CN108079216A - 一种蜂花粉制剂及制备方法和在预防dna氧化损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过将三种破壁蜂花粉混合后，通过乙醇提取蜂花粉中的活性成分，得到一种蜂花粉制剂。其活性成分包括：p‑香豆酸17.92±1.13mg/g，槲皮素69.83±0.95mg/g，异鼠李素8.72±0.64mg/g，柚皮素0.96±0.07mg/g，山奈酚24.34±0.93mg/g，高良姜素21.75±1.02mg/g。该蜂花粉制剂具有荞麦蜂花粉的高氧化能力，同时兼具油菜蜂花粉和高粱蜂花粉的强络合能力，可用于制备预防DNA氧化损伤的药物或保健食品。该蜂花粉经动物药效学实验证实，具有增强血清抗氧化能力，预防DNA氧化损伤的作用，可用于制备预防DNA氧化损伤的药物或保健食品。

Description

一种蜂花粉制剂及制备方法和在预防DNA氧化损伤中的应用
【技术领域】
本发明涉及一种蜂花粉制剂的制备方法及其在预防DNA氧化损伤中的应用，属于医药和功能性食品技术领域。
【背景技术】
氧化应激是指细胞内活性氧自由基的大量产生，或清除能力减弱，使自由基在细胞内积累，因此机体产生氧化应激。氧化应激可以导致DNA链断裂、位点突变等损伤，加速细胞的衰老和凋亡，从而引起很多疾病的发生，如老年痴呆、帕金森病、糖尿病、高血压、脑卒中等，更有可能引起癌症和肿瘤等恶性疾病。
目前关于蜂花粉抗氧化的研究较多，但相关产品开发较少。邵素英提出的专利“一种提高免疫力的蜂花粉及其制备方法”中虽然提出了提高免疫力的蜂花粉的制备方法，但并未限定其活性成分及含量，也未进行功能评价。曹炜等提出的专利“五味子蜂花粉有效部位及其在预防肝脏损伤中的应用”，限定了五味子蜂花粉活性部位的提取方法及成分，并做了保护肝脏的功能评价实验，但其活性成分含量不高，且并未涉及对DNA氧化损伤的预防功能。本发明专利旨在提供一种新型的高活性蜂花粉制剂的制备方法，并通过动物实验证明该蜂花粉制剂能够提高小鼠血清抗氧化能力和预防小鼠淋巴细胞DNA损伤。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种新型的高活性蜂花粉制剂及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
一种蜂花粉制剂，其活性成分包括：p-香豆酸17.92±1.13mg/g，槲皮素69.83±0.95mg/g，异鼠李素8.72±0.64mg/g，柚皮素0.96±0.07mg/g，山奈酚24.34±0.93mg/g，高良姜素21.75±1.02mg/g。
一种蜂花粉制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉混合，将混合花粉分散于乙醇溶液中，然后热回流提取多次，将每次的提取液混合后过滤，将得到的滤液减压浓缩至浸膏状；
(2)将步骤(1)得到的浸膏溶于甲醇溶液中，然后用乙酸乙酯萃取多次，将每次得到的乙酸乙酯层萃取液移出，混合后，减压浓缩至浸膏状；
(3)将步骤(2)得到的浸膏溶解于热水中形成料液，用XAD-2树脂吸附料液后，用蒸馏水冲洗XAD-2树脂，然后用甲醇溶液洗脱，将得到的洗脱液浓缩至浸膏状；
(4)将步骤(3)得到的浸膏溶解于热水中形成料液，用葡聚糖凝胶
SephadexLH-20吸附后用，用蒸馏水冲洗SephadexLH-20，然后用甲醇溶液洗脱，将得到的洗脱液浓缩至浸膏状；
(5)将步骤(4)得到的浸膏干燥成粉末，得到蜂花粉制剂；
由此方法制得的蜂花粉制剂，其活性成分包括：p-香豆酸17.92±1.13mg/g，槲皮素69.83±0.95mg/g，异鼠李素8.72±0.64mg/g，柚皮素0.96±0.07mg/g，山奈酚24.34±0.93mg/g，高良姜素21.75±1.02mg/g。
所述步骤(1)中破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉的质量比为5:3:2；混合花粉与乙醇的质量比为1：(10～20)；热回流提取2～4次，每次热回流温度为60～80℃，时间为2～5小时；减压浓缩滤液时的温度为40～60℃。
所述步骤(2)中浸膏与甲醇的质量比为1:10；将浸膏溶于甲醇溶液后，用乙酸乙酯萃取2～5次，每次萃取时间为20～40min，萃取用的乙酸乙酯与溶解有浸膏的甲醇溶液的体积比为1:1。
所述步骤(3)中的溶解浸膏的热水温度为60～90℃，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗XAD-2树脂后，用2～4倍柱床体积的甲醇洗脱。
所述步骤(4)中溶解浸膏的热水温度为70～90℃，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附后，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗SephadexLH-20后，用3-5倍柱床体积的甲醇溶液洗脱。
所述步骤(5)中干燥浸膏的温度为-50～-40℃，真空度为0.08～0.1MPa。
所述的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤药物中的应用。
所述的制备方法制备的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤药物中的应用。
所述的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤保健食品中的应用。
本发明公开了一种蜂花粉制剂及其制备方法与应用。该蜂花粉制剂具有较高的活性成分，实验证明，灌胃该蜂花粉制剂小鼠血清的抗氧化能力与预防DNA氧化损伤的能力显著高于正常对照小鼠。说明该蜂花粉制剂高活性成分能够增强血液的抗氧化能力与预防DNA氧化损伤的能力。
本发明将三种花粉混合后，通过乙醇提取蜂花粉中的活性成分，得到一种蜂花粉制剂，该蜂花粉制剂具有荞麦蜂花粉的高抗氧化能力，同时兼具油菜蜂花粉和高粱蜂花粉的强络合能力，提供了一种抗氧化蜂花粉药物或保健品的的制备方法，本方法也可用于制备预防DNA氧化损伤的药物或保健食品。
