CN105026431B - 单接头FabFv抗体和制备其的方法 - Google Patents

单接头FabFv抗体和制备其的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105026431B
CN105026431B CN201380072293.8A CN201380072293A CN105026431B CN 105026431 B CN105026431 B CN 105026431B CN 201380072293 A CN201380072293 A CN 201380072293A CN 105026431 B CN105026431 B CN 105026431B
Authority
CN
China
Prior art keywords
variable domain
seq
domain
sequence
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380072293.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105026431A (zh
Inventor
E·达弗
S·P·海伍德
D·P·汉弗莱斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCB Biopharma SRL
Original Assignee
UCB Biopharma SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UCB Biopharma SRL filed Critical UCB Biopharma SRL
Publication of CN105026431A publication Critical patent/CN105026431A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105026431B publication Critical patent/CN105026431B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

本公开内容涉及多特异性抗体分子，其包含以下三种多肽或由所述多肽组成：a)式(I)的多肽链：(Vxx)nVx‑Cx‑X‑V1；和b)式(II)的多肽链：(Vyy)nVy‑Cyc)式(III)的多肽：V2其中Vx表示可变结构域，Vxx表示可变结构域，Cx表示恒定区，X表示接头，V1表示可变结构域，Vy表示可变结构域，Vyy表示可变结构域，Cy表示恒定区，V2表示可变结构域，n独立地表示0或1，其中式(I)的多肽链和式(II)的多肽链对齐以使得恒定区Cx和Cy进行配对以及可变结构域Vx和Vy进行配对以形成结合结构域，并且任选二硫键存在于V1和V2之间，特别是当存在二硫键时。

Description

单接头FabFv抗体和制备其的方法
本公开内容涉及某些多特异性构建体、包含所述构建体的药物制剂、编码所述构建体的DNA和包含所述DNA的载体。本公开内容还延伸至例如在宿主细胞中表达所述构建体的方法，以及将所述构建体配制为药物组合物的方法。本公开内容还涉及所述构建体和制剂在治疗中的用途。
WO2009/040562和WO2010/035012公开了某些可用作治疗剂的双特异性分子，分别被称作为Fab-Fv或Fab-dsFv。这种类型的分子具有针对其特异于的抗原的良好的结合亲和力，并且在该形式中不会出现抗原结合位点的显著闭塞。尽管高百分比的这些抗体分子被表达为功能性单体，但有一部分发生聚集并且需要从其纯化所述单体。
本发明人已重新工程改造了相关分子以提供具有等同功能性的分子，同时最小化在表达阶段的聚集，从而显著提高单体的产率。
在一个实施方案中，提供了包含以下三种多肽或由所述多肽组成的多特异性抗体分子：
a)式(I)的多肽链：
(Vxx)nVx-Cx-X-V1；和
b)式(II)的多肽链：
(Vyy)nVy-Cy
c)式(III)的多肽：
V2
其中
Vx表示可变结构域，
Vxx表示可变结构域，
Cx表示恒定区结构域，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
Vy表示可变结构域，
Vyy表示可变结构域，
Cy表示恒定区结构域，
V2表示可变结构域，
n独立地表示0或1，
其中式(I)的多肽链和式(II)的多肽链对齐以使得恒定区Cx和Cy进行配对以及可变结构域Vx和Vy进行配对以形成结合结构域，并且任选二硫键存在于V1和V2之间，特别是当存在二硫键时。
在一个实施方案中，Vxx和Vyy也进行配对以形成结合结构域。
在一个实施方案中，二硫键存在于V1和V2之间。
在一个实施方案中，提供了包含以下三种多肽或由所述多肽组成的双特异性抗体分子：
a)式(Ia)的重链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(IIa)的轻链：
