CN108085398A - 一种基于脂联素基因adp鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用 - Google Patents

一种基于脂联素基因adp鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用，所述脂联素基因ADP的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第430位的碱基由G突变为A。与现有技术相比，本发明利用调节脂肪代谢的脂联素基因多态产生的多种基因型与产蛋和种鸭繁殖的相关性，通过对脂联素基因的分子标记与繁殖性状的关联，提供了一种间接选择家禽繁殖性状的方法，建立了鸭繁殖性状早期选择的育种方法。由于该脂联素基因ADP同时表达于母禽卵巢和输卵管，以及公禽睾丸，因此还可以对公禽进行选择，填补了常规鸭繁殖性状选择过程中无法对公禽进行选择的空白。

Description

一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及的是分子标记的技术领域，尤其涉及的是一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用。
背景技术
繁殖性状是畜禽生产中重要的经济性状之一，并受脂肪沉积的影响。母禽在育成期和产蛋期体脂沉积过多，卵巢和输卵管受大量脂肪包围和压迫，影响卵泡发育和排卵，导致产蛋下降。而分泌蛋壳的子宫腺周围脂肪沉积增加则影响蛋壳的形成，降低禽蛋品质。家禽脂肪沉积的遗传力为0.3-0.85，呈中高度遗传。然而，常规选择的遗传进展缓慢，且无法对公禽进行选择。
脂联素是由脂肪细胞特异分泌的内源性细胞因子，对家禽繁殖性状发挥重要的调控作用，是调节卵泡发育和卵母细胞成熟过程中能量需求的关键信号。脂联素基因同时表达于母禽卵巢和输卵管，以及公禽睾丸。中枢表达的脂联素通过加强葡萄糖代谢促进能量消耗以降低体脂，起到促进排卵、提高繁殖力的作用。
地方鸭种繁殖性状因就巢性而受到严重影响，单纯常规选择的遗传改良效率不高，利用功能基因标记进行分子标记辅助选育可以从遗传上根本改良选择性状，从而加速遗传进展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用，以解决常规鸭繁殖性状遗传选择进展缓慢，且无法对公禽进行选择的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记，所述脂联素基因ADP的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，所述分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第430位的碱基由G突变为A，或为如SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列的第430位的碱基由C突变为T，该突变导致该位点编码的氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸。
本发明还提供了一种上述分子标记在鉴定鸭繁殖性状中的应用，所述鸭繁殖性状主要指鸭的产蛋数和孵化率。
本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定鸭繁殖性状的方法，包括以下步骤：
(1)提取鸭翅静脉血液总DNA；
(2)以所述分子标记所在位点上下游的脂联素基因ADP的DNA序列为模板，设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的鸭翅静脉血液总DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)采用HgaⅠ酶切PCR扩增产物，获得酶切产物，由于HgaⅠ酶切识别位点为GACGC/CTGCG，因此，当该分子标记位点由G突变为A时，不能被HgaⅠ酶识别，电泳检测酶切产物，实现对鸭繁殖性状的遗传鉴定，具体为：
I、包含1条条带，则为AA纯合型，繁殖性状最优；
Ⅱ、包含2条条带，则为GG纯合型，繁殖性状最差；
Ⅲ、包含3条条带，则为AG杂合型，繁殖性状适中。
进一步地，所述分子标记所在位点的上游扩增产物的长度与下游扩增产物的长度均大于100bp，且所述分子标记所在位点的上游扩增产物与下游扩增产物的长度差大于100bp，以利于电泳检测和条带区分。
进一步地，所述特异性扩增引物序列为：
SEQ ID NO.2：ADP-F：ACGAGCAGAACCACTACG
SEQ ID NO.3：ADP-R：CTGAGGTGCAGCAAGACA
进一步地，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃复性30s，72℃延伸30s，34个循环，最后72℃延伸5min。
进一步地，所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明利用调节脂肪代谢的脂联素基因多态产生的多种基因型与产蛋和雏鸭健康的相关性，提供了一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用，通过对脂肪性状的分子标记与繁殖性状的关联，提供了一种间接选择家禽繁殖性状的方法，建立了鸭繁殖性状早期选择的育种方法。由于该脂联素基因ADP同时表达于母禽卵巢和输卵管，以及公禽睾丸，因此还可以对公禽进行选择，填补了常规鸭繁殖性状选择过程中无法对公禽进行选择的空白。
附图说明
图1为分子标记鉴定鸭繁殖性状的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1引物设计：
从鸭基因组数据库中找到SEQ ID NO.1所示的脂联素基因ADP对应的DNA序列，并以脂联素基因ADP的DNA序列为模板，设计特异性扩增引物ADP-F、ADP-R，序列如下所示：
SEQ ID NO.2：ADP-F：ACGAGCAGAACCACTACG
SEQ ID NO.3：ADP-R：CTGAGGTGCAGCAAGACA
该引物的扩增区域的长度为319bp序列，其中包含第430位的分子标记位点。
2.2提取血液总DNA
选取地方鸭300只，其中，公鸭60只，母鸭240只，翅静脉采血，利用大连宝生物公司生产的血液DNA提取试剂盒提取鸭翅静脉血样中总DNA，具体参照试剂盒使用说明书进行。
2.3PCR扩增
采用大连宝生物有限公司生产的含dNTP和DNA聚合酶的Mix进行PCR扩增。
PCR扩增体系为：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃复性30s，72℃延伸30s，34个循环，最后72℃延伸5min。
利用1％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得一条长度略大于300bp的条带，与预测的长度一致，说明获得了目的片段。利用大连宝生物有限公司的DNA回收试剂盒，回收PCR扩增产物，将PCR产物送到上海生工测序，序列如SEQ ID NO.4所示，与预测结果一致。
2.5酶切验证
酶切体系：
酶切条件：37℃水浴4小时。
利用高浓度(2％质量比)低电压琼脂糖凝胶电泳检测，获得如图1所示的结果(部分结果)，其中，若酶切产物：包含1条条带，为AA型；包含2条条带，为GG型；包含3条条带，为AG型。
2.6验证
统计240只母鸭个体产蛋数、种蛋受精率、孵化率，同时以60只公鸭所配母鸭为单元，统计每只公鸭对应母鸭的种蛋受精率和孵化率。
结果见下表1：
表1：不同基因型对公、母鸭繁殖性能的影响
表中可以看出，基因型为AA型母鸭300日龄产蛋121枚，AG型产蛋115枚，与AA型差异不显著，GG型产蛋101枚，显著低于AA型和AG型。统计公鸭对应母鸭产蛋数、受精率和孵化率发现，AA型公鸭受精率为95.1％，GG型受精率91.6％，AG型受精率93.3％，GG型受精率显著低于AA型，但与AG型差异不显著。该结果与预测结果一致，说明了本发明所述的分子标记与鸭繁殖性状具有显著相关性，利用该分子标记对鸭繁殖性状进行检测是可行性的，且检出率可达90％以上。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
序列表
<110> 安徽农业大学
安庆永强农业科技股份有限公司
<120> 一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 鸭(DUCK)
<400> 1
atgagggact cagcaggctt cctcctttgc tcactgctgt tggtggcccc ccactgcacg 60
gaggtggccg cccaggatcc ccagcctgac cccaaaacac cgtgcgccaa ctggatggga 120
ggagcacccg gctaccccgg tcacaacggg ctccccggca gggacgggaa agatggaaaa 180
gatggactaa agggagagaa aggagagcaa ggtttgcaag gctccaaagg cgaccaaggt 240
gccatgggaa gcgcggggcc agaggggcca agaggctttc caggacaccc agggctgaag 300
ggagacaagg gtgaaggggc ctatgtttac cgctccgcct tcagcgtggg gctgacggag 360
cgagcccccc accccaacgt ccccatccgc ttcagcaaga tcttctacaa cgagcagaac 420
cactacgacg ccagcaccgg caagttcctc tgcagcatcc ccggcaccta ctacttcgcc 480
taccacctga cggtgtacat gtcagatgtc aaggtcagcc tctacaagaa ggacaaggcc 540
gtcatcttca cctacgacca gttccagacc aacaacattg accaggcgag cggctctgtc 600
ttgctgcacc tcagctcagg ggatgaggtc tggctccagg tctacgggga gggggacaac 660
aacggtgtct acgctgacaa catcaacgat tccactttca tgggcttcct cctgtaccca 720
gacatggatt tccattag 738
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence）
<400> 2
acgagcagaa ccactacg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence）
<400> 3
ctgaggtgca gcaagaca 18
<210> 4
<211> 319
<212> DNA
<213> 鸭(DUCK)
<400> 4
ctcacaccac gggtgttgag ctcagtacca acagctccca accccaactc tgtcccccag 60
gtttgcaagg ctccaaaggg gaccaaggcg ccatgggaag cgcagggcca gaggggccaa 120
gaggctttcc aggacagcca gggctgaagg gagacaaggg tgaaggggcc tatgtttacc 180
gctccgcctt cagcgtgggg ctgacggagc gagcccccca ccccaacgtc cccatccgct 240
tcagcaagat cttctacaac gagcagaacc actacgacgc cagcaccggc aagttcctct 300
gcagcatccc cggcaccta 319