该蜂花粉经动物药效学实验证实，具有增强血清抗氧化能力，预防DNA氧化损伤的作用。利用本发明的蜂花粉制剂或其制备方法制备出的药物及保健品，可应用于减少人体的氧化应激现象，防止DNA链断裂、位点突变等损伤，进而预防如老年痴呆、帕金森病、糖尿病、高血压、脑卒中等疾病的发生。
【附图说明】
图1为蜂花粉制剂对小鼠血清脂蛋白氧化的抑制作用图；
图2为小鼠淋巴细胞彗星电泳图的淋巴细胞荧光染色图片；
其中：图2(I)为空白小鼠淋巴细胞；
图2(II)为灌胃蜂花粉制剂小鼠淋巴细胞；
图2(III)为空白小鼠淋巴细胞+100μM的H2O2；
图2(IV)为灌胃蜂花粉制剂小鼠淋巴细胞+100μM的H2O2；
图3为小鼠淋巴细胞尾DNA含量图(不同的小写字母代表差异显著)。
【具体实施方式】
本发明公开了一种蜂花粉制剂及其制备方法和在预防DNA氧化损伤中的应用。为了更清楚的说明本发明，下面结合实施例对本发明做进一步说明。
本发明通过乙醇提取破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉的混合物，得到一种蜂花粉制剂，其总黄酮含量为692.54mg/g。该蜂花粉制剂的活性成分包括但不限于以下物质：
(1)p-香豆酸17.92±1.13mg/g；
(2)槲皮素69.83±0.95mg/g；
(3)异鼠李素8.72±0.64mg/g；
(4)柚皮素0.96±0.07mg/g；
(5)山奈酚24.34±0.93mg/g；
(6)高良姜素21.75±1.02mg/g。
本发明的蜂花粉制剂通过以下步骤制备：
(1)取破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉按照5:3:2的比例进行混合；取混合花粉，加入溶剂乙醇，质量比为1：(10～20)，其中乙醇的浓度为60～90％(V/V)；将得到的料液通过热回流提取2～4次，每次设定温度为60-80℃，时间为2-5小时，然后将提取液混合后过滤，得到滤液；设定温度为40～60℃，将滤液减压浓缩至浸膏状态。
(2)将步骤(1)得到的浸膏溶于70～100％(V/V)的甲醇溶液中，浸膏与甲醇溶液的质量比为1:10；用与所得溶液相等体积的乙酸乙酯萃取2～5次，每次萃取时间为20～40min，然后合并萃取得到的乙酸乙酯萃取液，将其减压浓缩至浸膏状。
(3)将步骤(2)得到的浸膏溶于60～90℃的热水中，得到料液，将该料液用XAD-2树脂吸附后用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗，再用2～4倍柱床体积的甲醇溶液洗脱，其中甲醇浓度为80～100％(V/V)；将得到的洗脱液浓缩至浸膏状。
(4)将步骤(3)得到的浸膏再溶解于70～90℃的热水中，得到料液，将该料液用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附后用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗，再用3～5倍柱床体积的甲醇溶液洗脱；将得到的洗脱液浓缩至浸膏状。
(5)将步骤(4)得到的浸膏在温度为-50～-40℃，真空度为0.08～0.1MPa的情况下干燥成粉末，即得到本发明的蜂花粉制剂。
实施例1
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入60％的乙醇10L；在60℃下，通过热回流提取2次，每次提取2小时后得到提取液，合并2次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在45℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为70％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，每次萃取20min，合并2次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，并将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于70℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后再用2倍柱床体积的80％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于70℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-40℃，真空度为0.08MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸16.79mg/g，槲皮素69.01mg/g，异鼠李素8.12mg/g，柚皮素0.92mg/g，山奈酚23.52mg/g，高良姜素20.75mg/g。
实施例2
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入70％的乙醇12L；在70℃下，通过热回流提取3次，每次提取2小时后得到提取液，合并3次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在50℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为80％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取30min，合并3次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于80℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后再用3倍柱床体积的90％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于75℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用4倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-45℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸17.42mg/g，槲皮素69.53mg/g，异鼠李素8.68mg/g，柚皮素0.96mg/g，山奈酚24.49mg/g，高良姜素21.66mg/g。
