる、項４６に記載のアッセイ。
４８．項１～４５のいずれか１項に記載の方法により作製した多能性細胞の、対象の細胞治療の方法への使用。
４９．対象に実施する細胞治療に適合性のある細胞または組織を調製する方法であって、
項１～４５のいずれか１項に従って細胞から多能性細胞を生成することを含み、
細胞が自家細胞またはＨＬＡ適合同種細胞である、
方法。
５０．細胞または組織を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項４９に記載の方法。
５１．多能性細胞を含み、多能性細胞が、項１～４５のいずれかに記載の方法により細胞から生成される、組成物。
５２．多能性幹細胞を作製する方法であって、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で細胞を培養することを含む、方法。
５３．ＡＣＴＨを含むＬＩＦ培地で細胞を培養する、項５２に記載の方法。
５４．ＡＣＴＨが、約０．１μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、項５２または５３に記載の方法。
５５．細胞が、項１～４５のいずれかに記載の方法により生成される細胞である、項５２～５４のいずれかに記載の方法。
５６．細胞が全能性細胞である、項５２～５５のいずれかに記載の方法。
５７．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも３日間培養する、項５２～５６のいずれかに記載の方法。
５８．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも５日間培養する、項５２～５７のいずれかに記載の方法。
５９．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも７日間培養する、項５２～５８のいずれかに記載の方法。
６０．培養段階の後、細胞が、Ｏｃｔ３／４；Ｎａｎｏｇ；Ｒｅｘ１；Ｋｌｆ４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ２；Ｅｓｒｒ－ベータ；Ｔｂｘ３；およびＫｌｆ５からなる群より選択される幹細胞マーカーを検出可能なレベルで発現する、項５２～５９のいずれかに記載の方法。
６１．多能性細胞の自己複製能を増大させる方法であって、細胞を副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で培養することを含む、方法。
６２．ＡＣＴＨを含むＬＩＦ培地で細胞を培養することを含む、項６１に記載の方法。
６３．ＡＣＴＨが、約０．１μＭ～約１００μＭの濃度で存在する、項６１～６２のいずれかに記載の方法。
６４．細胞が、項１～４５のいずれかに記載の方法により生成される細胞である、項６１～６３のいずれかに記載の方法。
６５．細胞が全能性細胞である、項６１～６４のいずれかに記載の方法。
６６．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも３日間培養する、項６１～６５のいずれかに記載の方法。
６７．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも５日間培養する、項６１～６６のいずれかに記載の方法。
６８．細胞をＡＣＴＨ、２ｉまたは３ｉ培地の存在下で少なくとも７日間培養する、項６１～６７のいずれかに記載の方法。
６９．培養段階の後、細胞が、Ｏｃｔ３／４；Ｎａｎｏｇ；Ｒｅｘ１；Ｋｌｆ４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ２；Ｅｓｒｒ－ベータ；Ｔｂｘ３；およびＫｌｆ５からなる群より選択される幹細胞マーカーを検出可能なレベルで発現する、項６１～６８のいずれかに記載の方法。
７０．細胞治療を必要とする対象の自家細胞治療の方法であって、
ａ．対象から採取した細胞から項１～４５のいずれか１項に従って多能性細胞を生成することと、
ｂ．多能性細胞またはその分化した子孫を含む組成物を対象に投与することと
を含む、方法。
７１．組成物を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項７０に記載の方法。
７２．胎盤細胞に分化することが可能な多能性細胞を作製する方法であって、項１～４５のいずれかに記載の方法により作製した多能性細胞をＦＧＦ４の存在下で培養することを含む、方法。
７３．ＦＧＦ４の濃度が１ｎＭ～１μＭである、項７２に記載の方法。
７４．多能性細胞が胚性幹細胞に分化することが可能である、項７２または７３に記載の方法。
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号を付した項のいずれかによって定義され得る：
１．多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離すること；
ｂ．段階ａで得られた細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁させること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｄ．細胞懸濁液に約２～約２０体積のＨＢＳＳを加えること；
ｅ．段階ｄで得られた懸濁液から細胞を単離すること；
ｆ．段階ｅで得られた細胞をｐＨが約５．０～約６．０のＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｇ．細胞をその自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｈ．段階ｇで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｉ．段階ｈで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、方法。
２．単離することに遠心分離が含まれる、項１に記載の方法。
３．段階ａの前に最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、項１～２のいずれかに記載の方法。
４．段階ａの前に最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、項３に記載の方法。
５．細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることによりトリプシンが失活する、項３～４のいずれかに記載の方法。
６．段階ｃの研和が、細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項１～５のいずれかに記載の方法。
７．系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項６に記載の方法。
８．少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項６～７のいずれかに記載の方法。
９．１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項６～８のいずれかに記載の方法。
１０．１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項９に記載の方法。
１１．１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項１０に記載の方法。
１２．１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項６～１１のいずれかに記載の方法。
１３．１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項１２に記載の方法。
１４．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項６～１３のいずれかに記載の方法。
１５．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項１４に記載の方法。
１６．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、項１６に記載の方法。
１８．最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続する、項６～１７のいずれかに記載の方法。
１９．各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通過するようになるまで継続する、項６～１８のいずれかに記載の方法。
２０．研和の合計時間が約３０分である、項１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．段階ｄで約５～約１５体積のＨＢＳＳを加える、項１～２０のいずれかに記載の方法。
２２．段階ｄで約１０体積のＨＢＳＳを加える、項１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．段階ｆのＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項１～２２のいずれかに記載の方法。
２４．段階ｆのＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．段階ｆで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項１～２４のいずれかに記載の方法。
２６．段階ｆで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．段階ｆが、細胞を約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度になるよう再懸濁させることを含む、項１～２６のいずれかに記載の方法。
２８．段階ｆが、細胞を約２００万細胞／ｍＬの濃度になるよう再懸濁させることを含む、項１～２７のいずれかに記載の方法。
２９．段階ｇが、細胞を約３７℃で約２５分間インキュベートすることを含む、項１～２８のいずれかに記載の方法。
３０．段階ｇと段階ｈとを併せて約１０分～約１時間継続する、項１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．段階ｇと段階ｈとを併せて約３０分間継続する、項１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．段階ｉの培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項３２に記載の方法。
３４．多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で組織を機械的に細切すること；
ｂ．段階ａで得られた試料を、組織を攪拌しながら組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞をＨＢＳＳで希釈すること；
ｄ．段階ｃで得られた懸濁液から細胞を単離すること；
ｅ．段階ｄで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｆ．段階ｅで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｇ．段階ｆで得られた細胞懸濁液に約０．１～約１０体積のＲＢＣ単離溶液を加えて二重層を生じさせること；
ｈ．段階ｇで得られたＨＢＳＳ層をＲＢＣ単離溶液層から分離すること；
ｉ．段階ｈで得られたＨＢＳＳ懸濁液から細胞を単離すること；
ｊ．段階ｉで得られた細胞をｐＨが約５．０～約６．０のＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｋ．細胞を組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｌ．段階ｋで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｍ．段階ｌで得られた細胞を培地に再懸濁させること
を含む、
方法。
３５．赤血球を含む組織が、
肺；脾臓；および肝臓
からなる群より選択される、項３４に記載の方法。
３６．組織が肺であり、ＥＣＭ分解酵素がコレゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ）Ｐである、項３４～３５のいずれかに記載の方法。
３７．段階ａの細切を約１０分間継続する、項３４～３６のいずれかに記載の方法。
３８．段階ｆの研和が、細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項３４～３７のいずれかに記載の方法。
３９．系列が少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項３８に記載の方法。
４０．少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項３８～３９のいずれかに記載の方法。
４１．１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項３８～４０のいずれかに記載の方法。
４２．１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項４１に記載の方法。
４３．１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項４２に記載の方法。
４４．１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項３８～４３のいずれかに記載の方法。
４５．１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項４４に記載の方法。
４６．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項３８～４５のいずれかに記載の方法。
４７．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項４６に記載の方法。
４８．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項３８～４７のいずれかに記載の方法。
４９．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、項４８に記載の方法。
５０．最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項３４～４９のいずれかに記載の方法。
５１．各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項３４～５０のいずれかに記載の方法。
５２．研和の合計時間が約３０分である、項３４～５１のいずれかに記載の方法。
５３．段階ｊのＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項３４～５２のいずれかに記載の方法。
５４．段階ｊのＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項５３に記載の方法。
５５．段階ｊで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項３４～５４のいずれかに記載の方法。
５６．段階ｊで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項５５に記載の方法。
５７．段階ｋが、細胞を約３７℃で約２５分間インキュベートすることを含む、項３４～５６のいずれかに記載の方法。
５８．段階ｋと段階ｌとを併せて約１０分～約１時間継続する、項３４～５７のいずれかに記載の方法。
５９．段階ｍの培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、１％の抗生物質と、１％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項３４～５８のいずれかに記載の方法。
６０．成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項５９に記載の方法。
６１．最初の細胞がマウス細胞であり、スフィア培地がＬＩＦを含む、項１～６０のいずれかに記載の方法。
６２．得られた細胞を少なくとも１週間培養する段階をさらに含み、
培養が、
ａ．任意選択で成長因子を含む、スフィア培地を添加することと、
ｂ．皿の底に付着しないように細胞を攪拌することと
を含む、
項１～６１のいずれかに記載の方法。
６３．スフィア培地を１～４日ごとに添加する、項６２に記載の方法。
６４．スフィア培地を２日ごとに添加する、項６３に記載の方法。
６５．撹拌が、ピペットによる細胞のピペッティングを含む、項６２～６４のいずれかに記載の方法。
６６．ピペットの穴の直径が約１．１ｍｍである、項６５に記載の方法。
６７．ピペッティングを少なくとも１日１回実施する、項６５～６６のいずれかに記載の方法。
６８．ピペッティングを少なくとも１日２回実施する、項６７に記載の方法。
６９．多能性を有する細胞を選択することをさらに含み、
選択することが、
付着性の低い細胞を選択すること；スフィアの構成要素である細胞を選択すること；および相対的な大きさが小さい細胞を選択すること
からなる群より選択される方法を含む、
項１～６８のいずれかに記載の方法。
７０．多能性を示す細胞を選択する最終段階をさらに含む、項１～６９のいずれかに記載の方法。
７１．最初の細胞が組織の一部として存在しない、項１～７０のいずれかに記載の方法。
７２．最初の細胞が、体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、項１～７１のいずれかに記載の方法。
７３．最初の細胞が単離細胞である、項１～７２のいずれかに記載の方法。
７４．最初の細胞が不均一な細胞集団に存在する、項１～７３のいずれかに記載の方法。 ７５．最初の細胞が均一な細胞集団に存在する、項１～７４のいずれかに記載の方法。
７６．多能性を示す細胞を選択することが、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを含む、項１～７５のいずれかに記載の方法。
７７．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、項７６のいずれかに記載の方法。
７８．多能性を示す細胞を選択することが、付着性でない細胞を選択することを含む、項１～７７のいずれかに記載の方法。
７９．多能性細胞を培養して多能性細胞を増殖させることをさらに含む、項１～７８のいずれかに記載の方法。
８０．多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、項１～７９のいずれかに記載の方法。
８１．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、項８０に記載の方法。
８２．最初の細胞が哺乳動物細胞である、項１～８１のいずれかに記載の方法。
８３．最初の細胞がヒト細胞である、項１～８２のいずれかに記載の方法。
８４．最初の細胞が、成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊膜細胞または臍帯血細胞である、項１～８３のいずれかに記載の方法。
８５．多能性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することをさらに含む、項１～８４のいずれかに記載の方法。
８６．項１～８５のいずれかに記載の方法により作製した多能性細胞と候補薬剤とを接触させることを含む、アッセイ。
８７．多能性細胞の生存能、分化、増殖のうちの１つまたは複数に影響を及ぼす薬剤を特定するのに用いる、項８６に記載のアッセイ。
８８．項１～８５のいずれか１項に記載の方法により作製した多能性細胞の、対象の細胞治療の方法へ使用。
８９．対象に実施する細胞治療に適合性のある細胞または組織を調製する方法であって、
項１～８５のいずれか１項に従って細胞から多能性細胞を生成することを含み；
細胞が、自家細胞またはＨＬＡ適合同種細胞である、
方法。
９０．細胞または組織を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項８９に記載の方法。
９１．多能性細胞を含み、多能性細胞が、項１～８５のいずれかに記載の方法により細胞から生成される、組成物。
９２．細胞治療を必要とする対象の自家細胞治療の方法であって、
ａ．対象から採取した細胞から項１～８５のいずれか１項に従って多能性細胞を生成することと、
ｂ．多能性細胞またはその分化した子孫を含む組成物を対象に投与することと
を含む、方法。
９３．組成物を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項９２に記載の方法。
９４．２つのピペットを含み、第一のピペットの穴の直径が約９０～約２００ミクロンであり、第二のピペットの穴の直径が約２５ミクロン～約９０ミクロンである、キット。
９５．第一のピペットの穴の直径が約１００～約１５０ミクロンであり、第二のピペットの穴の直径が約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項９４に記載のキット。
９６．ＨＢＳＳをさらに含む、項９４～９５のいずれかに記載のキット。
９７．ＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項９４～９６に記載のキット。
９８．ＨＢＳＳのｐＨを滴定する酸をさらに含む、項９６～９７のいずれかに記載のキット。
９９．酸がＨＣ１である、項９８に記載のキット。
１００．スフィア培地と任意選択で成長因子とを含む、項９４～９９のいずれかに記載のキット。
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号を付した項のいずれかによって定義され得る：
１．多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離すること；
ｂ．段階ａで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液に再懸濁させること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｄ．段階ｃで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｅ．段階ｄで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｆ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、方法。
２．多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離すること
ｂ．段階ａで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液に再懸濁させること；
ｃ．段階ｂで得られた懸濁液から細胞を単離すること；
ｄ．段階ｃで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液に再懸濁させて細胞懸濁液にすること
ｅ．段階ｄで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｆ．段階ｅで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｇ．段階ｆで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｈ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、方法。
３．ＡＴＰが、ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約１．５～約５ｍｇ／ｃｃの濃度で存在する、請求項１～２のいずれかに記載の方法。
４．ＡＴＰが、ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約２．７ｍＭ～約９ｍＭの濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
５．ＨＢＳＳ溶液を所望のｐＨに達するまでＡＴＰ溶液で滴定することにより、ｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液を調製する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
６．ＡＴＰ溶液の濃度が約５０ｍＭ～約５００ｍＭである、請求項５に記載の方法。
７．ＡＴＰ溶液の濃度が約２００ｍＭである、請求項６に記載の方法。
８．ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０～約５．７である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
９．ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
１０．請求項６２の段階ｆおよび請求項６１の段階ｄのＨＢＳＳがＡＴＰを含まない、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
１１．単離することが遠心分離を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
１２．段階ａの前に最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
１３．段階ａの前に最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
１４．細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることによりトリプシンが失活する、請求項１２～１３のいずれかに記載の方法。
１５．研和が、直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して細胞を研和することを含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、請求項１５に記載の方法。
１７．少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、請求項１５～１６のいずれかに記載の方法。
１８．１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、請求項１５～１７のいずれかに記載の方法。
１９．１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、請求項１８に記載の方法。
２０．１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、請求項１９に記載の方法。
２１．１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、請求項１５～２０のいずれかに記載の方法。
２２．１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、請求項２１に記載の方法。
２３．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、請求項１５～２２のいずれかに記載の方法。
２４．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、請求項２３に記載の方法。
２５．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
２６．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、請求項２５に記載の方法。
