CN108064230B - 使重组抗体分子单体化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了增加在重组表达的抗体分子的组合物中的单体百分比的方法，其特征在于，所述抗体分子包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv，其包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化，所述方法包括：a)用选自尿素和/或盐酸胍的变性剂处理所述组合物的转化步骤；b)其中步骤a)在还原剂存在下或者在用还原剂进行处理后施行。

Description

使重组抗体分子单体化的方法
本公开内容涉及用于增加在重组表达的抗体分子的组合物中的单体的量的方法，以及从本文中所描述的方法获得或可获得的组合物。
治疗性单克隆抗体已成为非常重要的治疗剂类别。如在WO2010/019493中所公开的，这些抗体分子的纯化和配制是一种挑战。但是，极其重要的是，在治疗应用中只采用具有最高品质的材料。
在本领域中众所周知，重组蛋白质，特别是在原核生物中表达的那些，不是在生物学上有活性的，如果它们没有折叠成适当的三级结构而是形成了经不正确地折叠的蛋白质的大聚集体(也称为内含体)。使用离液剂来有效地使此类蛋白质聚集体变性和溶解是本领域中已知的。例如，WO2007/014170讨论了许多与重组蛋白质组合物的聚集相关联的问题，并且公开了包含乙酸钠和/或氯化钠和离液剂的缓冲系统。该方法是关于称为小模块免疫药物产品(small modular immunopharmaceutical product)(其包含单链结合结构域和FC区)的特殊抗体样式的解聚集来公开的，其中使用在酸性缓冲溶液中的离液剂。所述单链结合结构域不包含稳定化二硫键。
新型抗体样式常常要求存在至少一个Fv区，其包含轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)，其中所述可变结构域不处于在C-末端处连接至轻链恒定结构域(CL)或重链恒定结构域(CH1)的其天然状态。在天然出现的全抗体分子中，CL和CH1结构域的存在起着使VL和VH的配对稳定化的作用。因此，在CL和CH1结构域不存在下，所述可变结构域倾向于与相邻分子的可变结构域进行动态交换。停止该动态过程的一种方法是通过在VH和VL之间引入二硫键，其锁住v-区配对并阻止动态交换。但是，二硫键的存在也可以起着使不希望的抗体多聚体稳定化的作用。
新型抗体样式还常常包含连接体。但是，连接体的存在可以导致形成不希望的多聚体，当在一个分子中的可变结构域与在另一个分子中的可变结构域相配对从而将这两个分子连接在一起时。那时，在Fv中二硫键的存在就起着使多聚体种类稳定化的作用。
已知的双特异性抗体样式的一个实例为在WO2010/035012和WO2011/036460中所详细描述的Fab-dsFv抗体。该抗体样式具有形成包含两个或更多个单体的多聚体的倾向，如在图9中所显示的。相似的多聚体种类也出现在包含经二硫键键合的scFv分子的组合物中，其中来自一个scFv的VH与来自分开的scFv的VL进行配对从而形成经二硫键稳定化的Fv对，其将两个scFv分子连接在一起，从而导致两个scFv的二聚体。在分开的分子中的可变结构域的进一步配对可以产生更大的多聚体种类。
已知的纯化方法，例如色谱法，能够将大的多聚体种类与更小的单体种类相分开，但不可避免地导致较低的抗体总产量。因此，对于双特异性抗体样式，对于用于解决在抗体组合物中不希望的多聚体种类的问题的方法存在巨大的需要。
本公开内容的方法通过降低在包含抗体分子的组合物中的多聚体的量而提供了对上述问题的解决办法。本公开内容对于提供适合于人使用的单体单克隆抗体分子的组合物来说是尤其有用的。
因此，本文提供了增加在重组表达的抗体分子的组合物中的单体百分比的方法，其特征在于，所述抗体分子包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv，其包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化，所述方法包括：
a)用选自尿素和/或盐酸胍的变性剂处理所述组合物的转化步骤；
b)其中步骤a)在还原剂存在下或者在用还原剂进行处理后施行。
对于重组表达的抗体分子采用在本文中所描述的方法有利地增加了在组合物中的单体的量。此外，本文中的方法可以容易地和划算地以商业规模进行使用。
本发明的方法能够将多聚体种类转化成单体，由此增加了单体百分比。该转化步骤有利地允许还原剂还原在VH和VL之间的二硫键和允许多聚体种类部分地变性并由此使多聚体解装配。该方法还允许VH和VL结构域在单个抗体分子内形成Fv对，并且在VH和VL之间的稳定化二硫键的再形成导致单体。因此，与已知的尿素和胍用于溶解未正确地折叠的蛋白质聚集体的用途相反，发明人令人惊讶地显示，尿素和/或胍以及还原剂可以用于将由于一个或多个连接体和稳定化二硫键的存在而形成的抗体多聚体转化成抗体单体，而不使抗体完全变性。本发明的方法还有利地允许再形成正确的二硫键以产生所希望的单体。
已显示，在使用β-mea的情况下，单独的还原剂不提供多于至多25％的单体。但是，还原剂和温和变性剂的组合已显示出提供高得多的单体水平，例如在80％的单体的范围内。
在一个实施方案中，单体浓度的增加为2、3或4倍。本发明的方法优选地在转化步骤后提供了这样的重组抗体组合物，其包含至少50％，至少60％，至少70％、75％、80％、85％，或至少90％的以单体形式的抗体。
在一个实施方案中，提供了从该方法获得或可获得的组合物。
本发明还提供了从在本文中所公开的方法获得的组合物用于在治疗中使用的用途。
附图简述
图1显示了在室温下向经纯化的抗体A26 Fab-645dsFv添加β-mea之后获得的单体的％和单体的量，其通过SE-UPLC分析来获得。
图2A+2B显示了在施行采用β-mea和胍的转化之后对于抗体A26 Fab-645dsFv分别获得的单体的％和单体浓度。
图2C+D显示了在施行采用β-mea和尿素的转化之后对于抗体A26 Fab-645dsFv分别获得的单体的％和产量。
图2E显示了在施行采用β-mea和尿素的转化之后对于抗体A26 Fab-645dsFv所获得的单体的量。
图3显示了在采用β-mea和尿素的转化步骤期间在抗体A26 Fab-645dsFv的组合物中单体的％的时间过程。
图4显示了对于一系列参数的关于单体产量(％)的等值线图。
图5显示了对于一系列参数的关于单体产量(％)的等值线图。
图6显示了对于尿素浓度和β-mea浓度的单体产量的佳点图(sweet spot plot)。
图7显示了在转化步骤之前进料材料的SE-UPLC色谱图。
图8显示了在转化步骤之后样品的SE-UPLC色谱图，其中测试条件为4.7M尿素和115mM β-mea。
图9显示了单体的Fab-dsFv和多聚体版本的Fab-dsFv。
图10至17显示了各种抗体分子序列及其组分。
图18显示了示例性的抗体样式。
图19显示了示例性的抗体样式。
发明详述
在本文中所使用的术语“多聚体”或“多聚体形式”是指这样的抗体形式，其由来自两个或更多个其中所有结构域都经正确地折叠和配对的抗体单体的结构域组成。举例来说，多聚体可以从两个或更多个其中每个VH结构域与VL结构域进行配对从而形成互补Fv区的抗体单体来形成，如在图9中对于Fab-dsFv所显示的。
在一个实施方案中，在本文中所使用的“增加单体百分比”是指获得单体抗体分子的这样的数值，其是相比于在应用本公开内容的方法之前所获得的单体抗体分子百分比而言更高的总靶蛋白质产量的百分比。例如，单体百分比可以为抗体分子的初始产量的至少30％，并且在应用了本方法之后单体百分比可以为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一个实施方案中，绝对数值(即分离的单体的产量)在施行了本公开内容的方法后是更高的。
在本文中所使用的“产量”或“总蛋白质”是指在组合物中的抗体分子种类的组合值。在一个实施方案中，所采用的产量值为在根据本公开内容进行加工之前的值。
在一个实施方案中，所采用的产量值为在施行根据本公开内容的方法后回收的总蛋白质(抗体分子种类)的量。
在施行本公开内容的方法后回收的总蛋白质(抗体分子种类)将会减少，因为加工不可避免地导致一些损失。
靶蛋白质是指所表达的重组抗体分子。
重组蛋白质是通过采用重组技术而表达出的蛋白质，例如抗体分子。
除非上下文指明，否则在本文中所使用的“抗体浓度”(也称为进料浓度)(其涉及包含靶蛋白质及其多聚体的材料)是指所有抗体种类(包括单体和多聚体)的浓度。在一个实施方案中，抗体浓度为在用于从组合物中去除杂质的A蛋白纯化步骤之后在组合物中的抗体的浓度。
在本文中所使用的“还原剂”是指能够还原在所讨论的分子(例如抗体)中的二硫键的还原剂。在包含一个或多个二硫键的抗体存在下，还原剂具有在合适的条件下还原二硫键(例如形成-SH)的能力。在一个实施方案中，还原剂本身包含单个硫羟基团、两个硫羟基团或者三个或更多个硫羟基团。备选地，还原剂不包含硫羟基团本身。
在本文中所使用的“硫羟基”是指包含实体-SH的基团。
在一个实施方案中，所述还原剂选自包括下列各项的组：谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸亚乙酯、2-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙胺(包括其盐，例如盐酸盐)(也称为BMEA、bMEA或B-mea、β-mea或βmea)、半胱氨酸(例如盐酸半胱氨酸)、亚磷酸和二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、THP(三(羟丙基)膦)。
还原剂(特别是包含单个硫羟基团的硫羟基还原性试剂)的使用是有益的，因为在单体的可变区之间的所希望的二硫键在施行了所述方法后自然地形成，即不需要在所述方法结束时施行特定的氧化步骤。包含一个硫羟基团的硫羟基还原性试剂的实例包括，但不限于，谷胱甘肽、巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)、巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如盐酸半胱氨酸)。
在一个实施方案中，所述硫羟基还原性试剂为巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)、巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)，特别是2-巯基乙胺(也称为BMEA、bMEA或B-mea、β-mea或βmea)
根据本公开内容的方法的另外的好处是抗体分子不会由于所采用的条件而解折叠。也就是说，使由于将经适当地折叠的多肽/蛋白质解折叠而导致的失活最小化，并且避免了使抗体重折叠的需要。在一个其中所述抗体包含多个二硫键的实施方案中，不是在所述抗体中的所有二硫键都被还原。因此，在分子例如所谓的Fab-dsFv中，通过本发明的方法并不还原在所述抗体的Fab片段和Fv中的链内二硫键。β-mea对于Fab-dsFv分子来说是特别有利的。
在一个实施方案中，还原剂的浓度在1mM至150mM范围内，例如10至150mM、50至150mM、80至150mM、90至140mM、95至135mM，例如60、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mM。
在一个实施方案中，尿素、胍或其组合的浓度在1至5M范围内。
在本文中所使用的“尿素”是指也称为碳酰二胺的有机化合物，其具有化学式CO(NH2)2。
在本文中所使用的“胍”具有式HNC(NH2)2或其盐。优选地，使用盐酸胍。
在一个实施方案中，步骤a)中的变性剂为尿素。在一个实施方案中，在根据本公开内容的处理中尿素的浓度在1至5M范围内，例如2至5M、2.5至5M、3至5M、4至5M、4.0至4.9M或4.5至4.9M，例如2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9M，特别地4.7M。在一个实施方案中，尿素的浓度小于5M。