VL-CL
c)式(III)的多肽：
V2
其中
VH表示重链可变结构域，
CH1表示重链恒定区的结构域1，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
VL表示轻链可变结构域，
CL表示来自轻链的恒定区，
V2表示可变结构域，
其中任选二硫键存在于V1和V2之间，特别是当存在二硫键时。
在一个实施方案中，提供了包含以下三种多肽或由所述多肽组成的双特异性抗体分子：
a)式(Ib)的重链：
VH-CH1；和
b)式(IIb)的轻链：
VL-CL-X-V2
c)式(III)的多肽：
V1
其中
VH表示重链可变结构域，
CH1表示重链恒定区的结构域1，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
VL表示轻链可变结构域，
CL表示来自轻链的恒定区，
V2表示可变结构域，
其中任选二硫键存在于V1和V2之间，特别是当存在二硫键时。
在一个实施方案中，二硫键存在V1和V2之间。
有利的是，本发明的构建体最小化在表达期间发生的聚集的量并且最大化所获得的单体的量，例如，单体可以是表达的蛋白的50％、60％、70％或75％或更多例如80或90％或更多。
附图简述
图1显示根据本发明的单接头Fab-Fv构建体和对比构建体Fabdsscfv和FabdsFv的不同序列。
图2显示各种构建体的SDS-PAGE分析。
图3显示各种构建体的尺寸排阻分析。
图4显示根据本公开内容的各种示例构建体的图示。
图5显示在CHO细胞中从三基因质粒表达的单接头Fab-dsFv的瞬时表达。
图6显示从三基因质粒表达的各种单接头Fab-dsFv的SDS-PAGE分析。
图7显示从三基因质粒表达的单接头Fab-dsFv的尺寸排阻分析。
发明详述
本文中使用的多特异性抗体是指如本文所述的具有两个或更多个结合结构域例如两个或三个结合结构域的抗体分子。在一个实施方案中，构建体是三特异性抗体。本文中使用的三特异性分子是指具有三个抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点可以独立地结合相同或不同的抗原。
在一个实施方案中，构建体是双特异性抗体。本文中使用的双特异性分子是指具有两个抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点可以结合相同或不同的抗原。
在一个实施方案中，结构域均结合相同的抗原，包括结合抗原上的相同表位或结合抗原上的不同表位。
在一个实施方案中，存在三个结合结构域并且所述三个结合结构域各自结合不同的(有区别的)抗原。
在一个实施方案中，存在三个结合结构域并且两个结合结构域结合相同的抗原，包括结合相同抗原上的相同表位或不同表位，并且第三结合结构域结合不同的(有区别的)抗原。
在一个实施方案中，本公开内容涉及包含三种多肽链或由所述多肽链组成的双特异性抗体。
根据本公开内容的多特异性分子被提供为下列重链和轻链的二聚体：
分别式(I)和(II)，其中Vx-Cx部分与Vy-Cy部分一起形成功能性Fab或Fab'片段，或可选择地
式(Ia)和(IIa)，其中VH-CH1部分与VL-CL部分一起形成功能性Fab或Fab'片段。
在一个实施方案中，本公开内容的构建体仅具有两个抗原结合位点。
本文中使用的抗原结合位点是指分子的一部分，其包括与靶抗原特异性相互作用的可变区对，特别是同源对。
如本文所用的“特异性”意指仅识别其特异于的抗原的结合位点，或相较于针对其非特异于的抗原的亲和力具有显著更高的针对其特异于的抗原的结合亲和力(例如5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力)的结合位点。
结合亲和力可通过标准测定法来测定，例如表面等离子体共振，如BIAcore。
在一个实施方案中，一个或多个天然的或工程改造的链间(即轻链和重链之间)二硫键存在于功能性Fab或Fab'片段中。
在一个实施方案中，“天然”二硫键存在于式(I)和(II)的多肽链中的CH1和CL或对应的组分Cx和Cy之间。下文对CH1的引用可同样适用于Cx。下文对CL的引用可同样适用于Cy。
当CL结构域来源于κ或λ时，键形成半胱氨酸的天然位置是人cκ和cλ中的214(Kabat编号第4版1987)。
二硫键形成半胱氨酸在CH1中的确切位置取决于实际所使用的具体结构域。因此，例如在人γ-1中，二硫键的天然位置位于位置233(Kabat编号第4版1987)。其它人同种型例如γ2、3、4、IgM和IgD的键形成半胱氨酸的位置是已知的，例如人IgM、IgE、IgG2、IgG3、IgG4的位置127，和人IgD和IgA2B的重链的位置128。
分子恒定区中的二硫键可以是除可变结构域对V1和V2之间的任选二硫键之外的。
在一个实施方案中，根据本公开内容的多特异性抗体具有的二硫键所处的位置等同于或对应于CH1和CL之间天然存在的位置。
在一个实施方案中，包括CH1的恒定区和恒定区例如CL具有非天然存在的位置处的二硫键。这可通过在所需位置将半胱氨酸引入氨基酸链来工程改造至分子中。这种非天然二硫键附加于或替代CH1和CL之间存在的天然二硫键。