实施例3
取破壁花粉油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入80％的乙醇15L；在80℃下，通过热回流提取4次，每次提取3小时后得到提取液，合并4次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在55℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为85％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，每次萃取30min，合并4次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于85℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后再用4倍柱床体积的100％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于85℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用5倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.1MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸17.95mg/g，槲皮素69.88mg/g，异鼠李素8.67mg/g，柚皮素0.99mg/g，山奈酚23.48mg/g，高良姜素21.83mg/g。
实施例4
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入80％的乙醇20L；在70℃下，通过热回流提取2次，每次提取5小时后得到提取液，合并2次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在60℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为100％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取2遍，每次萃取40min，合并2次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于90℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后再用3倍柱床体积的100％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于90℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸18.95mg/g，槲皮素70.71mg/g，异鼠李素9.32mg/g，柚皮素0.98mg/g，山奈酚24.88mg/g，高良姜素20.77mg/g。
实施例5
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入90％的乙醇20L；在70℃下，通过热回流提取2次，每次提取5小时后得到提取液，合并2次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在40℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为100％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取5遍，每次萃取20min，合并5次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于60℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后，再用3倍柱床体积的100％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于90℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸17.01mg/g，槲皮素69.92mg/g，异鼠李素8.25mg/g，柚皮素1.03mg/g，山奈酚25.24mg/g，高良姜素21.93mg/g。
实施例6
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入70％的乙醇20L；在70℃下，通过热回流提取3次，每次提取5小时后得到提取液，合并3次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在40℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为80％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取4遍，每次萃取20min，合并4次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于70℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后，再用4倍柱床体积的100％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于90℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸19.05mg/g，槲皮素70.63mg/g，异鼠李素9.36mg/g，柚皮素0.93mg/g，山奈酚24.68mg/g，高良姜素22.77mg/g。
实施例7