２７．最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、請求項１５～２６のいずれかに記載の方法。
２８．各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、請求項１５～２７のいずれかに記載の方法。
２９．研和の合計時間が約３０分である、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。
３０．研和後の約５～約１５体積のＨＢＳＳである、請求項１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．研和後の約１０体積のＨＢＳＳである、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．研和後に加えるＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、請求項１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．研和後に加えるＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、請求項１～３２のいずれかに記載の方法。
３４．請求項６２の段階ｆまたは請求項６１の段階ｄで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、請求項１～３３のいずれかに記載の方法。
３５．請求項６２の段階ｆまたは請求項６１の段階ｄで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、請求項１～３３のいずれかに記載の方法。
３６．研和後にＨＢＳＳを加えた後、細胞が約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～３５のいずれかに記載の方法。
３７．研和後にＨＢＳＳを加えた後、細胞が約２００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～３６のいずれかに記載の方法。
３８．培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、請求項１～３７のいずれかに記載の方法。
３９．成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、請求項３８に記載の方法。
４０．多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で組織を機械的に細切すること；
ｂ．段階ａで得られた試料を、組織を攪拌しながら組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液で希釈すること；
ｄ．段階ｃで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｅ．段階ｄで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｆ．段階ｅで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｇ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、
方法。
４１．多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．Ｍ１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で組織を機械的に細切すること；
ｂ．段階ａで得られた試料を、組織を攪拌しながら組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液で希釈すること；
ｄ．段階ｂで得られた懸濁液から細胞を単離すること；
ｅ．段階ｃで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液に再懸濁させて細胞懸濁液にすること；
ｆ．段階ｄで得られた細胞懸濁液を研和すること；
ｇ．段階ｅで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること；
ｈ．段階ｆで得られた懸濁液から細胞を単離すること；および
ｉ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、
方法。
４２．赤血球を含む組織が、
肺；脾臓；および肝臓
からなる群より選択される、請求項４０～４１のいずれかに記載の方法。
４３．組織が肺であり、ＥＣＭ分解酵素がコレゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ）Ｐである、請求項４０～４２のいずれかに記載の方法。
４４．段階ａの細切を約１０分間継続する、請求項４０～４３のいずれかに記載の方法。
４５．ＡＴＰが、ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約１．５～約５ｍｇ／ｃｃの濃度で存在する、請求項４０～４４のいずれかに記載の方法。
４６．ＡＴＰが、ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約２．７ｍＭ～約９ｍＭの濃度で存在する、請求項４５に記載の方法。
４７．ＨＢＳＳ溶液を所望のｐＨに達するまでＡＴＰ溶液で滴定することにより、ｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液を調製する、請求項４０～４６のいずれかに記載の方法。
４８．ＡＴＰ溶液の濃度が約５０ｍＭ～約５００ｍＭである、請求項４７に記載の方法。
４９．ＡＴＰ溶液の濃度が約２００ｍＭである、請求項４８に記載の方法。
５０．ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０～約５．７である、請求項４０～４９のいずれかに記載の方法。
５１．ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０である、請求項４０～５０のいずれかに記載の方法。
５２．請求項１０１の段階ｇおよび請求項１００の段階ｅのＨＢＳＳがＡＴＰを含まない、請求項４０～５０のいずれかに記載の方法。
５３．単離することが遠心分離を含む、請求項４０～５０のいずれかに記載の方法。
５４．段階ｃの前に最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、請求項４０～５３のいずれかに記載の方法。
５５．段階ｃの前に最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
５６．細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることによりトリプシンが失活する、請求項５４～５５のいずれかに記載の方法。
５７．研和が、細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、請求項４０～５７のいずれかに記載の方法。
５８．系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、請求項５７に記載の方法。
５９．少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、請求項４０～５８のいずれかに記載の方法。
６０．１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、請求項４０～５９のいずれかに記載の方法。
６１．１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、請求項６０に記載の方法。
６２．１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、請求項６１に記載の方法。
６３．１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、請求項４０～６２のいずれかに記載の方法。
６４．１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、請求項４０～６３に記載の方法。
６５．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、請求項４０～６４のいずれかに記載の方法。
６６．系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、請求項６５に記載の方法。
６７．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、請求項４０～６６のいずれかに記載の方法。
６８．研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、請求項６７に記載の方法。
６９．最後の開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、請求項４０～６８のいずれかに記載の方法。
７０．各開口部または内腔での研和を、懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、請求項４０～６９のいずれかに記載の方法。
７１．研和の合計時間が約３０分である、請求項４０～７０のいずれかに記載の方法。
７２．研和後の約５～約１５体積のＨＢＳＳである、請求項４０～７１のいずれかに記載の方法。
７３．研和後の約１０体積のＨＢＳＳである、請求項４０～７２のいずれかに記載の方法。
７４．研和後に加えるＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、請求項４０～７３のいずれかに記載の方法。
７５．研和後に加えるＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、請求項４０～７４のいずれかに記載の方法。
７６．請求項１０１の段階ｇまたは請求項１００の段階ｅで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、請求項４０～７５のいずれかに記載の方法。
７７．請求項１０１の段階ｇまたは請求項１００の段階ｅで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、請求項４０～７６のいずれかに記載の方法。
７８．研和後にＨＢＳＳを加えた後、細胞が約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項４０～７７のいずれかに記載の方法。
７９．研和後にＨＢＳＳを加えた後、細胞が約２００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項４０～７８のいずれかに記載の方法。
８０．培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、請求項４０～７９のいずれかに記載の方法。
８１．成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、請求項８０に記載の方法。
８２．最初の細胞がマウス細胞であり、スフィア培地がＬＩＦを含む、請求項１～８１のいずれかに記載の方法。
８３．得られた細胞を少なくとも１週間培養する段階をさらに含み、
培養が、
ｊ．任意選択で成長因子を含む、スフィア培地を添加することと、
ｋ．皿の底に付着しないように細胞を攪拌することと
を含む、
請求項１～８１のいずれかに記載の方法。
８４．スフィア培地を１～４日ごとに添加する、請求項８３に記載の方法。
８５．スフィア培地を２日ごとに添加する、請求項８３に記載の方法。
８６．撹拌が、ピペットによる細胞のピペッティングを含む、請求項８２～８５のいずれかに記載の方法。
８７．ピペットの穴の直径が約１．１ｍｍである、請求項８６に記載の方法。
８８．ピペッティングを少なくとも１日１回実施する、請求項８６～８７のいずれかに記載の方法。
８９．ピペッティングを少なくとも１日２回実施する、請求項８８に記載の方法。
９０．多能性を有する細胞を選択することをさらに含み、
選択することが、
付着性の低い細胞を選択すること；スフィアの構成要素である細胞を選択すること；および相対的な大きさが小さい細胞を選択すること
からなる群より選択される方法を含む、
請求項１～８９のいずれかに記載の方法。
９１．多能性を示す細胞を選択する最終段階をさらに含む、請求項１～９０のいずれかに記載の方法。
９２．最初の細胞が組織の一部として存在しない、請求項１～９１のいずれかに記載の方法。
９３．最初の細胞が、体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、請求項１～９２のいずれかに記載の方法。
９４．最初の細胞が単離細胞である、請求項１～９３のいずれかに記載の方法。
９５．最初の細胞が不均一な細胞集団に存在する、請求項１～９４のいずれかに記載の方法。
９６．最初の細胞が均一な細胞集団に存在する、請求項１～９５のいずれかに記載の方法。
９７．多能性を示す細胞を選択することが、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを含む、請求項１～９６のいずれかに記載の方法。
９８．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、請求項９７のいずれかに記載の方法。
９９．多能性を示す細胞を選択することが、付着性でない細胞を選択することを含む、請求項１～９８のいずれかに記載の方法。
１００．多能性細胞を培養して多能性細胞を増殖させることをさらに含む、請求項１～９９のいずれかに記載の方法。
１０１．多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、請求項１～１００のいずれかに記載の方法。
１０２．幹細胞マーカーが、
Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４
からなる群より選択される、請求項１０１に記載の方法。
１０３．最初の細胞が哺乳動物細胞である、請求項１～１０２のいずれかに記載の方法。
１０４．最初の細胞がヒト細胞である、請求項１～１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．最初の細胞が、成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊膜細胞または臍帯血細胞である、請求項１～１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．多能性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することをさらに含む、請求項１～１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．請求項１～１０６のいずれかに記載の方法により作製した多能性細胞と候補薬剤とを接触させることを含む、アッセイ。
１０８．多能性細胞の生存能、分化、増殖のうちの１つまたは複数に影響を及ぼす薬剤を特定するのに用いる、請求項１０７に記載のアッセイ。
１０９．請求項１～１０６のいずれか１項に記載の方法により作製した多能性細胞の、対象の細胞治療の方法へ使用。
１１０．対象に実施する細胞治療に適合性のある細胞または組織を調製する方法であって、
請求項１～１０６のいずれか１項に従って細胞から多能性細胞を生成することを含み；
細胞が、自家細胞またはＨＬＡ適合同種細胞である、
方法。
１１１．細胞または組織を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
１１２．多能性細胞を含み、多能性細胞が、請求項１～１０６のいずれかに記載の方法により細胞から生成される、組成物。
１１３．細胞治療を必要とする対象の自家細胞治療の方法であって、
ｃ．対象から採取した細胞から請求項１～１０６のいずれか１項に従って多能性細胞を生成することと、
ｄ．多能性細胞またはその分化した子孫を含む組成物を対象に投与することと
を含む、方法。
１１４．組成物を対象に投与する前に多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号を付した項のいずれかによって定義され得る：
１．神経学的損傷の治療を必要とする対象に多能性またはＳＴＡＰ細胞を投与することを含む、神経学的損傷を治療する方法。
２．多能性またはＳＴＡＰ細胞を本明細書に記載される方法、例えば段落［０１５７］～［０１９０］、段落［００２０２］～［００２０４］の番号を付した項、実施例５または実施例７の方法により生成する、請求項１に記載の方法。
３．細胞が対象に対して自家性である、請求項１～２のいずれかに記載の方法。
４．神経学的損傷が、
急性神経学的損傷；慢性神経学的損傷；神経変性疾患；神経損傷；または脊髄損傷
からなる群より選択される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
特定の実施形態では、以下の項目が提供される：
（項目１）
多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離することと、
ｂ．段階ａで得られた細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁させることと、
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液を研和することと、
ｄ．前記細胞懸濁液に約２～約２０体積のＨＢＳＳを加えることと、
ｅ．段階ｄで得られた懸濁液から細胞を単離することと
ｆ．段階ｅで得られた前記細胞をｐＨが約５．０～約６．０のＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｇ．前記細胞をその自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすることと、
ｈ．段階ｇで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｉ．段階ｈで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させることと
を含む、方法。
（項目２）
単離することが遠心分離を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
段階ａの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、項目１～２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
段階ａの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることにより前記トリプシンが失活する、項目３～４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
段階ｃの研和が、前記細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項目１～５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項目６～７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項目６～８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項目１０に記載の方法。（項目１２）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項目６～１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項目６～１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項目１～１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記最後の開口部または内腔での研和を、前記懸濁液が前記開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目６～１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
各開口部または内腔での研和を、前記懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目６～１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
研和の合計時間が約３０分である、項目１～１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
段階ｄで約５～約１５体積のＨＢＳＳを加える、項目１～２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
段階ｄで約１０体積のＨＢＳＳを加える、項目１～２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
段階ｆのＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項目１～２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
段階ｆのＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項目１～２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
段階ｆで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項目１～２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
段階ｆで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項目１～２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
段階ｆが、前記細胞を約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させることを含む、項目１～２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
段階ｆが、前記細胞を約２００万細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させることを含む、項目１～２７のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
段階ｇが、前記細胞を約３７℃で約２５分間インキュベートすることを含む、項目１～２８のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
段階ｇと段階ｈとを併せて約１０分～約１時間継続する、項目１～２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
段階ｇと段階ｈとを併せて３０分間継続する、項目１～３０のいずれかに記載の方法。（項目３２）
段階ｉの培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項目１～３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で前記組織を機械的に細切することと、
ｂ．段階ａで得られた試料を、前記組織を攪拌しながら前記組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすることと、
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液をＨＢＳＳで希釈することと、
ｄ．段階ｃで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｅ．段階ｄで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｆ．段階ｅで得られた細胞懸濁液を研和することと、
ｇ．段階ｆで得られた前記細胞懸濁液に約０．１～約１０体積のＲＢＣ単離溶液を加えて二重層を生じさせることと、
ｈ．段階ｇで得られたＨＢＳＳ層をＲＢＣ単離溶液層から分離することと、
ｉ．段階ｈで得られたＨＢＳＳ懸濁液から細胞を単離することと、
ｊ．段階ｉで得られた前記細胞をｐＨが約５．０～約６．０のＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｋ．前記細胞を前記組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすることと、
ｌ段階ｋで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｍ．段階ｌで得られた前記細胞を培地に再懸濁させることと
を含む、
方法。
（項目３５）
前記赤血球を含む組織が、
肺；脾臓；および肝臓
からなる群より選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記組織が肺であり、前記ＥＣＭ分解酵素がコレゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ）Ｐである、項目３４～３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
段階ａの細切を約１０分間継続する、項目３４～３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
段階ｆの研和が、前記細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項目３４～３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項目３８～３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項目３８～４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項目４２に記載の方法。（項目４４）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項目３８～４３のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項目３８～４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項目３８～４７のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記最後の開口部または内腔での研和を、前記懸濁液が前記開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目３４～４９のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
各開口部または内腔での研和を、前記懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目３４～５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
研和の合計時間が約３０分である、項目３４～５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
段階ｊのＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項目３４～５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