在一个实施方案中，尿素的浓度在3至5M范围内，并且还原剂为处于在10至150mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，尿素的浓度在3至5M范围内，并且还原剂为处于在50至150mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，尿素的浓度在3至5M范围内，并且还原剂为处于在80至150mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，尿素的浓度在4至5M范围内，并且还原剂为处于在80至150mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，尿素的浓度在4.5至4.9M范围内，并且还原剂为处于在95至135mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，尿素的浓度为4.7M，并且还原剂为处于115mM的浓度下的2-巯基乙胺。
在一个实施方案中，步骤a)中的变性剂为盐酸胍(也称为胍)。在一个实施方案中，胍的浓度选自1.0至2.5M、1.0至2.0M、0.5至1.5M，例如1.0M。
在一个实施方案中，胍的浓度在0.5至1.5M范围内，并且还原剂为处于在10至150mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，胍的浓度在0.5至1.5M范围内，并且还原剂为处于在10至50mM范围内的浓度下的2-巯基乙胺。在一个实施方案中，胍的浓度为1.0M，并且还原剂为处于10mM的浓度下的2-巯基乙胺。
在一个实施方案中，将尿素和胍两者一起用作步骤a)中的变性剂，以上面所描述的特定浓度。备选地，将尿素或胍用作步骤a)中的变性剂。
在一个实施方案中，在添加尿素、胍或其组合之前，向所述重组抗体分子组合物添加还原剂。
在该实施方案中，步骤a)可以在用还原剂进行处理后施行。在该实施方案中，还原剂可以在用变性剂进行处理期间保留在所述组合物中，或者在步骤a)之前去除还原剂。还原剂越强，越可能适合于在预处理步骤中进行使用并且在步骤a)之前去除。因此，在一个其中所述还原剂选自亚磷酸、DDT、TCEP和THP的实施方案中，在步骤a)之前去除还原剂。如果需要，可以通过常规技术(包括渗滤等)在步骤a)之前去除还原剂。
备选地，还原剂在步骤a)中用变性剂进行处理期间保留在所述组合物中，并且这对于包含单个硫羟基团的还原剂(例如，选自谷胱甘肽、巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)、巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如盐酸半胱氨酸)的还原剂)来说特别地具有好处。
在一个实施方案中，在添加尿素、胍或其组合后，向所述重组抗体分子组合物添加还原剂。
在一个实施方案中，与添加尿素、胍或其组合相伴地向所述重组抗体分子组合物添加还原剂。
在上述实施方案(其中还原剂在步骤a)中用变性剂进行处理之前添加并在步骤a)中用变性剂进行处理期间保留在所述组合物中，或者在添加变性剂之后添加，或者与变性剂相伴地添加)中，可以通过常规技术(包括渗滤等)在步骤a)期间或之后去除还原剂。
在一个实施方案中，所述方法包括去除尿素和/或胍的进一步步骤。
在一个实施方案中，在去除尿素和/或胍后，所述方法在步骤a)后包括使所述组合物经历氧化条件的进一步步骤以便使在所述抗体中的一个或多个二硫键再形成。如果使用诸如亚磷酸、DDT、TCEP或THP的还原剂，该实施方案可以是具有好处的。备选地，所述方法在步骤a)后不包括使所述组合物经历氧化条件的步骤。特别地当使用包含单个硫羟基团的还原剂例如谷胱甘肽、巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)、巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如盐酸半胱氨酸)时，不需要氧化步骤。
在一个实施方案中，施行所述方法时所处的温度为环境温度，例如在15至25℃范围内，例如18、19、20、21、22、23、24或25℃。合适地，所述方法在18至25℃(例如18至22℃)范围内施行。
在本文中所使用的范围内的温度并不必然意味着要在该方法的持续时间内将所述组合物保持在相同的温度下，而是通常在施行所述方法的时间段期间将所述组合物保持在处于所述范围内的一个或多个温度下。如果和当温度在处理期间漂移或移动到了所述范围之外时，控制者将会采取步骤将所述组合物带回所希望的范围内。
在本发明的方法中，转化步骤合适地进行至少5分钟、至少15分钟或至少30分钟的时间段。在一个实施方案中，根据本公开内容处理抗体分子组合物所经过的时间段在1至70小时范围内，例如2至60小时，例如3至50小时、3至10小时、4至6小时、5至6小时、4.5至5.5小时，特别是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25小时。在一个实施方案中、所述时间段为大约4至6小时，例如4至5小时或5至6小时。
在一个实施方案中，根据本公开内容的方法包括搅拌，例如在100至1200rpm，例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或1200rpm范围内的搅拌。
在一个实施方案中，该方法的一个或多个步骤在3.5至9范围内，例如3.8、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8的pH下施行。在一个其中在所述组合物中存在氨基酸的实施方案中，在根据本公开内容进行处理之前，使用pH调节剂(例如磷酸)将所述组合物的pH调节至pH 7。当添加了赖氨酸时(其可以处于大约pH 10的高pH下)，该pH调节步骤是特别有利的。在该实施方案中，使用至pH 7的pH调节步骤改善了重组蛋白质的产量。在一个实施方案中，该方法的一个或多个步骤在3.5至9范围内，例如3.8、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8的pH下施行。
在一个实施方案中，在所述组合物中的抗体分子的浓度在1至5g/L范围内，例如2至4g/L或2至3g/L，特别是2.75g/L。
在一个实施方案中，所述抗体分子组合物不包含处于0.1M至8M的浓度下的盐。
在一个实施方案中，用于实施本发明的方法的稳健的条件包括4.5至4.9M尿素，95至135mM β-mea，在环境温度下，进行4至8小时，例如6小时，特别地在大约2.75g/L的抗体浓度下。
在一个实施方案中，用于实施本发明的方法的稳健的条件包括4.5至4.9M尿素，110至120mM β-mea，在环境温度下，进行4至8小时，例如6小时，特别地在大约2.75g/L的抗体浓度下。
在一个实施方案中，所述方法在大约20至25℃的温度下在115mM的β-巯基乙胺和4.7M的尿素存在下施行大约6小时的时间段。有利地，总抗体产量可以高达93％，其中其76％或更多为单体。
在本文中所使用的“抗体分子”是指抗体(即全抗体)或其结合片段。
术语“抗体”涉及完整的(全的)抗体(即包含两条重链和两条轻链的组成成分)，包含全抗体或其结合片段的分子。在本文中所使用的“结合片段”是指包含一个、两个、三个或更多个结合位点的抗体样分子，其中所述分子不包含“全抗体”的全长重链或轻链。在一个实施方案中，所述结合片段不包含CH2和/或CH3结构域。抗体的结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab，经修饰的Fab，Fab’，经修饰的Fab’，F(ab’)2，Fv，Fab-Fv，Fab-dsFv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，二、三或四价抗体，Bis-scFv，双体抗体(diabody)，三体抗体(triabody)，四体抗体(tetrabody)，和上述中的任一个的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)，例如在WO2009/040562中所公开的FabFv样式和在WO2010/035012中所公开的其经二硫键稳定化的版本。在本文中所使用的术语“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含含有轻链的VL(可变轻链)结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段，以及重链的VH(可变重链)结构域和第一恒定结构域(CH1)。
用于产生和制备抗体片段的方法是本领域中熟知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。用于在本公开内容中使用的其他抗体片段包括在WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所描述的Fab和Fab’片段。
典型的Fab’分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区VH、恒定结构域CH1和铰链区，并且轻链包含可变区VL和恒定结构域CL。在一个实施方案中，提供了Fab’的二聚体，例如二聚体化可以是通过铰链来进行的。
在一个实施方案中，所述重组表达的抗体分子为多特异性抗体分子，例如双特异性或三特异性抗体。在本文中所使用的“双特性分子”是指具有两个抗原结合位点(其可以结合相同或不同的抗原)的分子。在本文中所使用的“三特异性分子”是指具有三个抗原结合位点(其可以结合相同或不同的抗原)的分子。在本文中所使用的“多特异性分子”是指在本文中所描述的具有两个或更多个结合结构域(例如两个或三个结合结构域)的抗体分子。在一个实施方案中，所述结构域都结合相同的抗原，包括结合在所述抗原上的相同表位或结合在所述抗原上的不同表位。
在本文中所使用的“抗原结合位点”是指所述分子的一部分，该部分包含可变区对，特别是关连对(cognate pair)，其与靶抗原特异性地相互作用。“结合位点”、“抗原结合位点”、“结合结构域”、“抗原结合结构域”在本文中可互换使用，除非上下文另外指明。
因此，在一个实施方案中，所述抗体分子包含结合结构域。结合结构域通常将会包含6个CDR，其中三个来自重链和三个来自轻链。在一个实施方案中，来自每条链的3个CDR在构架内并且它们与该构架一起形成可变区。因此，在一个实施方案中，抗体分子包含对于抗原特异的结合结构域，其包含轻链可变区和重链可变区。在本文中所使用的“活性片段”是结合片段的同义词。
在本文中所使用的“特异性地”涉及这样的抗原结合位点，其仅识别它所特异于的抗原；或这样的结合位点，其对于它所特异于的抗原具有相比于对于它所非特异于的抗原的亲和力而言显著更高的结合亲和力，例如高至5、6、7、8、9、10倍的结合亲和力。结合亲和力可以通过标准测定法(例如，表面等离子体共振，例如BIAcore)来进行测量。
在抗体可变结构域中的残基常规地按照由Kabat等人所设计的系统来进行编号。该系统在Kabat等人,1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA(此后“Kabat等人(同上)”)中进行了阐述。在本说明书中使用该编号系统，除非另外指明。
Kabat残基命名并不总是与氨基酸残基的线性编号直接相符。实际的线性氨基酸序列可以包含比在严格的Kabat编号中少或额外的氨基酸，其相应于基本可变结构域结构的结构组分(无论是构架区还是互补性决定区(CDR))的缩短或插入。对给定的抗体，正确的Kabat残基编号可以通过将在抗体序列中的具有同源性的残基与“标准的”经Kabat编号的序列进行比对来确定。
按照Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。但是，按照Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等价于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外指明，否则在本文中所使用的“CDR-H1”意指残基26至35，如由Kabat编号系统和Chothia的拓扑环定义的组合所描述的。
按照Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。
在本发明的方法中，所述抗体包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv(VH/VL对)，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含另外的二硫键，例如其中所述二硫键是链间二硫健(例如在重链和轻链之间)，和/或其中所述二硫键在两条重链之间的铰链区内。