Claims (7)

1.一种基于脂联素基因ADP鉴定鸭繁殖性状的分子标记，所述脂联素基因ADP的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，其特征在于，所述分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第430位的碱基由G突变为A，或为如SEQ IDNO.1所示序列互补的核苷酸序列的第430位的碱基由C突变为T。
2.一种如权利要求1所述的分子标记在鉴定鸭繁殖性状中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定鸭繁殖性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取鸭翅静脉血液总DNA；
(2)以所述分子标记所在位点上下游的脂联素基因ADP的DNA序列为模板，设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的鸭翅静脉血液总DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)采用HgaⅠ酶切PCR扩增产物，获得酶切产物，电泳检测酶切产物，若酶切产物：
I、包含1条条带，则为AA型，繁殖性状最优；
Ⅱ、包含2条条带，则为GG型，繁殖性状最差；
Ⅲ、包含3条条带，则为AG型，繁殖性状适中。
4.根据权利要求3所述的一种鉴定鸭繁殖性状的方法，其特征在于，所述分子标记所在位点的上游扩增产物的长度与下游扩增产物的长度均大于100bp，且所述分子标记所在位点的上游扩增产物与下游扩增产物的长度差大于100bp。
5.根据权利要求3所述的一种鉴定鸭繁殖性状的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物序列为：
SEQ ID NO.2：ADP-F：ACGAGCAGAACCACTACG
SEQ ID NO.3：ADP-R：CTGAGGTGCAGCAAGACA。
6.根据权利要求3所述的一种鉴定鸭繁殖性状的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58-62℃复性30s，72℃延伸30s，30-35个循环，最后72℃延伸5min。
7.根据权利要求3所述的一种鉴定鸭繁殖性状的方法，其特征在于，所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
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