段階ｊのＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
段階ｊで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項目３４～５４のいずれかに記載の方法。
（項目５６）
段階ｊで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
段階ｋが、前記細胞を約３７℃で約２５分間インキュベートすることを含む、項目３４～５６のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
段階ｋと段階ｌとを併せて約１０分～約１時間継続する、項目３４～５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
段階ｍの培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、１％の抗生物質と、１％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項目３４～５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
前記成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離することと、
ｂ．段階ａで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液に再懸濁させることと、
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液を研和することと、
ｄ．段階ｃで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｅ．段階ｄで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｆ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させることと
を含む、方法。
（項目６２）
多能性細胞を生成する方法であって、
ａ．溶液から最初の細胞を単離することと、
ｂ．段階ａで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液に再懸濁させることと、
ｃ．段階ｂで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｄ．段階ｃで得られた前記細胞をｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液に再懸濁させて細胞懸濁液にすることと、
ｅ．段階ｄで得られた前記細胞懸濁液を研和することと、
ｆ．段階ｅで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｇ．段階ｆで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｈ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させること
を含む、方法。
（項目６３）
前記ＡＴＰが、前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約１．５～約５ｍｇ／ｃｃの濃度で存在する、項目６１～６２のいずれかに記載の方法。
（項目６４）
前記ＡＴＰが、前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約２．７ｍＭ～約９ｍＭの濃度で存在する、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
ＨＢＳＳ溶液を所望のｐＨに達するまでＡＴＰ溶液で滴定することにより、前記ｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液を調製する、項目６１～６４のいずれかに記載の方法。
（項目６６）
前記ＡＴＰ溶液が約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ＡＴＰ溶液が約２００ｍＭの濃度である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０～約５．７である、項目６１～６７のいずれかに記載の方法。
（項目６９）
前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０である、項目６１～６８のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
項目６２の段階ｆおよび項目６１の段階ｄのＨＢＳＳがＡＴＰを含まない、項目６１～６９のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
単離することが遠心分離を含む、項目６１～７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
段階ａの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、項目６１～７１のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
段階ａの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることにより前記トリプシンが失活する、７２～７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
前記研和が、前記細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項目６１～７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
前記系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項目７５～７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項目７５～７７のいずれかに記載の方法。
（項目７９）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項目７９に記載の方法。（項目８１）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項目７５～８０のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項目７５～８２のいずれかに記載の方法。
（項目８４）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項目６１～８４のいずれかに記載の方法。
（項目８６）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記最後の開口部または内腔での研和を、前記懸濁液が前記開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目７５～８６のいずれかに記載の方法。
（項目８８）
各開口部または内腔での研和を、前記懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目７５～８７のいずれかに記載の方法。
（項目８９）
研和の合計時間が約３０分である、項目６１～８８のいずれかに記載の方法。
（項目９０）
前記研和後の約５～約１５体積のＨＢＳＳである、項目６１～８９のいずれかに記載の方法。
（項目９１）
前記研和後の約１０体積のＨＢＳＳである、項目６１～９０のいずれかに記載の方法。（項目９２）
研和後に加える前記ＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項目６１～９１のいずれかに記載の方法。
（項目９３）
研和後に加える前記ＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項目６１～９２のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
項目６２の段階ｆおよび項目６１の段階ｄで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項目６１～９３のいずれかに記載の方法。
（項目９５）
項目６２の段階ｆおよび項目６１の段階ｄで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項目６１～９３のいずれかに記載の方法。
（項目９６）
研和後にＨＢＳＳを加えた後、前記細胞が約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、項目６１～９４のいずれかに記載の方法。
（項目９７）
研和後にＨＢＳＳを加えた後、前記細胞が約２００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、項目６１～９６のいずれかに記載の方法。
（項目９８）
前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項目６１～９７のいずれかに記載の方法。
（項目９９）
前記成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で前記組織を機械的に細切することと、
ｂ．段階ａで得られた試料を、前記組織を攪拌しながら前記組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすること；
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液で希釈することと、
ｄ．段階ｃで得られた前記細胞懸濁液を研和することと、
ｅ．段階ｄで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させることと、
ｆ．段階ｅで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｇ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させることと
を含む、
方法。
（項目１０１）
多能性細胞を生成する方法であって、
最初の細胞が、赤血球を含む組織中に存在し、
ａ．１つまたは複数のＥＣＭ分解酵素の存在下で前記組織を機械的に細切することと、
ｂ．段階ａで得られた試料を、前記組織を攪拌しながら前記組織の自然のｉｎ ｖｉｖｏでの温度付近でインキュベートすることと、
ｃ．段階ｂで得られた細胞懸濁液をｐＨが約４．０～約６．５のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）とＡＴＰの溶液で希釈することと、
ｄ．段階ｂで得られた懸濁液から細胞を単離することと、
ｅ．段階ｃで得られた細胞をｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液に再懸濁させて細胞懸濁液にすることと、
ｆ．段階ｄで得られた細胞懸濁液を研和すること、
ｇ．段階ｅで得られた細胞をＨＢＳＳに再懸濁させること、
ｈ．段階ｆで得られた懸濁液から細胞を単離すること、
ｉ．段階ｇで得られた細胞ペレットを培地に再懸濁させることと
を含む、
方法。
（項目１０２）
前記赤血球を含む組織が、
肺；脾臓；および肝臓
からなる群より選択される、項目１００～１０１のいずれかに記載の方法。
（項目１０３）
前記組織が肺であり、前記ＥＣＭ分解酵素がコレゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ）Ｐである、項目１００～１０のいずれかに記載の方法。
（項目１０４）
段階ａの細切を約１０分間継続する、項目１００～１０３のいずれかに記載の方法。
（項目１０５）
前記ＡＴＰが、前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約１．５～約５ｍｇ／ｃｃの濃度で存在する、項目１００～１０４のいずれかに記載の方法。
（項目１０６）
前記ＡＴＰが、前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中に約２．７ｍＭ～約９ｍＭの濃度で存在する、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
ＨＢＳＳ溶液を所望のｐＨに達するまでＡＴＰ溶液で滴定することにより、前記ｐＨが約４．０～約６．５のＨＢＳＳとＡＴＰの溶液を調製する、項目１００～１０６のいずれかに記載の方法。
（項目１０８）
前記ＡＴＰ溶液が約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度である、項目１０７に記載の方法。（項目１０９）
前記ＡＴＰ溶液が約２００ｍＭの濃度である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０～約５．７である、項目１００～１０９のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記ＨＢＳＳとＡＴＰの溶液のｐＨが約５．０である、項目１００～１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１２）
項目１０１の段階ｇおよび項目１００の段階ｅのＨＢＳＳがＡＴＰを含まない、項目１００～１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１３）
単離することが遠心分離を含む、項目１００～１１０のいずれかに記載の方法。
（項目１１４）
段階ｃの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約１分～約１０分間接触させることをさらに含む、項目１００～１１３のいずれかに記載の方法。
（項目１１５）
段階ｃの前に前記最初の細胞とトリプシンとを約３分～約５分間接触させることをさらに含む、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記細胞ペレットと、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ－１２とを接触させることにより前記トリプシンが失活する、１１４～１１５のいずれかに記載の方法。
（項目１１７）
前記研和が、前記細胞を直径が次第に小さくなる開口部または内腔の系列に通して研和することを含む、項目１００～１１７のいずれかに記載の方法。
（項目１１８）
前記系列が、少なくとも３つの開口部または内腔を含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
少なくとも１番目の開口部または内腔をＨＢＳＳまたは水で予めコートする、項目１００～１１８のいずれかに記載の方法。
（項目１２０）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．５ｍｍ～約２．０ｍｍである、項目１００～１１９のいずれかに記載の方法。
（項目１２１）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約０．７ｍｍ～約１．５ｍｍである、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記１番目の開口部または内腔の内径が約１．１ｍｍである、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約１分～約１０分間実施する、項目１００～１２２のいずれかに記載の方法。
（項目１２４）
前記１番目の開口部または内腔に通す研和を約５分間実施する、項目１００～１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約９０～約２００ミクロンおよび約２５ミクロン～約９０ミクロンである、項目１００～１２４のいずれかに記載の方法。（項目１２６）
前記系列の最後の２つの開口部または内腔の内径が、約１００～約１５０ミクロンおよび約５０ミクロン～約７０ミクロンである、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約５～約２０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約５～約２０分間の研和とを含む、項目１００～１２６のいずれかに記載の方法。
（項目１２８）
前記研和が、２番目の開口部または内腔から最後の開口部または内腔まで通す約１０分間の研和と、前記最後の開口部または内腔での約１５分間の研和とを含む、１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記最後の開口部または内腔での研和を、前記懸濁液が前記開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目１００～１２８のいずれかに記載の方法。
（項目１３０）
各開口部または内腔での研和を、前記懸濁液がその開口部または内腔を容易に通るようになるまで継続する、項目１００～１２９のいずれかに記載の方法。
（項目１３１）
研和の合計時間が約３０分である、項目１００～１３０のいずれかに記載の方法。
（項目１３２）
前記研和後の約５～約１５体積のＨＢＳＳである、項目１００～１３１のいずれかに記載の方法。
（項目１３３）
前記研和後の約１０体積のＨＢＳＳである、項目１００～１３２のいずれかに記載の方法。
（項目１３４）
研和後に加える前記ＨＢＳＳのｐＨが約５．１～約５．７である、項目１００～１３３のいずれかに記載の方法。
（項目１３５）
研和後に加える前記ＨＢＳＳのｐＨが約５．４である、項目１００～１３４のいずれかに記載の方法。
（項目１３６）
項目１０１の段階ｇまたは項目１００の段階ｅで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．０～約６．０である、項目１００～１３５のいずれかに記載の方法。
（項目１３７）
項目１０１の段階ｇまたは項目１００の段階ｅで得られる細胞のＨＢＳＳ懸濁液のｐＨが約５．６～約５．７である、項目１００～１３６のいずれかに記載の方法。
（項目１３８）
研和後にＨＢＳＳを加えた後、前記細胞が約５０万細胞／ｍＬ～約４００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、項目１００～１３７のいずれかに記載の方法。
（項目１３９）
研和後にＨＢＳＳを加えた後、前記細胞が約２００万細胞／ｍＬの濃度で存在する、項目１００～１３８のいずれかに記載の方法。
（項目１４０）
前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、約１％の抗生物質と、約２％のＢ２７と、任意選択で１つまたは複数の成長因子とを含むスフィア培地である、項目１００～１３９のいずれかに記載の方法。
（項目１４１）
成長因子が、ｂＦＧＦとＥＧＦとヘパリンとを含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記最初の細胞がマウス細胞であり、前記スフィア培地がＬＩＦを含む、項目１～１４１のいずれかに記載の方法。
（項目１４３）
得られた細胞を少なくとも１週間培養する段階をさらに含み、
前記培養が、
ａ．任意選択で成長因子を含む、スフィア培地を添加することと、
ｂ．皿の底に付着しないように前記細胞を攪拌することと
を含む、
項目１～１４１のいずれかに記載の方法。
（項目１４４）
前記スフィア培地を１～４日ごとに添加する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記スフィア培地を２日ごとに添加する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記攪拌が、ピペットによる前記細胞のピペッティングを含む、項目１４２～１４５のいずれかに記載の方法。
（項目１４７）
前記ピペットの穴の直径が約１．１ｍｍである、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記ピペッティングを少なくとも１日１回実施する、項目１４６～１４７のいずれかに記載の方法。
（項目１４９）
前記ピペッティングを少なくとも１日２回実施する、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
多能性を有する細胞を選択することをさらに含み、
前記選択することが、
付着性の低い細胞を選択すること；スフィアの構成要素である細胞を選択すること；および相対的な大きさが小さい細胞を選択すること
からなる群より選択される方法を含む、
項目１～１４９のいずれかに記載の方法。
（項目１５１）
多能性を示す細胞を選択する最終段階をさらに含む、項目１～１５０のいずれかに記載の方法。
（項目１５２）
前記最初の細胞が組織の一部として存在しない、項目１～１５１のいずれかに記載の方法。
（項目１５３）
前記最初の細胞が、体細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞である、項目１～１５２のいずれかに記載の方法。
（項目１５４）
前記最初の細胞が単離細胞である、項目１～１５３のいずれかに記載の方法。
（項目１５５）
前記最初の細胞が不均一な細胞集団に存在する、項目１～１５４のいずれかに記載の方法。
（項目１５６）
前記最初の細胞が均一な細胞集団に存在する、項目１～１５５のいずれかに記載の方法。
（項目１５７）
前記多能性を示す細胞を選択することが、幹細胞マーカーを発現する細胞を選択することを含む、項目１～１５６のいずれかに記載の方法。
（項目１５８）
前記幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４からなる群より選択される、項目１５７のいずれかに記載の方法。
（項目１５９）
前記多能性を示す細胞を選択することが、付着性でない細胞を選択することを含む、項目１～１５８のいずれかに記載の方法。
（項目１６０）
前記多能性細胞を培養して前記多能性細胞を増殖させることをさらに含む、項目１～１５９のいずれかに記載の方法。
（項目１６１）
前記多能性細胞が幹細胞マーカーを発現する、項目１～１６０のいずれかに記載の方法。
（項目１６２）
前記幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ４；Ｎａｎｏｇ；Ｅ－カドヘリンおよびＳＳＥＡ４からなる群より選択される、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
前記最初の細胞が哺乳動物細胞である、項目１～１６２のいずれかに記載の方法。
（項目１６４）
前記最初の細胞がヒト細胞である、項目１～１６３のいずれかに記載の方法。
（項目１６５）
前記最初の細胞が、成体細胞、新生児細胞、胎児細胞、羊膜細胞または臍帯血細胞である、項目１～１６４のいずれかに記載の方法。
（項目１６６）
前記多能性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することをさらに含む、項目１～１６５のいずれかに記載の方法。
（項目１６７）
項目１～１６６のいずれかに記載の方法により作製した多能性細胞と候補薬剤とを接触させることを含む、アッセイ。
（項目１６８）
前記多能性細胞の生存能、分化、増殖のうちの１つまたは複数に影響を及ぼす薬剤を特定するのに用いる、項目１６７に記載のアッセイ。
（項目１６９）
項目１～１６６のいずれか１項に記載の方法により作製した多能性細胞の、対象の細胞治療の方法へ使用。
（項目１７０）
対象に実施する細胞治療に適合性のある細胞または組織を調製する方法であって、
項目１～１６６のいずれか１項に従って細胞から多能性細胞を生成することを含み、
前記細胞が、自家細胞またはＨＬＡ適合同種細胞である、
方法。
（項目１７１）
前記細胞または組織を前記対象に投与する前に前記多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
多能性細胞を含み、前記多能性細胞が、項目１～１６６のいずれかに記載の方法により細胞から生成される、組成物。
（項目１７３）
細胞治療を必要とする対象の自家細胞治療の方法であって、
ａ．前記対象から採取した細胞から項目１～１６６のいずれか１項に従って多能性細胞を生成することと、
ｂ．前記多能性細胞またはその分化した子孫を含む組成物を前記対象に投与することと
を含む、方法。
（項目１７４）
前記組成物を前記対象に投与する前に、前記多能性細胞を予め定められた細胞系列に沿って分化させることをさらに含む、項目１７３に記載の方法。
実施例１
いかなる生物にも原始的な生存本能が備わっている。植物を著しい外部ストレスに曝すと、細胞の脱分化を引き起こし受傷領域または生物全体の再生を可能にする生存機序を活性化させる。このような機序は、下等生物が極端な環境変化を生き延びるのに不可欠なものであると思われるが、哺乳動物では未だ報告されていない。
本発明者らは、物理的ストレスにより、植物および下等生物にみられるものと同じように、成熟哺乳動物細胞が幹細胞の状態に戻るのではないかとする仮説を立てた。この仮説を検証するため、いくつかの成体体細胞組織から入手した成熟細胞を検討した。最初に、成熟細胞を変化させて成熟度の低い状態に戻すのに最も効果が高いと思われる物理的ストレスを絞り込むため、Ｏｃｔ４－ＧＦＰマウスから採取したＣＤ４５陽性リンパ球を検討した。このマウスの細胞では、幹細胞特異的Ｏｃｔ４プロモーターが活性化された場合、幹細胞表現型に戻ったことがわかる。成熟し完全に分化した細胞をいくつかの著しい外部刺激に曝露した。
例えば、ＣＤ４５陽性リンパ球を低ｐＨ溶液に曝露して強い化学的ストレスを与えた。曝露から３日以内にＧＦＰ発現細胞が観察され、５日目までにはＧＦＰ発現細胞で構成される球状コロニーが観察された。このようにして生成された細胞を本実施例ではストレス変化幹細胞（Ｓｔｒｅｓｓ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）（ＳＡＳＣまたはＳＡＣ）と呼ぶ。このほか、ＳＡＣを若返り幹細胞（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＲＳＣ）または動物カルス細胞（ａｎｉｍａｌ ｃａｌｌｕｓ ｃｅｌｌ）（ＡＣＣ）と呼ぶことがある。ＳＡＣは、胚性幹細胞に通常みられる数種類のマーカーを発現した。ＳＡＣはＥＳ細胞と同等の分化能を示し、キメラマウスの生成に寄与したほか、４Ｎ胚盤胞内に注射したところ、胎児全体を形成することが可能であった。このようにして生成された細胞は最初、低ミトコンドリア活性をはじめとする細胞ベースの損傷防御機序の誘導に通常みられる状態を示した。次いで、この細胞にＯｃｔ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子プロモーターの脱メチル化がみられた。ストレス変化細胞のリプログラミングは、間葉系－上皮系の転換を介して誘導されるものと思われた。この観察結果は、損傷（外部刺激）に応答した植物カルスに含まれる細胞についての記載と一致する。植物カルスは、ストレスが細胞からクローン体の形成が可能な多能性植物幹細胞への変換を誘導することにより形成される。成熟し完全に分化した哺乳動物体細胞が著しい外部刺激に応答することにより生成されたこのような球状コロニーを本明細書では動物カルス（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｌｌｕｓ）と呼び、そのようなコロニーまたはカルスに含まれるストレス変化細胞を「動物カルス細胞（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｌｌｕｓ Ｃｅｌｌ）」（ＡＣＣ）またはＳＡＣと呼ぶ。