在一个实施方案中，所述重组表达的抗体分子包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个或六个二硫键。在一个实施方案中，所述二硫键是天然出现的。在一个实施方案中，一个或多个二硫键被改造成在特定的位置处。在一个实施方案中，存在至少一个天然出现的二硫键和至少一个经改造的二硫键。在本文中所使用的“经改造的二硫键”涉及其中在该二硫键中的一个或两个硫是通过重组基因工程技术而引入的。
在VH和VL之间的二硫键的位置不受限制。关于在可变结构域中的二硫键的位置的实例包括，但不限于，从包括下列各项的组中选择的位置：
·VH37+VL95C，参见例如Protein Science,6,781-788,Zhu等人(1997)；
·VH44+VL100，参见例如Biochemistry,33,5451-5459,Reiter等人(1994)；或Journal of Biological Chemistry,第269卷,第28期,第18327-18331页,Reiter等人(1994)；或Protein Engineering,第10卷,第12期,第1453-1459页,Rajagopal等人(1997)；
·VH44+VL105，参见例如J Biochem.,118,825-831,Luo等人(1995)；
·VH45+VL87，参见例如Protein Science,6,781-788,Zhu等人(1997)；
·VH55+VL101，参见例如FEBS Letters,377,135-139,Young等人(1995)；
·VH100+VL50，参见例如Biochemistry,29,1362-1367,Glockshuber等人(1990)；
·VH100b+VL49；
·VH98+VL46，参见例如Protein Science,6,781-788,Zhu等人(1997)；
·VH101+VL46；
·VH105+VL43，参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第90卷,第7538-7542页,Brinkmann等人(1993)；或Proteins,19,35-47,Jung等人(1994)；
·VH106+VL57，参见例如FEBS Letters,377,135-139,Young等人(1995)，
以及在位于该分子中的可变区对中的与之相应的位置。
因此，在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)可以通过在两个半胱氨酸残基(一个在VH中，和一个在VL中)之间的二硫键相连接，其中所述半胱氨酸残基对的位置选自由下列各项组成的组：VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。在一个实施方案中，所述二硫键在位置VH44和VL100之间形成。
上面列出的氨基酸对在有助于被半胱氨酸替换从而可以形成二硫键的位置处。可以通过已知技术来将半胱氨酸改造入这些所希望的位置中。因此，在一个实施方案中，根据本公开内容的经改造的半胱氨酸涉及其中在给定氨基酸位置处的天然出现的残基被半胱氨酸残基所替换。
经改造的半胱氨酸的引入可以通过使用本领域中已知的任何方法来施行。这些方法包括，但不限于，PCR延伸重叠诱变、位点定向诱变或盒式诱变(通常参见，Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989；Ausbel等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。位点定向诱变试剂盒是商购可得的，例如
Figure BDA0001439416570000141
位点定向诱变试剂盒(Stratagen,La Jolla,CA)。盒式诱变可以基于Wells等人,1985,Gene,34:315-323来施行。备选地，可以通过经由重叠寡核苷酸的退火、连接以及PCR扩增和克隆进行全基因合成来制备突变体。
通常，其中VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化的VH/VL对是形成抗原结合位点并协作地结合抗原的互补VH/VL对，即对于相同抗原具有亲和力并协作地结合抗原的互补VH/VL对。典型地，它们将会是源自相同抗体(例如由宿主在体内产生的抗体)的VH/VL对。在本文中所使用的“协作地结合抗原”是指可变区共同特异性地结合靶抗原。
在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个Fv，其中VH不在C-末端处与重链恒定结构域CH1相融合，并且VL不在C-末端处与轻链恒定区CL(Cκ或Cλ)相融合。
VH和VL结构域能够形成相互作用，其通过与在其他抗体分子中的VH或VL结构域相互作用而导致多聚体形成。
在该Fv中，VH和VL结构域可以通过连接体直接地相互连结或者通过连接体与一个或多个另外的分子间接地相连结。在VH和VL之间的连结“固定”或定义了在给定VH和VL对之间的关系，从而如果所述VH与在另一个分子中的VL相配对，那么就形成多聚体，因为在原始VH和VL之间的关系由于所述连结的存在而得到保持。
相反地，在其中VH和VL结构域没有通过一个或多个连接体相连结的Fv中，VH和VL结构域能够“脱开”(也称为呼吸)，并且当它们重新配对时，如果可变结构域之一不是来自原始配对(但具有与它所替换的原始可变区相同的序列)，那么该分子将会仅作为单体来再形成。
在本发明中所指的连接体优选地不是二硫键。用于在抗体中使用的合适的连接体是本领域中熟知的。所述连接体可以包含一个或多个氨基酸。在一个进一步的实施方案中，所述连接体为包含2至40个氨基酸(例如2至30、2至20或2至10个氨基酸)的肽连接体。肽连接体的实例包括下面所公开的那些。
在一个实施方案中，所述连接体选自在序列39至90中所显示的序列。
铰链连接体序列
SEQ ID NO: 序列
39 DKTHTCAA
40 DKTHTCPPCPA
41 DKTHTCPPCPATCPPCPA
42 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
43 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
44 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
45 DKTHTCCVECPPCPA
46 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
47 DKTHTCPSCPA
柔性连接体序列
Figure BDA0001439416570000161
Figure BDA0001439416570000171
(S)在序列50至54中是任选的。
刚性连接体的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:89)、PPPP(SEQ ID NO:90)和PPP。
在本发明的一个方面，所述Fv包含通过单个连接体直接地相连结的VH结构域和VL结构域。用于直接地将VH结构域和VL结构域相连结的合适的连接体描述在上面。
在一个实施方案中，VH和VL形成经二硫键稳定化的单链可变片段，也称为dsscFv，其是这样的分子，即具有在VH和VL可变结构域之间的肽连接体和在所述VH和VL之间的结构域间二硫键的单链可变片段。
在该实施方案中，所述dsscFv分子可以与一个或多个另外的分子(优选地第二抗体或其结合片段)相融合，从而形成二、三或四价抗体。所述dsscFv通过一个或多个可以位于VH结构域、VL结构域或VH和VL两者中的连接体与一个或多个另外的分子相融合。例如，一个或多个dsscFv分子可以融合至全抗体或其结合片段的一条或多条链的C-末端或N-末端。例如，两个或更多个dsscFv分子可以融合在一起从而形成双体抗体、串联scFV(bis-dsscFv)或微型抗体(Minibody)。
可以具有通过Fv区进行多聚体化的倾向的抗体样式包括scFv、双体抗体、串联scFv、串联scFv-Fc、scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、Fab-scFv、sc双体抗体、sc双体抗体-Fc、sc双体抗体CH3、IgG-scFv、scFv-IgG、二合一IgG、双重V结构域IgG、IgG-V和V-Ig。当在Fv或scFv中采用二硫键以使这些构建体稳定化时，那么采用本方法来改善所获得的单体的产量可以是有益的。
在本发明的一个进一步的方面，每个VH和VL包含通过第二分子间接地将VH和VL相连结的连接体。在该方面，VH结构域和VL结构域通过分开的连接体连接至所述第二分子。用于将每个可变结构域连接至所述第二分子的合适的连接体描述在上面。所述第二分子提供了在VH和VL之间的间接连结。每个VL和VH在合适的位置处连接至所述第二分子，以便允许所述VH和VL结构域协作地结合靶抗原。VH结构域和VL结构域不通过肽键或肽连接体直接地相互连结。
在该方面，所述第二分子优选地为第二抗体或其结合片段，以形成二、三或四价抗体。在一个实施方案中，VH和VL结构域通过全抗体或者Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’或F(ab’)2间接地相连接。例如，当所述第二抗体为Fab时，VH结构域可以融合至所述第二抗体的重链恒定区(例如CH1)的C-末端，并且VL单结构域抗体可以融合至所述第二抗体的轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C-末端，由此形成Fab-dsFv。Fab-dsFv抗体详细描述在WO2010/035012和WO2011/036460中(这两篇文献通过提及而合并入本文)。
所述抗体可以包含另外的结合结构域，例如按照在WO2011/117653中所公开的经二硫键稳定化的DVD-Ig分子，或在WO2011/030107中所描述的所谓的(FabFv)2Fc(每篇文献通过提及而合并入本文)。因此，在本文中所使用的“抗体”包括二、三或四价抗体。
可以在本发明的方法中采用的其他合适的抗体样式描述在WO2011/030107(其公开了FabFvFc和(FabFv)2Fc抗体)、WO2011/061492(其公开了与PEG相缀合的Fab-dsFv抗体)和WO2011/086091(其公开了Fab-dsFv-dsFv)中(每篇文献通过提及而合并入本文)，其中在Fv或scFv中采用了二硫键。
可以在本发明的方法中采用以改善单体产量的其他合适的抗体样式描述在WO2015/197772(其通过提及而合并入本文)中，该文献公开了包含下列或由下列组成的多特异性抗体分子：
a)式(I)的多肽链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(II)的多肽链：
VL-CL-Y-V2，
其中，
VH表示重链可变结构域；
CH1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；
X表示键或连接体；
Y表示键或连接体；
V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；
VL表示轻链可变结构域；
CL表示来自轻链恒定区的结构域，例如Cκ；
V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，
其中V1和V2中至少一个为dsscFv。
在本文中所使用的“单链可变片段”或“scFv”是指包含下列组分或由下列组分组成的单链可变片段：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其通过在VH和VL可变结构域之间的肽连接体来稳定化。所述VH和VL可变结构域可以处于任何合适的方向，例如VH的C-末端可以连接至VL的N-末端，或者VL的C-末端可以连接至VH的N-末端。
在本文中所使用的“经二硫键稳定化的单链可变片段”或“dsscFv”是指这样的单链可变片段，其通过在VH和VL可变结构域之间的肽连接体来稳定化，并且还包括在VH和VL之间的结构域间二硫键。
在本文中所使用的“经二硫键稳定化的可变片段”或“dsFv”是指这样的单链可变片段，其不包括在VH和VL可变结构域之间的肽连接体，而是通过在VH和VL之间的结构域间二硫键来稳定化。
在本文中所使用的“单结构域抗体”或“sdAb”是指由单个单体可变抗体结构域(例如VH或VL或VHH)组成的抗体片段。
示例性的抗体样式显示在图18中。
在一个实施方案中，V1和V2两者都是dsscFv，并且该抗体样式在本文中也可以被称为Fab-2xdsscFv。所述VH和VL可变结构域可以处于任何合适的方向，例如VH的C-末端可以连接至VL的N-末端，或者VL的C-末端可以连接至VH的N-末端。