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入90％的乙醇20L；在70℃下，通过热回流提取2次，每次提取5小时后得到提取液，合并2次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在40℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为85％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取2遍，每次萃取30min，合并2次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于60℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后，再用3倍柱床体积的100％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于85℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用4倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸17.05mg/g，槲皮素70.78mg/g，异鼠李素8.53mg/g，柚皮素0.89mg/g，山奈酚23.41mg/g，高良姜素22.23mg/g。
实施例8
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入70％的乙醇20L；在80℃下，通过热回流提取3次，每次提取3小时后得到提取液，合并3次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在40℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为100％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取5遍，每次萃取20min，合并5次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于80℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后，再用3倍柱床体积的90％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于70℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-45℃，真空度为0.08MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸16.83mg/g，槲皮素69.03mg/g，异鼠李素8.08mg/g，柚皮素0.95mg/g，山奈酚23.63mg/g，高良姜素20.73mg/g。
实施例9
取破壁油菜蜂花粉500g，破壁荞麦蜂花粉300g，破壁高粱蜂花粉200g混合，加入90％的乙醇20L；在70℃下，通过热回流提取3次，每次提取2小时后得到提取液，合并3次的提取液并过滤，得到滤液。将滤液在40℃下减压浓缩至浸膏状态。
将上述浸膏溶于10倍重量，浓度为100％的甲醇溶液中，用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，每次萃取30min，合并3次萃取得到的乙酸乙酯萃取液后，将其减压浓缩至浸膏状。
将浸膏溶解于60℃热水中，用XAD-2树脂吸附，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗后，再用3倍柱床体积的80％的甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状；将所得浸膏再溶解于90℃热水中，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附，然后用3倍柱床体积的甲醇洗脱，洗脱液浓缩至浸膏状。
将得到的浸膏在温度为-50℃，真空度为0.09MPa条件下干燥成粉末，得到如下成分的蜂花粉制剂。
p-香豆酸18.39mg/g，槲皮素68.88mg/g，异鼠李素8.75mg/g，柚皮素1.02mg/g，山奈酚25.27mg/g，高良姜素21.45mg/g。
药效学研究
(1)试验材料与方法
受试物为蜂花粉制剂，实验动物为18-20g雄性昆明小鼠。24只昆明小鼠随机分为2组，每组12只，一组为正常对照组，另一组为实验组。所有实验小鼠适应一周后，实验组小鼠每日灌胃蜂花粉制剂10g/kg BW，正常对照组每日灌胃相同体积的蒸馏水。实验持续14天。在第14天灌胃结束后空腹2h，所有小鼠尾静脉采血。采集的血液一半装入普通离心管中，3000r/min离心分离血清；剩余血液装入有抗凝剂的离心管中混匀，然后加入预先装有淋巴细胞分离液的离心管中，1500-2000r/min离心，收集中间粉色层的细胞，用PBS洗涤3-5次即可得到淋巴细胞。
血清抗氧化能力测定：
用PBS(Na2HPO4：10.1mM；KH2PO4：1.8mM；KCl：27mM；NaCl：138mM)将两组老鼠血清稀释200倍后，加入12μmol/L的Cu2+溶液，37℃温育，每隔20min在234nm处测定一次吸光值，直至吸光值基本无变化。以相对吸光值为纵坐标，以时间为横坐标作图，曲线下面积采用GraphPad Prism 5软件分析，蜂花粉制剂对小鼠血清脂蛋白氧化的抑制率表示为：
淋巴细胞DNA损伤的测定：
取两组小鼠淋巴细胞，将其分散于0.15M的PBS(pH 7.4)，各组细胞一部分用于正常对照组，一部分用于H2O2损伤组，即此细胞实验分为四组：I组：正常对照组小鼠淋巴细胞；II组：灌胃蜂花粉制剂小鼠淋巴细胞；Ⅲ组：正常对照组小鼠淋巴细胞+100μM H2O2；Ⅳ组：灌胃蜂花粉制剂小鼠淋巴细胞+100μM H2O2。四组分散在PBS中的细胞在37℃条件下温育30min，与0.8％低熔点琼脂糖混合后平铺于载玻片上，干燥后，经过裂解、中和，在25V，300mA的条件下避光电泳20min，溴化乙锭显色，荧光显微镜下观察并拍照。用CASP软件对图像进行光密度分析。DNA损伤的程度用彗星电泳图片中尾DNA比例表示。