このように、著しい物理的および化学的ストレスにより、正常な成熟成体細胞が胚形成が可能な多能性幹細胞にリプログラミングされた。理論に束縛されることを望むものではないが、リプログラミングの機序には、損傷に応答したときに通常みられる細胞の生存および修復過程の誘導が含まれるものと思われる。本明細書では、哺乳動物細胞が、植物のものと極めて類似した、著しいストレス性の外部刺激に応答してリプログラミングされた状態に戻る生存機序を有することを示す。
様々な型の細胞で特定の遺伝子１～５の誘導および強制発現により多能性幹細胞の状態にリプログラミングされることが報告されている。ほかにも、熱傷、化学傷害、外傷および放射線照射などの刺激源への曝露によって細胞が損傷を受けると、正常細胞が変化して癌細胞になり得ると考えられている。
緒言
いかなる生物にも、環境に適応し、その体を再生することによってストレス性の刺激による損傷を生き延びようとする共通の本能が備わっている。植物では、接合子のみならず、完全に分化細胞および未成熟花粉にも個体発生が観察される。脊椎動物では、イモリに四肢を含めたいくつかの解剖学的構造および器官を再生する能力がみられる１。特に注目すべき点は、植物およびイモリの両方にみられる優れた再生能が、既に完全に分化した体細胞の脱分化を引き起こす外部刺激によって誘導されることである。この生存本能は、最初の生命体が出現してから数十億年が経過し、様々な生物が独自の方法で進化を遂げながらも、共通の祖先から現代の生物まで受け継がれてきたものと考えられる。哺乳動物の終末分化細胞は通常、分化過程を逆行することは不可能であると考えられているが、哺乳動物が、これまで認められていない、劇的な環境変化に応答して死を免れるためのプログラムを保持している可能性もある。
植物カルスは、受傷などの外部刺激に応答して形成される増殖細胞の塊であり、培養して植物ホルモンにより刺激することができる２。カルスには、カルス細胞と呼ばれるリプログラミングされた体細胞が含まれており、その体細胞はそれぞれが、クローン的に植物体全体を形成することが可能である。カルス細胞は植物に生得的に存在するのではなく、外部刺激に応答して体細胞から生成される。最近の研究では、遺伝子導入などの外因性の過程により哺乳動物の体細胞がリプログラミングされ得ることが明らかにされているが３～７、植物の場合と同じように外因性の物理的および／化学的刺激に応答して哺乳動物の体細胞がリプログラミングされることは報告されていない。興味深いのは、極端な外部刺激、例えば熱傷、化学傷害、外傷および放射線照射を含めた刺激源への曝露などにより正常な体細胞が変化して癌細胞になり得ると考えられていることである。このような知見は、外部刺激が哺乳動物細胞の変化をもたらすことを示しているものと思われる。
本研究では、哺乳動物細胞が植物と同じように、著しい外部ストレスへの曝露を生き延びる機序を保持しているとする仮説を立てた。本報では、著しい物理的および化学的刺激を加えることにより、様々な組織から入手した成熟し完全に分化した哺乳動物体細胞のリプログラミングが起こり得ることのほか、そのようなストレス変化細胞が、クローン体を再生することが可能な「動物カルス細胞」を含む動物カルスを形成することが可能であることを示す証拠を記載する。
結果
成熟体細胞に加える著しい物理的および化学的刺激。胚転写因子Ｏｃｔ４は細胞の多能性状態の調節に極めて重要であると考えられていることから、成熟細胞を変化させてＯｃｔ４を発現するようリプログラミングするのに最も効率的な外部刺激を特定することを最初の戦略とした。未分化細胞の混入を避けるため、最初にＣＤ４５陽性造血系細胞を検討した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウス８から入手した脾臓から採取したＣＤ４５陽性細胞を様々な著しい物理的および化学的刺激に曝露した。曝露には、浸透圧処理、著しい機械的研和による処理、低ｐＨへの曝露、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いて細胞膜損傷を加えること、低栄養状態への曝露ならびに低酸素および高Ｃａ２＋濃度への曝露を含めた。次に、ＦＡＣＳを用いて、ＧＦＰ発現細胞を特定し、分取し、収集した。Ｒ－Ｔ
ＰＣＲによりＯｃｔ４の遺伝子発現は確認した。加えた各刺激への曝露により、成熟細胞がリプログラミングされてＧＦＰをある程度発現するようになった（図５Ａ）。成熟細胞を低ｐＨによる化学的ストレスおよび著しい機械的研和による物理的ストレスに曝露するのが、Ｏｃｔ４を発現するよう成熟細胞を変化させるのに最も効果が高い処理であると思われた。Ｏｃｔ４発現細胞への変換を誘導するのに最適なｐＨを明らかにするため、ＣＤ４５陽性細胞をｐＨ４．０～ｐＨ６．８の様々な酸性度の溶液に曝露した。酸性溶液への曝露から３日目、ＦＡＣＳを用いて細胞のＧＦＰ発現を解析した。ＧＦＰを発現するよう細胞を変化させるのに最も効率的なのはｐＨ５．４～５．６の酸性溶液であった（図５Ｂ）。したがって、研究の残りの部分に選択するストレス処理として低ｐＨへの曝露に絞り込んだ。
次いで、ストレス変化Ｏｃｔ４発現細胞の維持に最も適した培養条件を明らかにした。ＥＳ樹立培地である３ｉ９およびＡＣＴＨ１０、ＥＳ培養条件であるＥＳ－ＬＩＦ１１、胚性神経幹細胞培養条件であるＢ２７－ＬＩＦ１２およびＥｐｉＳＣ培養条件１３を含めた既に記載されている培地をいくつか検討した。各培地に細胞を播き、ＧＦＰ発現コロニーをカウントした（図５Ｃ）。ＧＦＰ発現球状コロニーの生成には培地Ｂ２７－ＬＩＦが最も効果が高いと思われた。したがって、処理済み細胞の培養にはＢ２７－ＬＩＦ培地を用いた。
ストレス処理したＣＤ４５陽性細胞をＢ２７－ＬＩＦ培地で培養したところ、５日以内にＧＦＰ発現球状コロニーが観察されたのに対し、未処理対照にはＧＦＰ発現コロニーは観察されなかった（図１Ａ）。最初の７日間、球状コロニー直径約７０μｍまで成長し、その培養条件でさらに７日間維持することができた。コロニーの外形は若干いびつな形状を呈し、球状よりも植物にみられるカルスに形状に類似していた。そこで、ストレス処理により生成された細胞コロニーを動物カルス（ＡＣ）と呼ぶことにした。培養細胞を解離した後、ＦＡＣＳを用いて集団解析を実施した。解析から、特定の著しい刺激を加えることにより、それまでＣＤ４５陽性細胞集団に存在しなかったストレス変化細胞（これより動物カルス細胞（ＡＣＣ）と呼ぶ）が生成されることが明らかになった（図１Ｂ）。ストレス処理によるＣＤ４５陽性細胞の表現型の変化は単一細胞レベルで観察された。ＣＤ４５陽性細胞はＧＦＰを発現しなかったのに対し、ＡＣＣはＧＦＰを発現するとともに、ＣＤ４５の発現が減少した（データ不掲載）。単一細胞を検討したところ、処理済み細胞の大きさは未処理細胞よりも大きく見えることが明らかになった。そこで、ＡＣＣ集団の細胞の大きさをＦＡＣＳにより解析した。ＡＣＣの細胞の大きさは極めて小さく、細胞の８０％が直径８μｍ未満であった（図１Ｃ）。
ＣＤ４５減少およびＯｃｔ４発現に関連する表現型の経時的変化を検討するため、ストレス処理したＣＤ４５陽性細胞を第１日、第３日および第７日に解析した。第１日、ほとんどの細胞に依然としてＣＤ４５の発現がみられたが、Ｏｃｔ４の発現はみられなかった。第３日、マーカー発現が変化して、ＣＤ４５陰性細胞またはＣＤ４５陰性／Ｏｃｔ４陽性（ｄｉｍ）細胞が明らかになった。第７日、ＣＤ４５発現がみられなくなり、Ｏｃｔ４発現細胞が観察された（図１Ｄ）。培養の最初の７日間にＰＩ陽性細胞（死細胞）の数が徐々に増加した（データ不掲載）のは注目すべきことであり、ストレス処理および培養条件によって細胞の性質が徐々に変化し、Ｏｃｔ４を発現するよう変化に成功した細胞が選択されたことを示唆するものであった。
ＡＣＣの特徴付け。外部刺激への曝露による体細胞のリプログラミングを確認するため、ＡＣＣの初期胚形成マーカー遺伝子の発現を検討した。初期胚形成の陽性対照として、ＥＳ細胞を以下の実験で用いた。マーカー発現およびＤＮＡメチル化を以下のように特徴付けた：第７日の免疫蛍光染色では、ＡＣＣを含んだ球状コロニーが多能性細胞マーカーであるＥ－カドヘリン抗原、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－１、ＰＣＡＭ－１およびＡＰを一様に発現し、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性であることがわかった（データ不掲載）。遺伝子発現解析では、ＡＣＣおよびＥＳ細胞が、初代ＣＤ４５陽性細胞とは異なり、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｃａｔ１、Ｅｓｇ１、Ｄａｘ１、Ｆｇｆ５、Ｋｌｆ４およびＲｅｘ１遺伝子を同等のレベルで発現することがわかった（図２Ａ）。ＡＣＣのＥＳ特異的遺伝子の発現は第７日にピークに達した（図２Ａ）。バイサルファイトシーケンシングを実施して、ＡＣＣのＯｃｔ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子プロモーターのメチル化状態を明らかにした。対照試料である天然のリンパ球および培養リンパ球では、両プロモーターに広範囲にわたるメチル化がみられたのに対し、ＡＣＣでは、ＥＳ細胞にみられるものとほぼ同じ領域に広範囲にわたる脱メチル化がみられた（図２Ｂ）。したがって、哺乳動物体細胞が外部ストレスによってリプログラミングされたことがわかる。
ＧＯＦマウスのみならず野生型マウスでも成熟細胞のストレス処理によりＯｃｔ４遺伝子発現が生じることを確認するため、ＩＣＲマウスから入手した脾臓からＣＤ４５陽性リンパ球を採取した。次いで、リンパ球をストレス処理に曝露し、ＦＡＣＳを用いて第７日まで経時的に解析した。ストレス処理群にはＳＳＥＡ－１陽性／Ｅ－カドヘリン陽性の細胞集団がみられたのに対し、無ストレス処理対照群にはＳＳＥＡ－１／Ｅ－カドヘリン発現は観察されなかった（図６Ａ）。この二重陽性細胞は、Ｏｃｔ４遺伝子を発現することがＲ－Ｔ ＰＣＲにより確認された（図６Ｂ）。これらの結果から、マウスの系統に関係なく、ストレス処理の結果、ＣＤ４５陽性細胞からＯｃｔ４陽性の多能性マーカー発現細胞であるＡＣＣが生成されることが示された。
以上の結果は、成熟し完全に分化した成体体細胞がストレス処理によって「幹細胞性」に戻ったことを示唆するものである。
ＡＣＣの幹細胞性を評価するため、その自己複製および分化能を検討した。ＡＣＣの自己複製能を検討するため、既に成熟したＣＤ４５陽性リンパ球に由来するＡＣＣコロニーを単一細胞に分離し、クローン的に生じた集団が形成されるように、細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１個播いた。播種から１０日後、９６個のウェルのうち４個のウェルに球状コロニーがみられた。ＡＣＣの分裂時間はウェルによって異なっていた。１２～１６時間で分裂するものもあれば、３０～３４時間で分裂するものもあった。ＡＣＣを少なくとも５回継代しても、継続的なＯｃｔ４発現が観察された。したがって、ＡＣＣには自己複製能のほか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３胚葉のいずれの細胞にも分化する能力があることが示された。
成熟ＧＯＦリンパ球由来ＡＣを再び単一細胞に分離し、ＧＦＰを発現する細胞の集団のみが含まれるよう分取した後、分化培地で培養した。播種から１４～２１日後、細胞に外胚葉マーカーであるβΙΙΙ－チューブリンおよびＧＦＡＰ、中胚葉マーカーであるα－平滑筋アクチンならびに内胚葉マーカーであるα－フェトプロテインおよびサイトケラチン７の発現がみられた（データ不掲載）。したがって、ＡＣＣはｉｎ ｖｉｔｒｏで３胚葉の代表的な細胞に分化した。
様々な成体組織から入手した成熟体細胞のストレス変化。成熟リンパ球のみならず他の型の体細胞からでもＡＣＣを生成することができるかどうかを検討するため、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ（ＧＯＦ）マウス８から脳、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、肺および肝臓を採取した。組織試料から細胞を単離して単一細胞に分離し、様々な物理的および化学的ストレス条件で処理した。細胞を変化させる工程の効率には、細胞の入手源および細胞を暴露したストレス条件（１つまたは複数）の両方による差がみられた（図７Ａ）。ストレスが成熟細胞をＯｃｔ４を発現するよう変化させる能力には細胞の由来源による差がみられたが、３胚葉のいずれに由来する成熟細胞でも、ストレスがある程度Ｏｃｔ４を発現するよう細胞を変化させることが可能であった（図７Ａ）。いずれの成熟組織に由来するＡＣＣコロニーにも、多能性マーカー、Ｅ－カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＰＣＡＭ－１およびＡＰ（データ不掲載）およびＥＳ特異的マーカーの遺伝子（図７Ｂ）の発現がみられた。著しい物理的および化学的ストレスは、組織の入手源および由来源の胚葉に関係なく、成熟体細胞を幹細胞に戻るよう変化させた。
ＡＣＣ生成の初期段階における細胞の調節。以上の結果は、強い物理的および化学的刺激により体細胞のリプログラミングが起こることを示している。ストレス処理したリンパ球は５日以内にＡＣを形成することが観察された。ストレスに曝露することにより、分子事象に劇的な変化が起こるとする仮説を立てた。そこで、刺激への曝露から最初の７日間にあたるリプログラミングの初期段階に検討の対象を絞った。
ＡＣＣを著しいストレスに曝露しても生き延びたことから、ＡＣＣ生成過程では細胞損傷を修復するために通常活性化する生存機序が誘導されると推測された。まず、第１日、第３日および第７日に、ストレスに対する細胞応答およびＤＮＡ修復に関与する多数の候補遺伝子１４の発現を天然のＣＤ４５陽性細胞およびストレス処理したＣＤ４５陽性細胞で比較した。ＡＣＣ生成細胞と他の細胞との混合物を解析したところ、第１日に細胞応答遺伝子の発現が既に観察され、これらの遺伝子は７間にわたってアップレギュレートされた（図８）。細胞応答遺伝子のアップレギュレーションとＡＣＣ生成との間に相関がみられたため、第３日および第７日のＡＣＣを分取し、遺伝子発現を解析した。Ｈｉｆ３ａを除く候補遺伝子はいずれも、ＡＣＣ生成の過程で様々な程度までアップレギュレートされた（図３Ａ）。ＡＣＣ生成の過程では４種類の熱ショック遺伝子および１種類のＤＮＡ修復遺伝子がアップレギュレートされることがわかった。さらに、アップレギュレートされた遺伝子のうち７種類は、細胞の酸化還元状態の調節に直接関与することが知られているものである。以上の結果から、ＡＣＣ生成の過程で自己修復能または自己防御能が誘導されることが示唆された。
ＡＣＣに細胞酸化還元に関連する遺伝子のアップレギュレーションがみられたため、次にＡＣＣのミトコンドリア機能を検討した。ミトコンドリアは、真核細胞内で酸素を用いた酸化還元反応を介してＡＴＰの大部分の産生に関与する細胞小器官である。ＡＣＣ球状コロニーを継代せずに培養したところ、７日後に周縁部に位置する細胞から徐々にＧＦＰ発現が減少した。第１０日のＡＣＣには、ＧＦＰを発現する中心部の細胞およびＧＦＰを発現しない分化した周縁部の細胞が含まれていた（データ不掲載）。ミトコンドリア特異的色素であるＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄで染色することにより、ＡＣＣおよび分化細胞のミトコンドリアの形態を評価した。ＡＣＣのミトコンドリアは点状のものが核周囲に密集する形で観察され、球状で白色の分化細胞には、糸状のミトコンドリアが細胞質の広範囲にわたって多数含まれていた。ＡＣＣのＡＴＰ産生量は天然のＣＤ４５陽性細胞より少なかった（図３Ｂ）。また、ＡＣＣの活性酸素種（ＲＯＳ）産生量も天然のＣＤ４５陽性細胞より少なかった（図３Ｃ）。最後に、ｍｔＤＮＡ複製に関与する重要な因子、具体的にはミトコンドリア転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）、ミトコンドリア特異的ＤＮＡポリメラーゼガンマ（Ｐｏｌｇ）およびその副ユニット（Ｐｏｌｇ２）を評価した。ＡＣＣのＴｆａｍ、ＰｏｌｇおよびＰｏｌｇ２の遺伝子発現は分化細胞よりも低かった（図３Ｄ）。したがって、ＡＣＣに含まれるミトコンドリアの数は少なく、ＡＣＣのミトコンドリアの活性は分化細胞よりも低かった。以上の結果から、ＡＣＣが厳しいストレスに応答した後、分化細胞とは異なる代謝系を獲得して生き残ることが示唆された。
ＡＣＣの発生能。最後に、ＡＣＣが植物カルス細胞と同等の発生能を有するかどうかを評価した。発生能の最初の試験として、免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの皮下に移植したＡＣＣを検討した。移植から６週間後、ＡＣＣは３胚葉すべてにあたる組織を生成した（データ不掲載）。
ＡＣＣは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで３胚葉の代表的な細胞のいずれにも分化した。したがって、ＡＣＣのキメラ寄与能を評価した。Ｆ１ ＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦＰ×ＤＢＡ／２または１２９／ＳｖＧＦＰ×Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦＰ）またはＧＯＦに由来するＣＤ４５陽性細胞を用いて、キメラ形成試験に使用するＡＣＣを調製した。遺伝子発現解析で第７日にＡＣＣの多能性マーカー遺伝子の発現レベルが最も高くなることが明らかになったため、第７日のＡＣＣをキメラマウス形成試験に用いた。最初に従来のキメラ形成法を用いた。ＡＣをトリプシンで処理することにより単一細胞に分離した。次いで、ＡＣＣを胚盤胞に注入した（図４Ａ）。この方法を用いたところ、分離したＡＣＣのキメラ寄与率は極めて低かった（表１）。そこで、細胞損傷を引き起こすことが多いトリプシン処理１５を予め実施していないＡＣＣを胚盤胞に注入した。顕微鏡下でマイクロナイフを用いてＡＣを小さいクラスターに切り分けた。次いで、ＡＣの小さいクラスターを胚盤胞に注入した（図４Ａ）。この方法を用いたところ、ＡＣＣのキメラ寄与率は劇的に増大した（データ不掲載）。ＡＣＣにより形成されたキメラマウスは健常体に成長し（データ不掲載）、生殖系列の伝達が観察された。ＦＡＣＳにより各組織のキメラ寄与率を解析した。その結果から、リンパ球由来のＡＣＣがいずれの組織にも寄与することがわかった（図４Ｂ）。
上で示されたように、ＡＣＣは、３胚葉すべてに由来する様々な細胞から生成することができる（図７Ａ～７Ｂ）。様々な組織に由来するＡＣＣに異なる分化傾向があるかどうかを検討するため、Ｆ１ ＧＦＰマウスに由来する様々な組織からＡＣＣを生成し、ＩＣＲ胚盤胞に注入した。次いで、ＦＡＣＳを用いて、形成されたキメラマウスの各組織での寄与率を解析した。いずれの組織に由来するＡＣＣもキメラマウス形成に寄与することがわかった（図９）。さらに、様々な組織に由来するＡＣＣを用いて形成したキメラマウスでの皮膚、脳、筋肉、脂肪、肝臓および肺に対する寄与率を解析した。いずれの組織に由来するＡＣＣも、３胚葉すべての代表的な組織の形成に寄与し、分化傾向は全くみられなかった（図９）。
４Ｎの宿主胚盤胞に多能性細胞を注入する四倍体補完法によるマウスの形成は、得られる胚が注入したドナー細胞のみに由来することから、最も厳密な発生能の試験法である１６。ＤＢＡ×Ｂ６ＧＦＰ Ｆ１マウスまたは１２９／ＳｖＧＦＰ×Ｂ６ＧＦＰ Ｆ１マスに由来するリンパ球からＡＣＣを生成した。ＡＣＣを４Ｎ胚盤胞に注入したところ、原腸形成（中期）後期の「全ＡＣＣ胚」が形成された（データ不掲載）。ジェノタイピング解析から、「全ＡＣＣ胚」がＡＣＣの生成に用いた系統に特異的な遺伝子を有することが明らかになった。したがって、ＡＣＣは、植物カルス細胞と同じようにクローン体を形成する能力を有していた。
考察
哺乳動物体細胞は植物の場合とほぼ同じように、著しい外部刺激に曝露することにより動物カルス（ＡＣ）を形成する能力を示す。このようなカルスに含まれる細胞（動物カルス細胞、ＡＣＣ）は、キメラマウスを形成するほか、完全にＡＣＣから生成した細胞のみからなる新たな胚を形成する能力を有する。ここに記載した結果は、哺乳動物体細胞が外部刺激によって３胚葉のいずれにも分化する能力を再獲得することを示している。このことから、体細胞はこれまで考えられていたよりも可塑性が高いことが示唆される。さらに、本研究は、遺伝子も異種タンパク質も導入せずに体細胞をリプログラミングできる可能性を示すとともに、成体幹細胞の可能性に対する新たな洞察をもたらすものであり、幹細胞生物学の解明の重要な里程標となる。
材料および方法
組織採取および細胞培養。成熟リンパ球の単離には、ＧＯＦマウスまたはＩＣＲマウスに由来する脾臓を鋏で細切し、パスツールピペットを用いて機械的に分離した。分離した脾臓をセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ）でろ過した。収集した細胞をＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、同じ体積のｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（登録商標）、オンタリオ州、カナダ）を加えた後、１０００ｇで１５分間遠心分離した。リンパ球層を取り出し、ＣＤ４５抗体（ａｂ２５６０３、ａｂｅａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）とともに獲得した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりＣＤ４５陽性細胞を分取した。次いで、ＣＤ４５陽性細胞にストレス処理（ｐＨ５．５の溶液で１５分間）を実施し、１０００ＵのＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ社）および１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＢ２７培地に播いた。
外部刺激への曝露－ストレス処理。成熟細胞に機械的応力を加えるため、パスツールピペットを加熱し、次いでこれを引っ張って伸ばし、直径が約５０ミクロンの内腔を形成させた後、折った。次いで、このピペットに成熟体細胞を通して２０分間研和し、７日間培養した。成熟細胞に低酸素刺激を加えるため、酸素５％のインキュベーター内で細胞を３週間培養した。成熟細胞を基本培地で３週間培養することにより、細胞に低栄養状態刺激を加えた。成熟細胞を生理的ストレスに曝露するため、細胞を低ｐＨ（ｐＨ５．５）溶液で処理し、７日間培養した。ほかにも、細胞にさらに深刻な損傷を与えた。成熟細胞膜にポアを生じさせるため、細胞をＳＬＯ（ストレプトリジンＯ）で処理した。
ＳＬＯ処理した細胞は、１０μｇ／ｍＬのＳＬＯを含有するＨＢＳＳで５０分間、３７℃にてインキュベートした後、ＳＬＯを含まない培地で７日間培養した。低栄養ストレスに曝露する細胞は基本培地で２～３週間培養した。「ＡＴＰ」ストレスに曝露する細胞は、２．４ｍＭのＡＴＰを含有するＨＢＳＳで１５分間、３７℃にてインキュベートした後、培地で７日間培養した。「Ｃａ」ストレスに曝露する細胞は、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有する培地で２週間培養した。
バイサルファイトシーケンス。ＧＯＦマウスから入手した細胞を単一細胞に分離した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａを用いてＧＦＰ陽性細胞を収集した。ＡＣＣからゲノムＤＮＡを抽出し検討した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、テメキュラ、カリフォルニア州、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｃｏｎ．ｃｏｍ）を製造業者の指示書の通りに用いてＤＮＡのバイサルファイト処理を実施した。得られた修飾ＤＮＡを２つの順方向（Ｆ）プライマーおよび１つの逆方向（Ｒ）プライマー：
Ｏｃｔ４（Ｆ１、ＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴ（配列番号１）；Ｆ２、ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ（配列番号２）；Ｒ、ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ（配列番号３））および
Ｎａｎｏｇ（Ｆ１、ＧＡＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４）；Ｆ２、ＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴ（配列番号５）；Ｒ、ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号６））
を用いたネステッドポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲにより増幅した。ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＲ０３０Ａ）を用いてＰＣＲを実施した。ＧＲＡＳ（ゲノム資源解析ユニット）の援助によりＭ１３プライマーを用いてＤＮＡシーケンシングを実施した。
免疫組織化学。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００／ＰＢＳで透過処理した後、１％ＢＳＡ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、東京、日本）でブロッキングした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ－４８８またはＡｌｅｘａ－５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と結合したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗体とした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社）で細胞核を可視化した。ＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でスライドをマウントした。
蛍光標識細胞分取およびフローサイトメトリー。細胞を標準的プロトコルに従って調製し、氷上で０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁させた後、ＦＡＣＳを実施した。ＰＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて死細胞を排除した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰで細胞を分取し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＢＤ ＬＳＲＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。
ＲＮＡ調製およびＲＴ－ＰＣＲ解析。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅＳＡＣｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を実施した。増幅にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ－ＩＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に試料を供した。
動物試験。腫瘍形成能試験には、ＰＢＳ １００ｍｌに懸濁させた細胞を年齢の一致した免疫不全ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射した。６週間後、マウスを屠殺し剖検した。