可以在本发明的方法中采用以改善单体产量的其他合适的抗体样式描述在WO2013/068571(其通过提及而合并入本文)的实施例4中，该文献公开了Fab-dsscFv抗体样式。示例性的抗体样式显示在图19中。
在一个实施方案中，所述抗体不包含CH2和/或CH3结构域。
在一个实施方案中，所述抗体片段为所谓的Fab-dsFv样式，例如在WO2010/035012和WO2011/036460中所公开的(每篇文献通过提及而合并入本文)。
在一个实施方案中，所述抗体为在WO2011/117648中所公开的经二硫键稳定化的Fab。在一个实施方案中，所述抗体不是在WO2011/117648中所公开的经二硫键稳定化的Fab。
在一个实施方案中，所述抗体包含对于OX40特异的结合结构域。
在一个实施方案中，所述抗体包含对于血清白蛋白特异的结合结构域。
在一个实施方案中，所述抗体包含对于OX40特异的结合结构域和对于血清白蛋白特异的结合结构域，特别是Fab-dsFv样式，例如其中所述血清白蛋白结合结构域为Fv部分，特别是在WO2013/068563(其通过提及而合并入本文)中所公开的对于OX40和人血清白蛋白特异的双特异性抗体A26Fab-645dsFv。
本公开内容提供了结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其包含：
重链，其从N-末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)；
轻链，其从N-末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)，
其中所述重链和轻链是经对齐的，从而VH1和VL1形成第一抗原结合位点并且VH2和VL2形成第二抗原结合位点，
其中被所述第一抗原结合位点所结合的抗原为人OX40，和被所述第二抗原结合位点所结合的抗原为人血清白蛋白，
特别地，
其中所述重链的所述第一可变结构域(VH1)包含关于CDR-H1的在SEQ ID NO:1中给出的序列、关于CDR-H2的在SEQ ID NO:2中给出的序列和关于CDR-H3的在SEQ ID NO:3中给出的序列，并且所述轻链的所述第一可变结构域(VL1)包含关于CDR-L1的在SEQ ID NO:4中给出的序列、关于CDR-L2的在SEQ ID NO:5中给出的序列和关于CDR-L3的在SEQ ID NO:6中给出的序列，
其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有在SEQ ID NO:11中给出的序列，且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，并且
所述第二重链可变结构域(VH2)和所述第二轻链可变结构域(VL2)通过二硫键相连接。
在一个实施方案中，在所述CH1结构域和所述第二重链可变结构域(VH2)之间存在肽连接体。在一个实施方案中，在所述CL结构域和所述第二轻链可变结构域(VL1)之间存在肽连接体。在一个实施方案中，所述第一重链可变结构域(VH1)包含在SEQ ID NO:8中给出的序列。在一个实施方案中，所述第一轻链可变结构域(VL1)包含在SEQ ID NO:7中给出的序列。在一个实施方案中，所述重链包含在SEQ ID NO:15中给出的序列或由在SEQ ID NO:15中给出的序列组成。在一个实施方案中，所述轻链包含在SEQ ID NO:16中给出的序列或由在SEQ ID NO:16中给出的序列组成。
在一个实施方案中，所述抗体分子包含血清白蛋白结合结构域，例如包含一个、两个或三个来自在SEQ ID NO:29或30中所显示的可变区的重链CDR，和一个、两个或三个来自在SEQ ID NO:31或32中所显示的可变区的轻链CDR，特别地包含三个来自在SEQ ID NO:29或30中所显示的可变区的重链CDR，例如关于CDRH1的CDRH1、关于CDH2的CDRH2、关于CDH3的CDRH3，和三个来自在SEQ ID NO:31或32中所显示的可变区的轻链CDR，例如关于CDRL1的CDRL1、关于CDL2的CDRL2、关于CDL3的CDRL3。
在一个实施方案中，所述抗体分子包含在SEQ ID NO:30中所显示的重链可变区。在一个实施方案中，所述抗体分子包含在SEQ ID NO:32中所显示的轻链可变区。在一个实施方案中，所述抗体分子包含在SEQ ID NO:30中所显示的重链可变区和在SEQ ID NO:32中所显示的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述重链包含SEQ ID NO:15或19或者由SEQ ID NO:15或19组成。在一个实施方案中，所述轻链包含SEQ ID NO:16或20或者由SEQ ID NO:16或20组成。在一个实施方案中，所述结合片段抗体分子包含SEQ ID NO:15和16，15和20，16和19，或者19和20。因此，在一个实施方案中，提供了结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其具有包含在SEQ ID NO:15中给出的序列的重链和包含在SEQ ID NO:16中给出的序列的轻链。
在一个实施方案中，所述抗体分子，例如Fab-dsFv样式，是在WO2014/019727(其通过提及而合并入本文)中所公开的那种。
在一个实施方案中，所述抗体分子包含对于人血清白蛋白特异的结合结构域，其特别地具有在WO2013/068571(其通过提及而合并入本文)中所公开的CDR或可变区。
在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段是单克隆的。单克隆抗体可以通过本领域中已知的任何方法来制备，这些方法例如为杂交瘤技术(Kohler&Milstein,Nature,1975,256,495-497)、三源杂交瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunology Today,1983,4,72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy”,第77-96页,Alan R.Liss,Inc.,1985)。
在本公开内容的方法中所采用的抗体分子也可以通过使用单淋巴细胞抗体方法来产生，其中克隆和表达从被选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA，用例如由Babcook,J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93(15),7843-7848；WO92/02551；WO2004/051268；和WO2004/106377所描述的方法。
人源化抗体分子是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区，该构架区任选地包含一个或多个来自非人物种的供者残基(参见例如，US5,585,089)。在一个实施方案中，将经历本公开内容的方法的抗体分子人源化。
在本发明的方法中所采用的抗体也可以通过使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法来产生，这些方法包括由Brinkman等人,J.Immunol.Methods,1995,182,41-50；Ames等人,J.Immunol.Methods,1995,184,177-186；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,1994,24,952-958；Persic等人,Gene,1997 187,9-18；和Burton等人,Advances inImmunology,1994,57,191-280；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；和WO95/20401；以及US5,698,426；US5,223,409；US5,403,484；US5,580,717；US5,427,908；US5,750,753；US5,821,047；US5,571,698；US5,427,908；US5,516,637；US5,780,225；US5,658,727；US5,733,743；和US5,969,108所公开的那些。
转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)也可以用于产生人源化抗体，例如通过使用噬菌体技术。
全人抗体是这样的那些抗体，其中重链和轻链两者的可变区和恒定区(当存在时)全都是人来源的，或基本上与人来源的序列相同，不必须来自相同的抗体。全人抗体的实例可以包括，例如通过上面所描述的噬菌体展示方法而产生的抗体，和由小鼠所产生的抗体，在所述小鼠中鼠类免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因已被其人对应物替换，例如如在EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP 0438474和EP0463151中的一般性术语中所描述的。
用于在本发明的方法中使用的抗体材料可以通过使用牵涉编码抗体可变区和恒定区的DNA的操作和再表达的重组DNA技术来制备。标准分子生物学技术可以用于如所希望的那样修饰、添加或删除氨基酸或结构域。对于可变区或恒定区的任何改变仍然被在本文中所使用的术语“可变区”和“恒定区”所包括。
抗体起始材料可以获得自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人。抗体的各部分可以获得自多于一个物种，例如所述抗体可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种，而可变区来自另一个物种。抗体起始材料也可以进行修饰。在另一个实例中，通过使用重组DNA工程技术产生了抗体的可变区。此类经改造的版本包括例如通过在天然抗体的氨基酸序列中的或对天然抗体的氨基酸序列的插入、缺失或改变而从天然抗体可变区产生的那些。该类型的特别实例包括那些经改造的可变区结构域，其包含来自一种抗体的至少一个CDR和任选地一个或多个构架氨基酸，和来自第二种抗体的该可变区结构域的其余部分。用于产生和制备这些抗体的方法是本领域中熟知的(参见例如，Boss等人,US4,816,397；Cabilly等人,US6,331,415；Shrader等人,WO92/02551；Ward等人,1989,Nature,341,544；Orlandi等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,3833；Riechmann等人,1988,Nature,322,323；Bird等人,1988,Science,242,423；Queen等人,US5,585,089；Adair,WO91/09967；Mountain和Adair,1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev,10,1-142；Verma等人,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。
在一个实施方案中，所述抗体包含形成结合结构域的可变结构域对，其为关联对。在本文中所使用的“关联对”意指天然的可变结构域对，即其是从单个抗体或表达抗体的细胞中分离的。可变结构域可以是进行了优化和/或人源化的。源自关联对的经优化/人源化的可变结构域将会在优化/人源化后仍被认为是关联对。
因此，本公开内容扩展至使人抗体分子、人源化抗体分子或嵌合抗体分子经历在本文中所公开的方法。
在一个实施方案中，所述抗体分子特异性地结合靶抗原。在本文中所使用的“特异性地结合”意在涉及这样的分子，其对于靶抗原或配体(它所特异于的)具有高亲和力并且以低的或低得多的亲和力结合(或根本不结合)它所不特异于的抗原或配体。测量亲和力的方法是本领域技术人员已知的，并且包括诸如BIAcoreTM的测定法。