用SAS 8.1对数据进行差异显著性分析。
(2)结果
血清脂蛋白在Cu2+参与下，会氧化产生二烯烃，该物质在234nm处有最大吸收，因此样品在234nm吸光值越大表明血清脂蛋白被Cu2+氧化的量越多。如图1所示，正常对照组小鼠血清脂蛋白随时间增加而氧化，而本发明所涉及的蜂花粉制剂灌胃给昆明小鼠，14日后，仍能够显著抑制血清中脂蛋白氧化。抑制率达到68.52％，因此灌胃本发明蜂花粉小鼠的血清脂蛋白的抗氧化能力显著高于正常对照小鼠的血清脂蛋白的抗氧化能力。
结合图2，根据淋巴细胞损伤结果显示，正常对照组和灌胃蜂花粉制剂组小鼠淋巴细胞均没有损伤，呈现规则状态(图2中的I、II)；当加入100μM的H2O2时，正常对照组淋巴细胞收到较大损伤(图2中的III)，而预先灌胃14天蜂花粉制剂的淋巴细胞与正常对照组相比，损伤较小(图2中的Ⅳ)。
结合图3，淋巴细胞损伤DNA结果显示，正常对照组和灌胃蜂花粉制剂组小鼠淋巴细胞的尾DNA含量仅为8.23％和7.94％几乎没有损伤(如图3中的I，II)。但当加入100μM的H2O2时，正常对照组淋巴细胞的尾DNA为55.2％(图3中的III)，表明发生了严重的DNA损伤。而预先灌胃14天蜂花粉制剂的小鼠尾DNA为20.19％(图3中的Ⅳ)，与正常对照组小鼠相比，DNA损伤降低了63.42％。对测得数据进行统计学差异分析发现，正常组对照组和灌胃蜂花粉制剂的组差异不显著(p>0.05)，均为图3中的c数值水平；当加入100μM H2O2时，正常对照组淋巴细胞的尾DNA含量与预先灌胃14天蜂花粉制剂的小鼠尾DNA含量差异显著(p<0.05)，分别为图3中的a数值水平与b数值水平。
因此预先灌胃14天蜂花粉制剂小鼠的淋巴细胞DNA的抗氧化损伤能力优于正常对照组小鼠。
(3)结论
药效学研究结果表明，本发明所涉及的一种蜂花粉制剂能够显著提高小鼠血清抗氧化能力，同时预防DNA氧化损伤。本发明提供此蜂花粉制剂成分及制备方法可应用于抗氧化蜂花粉或保健品的制备，也可用于制备预防DNA氧化损伤的药品或保健食品，为开发此类产品提供了依据。
需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蜂花粉制剂，其特征在于，其活性成分包括：p-香豆酸17.92±1.13mg/g，槲皮素69.83±0.95mg/g，异鼠李素8.72±0.64mg/g，柚皮素0.96±0.07mg/g，山奈酚24.34±0.93mg/g，高良姜素21.75±1.02mg/g。
2.一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉混合，将混合花粉分散于乙醇溶液中，然后热回流提取多次，将每次的提取液混合后过滤，将得到的滤液减压浓缩至浸膏状；
(2)将步骤(1)得到的浸膏溶于甲醇溶液中，然后用乙酸乙酯萃取多次，将每次得到的乙酸乙酯层萃取液移出，混合后，减压浓缩至浸膏状；
(3)将步骤(2)得到的浸膏溶解于热水中形成料液，用XAD-2树脂吸附料液后，用蒸馏水冲洗XAD-2树脂，然后用甲醇溶液洗脱，将得到的洗脱液浓缩至浸膏状；
(4)将步骤(3)得到的浸膏溶解于热水中形成料液，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附后用，用蒸馏水冲洗SephadexLH-20，然后用甲醇溶液洗脱，将得到的洗脱液浓缩至浸膏状；
(5)将步骤(4)得到的浸膏干燥成粉末，得到蜂花粉制剂；
由此方法制得的蜂花粉制剂，其活性成分包括：p-香豆酸17.92±1.13mg/g，槲皮素69.83±0.95mg/g，异鼠李素8.72±0.64mg/g，柚皮素0.96±0.07mg/g，山奈酚24.34±0.93mg/g，高良姜素21.75±1.02mg/g。
3.根据权利要求2所述的一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中破壁油菜蜂花粉、破壁荞麦蜂花粉和破壁高粱蜂花粉的质量比为5:3:2；混合花粉与乙醇的质量比为1：(10～20)；热回流提取2～4次，每次热回流温度为60～80℃，时间为2～5小时；减压浓缩滤液时的温度为40～60℃。
4.根据权利要求2所述的一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中浸膏与甲醇的质量比为1:10；将浸膏溶于甲醇溶液后，用乙酸乙酯萃取2～5次，每次萃取时间为20～40min，萃取用的乙酸乙酯与溶解有浸膏的甲醇溶液的体积比为1:1。
5.根据权利要求2所述的一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的溶解浸膏的热水温度为60～90℃，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗XAD-2树脂后，用2～4倍柱床体积的甲醇洗脱。
6.根据权利要求2所述的一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中溶解浸膏的热水温度为70～90℃，用葡聚糖凝胶SephadexLH-20吸附后，用2倍柱床体积的蒸馏水冲洗SephadexLH-20后，用3-5倍柱床体积的甲醇溶液洗脱。
7.根据权利要求2所述的一种蜂花粉制剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)中干燥浸膏的温度为-50～-40℃，真空度为0.08～0.1MPa。
8.一种权利要求1所述的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤药物中的应用。
9.由权利要求2-7任意一项所述的制备方法制备的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤药物中的应用。
10.一种权利要求1所述的蜂花粉制剂在制备预防DNA氧化损伤保健食品中的应用。
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