ＡＴＰおよびＲＯＳアッセイ。供給業者のプロトコルに従ってＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）により細胞間ＡＴＰレベルを測定した。Ｇｅｌｏｍａｘ ９６ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いることにより蛍光強度を測定し、蛍光読取り値を細胞カウント数により正規化した。ＲＯＳレベルの測定には、細胞を暗黒中、２μΜジヒドロエチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含有する培地で１５分間、３７℃にてインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁させた。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スパーク、メリーランド州）を用いて３００００個の細胞の蛍光強度を記録した。
キメラマウス形成および解析。二倍体キメラおよび四倍体キメラの作製。ＩＣＲ系雌とＩＣＲ雄との交配から二倍体胚を入手し、ＢＤＦ１系雌とＢＤＦ１雄との交配から四倍体胚を入手した。２細胞胚の電気融合により四倍体胚を作製した１７。この試験では、トリプシン処理によりキメラ化が低下したため、ＡＣＣ球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを用いて小片に切り分けた後、ＡＣＣの小さいクラスターを大きいピペットで４．５日目の胚盤胞に注入した。翌日、キメラ胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌に移植した。
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１３．Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｈａｒｅ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４８，１９６－１９９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５９７２（２００７）．
１４．Ｓａｒｅｔｚｋｉ，Ｇ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｌ．，Ｌｅａｋｅ，Ａ，Ｌａｋｏ，Ｍ．＆ ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．Ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２，９６２－９７１，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２２－６－９６２（２００４）．
１５．Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ
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１６．Ｎａｇｙ，Ａ，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｎａｇｙ，Ｒ．，Ａｂｒａｍｏｗ－Ｎｅｗｅｒｌｙ，Ｗ．＆ Ｒｏｄｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅａｒｌｙ－ｐａｓｓａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ
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Figure 2023011931000002
Figure 2023011931000003
Figure 2023011931000004
実施例２：刺激により惹起される体細胞から多能性細胞への運命転換
ここでは、核移植も転写因子導入も用いずに、強い外部刺激により哺乳動物体細胞が多能性細胞に十分にリプログラミングされるという核初期化現象である「刺激惹起性多能性獲得」（ＳＴＡＰ）について記載する。ＬＩＦの存在下では、一過性の低ｐＨストレスがＣＤ４５＋造血細胞から、Ｏｃｔ３／４などの多能性細胞マーカーを発現し３胚葉への分化能を有する細胞への脱分化を引き起こす。このＳＴＡＰ細胞にはＥＳ細胞にように、ｏｃｔ３／４およびｎａｎｏｇプロモーター領域に相当量の脱メチル化がみられる。造血細胞由来ＳＴＡＰ細胞にはＴ細胞受容体の遺伝子再構成がみられ、このことは、系列転換によって運命拘束された体細胞からＳＴＡＰ細胞が生じることを示している。胚盤胞注入から、ＳＴＡＰ細胞が四倍体補完アッセイ法でも効率的にキメラに寄与するほか、生殖系列伝達を介して子孫に寄与することがわかる。したがって、強い環境要因によって運命決定のエピジェネティック状態が状況依存的に根本的に初期化され得る。
ウォディントンのエピジェネティックランドスケープのカナリゼーションという考え方では、細胞分化が丘を下るにつれて体細胞の運命が次第に決定されていく。一般に、分化した細胞の状態を逆転させるには、その核機能を核移植１および複数の転写因子の導入２などにより人為的、物理的または遺伝的に操作する必要があると考えられている。このように核を直接操作しなくても、体細胞が単に外部トリガーに応答してその核プログラムが初期化され得るかどうかは未だ明らかにされていない。このような状況は植物にみられることが知られており、具体的には、培養環境を大幅に変化させることにより成熟体細胞の運命を転換させることが可能であり、例えば、分離したニンジン細胞が未成熟芽体細胞になり、オーキシンの存在下でそこから茎および根を含めた植物全体の構造が発生する。動物体細胞が少なくとも特殊な条件下で現れる同様の能力を有し得るかどうかは難解な問題である。この１０年間、成体組織に多能性細胞（または密接に関連する細胞型）が存在するかどうかが議論されており、それについては様々なグループが矛盾した結論を報告している。しかし、そのうち、このような多能性細胞が分化した体細胞から生じ得ることを示したものはない。
ＣＤ４５（白血球共通抗原）が陽性の造血細胞は、ｉＰＳ細胞の誘導などのリプログラミングの研究に出発細胞型としてよく用いられる典型的な系列拘束された体細胞である。この細胞は、リプログラミングされない限り、Ｏｃｔ３／４などの多能性関連マーカーを発現することはない。特に脾臓組織のＣＤ４５＋細胞は、ほとんどが非白血球幹細胞（成熟中の細胞または前駆細胞）であると考えられており、Ｔ細胞受容体β鎖（ｔｃｒβ）遺伝子のゲノム再編成がみられるリンパ球からｉＰＳ細胞への転換は、運命拘束された体細胞からのリプログラミングの紛れもない特徴であると考えられている。そこで、本発明者らは、脾臓ＣＤ４５＋細胞が外部環境の大幅な変化、例えば単純な化学的攪乱によって引き起こされる変化などにより多能性を獲得するよう転換し得るかどうかという疑問に関心を抱くようになった。
結果
低ｐＨ処理により運命拘束された体細胞の運命転換が誘導された。ｏｃｔ３／４：：ｇｆｐ Ｂ６マウス１５から入手した成体脾臓から採取したＣＤ４５＋細胞を、物理的および化学的刺激を含めた様々な種類の強い一過性の刺激に曝露し、ＬＩＦ含有Ｂ２７培地を用いて数日間浮遊培養した後、ｏｃｔ３／４プロモーターの活性化を検討した。上に挙げた様々な攪乱のうち、低ｐＨによる攪乱に対象を絞った。以下に示すように、この種類の攪乱がｏｃｔ３／４誘導に最も効果が高いことがわかった。
刺激に曝露しない場合、分取した細胞の生存が可能なＬＩＦ含有培地での培養期間に関係なく、ＣＤ４５で分取した細胞にｏｃｔ３／４：：ＧＦＰの発現は全くみられなかった。これに対し、脾臓ＣＤ４５＋細胞を低ｐＨ培地（ｐＨ４．５～６．０；図１２Ａ）で３０分間処理したところ、培養第７日（ｄ７）に相当数のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞が出現した（図１２Ｂ；最も効果が高い範囲はｐＨ５．４～５．８であった；図１６Ｂ）。この細胞は継代せずにさらに少なくとも７日間（計１４日間）ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰを発現し続けた。この非付着培養のｄ７には、低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞が球状の（または若干いびつな）クラスターを形成し（データ不掲載；数個～数十個の細胞からなる）、もうＣＤ４５を発現することはなかった（図１２Ｃ）。低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞の大きさは未処理ＣＤ４５＋細胞よりも相当小さく（単一のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ細胞およびＣＤ４５細胞の免疫染色を参照されたい；図１２Ｃ）；前者の細胞の８０％が直径８μｍ未満であったのに対し、対照ＣＤ４５＋細胞の直径は８～１０μｍの範囲内にあった（ＦＡＣＳでの前方散乱解析により推定した図１２Ｄ（左側のピークはＯｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞を示し、右側のピークはＣＤ４５＋細胞を示している））のは興味深い。以上の観察結果は、ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋集団とＣＤ４５＋集団との間には２種類のマーカーの発現の差以外にも根本的な変化があったことを示唆している。
経時的解析（図１２Ｃ）では、ｄ１～ｄ３の間に細胞集団の動的変化が明らかになった。ｄ１の生存細胞（生存細胞数はｄ０の集団の約８５％に相当する）は大部分が依然としてＣＤ４５＋かつｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－であった。ｄ２およびｄ３には、生存細胞全体のうち相当数の集団（それぞれ２１％および３４％）がｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋になり、ＣＤ４５が薄くなった（図１２Ｃ；その時点までに、播いた細胞の約５０～６０％が消失した）。ｄ７には、相当数のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－細胞（生存細胞全体の５４％）がｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－／ＣＤ４５－集団とは異なる集団を形成していた（図１２Ｂ、上；ｄ７の総細胞数はｄ３と同程度であった）。未処理ＣＤ４５＋細胞の培養では、明白なｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－集団の形成はみられなかった（図１２Ｂ、下）。したがって、低ｐＨ処理群のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－集団の数は相当数にのぼり、ｄ７の生存細胞全体の約半数に相当するものであった。実際、ｄ２にｏｃｔ３／４：：ＧＦＰシグナルが初めて現れた時点で、ＧＦＰ＋細胞の数は最初に播いたＣＤ４５＋細胞の約８％に相当するものであった。したがって、極めてマイナーな集団（例えば、混入ＣＤ４５－細胞）が低ｐＨ処理から最初の２日間で急速に増殖してこのような相当数のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋集団を形成した可能性はほとんどないものと思われた。
ライブイメージング解析（データ不掲載）では、未処理細胞とは異なり、低ｐＨ処理ＣＤ４５＋細胞に小さいクラスターを形成する傾向がみられ、これが最初の数日間の間に徐々にＧＦＰシグナルを発するようになった。次いで、この小さいｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋クラスターはｄ５までに頻繁に融合してより大きいスフィアを形成したことから、このクラスターは多クローン性であることがわかる。このＧＦＰ＋クラスターは（ＧＦＰ－細胞とは異なり）極めて移動性が高く、細胞突起が突出させているものが多かったのは興味深い（データ不掲載）．
系列拘束された脾臓ＣＤ４５＋細胞、特にＴ細胞集団がｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞に寄与するかどうかを検討するため、ゲノムＰＣＲにより単離ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋スフィアのｔｃｒβのゲノム再編成を検討したところ、各スフィアにはｔｃｒβ遺伝子再編成のみられる細胞が含まれていることがわかった（データ不掲載）。混入したｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ７ＣＤ４５＋細胞の再編成が検出された可能性を排除するため、ｄ７にＦＡＣＳによりｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋／ＣＤ４５－細胞を分取し、ｔｃｒβ遺伝子再編成アッセイに供した。この場合も、ｔｃｒβ遺伝子再編成が明確に観察された（図１２Ｅ）。以上の観察結果は、脾臓細胞の運命拘束された体細胞集団（少なくとも、Ｔ細胞）が、その運命をＣＤ４５＋からｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋に転換することによってｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞に寄与することを示している。
低ｐＨ誘導Ｏｃｔ３／４＋細胞は多能性を有する。次に、刺激誘導細胞のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋発現が、その細胞が多能性であることを表しているのか、多能性は獲得せずに単に遺伝子発現パターン（この場合、ｏｃｔ３／４およびｃｄ４５）に特異的変化が起こったに過ぎないことを表しているのかを検討した。免疫染色から、ｄ７のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋スフィアがＯｃｔ３／４、ＳＳＥＡ－１、Ｎａｎｏｇ、Ｅ－カドヘリンおよびＡＰなどの多能性関連マーカーを発現することが明らかになった（データ不掲載）。ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析では、ｄ７の低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞はＣＤ４５＋細胞とは異なり、ＥＳ細胞と同レベルのｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ２、ｅｃａｔ１、ｅｓｇ１、ｄａｘ１およびｋｌｆ４遺伝子を発現することが明らかになり（図１３Ａ（各組とも左から右に向かって、ｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、ｓｏｘ２、ｅｃａｔ１、ｅｓｇ１、ｄａｘ１およびｋｌｆ４の発現を表す）；上記のマーカーはｄ３に既に陽性であった）、このことは、低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞が、ＣＤ４５＋細胞には発現することのない真に多能性に特徴的なマーカー遺伝子のセットを発現することを示している。
次に、この遺伝子発現パターンの劇的な変化が多能性関連遺伝子のエピジェネティックな修飾の変化を伴うものであるのかどうかを検討した。この目的のため、バイサルファイトシーケンシングを実施して、ｏｃｔ３／４プロモーターおよびｎａｎｏｇプロモーター領域のメチル化状態を検討した。ＣＤ４５＋細胞は、追加の培養の有無に関係なく、両プロモーターに密にメチル化されたパターンを示した。これに対し、低ｐＨ誘導ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞はＥＳ細胞のように、この２つの領域に広範囲にわたる脱メチル化を示し（図１３Ｂ）、細胞では多能性を表す２つの重要な遺伝子のエピジェネティック状態が実質的にリプログラミングされたことが示された。
次に、低ｐＨ誘導細胞が、多能性の共通の基準である３胚葉誘導体を形成する能力を有するかどうかを検討した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化アッセイ（データ不掲載）および奇形腫形成試験（データ不掲載）ともに、この細胞から外胚葉細胞（例えば、β－チューブリンＩＩＩ＋）、中胚葉細胞（例えば、平滑筋アクチン＋）および内胚葉細胞（例えば、アルファフェトプロテイン＋）が生じ得ることが示された。
まとめると、以上の観察結果は、外部から与えられた強い刺激によって運命拘束された体細胞系列の分化状態が多能性の細胞状態に転換し得ることを示している。以降、低ｐＨなどの強い外部刺激による体細胞から多能性細胞への運命転換を「刺激惹起性多能性獲得」（ＳＴＡＰ）と呼び、これにより生じた細胞をＳＴＡＰ細胞と呼ぶ。
その他の組織源由来のＳＴＡＰ細胞。ＳＴＡＰ細胞に関するまた別の重要な疑問として、低ｐＨ惹起性の転換という現象がＣＤ４５＋白血球に限定されるものであるのかどうかという点がある。この疑問を解決するため、ｏｃｔ３／４：：ｇｆｐマウスの脳、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、肺および肝臓組織から採取した体細胞を用いて同様の転換実験を実施した。
組織試料由来の細胞を単一細胞に分離し、一過性に低ｐＨに曝露し、ＬＩＦ含有培地で培養した。起源とする組織によって転換の効果は異なっていたが、培養ｄ７にｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞が再現性よく観察された（図１４Ａ（各組とも左から右に向かってＣＤ４５＋細胞、骨髄、脳、肺、筋肉、脂肪、線維芽細胞、肝臓および軟骨細胞を表す）。ＣＤ４５＋細胞がまれな脂肪組織の間葉系細胞（データ不掲載）のほか、軟骨細胞の初代培養細胞からもＳＴＡＰ細胞が効率的に誘導されたことは注目すべきことであり、非ＣＤ４５＋細胞集団からＳＴＡＰ細胞が生じ得ることを示している。これらのｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞クラスターはほかにも、多能性関連マーカー（図１４Ｂ（各組とも左から右に向かってＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＲｅｘ１の発現を表す）および図１８Ｂ、データ不掲載）およびＥＳ細胞特異的マーカー遺伝子（図１４Ｂおよび図１８Ｂ）を発現した。
ＳＴＡＰ細胞の多能性細胞としての特徴。したがって、ＳＴＡＰ細胞はＥＳ細胞特異的遺伝子を発現し、ｏｃｔ３／４およびｎａｎｏｇ遺伝子に同様のメチル化パターンがみられる。さらに、ＳＴＡＰ細胞は、ＬＩＦ含有培地などのマウスＥＳ細胞用の培地で樹立することができたが、マウスＥｐｉＳＣ培地では樹立することができなかった（データ不掲載）。
しかし、ＳＴＡＰ細胞にはマウスＥＳ細胞とかなりの類似性がみられたが、ほかにもいくつかの異なる特徴がみられた。例えば、ＳＴＡＰ細胞の自己複製能には制限がみられた。マウスＥＳ細胞（データ不掲載）とは異なり、ＳＴＡＰ細胞スフィアを９６ウェルプレートの各ウェルでクローン培養するべく酵素により単一細胞に分離した場合、追加でＬＩＦ含有培地（Ｇ－ＭＥＭまたはＢ２７ベース）で１０日間培養しても、付着条件であるか非付着条件であるかを問わず、コロニー（ＡＰ＋またはｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋）は全く形成されなかった（データ不掲載）。球状コロニー形成のみられる頻度は低かった（通常、９６ウェルのうち２～４ウェル）が、上記のコロニーはいずれもＡＰ－およびｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ－であった。ＳＴＡＰ細胞スフィアを部分的に分離し、高細胞密度条件下で培養した場合（データ不掲載；自己複製を支えるにはより適しているものと思われる）でも、２代継代したところで細胞数が減少し始め、継代５代目を越えるとｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞を維持することができなくなった。増殖および維持に関するこのような特徴は、ＳＴＡＰ細胞がマウスＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞とは特徴が一部異なる多能性細胞集団であることを示唆している。
マウスＥｐｉＳＣは、分化段階が若干進んだと考えられる別の種類の多能性幹細胞である。ＳＴＡＰ細胞は、いくつかの側面でＥｐｉＳＣ細胞とは挙動が異なるように思われた。付着培養では、ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞はマウスＥｐｉＳＣにみられる単層で平坦なコロニーとは異なり、マウスＥＳ細胞のように積み重なることにより半球状のコロニーを形成した。ＳＴＡＰ細胞はＥｐｉＳＣ培地で維持することも不可能であり、ＳＴＡＰ細胞がＥｐｉＳＣとは類似していないことが示唆される（データ不掲載）。さらに、ＥｐｉＳＣの単一細胞の継代を改善するＲＯＣＫ阻害剤（参照；Ｏｈｇｕｓｈｉ）で処理しても、分離ＳＴＡＰ細胞からのコロニー形成の促進はみられなかった（データ不掲載）。
免疫染色から、ＳＴＡＰ細胞がＥｐｉＳＣマーカーであるクローディン７およびＺＯ－１に陰性を示し、Ｋ１ｆ２／４に陽性を示すことが明らかになった（データ不掲載）。ＥＳ細胞マーカーであるＥｓｒｒβの発現はＳＴＡＰ細胞、ＥｐｉＳＣともに低いのに対し、ｅｌｆ５の発現はＳＴＡＰ細胞で特に低い（図１５Ａ（各組とも左から右に向かってＥＳ、ＥｐｉＳＣ、ＳＴＡＰおよびＣＤ４５を表す））ことから、ＥＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞およびＥｐｉＳＣのグループ分けはそれほど単純なものではないものと考えられる。ゲノム全域にわたるトランスクリプトームのクラスター解析では、ＳＴＡＰ細胞はＥＳ細胞に最も近く、ＲＮＡ発現は胚盤胞と実質的に同じであるのに対し、親ＣＤ４５＋細胞からは最も遠い（データ不掲載）。ＳＴＡＰ細胞のＸ染色体不活化の状態は興味深いものであり、具体的には、雌性ＳＴＡＰ細胞（ｄ７）の約４０％に不活化染色体がみられたのに対し、残りの細胞（約６０％）ではＸ染色体不活化が打ち消されていた（図１５Ｂ）。
以上の観察結果から、ＳＴＡＰ細胞の分化状態が、ＥＳ細胞に近いがこれとは異なる新規な準安定多能性状態であるという可能性が浮上してきた。
マウスにおけるキメラ形成および生殖系列伝達。最後に、胚盤胞注入アッセイによりＳＴＡＰ細胞のキメラ形成能を評価した。ＥＳ細胞とは異なり、ＳＴＡＰ細胞（Ｂ６のバックグラウンド）を単一細胞に分離してＩＣＲ胚盤胞に注入しても、体毛の色が濃いキメラマウスは全く生まれなかった（表４）。単一のＳＴＡＰ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することはほぼ不可能であることから、細胞の分離がその能力をいくぶん変化させるものと推測された。そこで、ＳＴＡＰ細胞クラスターを顕微鏡下でマイクロナイフを用いて手作業で小片に切り分け、一括して胚盤胞に注入した（データ不掲載）。このような手技を用いたところ、キメラマウスが相当な割合で生まれ、いずれも正常に発達した（データ不掲載）。次に、ＧＦＰを恒常的に発現するマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦＰとＤＢＡ／２または１２９／Ｓｖとを交雑したＦ１）のＣＤ４５＋細胞から生成し注入したＳＴＡＰ細胞の組織寄与率を検討した。ＳＴＡＰ細胞クラスターを注入したキメラ胚にＧＦＰ発現細胞が高い寄与率ないし中程度の寄与率でみられた（データ不掲載）。
ＦＡＣＳにより上記キメラ胚の各組織におけるＧＦＰ＋細胞の寄与率を解析した。ＣＤ４５＋細胞由来ＳＴＡＰ細胞は検討したいずれの組織にも寄与していた（データ不掲載）。さらに、キメラマウスにはＳＴＡＰ細胞に由来する子孫が生まれた（表５）。遺伝的およびエピジェネティック的に正常であることのほかにも、生殖系列伝達が多能性の厳格な基準であると考えられていることから２２、ＳＴＡＰ細胞のこの能力は重要であり、この真の多能性細胞の性質を示すものである。次いで、４Ｎ胚盤胞に細胞を注入することにより四倍体（４Ｎ）補完法を実施した（データ不掲載）。四倍体（４Ｎ）補完法は、得られる胚が注入したドナー細胞にのみ由来することから、その細胞の発生能を検討するのに最も厳密な試験法であると考えられている２３。ＣＤ４５＋細胞由来ＳＴＡＰ細胞（ＤＢＡ×Ｂ６ＧＦＰまたは１２９／Ｓｖ×Ｂ６ＧＦＰ Ｆ１マウス由来）を４Ｎ胚盤胞に注入したところ、Ｅ１０．５に「すべてＧＦＰ＋の胚」が形成され（データ不掲載）、胚構造全体を構築するのにＳＴＡＰ細胞のみで十分であることが示された。
以上の観察結果を考え合わせると、ＳＴＡＰ細胞が胚環境においてあらゆる体細胞および生殖系列に分化する発生能を有することを明確に示している。
考察
ここに記載したデータから、体細胞が潜在的にもつ驚くほど柔軟な可塑性が明らかになった。多能性細胞への転換さえ起こるこの動的可塑性は、細胞をその生存環境では通常経験しないと考えられる強い刺激に一過性に曝露したときに現れる。
ＣＤ４５＋細胞からＳＴＡＰ細胞への転換は、少なくともＨＤＡＣ阻害剤（例えば、トリコスタチンＡ）による処理にも５－アザ－シチジンによる処理にも実質的に影響を受けることはなかった。
ここでは、低ｐＨ処理により培養細胞の数が実質的に減少したことを示した。しかし実際には、最初の２４時間の生存細胞の減少はわずかなものであり、大部分の細胞にはこの処理が急性致死作用を及ぼした可能性は低いことを示唆している。代わりに、遅れてｄ２～ｄ５の間に細胞の消失が徐々に起こった。これと同じように、データから、低ｐＨに曝露したｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞では、同じ培地で培養した対照細胞とは異なり、ｄ３にストレスに対する細胞応答およびＤＮＡ修復に関与する多数の遺伝子２１が強力に誘導されたことが明らかになり、細胞が生命を脅かすストレスまたは亜致死性ストレスのような刺激に応答したことが示唆された。興味深いことに、その遺伝子発現レベルはｄ７でさらに高くなったことから、ストレス誘導遺伝子が細胞生存に果たす役割のみならず、推測ではあるが、ストレス誘導遺伝子がリプログラミング過程に関与している可能性も今後検討するのに興味深い。
また別の未解決の問題として、細胞のリプログラミングが低ｐＨ処理によって特異的に開始されるのか、いくつかの他の種類の亜致死性ストレス、例えば物理的損傷、細胞膜穿孔、浸透圧ショック、成長因子遮断、低酸素状態および高Ｃａ２＋培地曝露などによっても開始されるのかという問題がある。少なくともその一部、特に激しい研和による物理的損傷およびストレプトリジンＯによる膜穿孔によって、ＣＤ４５＋細胞からのｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞の生成が誘導されたのは注目すべきことである（図１８Ａ）。これらの観察結果から、このような関連性の低い亜致死性ストレスの下流に存在する特定の共通する調節モジュールが、堅く施錠されたエピジェネティックな分化状態から体細胞を開放する鍵として作用し、エピジェネティック調節全体の変化を引き起こす可能性が浮上してくる。一部のｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ＋細胞がｄ２までに出現したことを考えると、このようなリプログラミング機序が最初の２日間の間に機能し始めるという可能性がある。
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１６ Ｙｉｎｇ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，５１９－５２３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６９６８（２００８）．１７ Ｏｇａｗａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｓ．＆ Ｎｉｗａ，Ｈ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｌｏｎａｌ
ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｖｏｔｅｄ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ９，Ａｌ ｌ－４７７，ｄｏｉ：１０．１１ １１／ｊ．ｌ３５６－９５９７．２００４．００７３６．ｘ（２００４）．
１８ Ｇｏｕｇｈ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＬＩＦ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １，２８１－２８８（１９８９）．
１９ Ｈｉｔｏｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｏ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８，１８０６－１８１１，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．ｌ２０８４０４（２００４）．
２０ Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｈａｒｅ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４％，１９６－１９９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５９７２（２００７）．
２１ Ｓａｒｅｔｚｋｉ，Ｇ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｌ．，Ｌｅａｋｅ，Ａ．，Ｌａｋｏ，Ｍ．＆ ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．Ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ
ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２，９６２－９７１，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２２－６－９６２（２００４）．
２２ Ｓｕｒａｎｉ，Ｍ．Ａ．＆ Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇｙｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｇｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２，１０３４－１０３６（１９８３）．
２３ Ｎａｇｙ，Ａ．，Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｎａｇｙ，Ｒ．，Ａｂｒａｍｏｗ－Ｎｅｗｅｒｌｙ，Ｗ．＆ Ｒｏｄｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅａｒｌｙ－ｐａｓｓａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０，８４２４－８４２８（１９９３）．
２４ Ａ．Ｐ．Ｄｙｂａｎ，Ｖ．Ｓ．Ｂ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）．
２５ Ｇｒｏｐｐ，Ａ．，Ｗｉｎｋｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｅｒｂｓｔ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｃｌａｕｓｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．Ｍｕｒｉｎｅ ｔｒｉｓｏｍｙ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏ，ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｚｏｏｌｏｇｙ ２２８，２５３－２６９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｅｚ．ｌ４０２２８０２１０（１９８３）．
材料および方法
組織採取および細胞培養。成熟リンパ球を単離するため、１週齢のＧＯＦマウスまたはＩＣＲマウス由来の脾臓を鋏で細切し、パスツールピペットを用いて機械的に分離した。分離した脾臓をセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ）でろ過した。収集した細胞をＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、同じ体積のｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（登録商標）、オンタリオ州、カナダ）を加えた後、１０００ｇで１５分間遠心分離した。リンパ球層を取り出し、ＣＤ４５抗体（ａｂ２５６０３、ａｂｅａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）とともに獲得した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりＣＤ４５陽性細胞を分取した。次いで、ＣＤ４５陽性細胞にストレス処理（ｐＨ５．５の溶液で１５分間）を実施し、１０００ＵのＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＢ２７培地に播いた。
外部刺激への曝露－ストレス処理。成熟細胞に機械的応力を加えるため、パスツールピペットを加熱し、次いでこれを引っ張って伸ばし、直径が約５０ミクロンの内腔を形成させた後、折った。次いで、このピペットに成熟体細胞を通して２０分間研和し、７日間培養した。成熟細胞に低酸素刺激を加えるため、酸素５％のインキュベーター内で細胞を３週間培養した。成熟細胞を基本培地で３週間培養することにより、細胞に低栄養状態刺激を加えた。２ｍＭのＣａＣｌ２を含有する培地で成熟細胞を７日間培養することにより、細胞に高Ｃａ培養濃度をもたらした。成熟細胞を生理的ストレスに曝露するため、細胞を低ｐＨ（ｐＨ５．５）溶液で処理し、７日間培養した。ほかにも、細胞にさらに深刻な損傷を与えた。成熟細胞膜にポアを生じさせるため、細胞を２３０ｎｇ／ｍｌのＳＬＯ（ストレプトリジンＯ）（Ｓ５２６５、Ｓｉｇｍａ社）で２時間処理した後、７日間培養した。
バイサルファイトシーケンス。ＧＯＦマウスから入手した細胞を単一細胞に分離した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）を用いてＧＦＰ陽性細胞を収集した。ＳＡＣからゲノムＤＮＡを抽出し検討した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、テメキュラ、カリフォルニア州、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｃｏｎ．ｃｏｍ）を製造業者の指示書の通りに用いてＤＮＡのバイサルファイト処理を実施した。
得られた修飾ＤＮＡを２つの順方向（Ｆ）プライマーおよび１つの逆方向（Ｒ）プライマー：
Ｏｃｔ４（Ｆ１、ＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴ；Ｆ２、ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ；Ｒ、ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ）およびＮａｎｏｇ（Ｆ１、ＧＡＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴ；Ｆ２、ＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴ；Ｒ、ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣ）
を用いたネステッドポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲにより増幅した。ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＲ０３０Ａ）を用いてＰＣＲを実施した。ＧＲＡＳ（ゲノム資源解析ユニット）の援助によりＭ１３プライマーを用いてＤＮＡシーケンシングを実施した。
免疫組織化学。培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ－１００／ＰＢＳで透過処理した後、１％ＢＳＡ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、東京、日本）でブロッキングした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ－４８８またはＡｌｅｘａ－５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と結合したヤギ抗マウスまたは抗ウサギ抗体とした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社）で細胞核を可視化した。ＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でスライドをマウントした。
蛍光標識細胞分取およびフローサイトメトリー。細胞を標準的プロトコルに従って調製し、氷上で０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁させた後、ＦＡＣＳを実施した。ＰＩ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて死細胞を排除した。陰性対照では、一次抗体を同じアイソタイプのＩｇＧ陰性対照に置き換えて特異性を確保した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（商標）で細胞を分取し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを備えたＢＤ ＬＳＲＩＩ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。
ＲＮＡ調製およびＲＴ－ＰＣＲ解析。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ（商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅＳＡＣｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を実施した。増幅にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）Ｍｉｘ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ－ＩＩ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に試料を供した。
動物試験。腫瘍形成能試験には、ＰＢＳ １００ｍｌに懸濁させた細胞を年齢の一致した免疫不全ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射した。６週間後、マウスを屠殺し剖検した。
ＡＴＰおよびＲＯＳアッセイ。供給業者のプロトコルに従ってＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＨＳ ＩＩ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）により細胞間ＡＴＰレベルを測定した。Ｇｅｌｏｍａｘ（商標）９６ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いることにより蛍光強度を測定し、蛍光読取り値を細胞カウント数により正規化した。ＲＯＳレベルの測定には、細胞を暗黒中、２μΜジヒドロエチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を含有する培地で１５分間、３７℃にてインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁させた。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、スパーク、メリーランド州）を用いて３００００個の細胞の蛍光強度を記録した。
キメラマウス形成および解析。
二倍体キメラおよび四倍体キメラの作製。ＩＣＲ系雌とＩＣＲ雄との交配から二倍体胚を入手し、ＢＤＦ１系雌とＢＤＦ１雄との交配から四倍体胚を入手した。２細胞胚の電気融合により四倍体胚を作製した。この試験では、トリプシン処理によりキメラ化が低下したため、ＳＡＣ球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを用いて小片に切り分けた後、ＳＡＣの小さいクラスターを大きいピペットで４．５日目の胚盤胞に注入した。翌日、キメラ胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌に移植した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化アッセイ。
中胚葉系列分化アッセイ。第７日にストレス変化細胞の集団を収集し、単一細胞に分離した後、セルソーターによりＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞のみを収集した。収集した細胞は、２０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭであった。３日ごとに培地を交換した。７～１４日後、抗α－平滑筋アクチン抗体（Ｎ１５８４、ＤＡＫＯ社）で筋細胞を染色した。陰性対照では、一次抗体を同じアイソタイプのＩｇＧ陰性対照の置き換えて特異性を確保した。
神経系列分化アッセイ。第７日にストレス変化細胞の集団を収集し、単一細胞に分離した後、セルソーターによりＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞のみを収集した。収集した細胞を、２％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％のＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）および２０ｎｇ／ｍのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１、ｖ／ｖ）を入れたオルニチンコートチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に播いた。３日ごとに培地を交換した。１０～１４日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間、４℃にて固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで１５分間、室温にて洗浄し、２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで２０分間インキュベートして非特異的反応をブロックし、抗βΙΙΙチューブイン（Ｔｕｂｕｉｎ）マウスモノクローナル抗体（Ｇ７１２１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）および抗ＧＦＡＰマウスモノクローナル抗体（ＡＢ５８０４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）とインキュベートした。陰性対照では、一次抗体を同じアイソタイプのＩｇＧ陰性対照の置き換えて特異性を確保した。
肝分化アッセイ。第７日にストレス変化細胞の集団を収集し、単一細胞に分離した後、セルソーターによりＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞のみを収集した。収集した細胞を、肝細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ社、ヴッパータール、ドイツ）５００ｍＬ、アスコルビン酸０．５ｍＬ、ＢＳＡ－ＦＡＦ（無脂肪酸）１０ｍＬ、ヒドロコルチゾン０．５ｍＬ、トランスフェリン０．５ｍＬ、インスリン０．５ｍＬ、ＥＧＦ ０．５ｍＬおよびゲンタマイシン－アンホテリシン０．５ｍＬ（ＧＡ－１０００；以上Ｌｏｎｚａ社製）からなり１０％のＦＣＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社）を添加した肝細胞培地を入れたチャンバー２ウェルスライドガラス（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に播いた。以下の抗体；抗α－フェトプロテインマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ１３６８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）および抗サイトケラチン７マウスモノクローナル抗体（ａｂ６６８、ａｂｅａｍ社）を用いた免疫組織化学により分化細胞を検出した。陰性対照では、一次抗体を同じアイソタイプのＩｇＧ陰性対照の置き換えて特異性を確保した。
ｉｎ ｖｉｖｏ分化アッセイ：第７日にストレス変化細胞の集団を収集し、単一細胞に分離した後、セルソーターによりＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞のみを収集した。収集した細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ ５０μｌに再懸濁させた。この溶液を直径２００ミクロンのポリグリコール酸繊維の不織布メッシュからなる３×３×１ｍｍのシートに播種し、４週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背側腹側部の皮下に埋植した。４週間後、埋植物を回収し、免疫組織化学的手法を用いて解析した。埋植物を１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、ルーチン的に処理して厚さ４μｍにした。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。内胚葉マーカーである抗α－フェトプロテインマウスモノクローナル抗体（ＭＡＢ１３６８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて内胚葉組織を同定した。抗βΙΙΙチューブリンマウスモノクローナル抗体（Ｇ７１２１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて外胚葉組織を同定した。抗α－平滑筋アクチン抗体（Ｎ１５８４、ＤＡＫＯ社）を用いて中胚葉組織を同定した。陰性対照では、一次抗体を同じアイソタイプのＩｇＧ陰性対照の置き換えて特異性を確保した。
ＴＣＲβ鎖再編成の解析。ＣＤ４５陽性細胞由来のＳＡＣを用いて形成したキメラマウスの尾端およびＳＡＣからｇＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡ ５０ｎｇにプライマー（５’－ＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴ－３’および５’－ＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴ－３’）を用いてＰＣＲを実施した。増幅したＤＮＡを１．５％アガロースゲルで電気泳動させた。
キメラマウスのジェノタイピング。４Ｎキメラマウスの尾端からｇＤＮＡを抽出した。プライマー（ＧＦＰ：Ｆ－ＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧおよびＲ－ＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴ；ＩＬ－２：Ｆ－ＣＴＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＡＴＣＴおよびＲ－ＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣ）を用いてジェノタイピングを実施した。
次いで、Ｏｃｔ４を発現するストレス変化細胞の維持に最適な培養条件を決定した。ＥＳ樹立培地である３ｉ１６およびＡＣＴＨ１１、ＥＳ培養条件であるＥＳ－ＬＩＦ１８、Ｏｃｔ４発現原始神経幹細胞培養条件であるＢ２７－ＬＩＦ１ならびにＥｐｉＳＣ培養条件２０を含めたこれまでに記載されているいくつかの培地を検討した。各培地に細胞を播き、ＧＦＰ発現コロニーをカウントした（図Ｓ１Ｃ）。ＧＦＰ発現球状コロニーの生成には培地Ｂ２７－ＬＩＦが最も効果が高いように思われた。したがって、処理細胞の培養にはＢ２７－ＬＩＦ培地を用いた。
様々な組織から得られた細胞から生成したＳＡＣに異なる分化傾向があるかどうかを検討するため、Ｆ１ ＧＦＰマウスに由来する様々な組織からＳＡＣを生成し、それをＩＣＲ胚盤胞に注入した。次いで、ＦＡＣＳを用いて、形成されたキメラマウスの各組織での寄与率を解析した。いずれの組織に由来するＳＡＣもキメラマウス形成に寄与することがわかった（データ不掲載）。さらに、様々な組織に由来するＳＡＣを用いて形成したキメラマウスでの皮膚、脳、筋肉、脂肪、肝臓および肺に対する寄与率を解析した。いずれの組織に由来するＳＡＣｓも、３胚葉すべての代表的な組織の形成に寄与し、分化傾向は全くみられなかった（データ不掲載）。
Figure 2023011931000005
Figure 2023011931000006
実施例３
理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載される方法は、アポトーシスまたは制御された細胞死に関連する過程を活性させものであると考えられる。細胞が軽度の損傷を受けると、修復遺伝子の活性化が誘導され得る。細胞が重度の損傷を受けると、これまでに明らかにされていない生存機序が活性化され得る。細胞が著しいストレス、例えば本明細書に記載されるストレスなどに曝露されると、損傷を受けた細胞から細胞成分（例えば、ミトコンドリア、小胞、核、リボソーム、小胞体、エキソソーム、エンドソーム、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム、ＡＴＰ、タンパク質、酵素、炭水化物、脂質など）が「セリュー（ｃｅｌｌｉｅｕ）」中に放出されることが考えられる。本明細書に記載されるデータは、この「セリュー（ｃｅｌｌｉｅｕ）」が細胞を再構成し、かつ／または細胞の生存を促進することが可能であり得ることを示している。さらに、理論に束縛されることを望むものではないが、ミトコンドリア（およびその他の細胞小器官）は細胞の再構成を指令することが可能であることが考えられる。ミトコンドリアは、大きさが小さく、単純で、細胞分化を指令することが可能であり、原核生物様の性質をもつことから、親細胞にとっては致死的となるストレスを生き延びるものと考えられる。ミトコンドリアは、遊離した状態、膜に封入された状態および／または他の細胞成分と結合した状態で細胞から放出され得る。
あるいは、理論に束縛されることを望むものではないが、核が、ミトコンドリアをある程度含むことができる細胞膜に封入されて無傷の状態で存在し続けるという可能性もある。次いで、核のエピジェネティックな調節を失い細胞質および細胞小器官が極めて少なくなった損傷細胞が、押し出された細胞小器官と相互作用し、可能性としてはこれと融合する可能性が考えられる。これにより、成長および複製に必要な細胞成分を有する細胞が生じるが、その細胞はエピジェネティックな調節が失われており、したがって、より原始的な（例えば、より多能性の高い）状態が誘導される。
実施例４：リプログラミングされ多能性を獲得した細胞の胚系列および胎盤系列への発生能
一般に、出生後の体細胞の運命は固定されており、核移植１、２または鍵となる転写因子による遺伝子操作３を受けない限り変わらない。本明細書で示されるように、本発明者らは、刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）４と呼ばれる、亜致死性刺激により体細胞が多能性細胞にリプログラミングされるという予想外の現象を発見した。本明細書にはほかにも、リプログラミングされたＳＴＡＰ細胞がＥＳ細胞とは異なる特有の分化能を示すことが示される。ＳＴＡＰ細胞は、胚盤胞注入アッセイからわかるように、胚組織のみならず胎盤系にも寄与し得る。その胎盤寄与の効果は、ＦＧＦ４とともに培養することによってさらに強化された。逆に、ＥＳ細胞維持培地でさらに継代して培養すると、最初は自己複製能に制限がみられたＳＴＡＰ細胞から、トロホブラスト様ではなくＥＳ細胞様の特徴を示し安定して増殖する細胞系が生じる。四倍体補完法では、この変化したＳＴＡＰ細胞（ＳＴＡＰ幹細胞）からマウスが生まれたが５、胎盤組織に寄与することはなかった。したがって、ＳＴＡＰ細胞は、ｉＰＳ細胞とは異なり、ＥＳ細胞のものとは異なる新規な準安定状態の多能性６を示し得る。ＳＴＡＰ幹細胞技術は、新世代再生医療の多用途で強力な資源をもたらし得るものである。
ここでは、細胞運命の転換、具体的には、体細胞が低ｐＨ曝露などの亜致死性刺激を受けた後に多能性を再獲得する４という興味深い現象について記載する。脾臓ＣＤ４５＋細胞（運命拘束されたＴ細胞を含む）をｐＨ５．７に３０分間曝露し、次いでＬＩＦの存在下で培養すると、第２日（ｄ２）に相当な割合の生存細胞が多能性細胞マーカーであるＯｃｔ３／４を発現し始める。ｄ７までには、真の多能性マーカープロファイルおよび３胚葉に分化する能力（例えば、奇形腫形成によって示される）を有する多能性細胞のクラスターが形成される。このＳＴＡＰ細胞はほかにも、胚盤胞注入アッセイでキメラマウスに効率的に寄与し得る、生殖系列伝達が可能である。これらの特徴はＥＳ細胞のものと類似しているが、ＳＴＡＰ細胞は、少なくとも自己複製能に制限があり（通常、継代数が最大３～５代）、解離培養において脆弱であるという点でＥＳ細胞とは異なるものであるように思われる４。
本実施例では、胚盤胞注入アッセイにより予想外の観察結果が明らかになったのち、本発明者らは、ＳＴＡＰ細胞が胚盤胞の２つ主要な種類の細胞である内部細胞塊型（またはＥＳ細胞様）細胞およびトロホブラスト／胎盤系列細胞に分化する能力に対象を絞り込み、その特有の性質をさらに検討した７～９。注入したＥＳ細胞の子孫は全般的に、キメラの胚部分にはみられたが、胎盤部分にみられるのはまれであった７（データ不掲載）。注入したＳＴＡＰ細胞が胚のみならず胎盤および胚体外膜にも寄与したのは驚くべきことである（図２２）。この２つの系列への寄与はキメラ胚のおよそ６０％に観察された。
この観察結果に促されてＳＴＡＰ細胞のトロホブラストへの分化能を検討した。胚盤胞をＦＧＦ４の存在下で長期間付着培養することでトロホブラスト細胞系（トロホブラスト幹細胞；ＴＳ細胞）８、９を誘導することが可能であることが知られている。ＳＴＡＰ細胞クラスターを同じ条件下で培養したところ（図２３Ａ；９６ウェルプレートの１ウェル当たり１つのクラスター）、球状のＳＴＡＰ細胞クラスターが徐々に消失し、ｄ７～ｄ１０までには、ＳＴＡＰ細胞とは異なる平坦な外見をもつ細胞が生じてコロニーを形成した（データ不掲載）。ｏｃｔ３／４：：ＧＦＰ発現のレベルが高いＳＴＡＰ細胞とは異なり、この平坦な細胞（プレート底面に付着していた）は、ＦＧＦ４との培養の第７日に中程度のＧＦＰシグナルを示した（データ不掲載）。免疫染色では、ＦＧＦ４誘導（Ｆ４Ｉ）細胞が中程度のレベルのｏｃｔ３／４：：ＧＦＰに加えて、トロホブラストのマーカー１０～１２であるインテグリンアルファ７およびエオメソデルミンを強力に発現する（データ不掲載）ことがわかった。Ｎａｎｏｇの発現が検出されたが、極めて低レベルであった（データ不掲載）。これと同じくｑＰＣＲ解析でも、Ｆ４Ｉ細胞がトロホブラスト系列マーカー遺伝子（例えば、ｃｄｘ２）は相当なレベルで発現するのに対し、ｏｃｔ３／４およびｎａｎｏｇの発現は親ＳＴＡＰ細胞よりも低いことが示された（図２３Ｂ）。このＦ４Ｉ細胞は、３日ごとにトリプシン消化を用いて継代することにより効率的に拡大することができ、ＦＧＦ４の存在下では３０代を超えても安定な状態を維持した（ＦＧＦ４の非存在下では増殖が止まった）。この樹立および拡大はＭＥＦ細胞上でもゼラチンコートした底面上でも可能であったが、ＭＥＦフィーダー上で培養した方が上皮の外見が明瞭に見える傾向があった（データ不掲載）。