所述抗体可以是对于任何靶抗原特异的。抗原可以为细胞相关蛋白，例如在细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或者它可以为可溶性蛋白质。目的抗原也可以是任何在医学上有关的蛋白质，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白的特别实例包括，粘附分子，例如，整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4，E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白，CD2，CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD11a，CD11b，CD18，CD19，CD20，CD23，CD25，CD33，CD38，CD40，CD40L，CD45，CDW52，CD69，CD134(OX40)，ICOS，BCMP7，CD137，CD27L，CDCP1，CSF1或CSF1-受体，DPCR1，DPCR1，dudulin2，FLJ20584，FLJ40787，HEK2，KIAA0634，KIAA0659，KIAA1246，KIAA1455，LTBP2，LTK，MAL2，MRP2，柄蛋白样2，NKCC1，PTK7，RAIG1，TCAM1，SC6，BCMP101，BCMP84，BCMP11，DTD，癌胚抗原(CEA)，人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)，I类MHC和II类MHC抗原，KDR和VEGF，PD-1，DC-SIGN，TL1A，DR3，IL-7受体A，和合适时，其受体。
可溶性抗原包括，白介素例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17(例如IL17A和/或IL17F)，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干扰素例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子TNF(以前称为肿瘤坏死因子-α，在本文中称为TNF或TNFα)、肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生生长因子例如PDGF-α和PDGF-β，WISP-1，和合适时，其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒例如流感病毒、EBV、HepA、B和C，生物恐怖主义试剂，放射性核素，和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
在一个实施方案中，所述方法包括将抗体分子纯化至适合于向人施用的标准并然后对其进行配制的进一步步骤。
通过采用在本文中所描述的方法来纯化的抗体分子具有高的结合亲和力，特别地nM或pM。
亲和力可以通过使用本领域中已知的任何合适方法(包括BIAcoreTM)来进行测量。在一个实施方案中，所述抗体或结合片段具有大约100pM或更好，例如大约50pM或更好，例如大约40pM或更好，特别地30pM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，所述抗体或结合片段是完全人的或经人源化的，并且具有大约100pM或更好的结合亲和力。
在本文中所使用的“天然出现的结构域的衍生物”意在涉及其中在天然出现的序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸已被替换或删除，例如以便优化该结构域的特性，例如通过消除不希望的特性但其中该结构域的特征性特点被保留。
本领域技术人员还将会理解，所述抗体可以经历各种各样的翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于使用以表达所述分子的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺方面的变化。一种常见的修饰为由于羧肽酶的作用而引起的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如在Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所描述的)。这些翻译后改变可以影响所述分子的特性并因此影响下游加工。
在一个实施方案中，在本公开内容的方法中所使用的抗体组合物不包含乙酸钠，例如处于25mM的浓度的。在一个实施方案中，在本公开内容的方法中所使用的抗体组合物不包含氯化钠，例如处于25mM的浓度的。
在一个实施方案中，根据本公开内容的转化步骤在经澄清的上清液中施行。上清液可以通过任何合适的手段(例如离心、过滤等)来进行澄清。在一个实施方案中，上清液通过采用0.22微米过滤来进行澄清。
在一个实施方案中，在热转化步骤之前对上清液进行A蛋白色谱法的步骤。A蛋白纯化在本文中所公开的抗体分子类型(特别是不包含CH2CH3结构域的那些)的背景下是特别有利的，因为该技术允许将多聚体与单体解析开。
A蛋白色谱法的使用可以用于回收以单体形式的不包含Fc区的包含人VH3结构域的抗体。已在人VH3结构域和A蛋白的结合之间观察到亲和效应。鉴于它未曾关于Fc区和A蛋白之间的相互作用进行过描述并且允许将单体的包含人VH3结构域的抗体从包含该抗体的单体和多聚体形式的混合物中回收，该发现是令人惊讶的。
因此，A蛋白纯化的步骤可以包括：a)将包含以单体和多聚体形式的包含人VH3结构域的抗体的混合物施加至A蛋白色谱法材料，其中所述A蛋白包含结构域D和/或E，这在允许所述抗体与A蛋白结合的条件下进行；和b)回收以单体形式的包含人VH3结构域的抗体，其中所述包含人VH3结构域的抗体不包含Fc区。备选地，A蛋白纯化的步骤包括：a)将包含以单体和多聚体形式的包含人VH3结构域的抗体的混合物施加至A蛋白色谱法材料，其中所述A蛋白包含结构域D和/或E；b)允许所述抗体与A蛋白结合；c)施加选择性地破坏以单体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液；d)回收所得的洗脱物；和任选地，e)施加破坏以多聚体形式的抗体的结合的第二洗脱缓冲液并回收该第二洗脱物，其中所述包含人VH3结构域的抗体不包含Fc区。在一个其中所述抗体为在WO2013/068563中所公开的对于OX40和人血清白蛋白特异的抗体A26Fab-645dsFv的实施方案中，A蛋白纯化如上面那样进行，其中在步骤c)中，所述洗脱缓冲液具有pH 3.5至pH 4.2，优选地pH 3.6至pH 4.1，pH 3.7至pH 4.0，优选地pH3.8至pH 3.9，或pH 3，以破坏单体的结合，并且在任选的步骤e)中，所述洗脱缓冲液具有低于3.5的pH，优选地低于3.4的pH，优选地pH 2.8至pH 3.2，优选地pH 2.9至pH 3.1，优选地pH 3.0，其破坏以多聚体形式的抗体的结合。
备选地，A蛋白纯化的步骤包括：a)将包含以单体和多聚体形式的包含人VH3结构域的抗体的混合物施加至A蛋白色谱法材料，其中所述A蛋白包含结构域D和/或E；b)允许以多聚体形式的抗体的结合；c)回收在流出物(flow-through)中的以单体形式的抗体；和任选地，d)施加选择性地破坏以多聚体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液；和e)回收产生自d)的洗脱物；其中所述包含人VH3结构域的抗体不包含Fc区。
在一个备选的实施方案中，在转化步骤之前不进行A蛋白色谱法。
在一个实施方案中，所述方法包括进一步的下游加工步骤。在一个实施方案中，所述方法包括下游纯化的进一步步骤，例如其中所述下游加工包括色谱法步骤，例如疏水相互作用色谱法或离子交换色谱法。
下游加工步骤意味着，在实施用尿素和/或胍和还原剂进行的处理之后采用至少一个步骤来进一步纯化抗体分子。下游加工的实例包括一个或多个色谱法步骤，例如大小排阻色谱法、离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法)、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法例如A蛋白色谱法(例如MabSelect柱)。在多肽和蛋白质的下游加工中所采用的技术是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，所述下游加工包括色谱法步骤，特别是离子交换色谱法。在一个实施方案中，所述方法包括阴离子交换色谱法步骤，随后为阳离子交换色谱法步骤，或者反过来。在一个实施方案中，采用疏水相互作用色谱法。在一个实施方案中，采用混合模式色谱法。在一个实施方案中，采用多个色谱法步骤。
在一个实施方案中，所述方法包括病毒灭活步骤，例如将包含所述蛋白质的组合物保持在确定的pH(例如低pH)下经过确定的时间段。
在一个实施方案中，最后的下游加工步骤为渗滤步骤和缓冲液交换以提供关于所述蛋白质的最终的贮藏缓冲液和浓度。
在一个实施方案中，所述下游加工包括A蛋白(例如MabSelect柱)纯化，如上面所描述的，在转化步骤之前。
在一个实施方案中，所述下游加工进一步包括病毒灭活步骤，随后为超滤和缓冲液交换，再随后为阴离子交换色谱法和接着的阳离子交换色谱法和病毒过滤步骤。
在一个实施方案中，在转化步骤之后的下游加工包括病毒灭活步骤，随后为超滤和缓冲液交换，再随后为阴离子交换色谱法和接着的阳离子交换色谱法和病毒过滤步骤。
在一个实施方案中，所述下游加工进一步包括病毒灭活步骤，随后为超滤和缓冲液交换，再随后为阳离子交换色谱法和接着的阴离子交换色谱法和病毒过滤步骤。
其他下游加工步骤包括疏水相互作用色谱法(HIC)或混合模式色谱法。
在一个实施方案中，最后的下游加工步骤为渗滤步骤和缓冲液交换以提供关于所述蛋白质的最终的贮藏缓冲液和浓度。
在一个实施方案中，在本文中所公开的方法提供了将经纯化的单体抗体分子缀合至一个或多个效应分子的进一步步骤。所述效应分子可以包含单个效应分子，或者两个或更多个此类分子，其如此地经连接从而形成可以附着至抗体分子的单个部分。
在希望获得与效应分子相连接的抗体时，这可以通过标准的化学或重组DNA程序来制备，其中将抗体直接地或通过偶联试剂连接至效应分子。用于将此类效应分子缀合至抗体的技术是本领域中熟知的(参见Hellstrom等人,Controlled Drug Delivery,第2版,Robinson等人编辑,1987,第623-53页；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58；和Dubowchik等人,1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。特别的化学程序包括，例如在WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476和WO03031581中所描述的那些。备选地，在所述效应分子为蛋白质或多肽时，所述连接可以通过使用重组DNA程序来实现，例如如在WO86/01533和EP0392745中所描述的。
在本文中所使用的术语“效应分子”包括例如抗肿瘤试剂，药物，毒素，在生物学上有活性的蛋白质，例如酶、其他抗体或抗体片段，合成的或天然出现的聚合物，核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段，放射性核素，特别是放射性碘化物，放射性同位素，经螯合的金属，纳米颗粒，和报道基团，例如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱学来检测的化合物。
效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒性试剂，其包括任何对于细胞有害(例如，杀死细胞)的试剂。实例包括康普瑞汀、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、美登素类化合物、海绵抑制素、利索新、软海绵素、杆孢菌素、哈米特林、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，以及其类似物或同系物。
效应分子还包括，但不限于，抗代谢物(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷基化试剂(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)(顺铂))、蒽环类(例如，柔红霉素(以前，道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前，放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨曲霉素(AMC)、加利车霉素或倍癌霉素)和抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
其他效应分子可以包括经螯合的放射性核素例如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，例如但不限于，烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。
其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。目的酶包括，但不限于，蛋白质水解酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。目的蛋白质、多肽和肽包括，但不限于，免疫球蛋白，毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活物，血栓试剂或抗血管发生试剂，例如血管生长抑素或内皮抑制素，或者生物应答调节物例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应分子可以包括例如在诊断中有用的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、发射正电子的金属(用于在正电子发射断层成像术中使用)和非放射性顺磁性金属离子。关于可以与用于用作诊断剂的抗体相缀合的金属离子，通常参见US4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实例中，所述效应分子可以增加所述抗体的体内半寿期，和/或降低所述抗体的免疫原性，和/或增强抗体穿越上皮屏障向免疫系统的递送。该类型的合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如在WO05/117984中所描述的那些。
在所述效应分子为聚合物时，它通常可以为合成的或天然出现的聚合物，例如任选地经取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物，或者支化或非支化的多糖，例如同多糖或异多糖。
可以在上面提及的合成聚合物中存在的特别的任选的取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基基团。
合成聚合物的特别的实例包括任选地经取代的直链或支链聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇或其衍生物，尤其是任选地经取代的聚乙二醇例如甲氧基聚乙二醇或其衍生物。特别的天然出现的聚合物包括乳糖、直链淀粉、右旋糖酐、糖原或其衍生物。
在本文中所使用的“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如硫羟基选择性的反应性基团例如马来酰亚胺等。所述反应性基团可以直接地或通过连接体区段连接至聚合物。将会意识到，此类基团的残基在某些情况下将会作为在本公开内容的抗体和聚合物之间的连接基团而成为产物的一部分。
聚合物的大小可以按所希望的进行变化，但通常将会在500Da至50000Da，例如5000至40000Da，例如20000至40000Da的平均分子量范围内。特别地，基于所述产物的所想要的用途，例如定位至某些组织例如肿瘤的能力或延长循环半寿期的能力，来选择聚合物大小(回顾可参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，在想要产物离开循环并穿透入组织(例如用于在肿瘤治疗中使用)时，那么使用小分子量聚合物(例如具有大约5000Da的分子量)可以是有利的。对于其中产物保留在循环中的应用，使用较高分子量聚合物(例如具有在20000Da至40000Da范围内的分子量)可以是有利的。
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚乙二醇或尤其是甲氧基聚乙二醇或其衍生物，其尤其具有在大约15000Da至大约40000Da范围内的分子量。
在一个实例中，将用于在本发明中使用的抗体附着至聚乙二醇(PEG)部分。在一个特别的实例中，可以通过任何位于抗体中的可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离的氨基、亚氨基、硫羟基、羟基或羧基基团)来附着PEG分子。此类氨基酸可以天然地出现在抗体中，或者可以通过使用重组DNA方法来改造入抗体中(参见例如US5,219,996；US5,667,425；WO98/25971)。在一个实例中，本发明的分子为经修饰的抗体，其中所述修饰为向其重链的C-末端添加一个或多个氨基酸以允许附着效应分子。可以使用多个位点来附着两个或更多个PEG分子。在一个实施方案中，将PEG分子连接至在轻链中的半胱氨酸171，例如参见WO2008/038024(其通过提及而合并入本文)。
合适地，通过至少一个位于抗体中的半胱氨酸残基的硫羟基团来共价连接PEG分子。每个附着至经修饰的抗体的聚合物分子可以共价连接至位于抗体中的半胱氨酸残基的硫原子。所述共价连接通常将会是二硫键，或特别地硫-碳键。在使用硫羟基团作为经适当地活化的效应分子的附着点时，可以使用例如硫羟基选择性的衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。在上面所描述的经聚合物修饰的抗体的制备中，可以使用经活化的聚合物作为起始材料。经活化的聚合物可以为任何包含硫羟基反应性基团的聚合物，例如α-卤代羧酸或α-卤代羧酸酯，例如碘乙酰胺，亚胺，例如马来酰亚胺，乙烯基砜，或二硫化物。此类起始材料可以商购获得(例如从Nektar(以前Shearwater Polymers Inc.),Huntsville,AL,USA)或者可以通过使用常规化学程序从商购可得的起始材料来制备。特别的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获得自Nektar(以前Shearwater)；Rapp Polymere；和SunBio)和M-PEG-SPA(可获得自Nektar(以前Shearwater))。
在一个实施方案中，本公开内容扩展至从在本文中所公开的方法获得或可获得的抗体分子。
在一个实施方案中，所述方法包括将从所示方法获得的抗体分子(包括其缀合版本)配制成合适于在人中使用的药学制剂的进一步步骤。
因此，本发明还提供了用于制备药学或诊断学组合物的方法步骤，其包括添加本发明的抗体并将其与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合在一起。
从本公开内容的方法获得的抗体分子可以是在所述药学或诊断学组合物中唯一的活性成分，或者可以伴随有其他活性成分，包括其他抗体成分例如抗-TNF、抗-IL-1β、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体，或非抗体成分例如黄嘌呤。其他合适的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，例如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在一个进一步的实施方案中，将根据本公开内容的抗体或组合物与另外的药学上有活性的试剂相组合地进行使用，所述另外的药学上有活性的试剂例如为皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(例如沙丁胺醇、沙美特罗或福莫特罗)，或细胞生长和增殖的抑制剂(例如雷帕霉素、环磷酰胺、氨甲蝶呤)，或备选地，CD28和/或CD40抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂为小分子。在另一个实施方案中，所述抑制剂为对于靶标特异的抗体。
合适地，所述药学组合物包含治疗有效量的本发明的抗体。在本文中所使用的术语“治疗有效量”是指对于治疗、改善或预防所靶向的疾病或状况或者对于展示出可检测的治疗或预防效果来说所需要的治疗剂的量。在最初，可以在细胞培养测定法中或者在动物模型中(通常在啮齿类动物、兔子、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效量。动物模型还可以用于测定施用的合适的浓度范围和途径。然后，这样的信息可以用于确定对于在人中施用来说有用的剂量和途径。
对于人受试者的精确的治疗有效量将会取决于疾病状态的严重度，受试者的总体健康状态，受试者的年龄、体重和性别，饮食，施用的时间和频次，药物组合，反应敏感性，和对于疗法的耐受性/应答。该量可以通过常规实验来进行测定，并且在临床医生的判断之内。通常，治疗有效量将会为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。药学组合物可以方便地以单位剂量形式来呈现，所述单位剂量形式在每剂中包含预定量的本发明的活性试剂。
组合物可以单独地向患者施用，或者可以与其他试剂、药物或激素相组合地(例如同时地、顺次地或分开地)进行施用。
施用本发明的抗体所采取的剂量取决于待治疗的状况的性质，例如疾病/炎症所呈现的程度，以及取决于所述分子是预防性地进行使用还是用于治疗现有的状况。
给予剂量的频次将会取决于所述抗体的半寿期和其效果的持续时间。如果所述抗体具有短的半寿期(例如，2至10小时)，那么可能需要每天给予一剂或更多剂。备选地，如果所述抗体具有长的半寿期(例如，2至15天)，那么可能仅需要每天一次，每周一次，或者甚至每1或2个月一次给予剂量。
药学上可接受的载体本身不应当诱导对于接受该组合物的个体有害的抗体的产生，并且不应当是有毒的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或者有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
在治疗性组合物中的药学上可接受的载体可以额外地包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或者pH缓冲物质，可以存在于这样的组合物中。此类载体使得所述药学组合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆液和悬浮液，以用于被患者摄取。
用于施用的合适形式包括适合于肠胃外施用(例如，通过注射或输注，例如通过推注或连续输注)的形式。在产品是用于注射或输注时，可以采取在油性或水性载料中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并且它可以包含配制试剂，例如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，本公开内容的分子可以是以干的形式，其用于在使用前用合适的无菌液体进行重构。
一旦进行了配制，可以将本发明的组合物直接地施用给受试者。待治疗的受试者可以是动物。但是，在一个或多个实施方案中，所述组合物适合于向人受试者施用。
合适地，在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH与抗体的等电点的值不是近似的，例如如果制剂的pH为7，那么8-9或以上的pI可以是合适的。尽管并不希望被理论所束缚，但是认为这可以最后提供具有经改善的稳定性的最终制剂，例如抗体保留在溶液中。
本发明的药学组合物可以通过众多途径来进行施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内，鞘内、心室内、透皮、经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器(hypospray)也可以用于施用本发明的药学组合物。典型地，可以将该治疗性组合物制备成可注射的，以液体溶液或悬浮液形式。也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮在液体载料中的固体形式。
通常，所述组合物的直接递送将会通过注射(以皮下、腹膜内、静脉内或肌内方式)来完成，或者递送至组织的间质空间。也可以将所述组合物施用入损伤内。按剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
将会意识到，在所述组合物中的活性成分将会是抗体。如此，它将会易于在胃肠道中降解。因此，如果所述组合物待通过使用胃肠道的途径来进行施用，那么所述组合物将会需要包含这样的试剂，其保护抗体免于降解，但是一旦它被从胃肠道中吸收就会释放抗体。