胚盤胞注入アッセイでは、Ｆ４Ｉ細胞の胎盤寄与が高頻度で観察された（５０～６０％）（データ不掲載）。キメラ胎盤では、Ｆ４Ｉ細胞が胎盤細胞全体の約１０％に寄与するのが通常であった（図２３Ｃ、レーン１～３；対照ＥＳ細胞には実質的な胎盤寄与がみられなかったことに注目されたい、レーン４～６）。これらの観察結果は、少なくともトロホブラストマーカーの発現および胎盤への寄与を考慮に入れれば、ＳＴＡＰ細胞がＦＧＦ４処理によりＴＳ様細胞を生成する能力を有することを示唆している。ＥＳ細胞には（遺伝子操作しない限り）ＴＳ様細胞へのこの種の誘導があまりみられない１１ことから、このような能力は、ＥＳ細胞とは異なるＳＴＡＰ細胞のまた別の特徴であると思われる。
一方、ＳＴＡＰ細胞に由来するＦ４Ｉ細胞はほかにも、胚盤胞由来ＴＳ細胞とは異なる特徴を有するものと思われる。第一に、従来のＴＳ細胞１３とは異なり、Ｆ４Ｉ細胞は中程度のレベルのｏｃｔ３／４を発現した（データ不掲載）。さらに、ＴＳ細胞とは異なり、胚盤胞注入Ｆ４Ｉ細胞にはこのほか、寄与度は全般的に低いものの、（キメラ胎盤を用いたいずれの場合にも）胚部分への寄与がみられた（データ不掲載）。
以上の観察結果をまとめると、ＳＴＡＰ細胞集団が胎盤分化の能力を有する点でＥＳ細胞とは性質が異なることがわかる。
このことを考慮して、胚盤胞に存在するまた別の細胞型である胚系列への分化を検討した。ＥＳ細胞とは異なり、ＳＴＡＰ細胞は自己複製能に制限があり、単一細胞から拡大することができない。従来のＬＩＦ含有培地（ＳＴＡＰ細胞樹立に用いたＢ２７＋ＬＩＦ培地を含む）ではＳＴＡＰ細胞を（クラスターの部分的な解離培養を用いても）６代以上維持することはできなかった。しかし、ＬＩＦを加えたＡＣＴＨ含有培地１５（以降、ＡＣＴＨ培地）には、ＳＴＡＰ細胞コロニーの増殖速度に対して比較的良好な支持作用がみられた（データ不掲載）。ＡＣＴＨ培地中、ＭＥＦフィーダーまたはゼラチン上で培養したところ（図２４Ａ）、一部のＳＴＡＰ細胞クラスターが増殖し続けた（通常、９６ウェルプレートを用いた単一クラスター培養でウェルの２０～５０％にみられた）（データ不掲載）。この増殖コロニーはマウスＥＳ細胞のものと類似し、高レベルのｏｃｔ３／４：：ＧＦＰを発現した。親ＳＴＡＰ細胞とは異なり、この拡大コロニーの細胞は、この培地で７日間培養した後、解離への耐性を示すようになり、単一細胞として継代することが可能であった（データ不掲載）。ＳＴＡＰ細胞とは対照的に、この変化した細胞はＥＳ細胞のように、少なくとも培養１２０日目までは指数関数的に増殖することが可能であった（図２４Ｂ）。この拡大可能性の増大には、多色ＦＩＳＨ解析によって示されるように、染色体異常は伴わなかった１６（データ不掲載）。７日間の拡張後、細胞は増殖し、検討したＥＳ細胞培地のいずれでも維持することができたが、この最初の７日間の拡大が最も効率的に実施されたのはＡＣＴＨ培地であった（例えば、３ｉ培地ではコロニーの形成速度が遅く、頻度も低かった１７；データ不掲載）。
以降、ＳＴＡＰ細胞に由来する増殖性細胞をＳＴＡＰ幹細胞と呼ぶ。ＳＴＡＰ細胞とは異なり、ＦＧＦ４との培養でＳＴＡＰ幹細胞からＴＳ様細胞が生じることはなかった（データ不掲載）。免疫染色から、雌ＳＴＡＰ細胞に相当な割合でみられた（参考文献）Ｘ染色体不活化１８がＳＴＡＰ幹細胞にはもう観察されないことがわかった（データ不掲載）。ＳＴＡＰ幹細胞は、ＥＳ細胞の様々なＲＮＡマーカー（図２４Ｃ）およびタンパク質マーカー（データ不掲載）を発現した。ＣＤ４５＋からＳＴＡＰ細胞に転換したときに脱メチル化されるｏｃｔ３／４およびｎａｎｏｇ遺伝子座でのＤＮＡメチル化のレベルは低く維持された（図２４Ｄ）。分化したクラスター１９～２１では、ＳＴＡＰ幹細胞から外胚葉、中胚葉および内胚葉誘導体が生じた（データ不掲載）。以上の観察結果は、ＳＴＡＰ幹細胞がＥＳ細胞のものとは異なる特徴を示すことを示している。
このことと一致して、ＳＴＡＰ幹細胞は、複数代継代した後にも奇形腫を形成し（データ不掲載）、胚盤胞注入によりキメラマウスに効率的に寄与する（データ不掲載）ことが可能であった。ＳＴＡＰ幹細胞の胚寄与における著明な有効性は、四倍体補完法５でこの細胞から、成体まで成長し、さらには子孫をもたらすことも可能なマウスが生まれたことによって明確に示された（データ不掲載）。８つの異なる系統のＳＴＡＰ幹細胞がこの能力を再現性よく示した（このような完全な補完はよく用いられるＥＳ細胞系でも困難なことが多いことに注目されたい）ことを考慮すれば、成体体細胞を起源とするＳＴＡＰ細胞が、多能性幹細胞系の誘導という側面で胚盤胞そのものと同等の（あるいは可能性としてはこれに勝る）魅力的な供給源になり得るものと推測される。
重要なのは、ＳＴＡＰ細胞およびＦ４Ｉ細胞とは異なり、ＳＴＡＰ幹細胞は胎盤組織に寄与する能力を喪失したように思われる（データ不掲載）一方で、キメラの様々な組織を生じた（図２５Ａ～２５Ｂ）ことである。したがって、ＳＴＡＰ細胞とＳＴＡＰ幹細胞との差は、自己複製活性にとどまらず、胎盤系列に分化する能力の喪失も含むものである。
以上の観察結果は、ＳＴＡＰ細胞に特有の多能性状態を示している。単一細胞からのＳＴＡＰ細胞のクローン化が不可能である（上記の）ことが単一細胞レベルでの運命拘束解析の妨げになっているが、ＳＴＡＰ手順により体細胞を胚系列にも胎盤系列にも適性のある多能性細胞集団に転換することが可能であることは注目に値する。ＳＴＡＰ細胞の分化状態を徹底的に理解することが今後の研究に重要な主題となる。特に、ＳＴＡＰ細胞が桑実胚期の胚細胞に類似した胎盤系列への適性を有することによって示唆されるように、ＳＴＡＰ細胞がＥＳ細胞よりも成熟が進んだ状態にあるのかどうかを検討するのが興味深いものとなる。最近の研究では、従来のＥＳ細胞培養にも、ごく初期の段階の胚のものに類似した明確な特徴を有する極めて少数のＯｃｔ３／４－細胞の集団が含まれることが報告されている２２。ＳＴＡＰ細胞は、二重適性能を可能にするがＥＳ細胞とは異なる類似した代謝状態を有する可能性があり、この状態は大部分の細胞集団にみられるものである。
ここでは、ＳＴＡＰ細胞がＥＳ様多能性幹細胞系に形質転換する能力を有することを示す。ＳＴＡＰ細胞（雌マウス由来）はＸ染色体不活性化がいくぶんモザイクになっており、ＳＴＡＰ細胞の約４０％に不活化の消失がみられ４、残りの細胞はこれを維持することは注目に値する。これに対し、ＥＳ細胞ではＸ染色体がともに再現性よく不活化されている。興味深いことに、誘導後のＳＴＡＰ「幹」細胞にはＥＳ細胞と同じくＸ染色体不活性化が全くみられず、この意味においても、親ＳＴＡＰ細胞のエピジェネティックな調節がマウスＥＳ細胞のものと類似しているが同じではないことが示唆される。
これらの結果は、運命拘束された体細胞には予想外にも、亜致死性刺激に曝露したときにそれ自体の運命をナイーブ細胞にリプログラミングする「自発的な転換能力」があることを示している。これにより、上記のものを含めた興味深く難解な生物学的疑問が浮上してくる。それに加えて、この新たに発見されたＳＴＡＰ現象が幹細胞医療の方法論にもたらす可能性がある。遺伝子導入（癌性形質転換のリスクを増大させ得る）を用いずに体細胞から誘導されるＳＴＡＰ細胞またはＳＴＡＰ幹細胞から導かれる分化によって、様々な型の組織の形成が可能になることが考えられる。さらに、ｉＰＳ細胞の転換とは異なり、ＳＴＡＰ転換は極めて高い頻度で起こり、低ｐＨ曝露などの強い刺激によって惹起される特定の内因性のプログラムによって進行する。ＳＴＡＰ幹細胞はＥＳ細胞のように容易に拡大およびクローン化が可能であることから、厳格な品質管理の下で医学的に有用な組織を大規模に生成するにはＳＴＡＰ細胞よりもＳＴＡＰ幹細胞の方が適するものと考えられる。本発明者らは予備研究で、ＳＴＡＰ幹細胞が効率的に網膜前駆細胞２３、皮質前駆細胞２４および拍動心筋細胞２５に分化するのを示すことに成功を収めている（データ不掲載）。
方法
細胞培養。低ｐＨ溶液に一過性に曝露することによりＣＤ４５＋細胞からＳＴＡＰ細胞を生成した後、Ｂ２７＋ＬＩＦ培地で培養した（Ｏｂｏｋａｔａら，２０１３；共同提出）。Ｆ４Ｉ細胞系の樹立には、９６ウェルプレートのＦＧＦ４含有ＴＳ培地中のＭＥＦフィーダー細胞上にＳＴＡＰ細胞クラスターを移した。ｄ７～ｄ１０の間に従来のトリプシン法を用いて細胞に最初の継代を実施した。ＳＴＡＰ幹（ＳＴＡＰＳ）細胞系の樹立には、ＡＣＴＨ含有培地中のＭＥＦフィーダーまたはゼラチンコートディッシュ上にＳＴＡＰスフィアを移した。４～７日後、従来のトリプシン法を用いて細胞に最初の継代を実施し、懸濁させた細胞を５％のＦＣＳおよび１％のＫＳＲを含有するＥＳ維持培地に播いた。
キメラマウス形成および解析。ＳＴＡＰ幹細胞、Ｆ４Ｉ細胞およびＥＳ細胞の注入には、従来の胚盤胞注入法を用いた。ＳＴＡＰ細胞注入には、トリプシン処理によりキメラ化が低下したため、ＳＴＡＰ細胞クラスターを一括して注入した。ＳＴＡＰ球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを用いて小片に切り分けた後、ＳＴＡＰコロニーの小さいクラスターを大きいピペットで４．５日目の胚盤胞に注入した。翌日、キメラ胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌に移植した。２細胞胚の電気融合により四倍体胚を作製した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ分化アッセイ：１×１０５個のＳＴＡＰＳ細胞を４週間齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背側腹側部に皮下注射することにより奇形腫形成を検討した。ＳＤＩＡ法およびＳＦＥＢｑ法２４、２６によりｉｎ ｖｉｔｒｏ神経分化を誘導した。ＳＴＡＰＳ細胞集塊を成長因子（アクチビン）または１０％のＦＣＳとともに培養することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内中胚葉分化２５を誘導した。
核型解析。サブコンフルエントのＳＴＡＰＳ細胞をコルセミドにより分裂中期で停止させ、多色ＦＩＳＨ解析（Ｍ－ＦＩＳＨ）に供した。既に記載されている通りに（Ｊｅｎｔｓｃｈら，２００３）、７種類の異なる蛍光色素を用いてマウス染色体特異的彩色プローブを組合せ的に標識し、ハイブリダイズさせた。
細胞培養。既に記載されている通りに（Ｏｂｏｋａｔａら，２０１３；共同提出）、ＣＤ４５＋細胞からＳＴＡＰ細胞を生成した後、Ｂ２７＋ＬＩＦ培地で７日間培養した。Ｆ４Ｉ細胞系の樹立には、９６ウェルプレートのＦＧＦ４含有ＴＳ培地中のＭＥＦフィーダー細胞上にＳＴＡＰ細胞クラスターを移した。ｄ７～ｄ１０の間に従来のトリプシン法を用いて細胞に最初の継代を実施した。のちの継代は３日ごとに実施した。
ＳＴＡＰ幹（ＳＴＡＰＳ）細胞系の樹立には、ＡＣＴＨ含有培地中のＭＥＦフィーダー細胞上にＳＴＡＰスフィアを移した。４～７日後、従来のトリプシン法を用いて細胞に最初の継代を実施し、懸濁させた細胞を５％のＦＣＳおよび１％のＫＳＲを含有するＥＳ維持培地に播いた。のちの継代は２日ごとに実施した。
キメラマウス形成および解析。二倍体キメラおよび四倍体キメラの作製には、ＩＣＲ系雌とＩＣＲ雄との交配から二倍体胚を入手し、ＢＤＦ１系雌とＢＤＦ１雄との交配から四倍体胚を入手した。細胞胚の電気融合により四倍体胚を作製した。ＳＴＡＰ幹細胞、Ｆ４Ｉ細胞およびＥＳ細胞の注入には従来の胚盤胞注入法を用いた。ＳＴＡＰ細胞の注入には、トリプシン処理によりキメラ化が低下したため、ＳＴＡＰ細胞クラスターを一括して注入した。ＳＴＡＰ球状コロニーを顕微鏡下でマイクロナイフを用いて小片に切り分けた後、ＳＴＡＰコロニーの小さいクラスターを大きいピペットで４．５日目の胚盤胞に注入した。翌日、キメラ胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌に移植した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ分化アッセイ：１×１０５個のＳＴＡＰ－Ｓ細胞を４週間週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背側腹側部に皮下注射した。６週間後、埋植物を回収し、組織学的に解析した。埋植物を１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、ルーチン的に処理して厚さ４μｍにした。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
ＳＤＩＡ法およびＳＦＥＢｑ法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ神経分化を誘導した。ＳＴＡＰＳ細胞集塊を成長因子（アクチビン）または１０％のＦＣＳとともに培養することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内中胚葉分化を誘導した。
免疫染色。細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した後、一次抗体である抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；１：３００）、抗Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；１：３００）、抗Ｎａｎｏｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；１：３００）、抗ＫＬＦ２／４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社；１：３００）および抗Ｅｓｒｒβ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社；１：３００）とインキュベートした。一晩インキュベートした後、Ａｌｅｘａ５４６とコンジュゲートした二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて、結合した抗体を可視化した。ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で核を染色した。
ＲＮＡ調製およびＲＴ－ＰＣＲ解析。ＲＮｅａｓｙ（商標）Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅＳＡＣｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を実施した。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）をＰＣＲ増幅に使用し、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ－ＩＩ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に試料を供した。
核型解析。多色ＦＩＳＨ解析（Ｍ－ＦＩＳＨ）により核型解析を実施した。培地に５％ＣＯ２中、３７℃で２．５時間、コルセミド（最終濃度０．２７０μｇ／ｍｌ）を加えることにより、サブコンフルエントのＳＴＡＰＳ細胞を分裂中期で停止させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理し、細胞培地に再懸濁させ、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＰＢＳ ３ｍｌ中の細胞ペレットに、予め温めた低張０．０３７５Ｍ ＫＣ１溶液７ｍｌを加えた。細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを０．０３７５Ｍ ＫＣ１溶液３～５ｍｌに再懸濁させた。細胞を穏やかにピペッティングすることによりメタノール／酢酸（３：１；体積／体積）で固定した。固定を４回実施した後、細胞をガラススライドに塗布した。ＦＩＳＨ法には、既に記載されている通りに（Ｊｅｎｔｓｃｈら，２００３）、７種類の異なる蛍光色素を用いてマウス染色体特異的彩色プローブを組合せ的に標識し、ハイブリダイズさせた。Ｓｅｎｓｙｓ ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ社、ツーソン、アリゾナ州）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ ＲＸＡ ＲＦ８ 落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｋｒｏｓｙｓｔｅｍｅ社、ベンスハイム、ドイツ）を用いて、各細胞系について９～１５例の分裂中期の塗布標本を得た。カメラおよび顕微鏡はＬｅｉｃａ Ｑ－ＦＩＳＨソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｎｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ケンブリッジ、イギリス）により制御した。分裂中期の塗布標本をＬｅｉｃａ ＭＣＫソフトウェアに基づいて処理し、多色カリオグラムで表した。
バイサルファイトシーケンス。
ＳＴＡＰＳ細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、テメキュラ、カリフォルニア州、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｃｏｎ．ｃｏｍ）を製造業者の指示書の通りに用いてＤＮＡのバイサルファイト処理を実施した。
得られた修飾ＤＮＡを２つの順方向（Ｆ）プライマーおよび１つの逆方向（Ｒ）プライマー：
ｏｃｔ３／４（Ｆ１、ＧＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴ（配列番号７３）；Ｆ２、ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ（配列番号７４）；Ｒ、ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ（配列番号７５））およびｎａｎｏｇ（Ｆ１、ＧＡＧＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号７６）；Ｆ２、ＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴ（配列番号７７）；Ｒ、ＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号７８））
を用いたネステッドポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲにより増幅した。ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＲ０３０Ａ）を用いてＰＣＲを実施した。理研ＣＤＢのゲノム資源解析ユニットにてＭ１３プライマーを用いてＤＮＡシーケンシングを実施した。
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１５．Ｏｇａｗａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｈ．，Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｓ．＆ Ｎｉｗａ，Ｈ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｌｏｎａｌ
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１６．Ｊｅｎｔｓｃｈ Ｉ，Ｇｅｉｇｌ Ｊ，Ｋｌｅｉｎ ＣＡ，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ ＭＲ．Ｓｅｖｅｎ－ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ Ｍ－ＦＩＳＨ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０３，８４－８８（２００３），
１７．Ｙｉｎｇ，Ｑ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５３，５１９－５２３（２００８）．
１８．Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋ，Ａｒａｋｉ Ｋ，Ｏｈｔｓｕｋａ Ｓ，Ｗａｋａｙａｍａ
Ｔ，Ｎｉｗａ Ｈ．Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｘ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８，１９７－２０２（２０１１）．
１９．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｋａｍｉｙａ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｓ．，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，ａｎｄ Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００５）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，２８８－２９６
２０．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．，Ｋｕｗａｎａ，Ｙ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．－Ｉ．ａｎｄ Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２０００）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｎ ２８，３１－４０．
２１．Ｇｏｕｏｎ－Ｅｖａｎｓ Ｖ，Ｂｏｕｓｓｅｍａｒｔ Ｌ，Ｇａｄｕｅ Ｐ，Ｎｉｅｒｈｏｆｆ Ｄ，Ｋｏｅｈｌｅｒ ＣＩ，Ｋｕｂｏ Ａ，Ｓｈａｆｒｉｔｚ ＤＡ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ．（２００６）ＢＭＰ－４ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１４０２－１４１１．
２２．Ｍａｃｆａｒｌａｎ ＴＳ，Ｇｉｆｆｏｒｄ ＷＤ，Ｄｒｉｓｃｏｌｌ Ｓ，Ｌｅｔｔｉｅｒｉ Ｋ，Ｒｏｗｅ ＨＭ，Ｂｏｎａｎｏｍｉ Ｄ，Ｆｉｒｔｈ Ａ，Ｓｉｎｇｅｒ Ｏ，Ｔｒｏｎｏ Ｄ，Ｐｆａｆｆ ＳＬ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｔｅｎｃｙ ｆｌｕｃｔｕａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４８７，５７－６３（２０１２）．２３．Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ．，Ｔａｋａｔａ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｄａ，Ｍ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｅ．，Ｏｋｕｄａ，Ｓ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．ａｎｄ Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２０１１）Ｓｅｌｆ－ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｏｐｔｉｃ－ｃｕｐ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４７２，５１－５６．
２４．Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｏ－Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｋａｗａｄａ，Ｍ．，Ｙｏｎｅｍｕｒａ，Ｓ．，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．，Ｗａｔａｙａ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｋ．ａｎｄ Ｓａｓａｉ，Ｙ．（２００８）Ｓｅｌｆ－Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｃｔｉｖｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ Ｓｉｇｎａｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３，５１９－５３２
２５．Ｂｏｈｅｌｅｒ ＫＲ，Ｃｚｙｚ Ｊ，Ｔｗｅｅｄｉｅ Ｄ，Ｙａｎｇ ＨＴ，Ａｎｉｓｉｍｏｖ ＳＶ，Ｗｏｂｕｓ ＡＭ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．９１，１８９－２０１（２００２）．
２６．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｓ．，Ｋｕｗａｎａ，Ｙ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．－Ｉ．ａｎｄ Ｓａｓａｉ，Ｙ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｎ ２８，３１－４０（２０００）
Figure 2023011931000007
Figure 2023011931000008
Figure 2023011931000009
Figure 2023011931000010
実施例５：成熟体細胞からＳＴＡＰ細胞を生成するためのプロトコル。
ここでは、研究対象とする細胞の種類に関係なくＳＴＡＰ細胞を生成するための改善されたプロトコルについて記載する。以下のプロトコルは、２０１４年１月３１日にＮａｔｕｒｅに公開された本発明者らの論文（Ｏｂｏｋａｔａら，Ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｆａｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５０５．６４１－６４７，２０１４）に記載されているものを改善したものであり、例えば、効率および収率の増大をもたらす。このプロトコルは極めて単純なものであるが、細胞懸濁液ではなく組織から出発する場合、若干異なるものとなる。出発材料として用いる細胞型または組織によっても異なるものとなる。
いくつかの実施形態では、いずれの段階も省かない。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が内径の小さくなったピペットのうち開口部が最も小さいピペットの中を容易に上下させて研和できるようになるまで懸濁液を最低３０分間、研和する。最初に、細胞懸濁液から出発する場合のプロトコルについて記載し、次いで、軟部組織から出発する場合に必要な追加の段階について記載する。
成熟体細胞の懸濁液から出発する場合のＳＴＡＰ細胞生成：
Ａ１．生きた体細胞を遠心管内に懸濁させ、次いで１２００ｒｐｍで５分間遠心分離するべきである。注：細胞の入った組織培養皿に０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社：２５３００－０５４）を３～５分間加えて、遠心管に加える付着細胞を解離させてもよい。
Ａ２．細胞ペレットの高さまで上清を吸引する。
Ａ３．得られたペレットを５０ｍｌチューブに入ったハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ
Ｃａ＋Ｍｇ＋Ｆｒｅｅ：Ｇｉｂｃｏ社、１４１７０－１１２）に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。例えば、ペレットを５０ｍチューブに入った２～３ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁させ得る。
Ａ４．標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを培地で予めコートする（これにより細胞がピペットに付着しなくなる－例示的なピペットにはＦｉｓｈｅｒ社銘柄の９インチ（約２３ｃｍ）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｉｐｅｔｔｅｓ：１３－６７８－２０Ｄがある）。細胞懸濁液をピペットで５分間、吸引・吐出して研和し、細胞集塊および結合したあらゆる残骸を解離する。この操作は相当量の力で実施し得る。
Ａ５．研和過程の最後の段階として、開口部が極めて小さい先端熱加工したピペットを２つ、以下のように作製する：
標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットをブンゼンバーナーで加熱し、次いで、ピペットの遠心（溶解している）端を内腔が潰れ先端がちぎれるまで引っ張って伸ばし、ガラスの先端が穴の閉じた尖った状態にする。ピペットが冷めるまで待った後、穴の閉じた遠心端を極めて小さい内腔が確認できるまでちぎる。この工程を２本目のピペットにも繰り返すが、先端は１本目よりもやや近位のところでちぎり、遠位内腔を若干大きくする。大きい方の内腔は直径を約１００～１５０ミクロンにするべきであるのに対し、他方のピペットの内腔はこれより小さい約５０～７０ミクロンにするべきである。
次いで、内腔が大きい方のピペットに細胞懸濁液を通して１０分間研和する。この後、内腔が小さい方（５０～７０ミクロン）のピペットに通してさらに１５分間研和する。懸濁液が内径の小さい方の先端熱加工したピペットの中を容易に上下するようになるまで研和を続ける。各ピペットは培地で予めコートしておく。このほか、研和する際には、空気を吸引することおよび細胞懸濁液に泡または気泡を生じさせることを避けなければならない。
Ａ６．懸濁液に総体積が２０ｍｌになるまでＨＳＢＢを加え、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を吸引する。
Ａ７．細胞をｐＨ５．４のＨＢＳＳに２×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で再懸濁させた後、３７℃で２５分間、インキュベーター内に置く。細胞懸濁液を加えるとＨＢＳＳのｐＨが上昇するため、ｐＨが所望の最終ｐＨ５．６よりも低いＨＢＳＳ溶液を用いてもよい。溶液を酸性にする場合、ハンクス液に酸を加えた後直ちに、５ｍｌピペットを用いて溶液を１０秒間穏やかにピペッティングする。ＨＢＳＳは緩衝能が極めて低いため、前の懸濁液の上清から移った溶液が少しでもあると、ＨＢＳＳのｐＨが大幅に影響を受ける。以下の指示は、この実験の実施形態によるＳＴＡＰ細胞生成に最適なｐＨ５．６～５．７のＨＢＳＳを作製する方法を示すものである。最初に、予め冷却したＨＢＳＳ（４℃）のｐＨを１２ＮのＨＣｌでｐＨ５．６まで滴定する。この滴定は、ＨＢＳＳ ５０ｍｌに１２ＮのＨＣ１ １１．６μｌを徐々に加えることにより実施する。このｐＨを確認した後、溶液を０．２ミクロンのシリンジフィルターまたはボトルトップフィルターに通して保管用の新たな無菌容器に入れることにより滅菌する。しかるべき数の細胞を用いて最初の試験的実験を終えた時点で最終ｐＨが５．６～５．７であることを確認されたい。ＨＢＳＳのｐＨは極めて重要であるため、使用前にはその都度、溶液のｐＨを確認し、再度滴定し、再度滅菌する。
Ａ８．２５分間酸浴させた後、懸濁液を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
Ａ９．上清を吸引し、得られたペレットを本明細書で「スフィア培地」と呼ぶもの（１％の抗生物質および２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社、１２５８７－０１０）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２）５ｍｌに再懸濁させ、以下のサプリメント：ｂ－ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（０．２％、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０７９８０）の存在下、非付着性組織培養皿に１０５細胞／ｃｃの濃度で入れる。細胞がマウスの細胞である場合、ＬＩＦ（１０００Ｕ）を添加するべきである。いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヘパリンなどのサプリメントを必要としないこともある。細胞を組織培養皿に入れた後、最初の１週間は、細胞が皿の底に付着しないように１日２回、５ｍｌピペットを用いて細胞を２分間穏やかにピペッティングし得る。いくつかの実施形態では、これにより良好なスフィア形成が促進され得る。記載したサプリメントを含有するスフィア培地を１日置きに添加する（１０ｃｍの培養皿には１日当たり１ｍｌ添加し、あるいは６ｃｍの培養皿に１日当たり０．５ｍｌ添加する）。
Ｂ．ＢＣを多数含む軟部組織から出発する場合のＳＴＡＰ細胞生成。
Ｂ１．切り出して洗浄した無菌の器官組織をコラゲナーゼ５０μｌの入った６０ｍｍペトリ皿に入れる（脾臓はいかなる消化酵素にも曝露しなくてよい）。本明細書では、消化に最適なコラゲナーゼまたは酵素の種類が器官組織によって異なることを考慮する。
Ｂ２．解剖用のメスおよび鋏を用いて１０分間、組織が一様にゼラチン状になったように見えるまで細切して剥離し、コラゲナーゼに曝露する表面積を増大させる。
Ｂ３．追加で４５０μｌのコラゲナーゼを皿に加え、３７℃、９０ＲＰＭで３０分間、インキュベーター／振盪器内に置く。
Ｂ４．皿にＨＢＳＳ １．５ｍｌを加え（総体積を２．０ｍｌにする）、次いで内容物全体を５ｍｌピペットで吸引し、５０ｍｌチューブに入れる。
Ｂ５．成熟体細胞から出発する場合、ここで、既に上に記載した研和（段階Ａ４～Ａ５）に進む。
Ｂ６．研和終了後（成熟体細胞の培養皿を用いる場合、段階Ａ５を終えた後）、１５ｍｌチューブにＨＢＳＳ ３ｍｌを加えて体積を５ｍｌとし、次いで、チューブの底にＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ ５ｍｌを徐々に加えて良好な二重層を生じさせる。いくつかの実施形態では、２つの溶液が混ざらないようにするべきである。
Ｂ７．このチューブを１０００ｇで１０分間遠心分離する。チューブを１８０°回転させ、１０００ｇでさらに１０分間、再び遠心分離する。これにより、赤血球がチューブの底にペレットを形成する。
Ｂ８．標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを用いて、ＨＢＳＳとＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅとの間にある細胞懸濁液の層を吸引し、新たな５０ｍｌチューブに入れる。
Ｂ９．懸濁液にＨＳＢＢの総体積が２０ｍｌになるまでＨＳＢＢを加え、次いで、５ｍｌピペットで１分間ピペッティングすることによって懸濁液を十分にかき混ぜる。
Ｂ１０．溶液を１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引する。
Ｂ１１．次の段階については、本実施例に記載したＡ７～Ａ９を参照されたい。
実施例６：ラット脊髄のＮＫ－１発現ニューロンの化学的除去によって低下した正常な痛覚過敏反応の成体ＳＴＡＰ幹細胞による回復。
脊髄損傷には、痺れ感、錯感覚および疼痛を含めた高頻度の慢性神経知覚障害が複合的に認められる。これらの外傷により生じる病理学的変化は広範囲に及ぶため、そのいずれの１つでも、その根底のある機序を理解し、有効な治療法を開発するのは複雑なものとなる。ここでは、限定的であるが十分に定義されている感覚消失を生じた後、ストレスを加えた成体幹細胞（刺激惹起性多能性獲得、ＳＴＡＰによって変化した細胞）を埋植することによって正常な状態に戻った極めて特異的な脊髄の細胞損傷について記載する。
ニューロキニン－１受容体（ＮＫ１Ｒ）発現ニューロンの大部分を除去するため、雄ラット脊髄の髄腔内（ｉ．ｔ．）腔に特異性の高い細胞毒素ＳＳＰ－ＳＡＰ（２０μＬ、１μＭ）を注射した。２～３週間後、フォン・フレイ線維による刺激に対する機械的痛覚過敏と放射熱源から引っ込める動作の潜伏時間の短縮として現れる熱痛覚過敏とからなる、後肢足底部へのカプサイシン（１μＬ、０．１％）注射に対する正常な強い痛覚過敏反応がほとんど認められなくなった。次いで、ＳＴＡＰ幹細胞のｉ．ｔ．注射を実施したところ、個々の細胞の懸濁液であっても球状の細胞集塊であっても、その後１～２週間かけてカプサイシン誘導性機械的痛覚過敏および熱痛覚過敏が徐々に回復した。回復した反応は、振幅も経時変化も除去前の元の反応と同じであり、Ｋ－１ＲアンタゴニストであるＬ－７３３，０６０（３００μＭ）のｉ．ｔ．注射によって完全に抑制された。痛覚過敏機能が回復したラットの腰髄の免疫細胞化学検査では、後角全体にわたってＮＫ－１Ｒの染色が認められた。したがって、ＳＴＡＰ幹細胞は、特異的な脊髄ニューロン喪失後に正常な機能を回復させることが可能であり、脊髄損傷の治療法のモデルになるものと思われる。
ストレス誘導性無痛覚を最小限に抑え、ベースラインとなる未処置の初期の行動データを得るため、成体雄Ｓ－Ｄラットを最初、４～５日間ハンドリングして試験活動領域に慣らした。一方の後肢足底表面を１５ｇのフォン・フレイ線維（ＶＦＨ）で３秒ごとに１０回探索することにより、触覚に対する反応性を決定した。治療もカプサイシン注射も実施していないベースライン感度は、探索１０回当たり約１～２回の肢引っ込め動作に相当するものであった。放射熱源からの肢引っ込め動作の潜伏時間（ハーグリーブス法：カットオフ時間は１８秒に設定）によって熱感度を明らかにした。ベースライン潜伏時間は約１６秒であった。髄腔内注射を実施する前、未処置ラットの後肢へのカプサイシン注射に対する反応は、触覚がＶＦＨ探索１０回当たり６回の引っ込め動作、熱が潜伏時間６秒であることがわかった。
３０ｇの針を使用し、大部分のＮＫ１－Ｒ発現脊髄ニューロンを除去するＳＳＰ－ＳＡＰ（修飾Ｐ物質－サポリンコンジュゲート）（Ｍａｎｔｙｈら）またはその不活性類似体であるＢｌａｎｋ－ＳＡＰ（サポリンとコンジュゲートしたナンセンスペプチド）を送達する仙骨法により髄腔内注射を実施した。
数週間後、ＳＳＰ－ＳＡＰ処置個体（Ｂｌａｎｋ－ＳＡＰ処置個体ではない）のカプサイシンによる急性の反応亢進が消失したとき、腰髄のＳＡＰコンジュゲートを注射した領域と同じ領域に刺激惹起性多能性活性化（ＳＴＡＰ）幹細胞（図２６を参照されたい）を注射した。
カプサイシン注射後の触覚刺激および熱刺激に対する反応をさらに５週間追跡し、その時点でラットにペントバルビタール（７５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔をかけ、冷生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドを経心灌流した。脊髄を厚さ５０μｍに薄切し、抗ＮＫ１－Ｒおよび抗ニューロン一次抗体：［１％のＮＤＳおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳに溶かしたウサギ抗ＮＫ－１Ｒ（ロット番号０１１Ｍ４８１９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）１：５０００（２．３ｇ／ｍｌ）およびマウス抗ＮｅｕＮ（ロット番号ＬＶ１８２５８４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州）１：５００（２μｇ／ｍｌ）］で染色し、次いで、十分に洗浄し、相関する２°Ａｂ［１％のＮＤＳおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳに溶かしたロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（ロット番号８１９５７２）およびロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ロット番号１１１３５３７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）、ともに１：１０００（２μｇ／ｍｌ）］中でインキュベートした後、蛍光顕微鏡で観察した。
各実験グループ（ｎ＝３／グループ）の表層（ＩおよびＩＩ）および深部（ＩＩＩ～Ｖ）の薄片について１組織切片当たりのＮＫ－１およびＮｅｕ－Ｎ免疫陽性細胞体の総数をカウントした。結果を、ＳＳＰ－ＳＡＰ（または溶媒）を投与し幹細胞治療を実施したラットまたは実施しなかったラットの表層および深部の薄片中の生存ニューロンの平均百分率で表す。
髄腔内ＳＳＰ－ＳＡＰで処置したラットには、カプサイシン注射後の肢引っ込め閾値の低下によって示される機械的痛覚過敏の減少がみられる（図２７）。脊髄幹細胞を埋植してから５週間後、カプサイシン誘導性痛覚過敏の回復がみられる。幹細胞埋植物により、ＳＳＰ－ＳＡＰ処置ラットの痛覚過敏反応が未処置ラットおよびＢｌａｎｋ－ＳＡＰ処置対照のものに戻った（図２８）。幹細胞埋植物によってカプサイシン感受性が回復した場合、ＮＫ１－Ｒの特異的アンタゴニストの効力の増大がみられる（図２９）。
ＳＳＰ－ＳＡＰは、脊髄のＮＫ１Ｒ発現ニューロンを除去する効果が高く、それにより後肢に注射したカプサイシンに対する初期痛覚過敏反応を実質的に消失させる。ＳＴＡＰ幹細胞を送達することにより、ＳＳＰ－ＳＡＰ処理ラットのカプサイシンに対する「正常な」痛覚過敏性の触覚および熱反応が回復する。Ｂｌａｎｋ－ＳＡＰの注射により痛覚過敏反応性に変化がみられなかったラットでは、ＳＴＡＰ幹細胞の送達はカプサイシンに対する反応に何ら効果を示さなかった。ＳＴＡＰ幹細胞による痛覚過敏反応の正常化に伴って、脊髄にＮＫ１Ｒ－ＩＲの回復がみられた。ＳＴＡＰ幹細胞で回復したラットでは、ＮＫ１Ｒのアンタゴニストがカプサイシン痛覚過敏を抑制する効力が未処置ラットまたはＢｌａｎｋ－ＳＡＰ投与ラットの１０～６０倍増強された。理論に束縛されることを望むものではないが、この現象は、回復したラットではＳＴＡＰ幹細胞によって誘導されたＮＫ１Ｒのアンタゴニストの親和性または痛覚過敏反応のスキーム全体へのＮＫ１Ｒの結合の差が変化したことにより起こったのではないかと考えられる。
実施例７：ここでは、細胞の供給源に関係なく成熟体細胞からの多能性ＳＴＡＰ幹細胞作製の結果に改善をもたらすプロトコルについて記載する。このプロトコルは技術の改善を反映するべく修正したものである。このプロトコルでは、所望の最終結果、すなわち多能性ＳＴＡＰ細胞の作製を達成するのにより効果的な個々のストレスおよび方法を組み合わせて用いる。
理論に束縛されることを望むものではないが、ここでは、本明細書に記載される一部のプロトコルで、生成する細胞およびスフィアの生存率を改善するため、ＡＴＰをエネルギー源として用いたことを考慮する。ＡＴＰの添加により、スフィア形成が良好になり、成熟細胞を曝露する溶液のｐＨの著明な低下がもたらされた。ＳＴＡＰ細胞の生成にＡＴＰを含有する低ｐＨ溶液を用いることをさらに探究すると、ｐＨ単独でもＳＴＡＰ細胞の生成がみられたが、ＡＴＰを含有する低ｐＨ溶液の使用によりこの転換の有効性が大幅に増大したことがわかる。この溶液を成熟細胞の機械的研和と組み合わせて用いると、結果はさらに意味深いものとなった。したがって、ここでは、以上の観察結果を組み合わせてＳＴＡＰ細胞生成の有効性を増大させるプロトコルについて記載する。
記載するプロトコルは、研究対象とする細胞型に関係なく効率的にＳＴＡＰを生成するものである。いくつかの実施形態では、低ｐＨのＡＴＰ増強溶液中での成熟細胞懸濁液の研和を、例えば懸濁液が内径の小さくなったピペットのうち開口部が最も小さいピペットの中を容易に上下させて研和できるようになるまで、最低３０分間続ける。最初に、細胞懸濁液から出発する場合のプロトコルについて記載し、次いで、軟部組織から出発する場合に必要な追加の段階について記載する。
Ａ．成熟体細胞の懸濁液から出発する場合のＳＴＡＰ細胞生成：
Ａ１．ＡＣＴを含有する低ｐＨ ＨＢＳＳ溶液を以下の通りに作製した後、段階Ａ４に使用するために取っておく。水（ＭｉｌｌｉＱ水）にＡＴＰ粉末（アデノシン５’三リン酸二ナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａ社、Ａ２３８３）を１ｍＬ当たり１１０．２２ｍｇ加えることにより、ＨＢＳＳに加える２００ｍＭのＡＴＰストック溶液を作製する。この溶液のｐＨは約３．０である。
ＨＢＳＳ（フェノール赤を含む）［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１４１７０－１６１］５ｍＬを１５ｍＬチューブに入れる。清潔なｐＨセンサーをＨＢＳＳに入れる。ＡＣＴストック溶液で所望のｐＨ、例えば５．０が得られるまで１滴ずつＨＢＳＳを滴定する。測定が正確になるよう溶液をしっかりかき混ぜる。
いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約０．５ｍｇ／ｃｃ～約１００ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約０．５ｍｇ／ｃｃ～約２０ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約０．５ｍｇ／ｃｃ～約１０ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約１．０ｍｇ／ｃｃ～約７ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約１．５ｍｇ／ｃｃ～約５ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約１ｍＭ～約１５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約１ｍＭ～約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約１ｍＭ～約１５ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約２．０ｍＭ～約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は約２．７ｍＭ～約９ｍＭである。
いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約０．５ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約１．０ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約１．５ｍｇ／ｃｃである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約２．０ｍＭである。いくつかの実施形態では、得られるＨＢＳＳとＡＴＰの溶液中のＡＴＰの濃度は少なくとも約２．７ｍＭである。
いくつかの実施形態では、溶液を所望のｐＨおよび／またはその付近に緩衝することにより、ＡＴＰの濃度をさらに高くし得る。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは少なくとも５．０である。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは少なくとも約５．０である。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは約５．０である。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは約４．０～約６．５である。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは約５．０～約５．７である。
処理する生きた体細胞を細胞懸濁液として遠心管に加え、次いで１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。いくつかの実施形態では、細胞の入った組織培養皿に０．０５％（Ｇｉｂｃｏ社：２５３００－０５４）を３～５分間加えて、遠心管に加える付着細胞を解離させてもよい。
Ａ３．細胞ペレットの高さまで上清を吸引する。
Ａ４．得られたペレットを５０ｍｌチューブに入ったＡＴＰを含む低ｐＨのハンクス平衡塩類溶液（上の段階１Ａで作製したもの）に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。いくつかの実施形態では、５０ｍｌチューブに入れた体積２～３ｍＬの細胞懸濁液を用い得る。
Ａ５．標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを培地で予めコートする（これにより細胞がピペットに付着しなくなる－例えば、Ｆｉｓｈｅｒ社銘柄の９インチ（約２３ｃｍ）Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｐｉｐｅｔｔｅｓ：１３－６７８－２０Ｄがある）。細胞懸濁液をピペットで５分間、吸引・吐出して研和し、細胞集塊および結合したあらゆる残骸を解離する。この操作は相当量の力で実施し得る。
Ａ６．研和過程の最後の段階として、開口部が極めて小さい先端熱加工したピペットを２つ、以下のように作製する：標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットをブンゼンバーナーで加熱し、次いで、ピペットの遠心（溶解している）端を内腔が潰れ先端がちぎれるまで引っ張って伸ばし、ガラスの先端が穴の閉じた尖った状態にする。ピペットが冷めるまで待った後、穴の閉じた遠心端を極めて小さい内腔が確認できるまでちぎる。この工程を２本目のピペットにも繰り返すが、先端は１本目よりもやや近位のところでちぎり、遠位内腔を若干大きくする。大きい方の内腔は直径を約１００～１５０ミクロンにするべきであるのに対し、他方のピペットの内腔はこれより小さい約５０～７０ミクロンにするべきである。次いで、内腔が大きい方のピペットに細胞懸濁液を通して１０分間研和する。この後、内腔が小さい方（５０～７０ミクロン）のピペットに通してさらに１５分間研和する。懸濁液が内径の小さい方の先端熱加工したピペットの中を容易に上下するようになるまで研和を続ける。ここでも各ピペットを忘れずに培地で予めコートする。このほか、研和する際には、空気を吸引することおよび細胞懸濁液に泡または気泡を生じさせることを避けなければならない。
Ａ７．懸濁液に総体積が２０ｍｌになるまで通常の（ＡＴＰを含有しない）ＨＳＢＢを加え、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を吸引する。
Ａ８．得られたペレットを本発明者らが「スフィア培地」と呼ぶもの（１％の抗生物質および２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社、１２５８７－０１０）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２）５ｍｌに再懸濁させ、以下のサプリメント：ｂ－ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（０．２％、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、０７９８０）の存在下、非付着性組織培養皿に１０５細胞／ｃｃの濃度で入れる。細胞がマウスの細胞である場合、ＬＩＦ（１０００Ｕ）を添加するべきである。いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦ、ＥＧＦおよびヘパリンなどのサプリメントを必要としないこともある。細胞を組織培養皿に入れた後、最初の１週間は、細胞が皿の底に付着しないように１日２回、５ｍｌピペットを用いて細胞を２分間穏やかにピペッティングするべきである。この操作は、良好なスフィア形成を生じさせるのに重要である。記載したサプリメントを含有するスフィア培地を１日置きに添加する（１０ｃｍの培養皿には１日当たり１ｍｌ添加し、あるいは６ｃｍの培養皿には１日当たり０．５ｍｌ添加する）。
Ｂ．ＲＢＣを多数含む軟部組織から出発する場合のＳＴＡＰ細胞生成。
Ｂ１．切り出して洗浄した無菌の器官組織を組織の大きさに応じて５０～５００μｌのコラゲナーゼの入った６０ｍｍペトリ皿に入れる。組織全体を湿らせるのに十分な量のコラゲナーゼを加える。消化に最適なコラゲナーゼをはじめとする酵素の種類が器官組織によって異なる（脾臓はいかなる消化酵素にも曝露しなくてよい）。
Ｂ２．解剖用のメスおよび鋏を用いて１０分間、組織が一様にゼラチン状になったように見えるまで細切して剥離し、コラゲナーゼに曝露する表面積を増大させる。
本明細書では、この方法の本実施形態または本明細書に記載される方法の任意の実施形態では、縁が平坦な刃および／または表面、例えば曲線になった外科刀ではなく１１番解剖用メスを用いて組織の剥離を実施してもよいことが特に考慮される。あるいは、本明細書に記載される実施形態では、組織を破壊するため、剥離の代わりに高周波音波を当て、かつ／または剥離と（同時にまたは逐次的に）組み合わせてもよい。高周波音波により、例えば膜を破壊し、組織および／または膜に穴を開け、かつ／あるいは膜漏出を引き起こすことができる。高周波音波はほかにも、スケールアップすることが可能である。当業者であれば組織に高周波音波を当てる方法に精通しており、例えば、市販の超音波発生装置が利用可能である（例えば、イリノイ州バーノンヒルズのＣｏｌｅ－Ｐａｌｍｅｒ社から入手可能なＱｓｏｎｉｃａ Ｑ５５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、カタログ番号ＵＸ－０４７１２－５２）．
Ｂ３．追加のコラゲナーゼを皿に加えて総体積を０．５ｍｌとし、３７℃、９０ＲＰＭで３０分間、インキュベーター／振盪器内に置く。
Ｂ４．皿に低ｐＨ ＨＢＳＳ／ＡＴＰ溶液１．５ｍｌを加え（総体積を２．０ｍｌにする）、次いで内容物全体を５ｍｌピペットで吸引し、５０ｍｌチューブに入れる。
Ｂ５．成熟体細胞から出発する場合、ここで、既に上に記載した研和（段階Ａ４～Ａ５）に進む。
Ｂ６．研和終了後（成熟体細胞の培養皿を用いる場合、段階Ａ５を終えた後）、１５ｍｌチューブにＨＢＳＳ ３ｍｌを加えて体積を５ｍｌとし、次いで、チューブの底にＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ ５ｍｌを徐々に加えて良好な二重層を生じさせる。溶液は、二重層が生じるよう記載した通りに加え、２つの溶液が混ざらないようにするべきである。
Ｂ７．このチューブを１０００ｇで１０分間遠心分離する。チューブを１８０°回転させ、１０００ｇでさらに１０分間、再び遠心分離する。これにより、赤血球がチューブの底にペレットを形成する。
Ｂ８．標準的な９インチ（約２３ｃｍ）ガラスピペットを用いて、ＨＢＳＳとＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅとの間にある細胞懸濁液の層を吸引し、新たな５０ｍｌチューブに入れる。
Ｂ９．懸濁液にＨＳＢＢの総体積が２０ｍｌになるまでＨＳＢＢを加え、次いで、５ｍｌピペットで１分間ピペッティングすることによって懸濁液を十分にかき混ぜる。
Ｂ１０．溶液を１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引する。
Ｂ１１．次の段階についてはＡ６～Ａ８を参照されたい。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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