药学上可接受的载体的详尽讨论在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中可得到。
在一个实施方案中，所述制剂作为用于局部施用(包括吸入)的制剂来提供。
合适的可吸入制备物包括可吸入粉末、包含推进气体的计量气雾剂或没有推进气体的可吸入溶液。包含活性物质的根据本公开内容的可吸入粉末可以仅仅由上面提及的活性物质组成，或者由上面提及的活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉末可以包括单糖(例如，葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如，乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如，右旋糖酐)，多元醇(例如，山梨醇、甘露醇、木糖醇)，盐(例如，氯化钠、碳酸钙)，或者这些与另一种的混合物。合适地，使用单糖或二糖，乳糖或葡萄糖的使用特别地是以其水合物的形式(但不是排他地)。
用于在肺中沉积的颗粒要求小于10微米的颗粒大小，例如1-9微米，例如0.1至5μm，特别是1至5μm。活性成分(例如抗体)的颗粒大小是最为重要的。
可以用于制备可吸入气雾剂的推进气体是本领域中已知的。合适的推进气体选自：烃类例如正丙烷、正丁烷或异丁烷，和卤代烃类例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上面提及的推进气体可以以其本身或者以其混合物来进行使用。
特别合适的推进气体为选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上面提及的卤代烃类中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。
包含推进气体的可吸入气雾剂还可以包含其他成分，例如助溶剂、稳定剂、表面活性试剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的工具。所有这些成分是本领域中已知的。
根据本发明的包含推进气体的可吸入气雾剂可以包含直至5重量％的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如0.002至5重量％、0.01至3重量％、0.015至2重量％、0.1至2重量％、0.5至2重量％或0.5至1重量％的活性成分。
备选地，至肺的局部施用也可以是通过施用液体溶液或悬浮液制剂，例如采用装置诸如雾化器，例如与压缩机相连的雾化器(例如，与Pari Master(R)压缩机相连的PariLC-Jet Plus(R)雾化器，其由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造)。
可以将从在本文中的方法获得的抗体或结合片段分散在溶剂中进行递送，例如以溶液或悬浮液的形式。可以将它悬浮在合适的生理学溶液例如盐水或其他药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域中已知的缓冲溶液可以包含0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1mL水，以便达到大约4.0至5.0的pH。悬浮液可以使用例如经冻干的分子。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域中熟知的，并且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。可以将溶液或悬浮液包囊在脂质体或生物可降解的微球中。通常，将会采用无菌制备方法以基本上无菌的形式来提供所述制剂。
这可以包括：用于所述制剂的经缓冲的溶剂/溶液的生产和过滤灭菌，所述分子在该无菌的经缓冲的溶剂/溶液中的无菌悬浮，和通过本领域技术人员熟悉的方法将所述制剂分装入无菌储器中。
根据本公开内容的可雾化制剂可以例如作为包装在铝箔包裹物中的单剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)来提供。每个小瓶在一定体积(例如2mL)的溶剂/溶液缓冲液包含单位剂量。
在本说明书的背景下，“包含”意在表示包括。在技术上合适时，可以将本发明的实施方案相组合。任何在本文中以肯定方式叙述的实施方案可以用作否定式排除的基础。
现在将会参考下面的实施例来描述本发明，这些实施例仅是举例说明性的并且不应当以任何方式被解释为限制了本发明的范围。
实施例1：抗体分子材料的制备
A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清
使具有轻链序列A26Fab轻-(3xG4S)-645dsFv(gL4)(SEQ ID NO:16)和重链序列A26Fab重-(G4S,G4T,G4S)-645dsFv(gH5)(SEQ ID NO:15)的结合人OX40和血清白蛋白的构建体在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中进行表达。这通过用包含关于DHFR的基因(作为选择标记)和编码该产物的基因的质粒载体进行转染来产生，其中遵循制造商的说明书使用Nuclefector(Lonza)。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中和在DHFR抑制剂氨甲蝶呤存在下选择经转染的细胞。
在整个接种阶段，将细胞系在包含20nM氨甲蝶呤的培养基中进行培养。然后，将细胞在氨甲蝶呤不存在下进行培养。对于最后的培养步骤，将细胞在80L不锈钢生物反应器中在培养基中在氨甲蝶呤不存在下培养14天。在第14天通过圆盘堆叠式离心来收获生物反应器内容物，随后为多个过滤步骤以产生经澄清的上清液。
由哺乳动物表达的A26Fab-645dsFv的A蛋白纯化
取决于所需要的规模，将经澄清的CHO上清液施加至以一系列柱大小进行装填的9.4ml HiScreen(串联的2个柱子)MabSelect色谱法树脂(GE Healthcare)。将柱子在Delbeccos磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中或在100mM磷酸钠,150mM NaCl(pH7.4)中进行平衡。在上样后将柱子用PBS平衡缓冲液进行洗涤。然后，用pH3.4的0.1M柠檬酸钠缓冲液洗脱结合的材料。将收集的洗脱峰的pH用2M Tris/HCl pH 8.5调节至～pH7。通过使用10kDa分子量截止离心浓缩器或切向流超滤膜，将pH经调节的洗脱物的缓冲液交换为pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液。
实施例2：仅还原剂以及还原剂和变性剂的组合对于单体产量的影响
仅还原剂
进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体，浓度1g/L和15％单体。该实验在室温下在Eppendorfs中以1mL的进料体积来施行。所使用的还原剂为50mM β-mea。在施行任何分析之前，将样品用PBS进行缓冲液交换以去除还原剂。
在0至23小时的时间段期间分析单体百分比。
表1：在用50mM β-mea进行处理后的单体百分比
时间(小时) 抗体分子的浓度(g/L) ％单体
0 14.8 25.2
1 14.8 25.1
2 14.8 25.0
3 14.8 24.9
4 14.9 25.1
5 14.9 25.0
6 14.9 25.1
23 14.9 25.0
还原剂和变性剂的组合
进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体，浓度1.1g/L和14％单体。
使用3M尿素作为变性剂，和使用50mM β-mea作为还原剂。首先向进料添加尿素，随后添加还原剂。在添加还原剂后，对时间点进行取样直至5小时，第一次在添加β-mea后立即进行(标示为0小时)。对每个样品进行缓冲液交换，然后通过SE UPLC来进行分析。所述实验在室温下施行。
结果显示在表2中：
Figure BDA0001439416570000411
HMWS＝高分子量种类
使用SE-HPLC分析来测定单体的％和单体量(也参见图1)。
可以看出，使用3M尿素作为变性剂和50mM β-mea提供了显著地经改善的单体百分比，而同时也增加了单体量。尿素能够实现多聚体至单体的转化，而不还原在Fab的重链之间的二硫键。
结论：β-mea被鉴定为关于为了还原Fv链间二硫键而同时保留Fab链间二硫键的转化反应的最佳还原剂。其他所测试的还原剂(数据未显示)看起来增加了单体的％(通过SE分析)，但是如在随后的SDS PAGE分析中所看出的，它们还原了这两种链间二硫键，因此在Fab-dsFv的转化中不是有用的。
具有变化的浓度的还原剂和变性剂的组合
通过改变变性剂和还原剂的浓度来施行筛选实验，以便鉴定出用于将多聚体种类转化为单体的最佳条件。进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体。每个实验在室温下施行，具有1200rpm的混合速率、1.1g/L的进料浓度和5mL的样品体积。首先向进料添加尿素，快速地随后添加还原剂。从0至5小时获取时间过程样品。在转化步骤结束时，将样品立即冷冻于-20℃。1天后，将样品进行0.22μm过滤并且通过SE UPLC来进行分析。转化反应继续进行直至分析，因为变性剂和还原剂仍然存在。所测试的变性剂为尿素和盐酸胍(GuHCl)。
表3：关于变性剂和还原剂的组合的实验计划
Figure BDA0001439416570000421
对样品施行的大小排阻色谱法的结果显示在图2A-E中。
1M胍与10mM β-mea给出了最高的单体产量(参见图2B)。
在3M尿素和50mM β-mea样品中，看到81％单体(参见图2C)。甚至用仅10mM β-mea，在3M尿素样品中看到77％单体(图2C)。1M尿素样品仍然具有单体的％的显著增加，但相比于3M尿素样品而言具有更低的单体的％。
如在显示了产量(％)和单体浓度的图2D和2E中所显示的，用3M尿素、50mM β-mea，在2小时后存在84.7％(关于产量)和0.79g/L的单体(是进料的5倍)。在3M尿素、10mM β-mea样品和1M尿素、50mM β-mea样品中也存在高的单体回收。在这些样品中，5M尿素导致某些产物损失。
结论：使用3M尿素作为变性剂的结果是非常有前景的并且提供了5倍的单体增加，而用胍看到了4倍的单体增加。
实施例3：尿素转化时间过程
在SE UPLC柱上进行了关于尿素转化的时间过程研究。进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体。在1.5mL小瓶中制备两个样品并在SE UPLC上走柱。首先向进料添加尿素，快速地随后添加还原剂。时间点每40分钟来实施。对于所述样品的条件为：
·0.5g/L进料浓度，20mM β-mea浓度，pH 8.6，4M尿素浓度；
·5.0g/L进料浓度，100mM β-mea浓度，pH 5.4，4M尿素浓度。
将样品区室的温度设置至10℃，其相比于在室温下的反应而言将会降低反应速度。从SE-UPLC分析所获得的结果显示在图3中。
实施例4：参数筛选-1
为了找到关于转化步骤(其中使用β-mea作为还原剂和使用尿素作为变性剂)的最佳条件，调查研究了被认为对于转化反应具有最大影响的参数。这些参数为进料浓度、尿素浓度、β-mea浓度和pH(参见表3)。进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体。进料材料包含15％单体，并且用于所有转化步骤的时间为5小时。首先向进料添加尿素，快速地随后添加还原剂。
表4：所筛选的参数范围
因素 水平
进料浓度 0.5-5g/L
β-mea浓度 20-100mM
尿素浓度 0.5-4M
pH 5.4-8.6
在96-深孔平板上施行转化步骤，重复每个实验，并且使用TECAN自动机来准备所述实验。所述实验在室温下施行，并且所述样品用SE UPLC来进行分析。所测量的响应为单体的％、总产量和单体产量。
实验设计显示在表5中：
Figure BDA0001439416570000441
所述样品通过SE-HPLC来进行分析，并且结果显示在表6中。
表6：关于第一次参数范围筛选的结果
Figure BDA0001439416570000451
关于单体产量(％)的等值线图给出在图16中。
用于使单体的％最大化的最佳条件为最高的还原剂浓度(100mM β-mea)和最高的变性剂浓度(4M尿素)。
尿素浓度对于单体的％具有强烈的正效应。β-mea浓度对于单体的％具有较弱的正影响。从该第一次参数范围筛选中，选择出进一步的范围以用于随后的第二次筛选。这些为80-150mM(对于β-mea浓度)和2.5至5M(对于尿素浓度)。选择这些范围是因为对于蛋白质来说它们是防止单链形成的极限。
实施例5：参数筛选-2
为了找到关于使单体产量最大化的最佳条件，通过从实施例4中选择具有前景的范围来施行第二次参数范围筛选。被选择用于第二次筛选的范围显示在表7中。
表7：关于第2次筛选的参数
因素 水平
β-mea浓度 80-150mM
尿素浓度 2.5-5M
pH 5.4-8.6
进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体。在96-深孔平板上施行转化步骤，重复每个实验，并且使用TECAN自动机来准备所述实验。进料材料包含15％单体，并且用于所有转化步骤的时间为5小时。首先向进料添加尿素，快速地随后添加还原剂。所述实验在室温下施行，并且所述样品在过滤后用SE UPLC来进行分析。使用多重线性回归来拟合该模型。
在该研究中所获得的结果显示在表8中。
表8：关于第2次参数范围筛选的结果
Figure BDA0001439416570000471
如在前面的筛选研究中那样，尿素浓度对于单体的％具有最强的(正的)影响，而β-mea在整个所调查研究的范围内具有小得多的(正的)影响。将β-mea浓度从80mM改变至150mM对于转化反应具有很小的影响。
在包含2.5M尿素的实验中具有低的产量，而所有其他具有3.8M及以上的尿素浓度的实验均具有相似的显著地经改善的产量。关于单体产量(％)的等值线图显示在图5中。
因此，发现在通过用80至150mM的β-mea和3.8M至5M的尿素处理重组表达的多肽来进行Fab-dsFv转化时，增加了单体百分比。
实施例6：稳健性测试
跨越在实施例5中发现的关于60％及以上的单体产量的实验空间的佳点图给出在图6中。
选择在该区域中的五个实验点来证实来自实施例5的结果并且提供在其中施行转化步骤的稳健空间。pH显示出对于单体产量没有显著影响，因此所有实验都在pH 7下进行。
进料为在实施例1中所提供的经纯化的抗体。关于所述样品的进料浓度为2.75g/L，并且这其中的15％为单体。来自SE UPLC分析的实验点和结果显示在表9中。转化步骤进行6小时。
表9：关于稳健性测试的实验结果
Figure BDA0001439416570000481
在整个五个实验中，单体产量从71％至77％变化。产量和单体的％这些响应在整个实验中也相当一致。
在来自表9中实验5的转化步骤(使用4.7M尿素和115mM β-mea)之前和之后的样品的SE-UPLC色谱图显示在图7和图8中。
实施例7：在2L规模下的转化
如在实施例1中那样进行A26Fab-645dsFv的CHO表达和澄清以提供经澄清的培养物液体作为用于2L规模实验的进料。转化实验在2L发酵容器中施行，其中使用2L的转化体积。抗体浓度为2.2g/L，其中30％为单体。实验条件显示在表10中，并且转化步骤施行17小时。在所述实验中，首先添加还原剂β-mea，随后添加尿素。所述样品通过SE UPLC来进行分析。
表10：关于2L转化实验的实验条件
尿素浓度(M) pH ℃ β-mea浓度(mM)
3.0 7 室温 50
表11：关于2L转化实验的实验结果
Figure BDA0001439416570000491
可能的是，将转化步骤放大至2L规模，在代表了在生产规模下所使用的那些的容器中。可能的是，在用β-mea和尿素进行的转化步骤后显著地增加单体的量。
结论：
鉴定出了用于转化步骤的稳健的条件，其为：4.5至4.9M尿素，95至135mM β-mea，6小时，进料浓度2.75g/L。
最稳健的条件被鉴定为：4.7M尿素，115mM β-mea，6小时，进料浓度2.75g/L。
通过使用这些最稳健的条件，单体的％令人惊讶地从15％增加至82％。关于转化步骤的产量为93％，这导致76％的单体产量。在进料中的单体浓度为0.4g/L，而在转化后的产物中的单体浓度为2.0g/L。这是在转化步骤后单体的量的出人意料的5倍增加。
转化步骤被成功地放大至2L规模，其中使用3M尿素和50mM β-mea，并且采用代表了在生产规模下的那些的容器。
Figure IDA0001439416620000011
Figure IDA0001439416620000021
Figure IDA0001439416620000031
Figure IDA0001439416620000041
Figure IDA0001439416620000051
Figure IDA0001439416620000061
Figure IDA0001439416620000071
Figure IDA0001439416620000081
Figure IDA0001439416620000091
Figure IDA0001439416620000101
Figure IDA0001439416620000111
Figure IDA0001439416620000121
Figure IDA0001439416620000131
Figure IDA0001439416620000141
Figure IDA0001439416620000151
Figure IDA0001439416620000161
Figure IDA0001439416620000171
Figure IDA0001439416620000181
Figure IDA0001439416620000191
Figure IDA0001439416620000201
Figure IDA0001439416620000211
Figure IDA0001439416620000221
Figure IDA0001439416620000231
Figure IDA0001439416620000241
Figure IDA0001439416620000251
Figure IDA0001439416620000261
Figure IDA0001439416620000271
Figure IDA0001439416620000281
Figure IDA0001439416620000291
Figure IDA0001439416620000301

Claims (30)

1.增加在重组表达的抗体分子的组合物中的单体百分比的方法，其特征在于，所述抗体分子包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv，其包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化，所述方法包括：
a)用从由尿素和盐酸胍组成的组中选择的变性剂处理所述组合物的转化步骤，其中所述尿素处于1至5M的浓度，或者所述盐酸胍处于1至2M的浓度；
b)其中步骤a)在还原剂存在下或者在用还原剂进行处理后施行，其中所述还原剂为包含单个硫羟基团的硫羟基还原性试剂，并且其中所述还原剂处于10至150mM的浓度。
2.根据权利要求1的方法，其中所述还原剂处于50至150mM的浓度。
3.根据权利要求2的方法，其中所述还原剂处于95至135mM的浓度。
4.根据权利要求3的方法，其中所述还原剂处于110至120mM的浓度。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述还原剂选自由下列各项组成的组：谷胱甘肽(GSH)、2-巯基乙醇(BME)、2-巯基乙胺(BMEA)和盐酸半胱氨酸。
6.根据权利要求5的方法，其中所述还原剂为2-巯基乙胺。
7.根据权利要求1的方法，其中所述尿素处于3至5M的浓度。
8.根据权利要求7的方法，其中所述尿素处于4.5至4.9M的浓度。
9.根据权利要求8的方法，其中所述尿素处于4.7M的浓度。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤a)进行在2至70小时范围内的时间段。
11.根据权利要求10的方法，其中步骤a)进行在3至50小时范围内的时间段。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤a)进行在4至25小时范围内的时间段。
13.根据权利要求1的方法，其中所述方法在室温下施行。
14.根据权利要求1的方法，其中所述抗体处于在0.5g/L至5g/L范围内的浓度。
15.根据权利要求1的方法，其中所述转化步骤在相伴的搅拌存在下施行。
16.根据权利要求15的方法，其中搅拌速率在100至1200rpm范围内。
17.根据权利要求1的方法，其包括下游纯化的进一步步骤。
18.根据权利要求17的方法，其中下游加工包括色谱法步骤。
19.根据权利要求1的方法，其中通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化的所述VH和VL为形成抗原结合位点的互补VH/VL对。
20.根据权利要求1的方法，其中所述VH和VL通过连接体直接地相连结。
21.根据权利要求20的方法，其中所述抗体选自dsscFv、Fab-2xdsscFv、Fab-dsscFv-dsFv、Fab-dsscFv-sdAb、Fab-dsscFv-scFv和Fab-dsscFv。
22.根据权利要求1的方法，其中每个VH和VL包含通过第二抗体间接地将所述VH和VL相连结的连接体。
23.根据权利要求22的方法，其中所述抗体为Fab-dsFv。
24.根据权利要求1的方法，其中所述抗体为结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其包含：
重链，其从N-末端开始依次包含第一重链可变结构域(VH1)、CH1结构域和第二重链可变结构域(VH2)；
轻链，其从N-末端开始依次包含第一轻链可变结构域(VL1)、CL结构域和第二轻链可变结构域(VL2)，
其中所述重链和轻链是经对齐的，从而VH1和VL1形成第一抗原结合位点并且VH2和VL2形成第二抗原结合位点，
其中被所述第一抗原结合位点所结合的抗原为人OX40，和被所述第二抗原结合位点所结合的抗原为人血清白蛋白。
25.根据权利要求24的方法，其中所述重链的所述第一可变结构域(VH1)包含在SEQ IDNO:1中给出的CDR-H1序列、在SEQ ID NO:2中给出的CDR-H2序列和在SEQ ID NO:3中给出的CDR-H3序列，并且所述轻链的所述第一可变结构域(VL1)包含在SEQ ID NO:4中给出的CDR-L1序列、在SEQ ID NO:5中给出的CDR-L2序列和在SEQ ID NO:6中给出的CDR-L3序列，
其中所述第二重链可变结构域(VH2)具有在SEQ ID NO:11中给出的序列，且所述第二轻链可变结构域(VL2)具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，并且
所述第二重链可变结构域(VH2)和所述第二轻链可变结构域(VL2)通过二硫键相连接。
26.包含还原剂以及选自尿素和盐酸胍的变性剂的组合物，其用于将抗体分子的多聚体种类转化成单体，其中所述抗体分子包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv，其包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化，其中所述还原剂为包含单个硫羟基团的硫羟基还原性试剂并且处于10至150mM的浓度，并且其中所述尿素处于1至5M的浓度，或者所述盐酸胍处于1至2M的浓度。
27.根据权利要求26的组合物，其中尿素处于3至5M的浓度，和所述还原剂处于80至150mM的浓度。
28.根据权利要求26或27的组合物，其中所述还原剂为2-巯基乙胺。
29.包含还原剂以及选自尿素和盐酸胍的变性剂的组合物用于将抗体分子的多聚体种类转化成单体的用途，所述抗体分子包含至少一个具有对于目的抗原的特异性的Fv，其包含一个VH和一个VL，其中所述VH和VL通过一个或多个连接体直接地或间接地相连结并且通过它们之间的二硫键来稳定化，其中所述还原剂为包含单个硫羟基团的硫羟基还原性试剂并且处于10至150mM的浓度，并且其中所述尿素处于1至5M的浓度，或者所述盐酸胍处于1至2M的浓度。
30.根据权利要求29的用途，其中所述还原剂为2-巯基乙胺。
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