可以使用本领域中已知的任何方法进行工程改造的半胱氨酸的引入。这些方法包括但不限于，PCR延伸重叠诱变，定点诱变或盒式诱变(参见，一般地，Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989；Ausbel等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。定点诱变试剂盒可商购获得，例如Quik
Figure BDA0000774787070000061
定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)。盒式诱变可以基于Wells等人,1985,Gene,34:315-323中所描述的来进行。可选择地，突变体可以通过全基因合成通过退火、连接和PCR扩增以及重叠寡核苷酸的克隆来制备。
在一个实施方案中，CH1和CL之间的二硫键完全不存在，例如链间半胱氨酸可以由另一种氨基酸例如丝氨酸取代。因此，在分子的功能性Fab片段中不存在链间二硫键。公开内容如WO2005/003170(通过引用并入本文)描述了如何在不存在链间二硫键的情况下提供Fab片段。
在一个实施方案中，式(I)的多肽链中的n为1。
在一个实施方案中，式(II)的多肽链中的n为1。
在一个实施方案中，式(I)和(II)的多肽链中的n为1。
在一个实施方案中，式(I)和(II)的多肽链中的n为0。
Vxx可以源自重链可变区、轻链可变区或其组合并且可以包括1至20个氨基酸的氨基酸接头，例如如下文所述的。在一个实施方案中，Vxx由可变区，特别是来源于重链的可变区组成。在一个实施方案中，Vxx表示轻链可变结构域。在一个实施方案中，Vxx是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，Vxx是人源化的。
Vx可以源自重链可变区、轻链可变区或其组合，特别是来源于重链的可变区。在一个实施方案中，Vx表示轻链可变结构域。在一个实施方案中，Vx是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，Vx是人源化的。
式(I)的多肽中的Vx对应于多肽链(Ia)中的VH。
VH表示可变结构域，例如重链可变结构域。在一个实施方案中，VH表示重链可变结构域。在一个实施方案中，VH是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，VH是人源化的。
V1表示可变结构域，例如重链或轻链可变结构域。在一个实施方案中，V1表示重链可变结构域。在一个实施方案中，V1表示轻链可变结构域。在一个实施方案中，V1是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，V1是人源化的。
Vyy可以源自重链、轻链或其组合并且可以包括1至20个氨基酸的氨基酸接头，例如如下文所述的。在一个实施方案中，Vyy由可变区，特别是来源于轻链的可变区组成。在一个实施方案中，Vyy表示重链可变结构域。在一个实施方案中，Vyy是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，Vyy是人源化的。
Vy可以源自重链可变区、轻链可变区或其组合，特别是来源于轻链的可变区。在一个实施方案中，Vy表示重链可变结构域。在一个实施方案中，Vy是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，Vy是人源化的。
式(II)的多肽中的Vy对应于式(IIa)的多肽中的VL。
VL表示可变结构域，例如轻链可变结构域。在一个实施方案中，VL表示轻链可变结构域。在一个实施方案中，VL是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，VL是人源化的。
V2表示可变结构域，例如重链或轻链可变结构域。在一个实施方案中，V2表示轻链可变结构域。在一个实施方案中，V2表示重链可变结构域。在一个实施方案中，V2是嵌合可变结构域，也就是说，其包含来源于至少两个物种的组分，例如人框架和非人CDR。在一个实施方案中，V2是人源化的。
通常Vxx和Vyy一起形成抗原结合结构域。在一个实施方案中，Vxx和Vyy一起表示同源对。
通常Vx和Vy一起形成抗原结合结构域。在一个实施方案中，Vx和Vy一起表示同源对。
在一个实施方案中，由VH和VL形成的结合结构域特异于第一抗原。
在一个实施方案中，VH和VL形成同源对。
通常V1和V2一起形成抗原结合结构域。在一个实施方案中，V1和V2一起表示同源对。
在一个实施方案中V1和V2一起形成特异于第一抗原的抗原结合结构域(即分子中的两个结合结构域可以特异于同一抗原，例如结合其中的相同或不同表位)。
在一个实施方案中，V1和V2一起成为人血清白蛋白的结合结构域。
在一个实施方案中，V1和V2一起形成特异于第二抗原的抗原结合结构域(即分子中的两个结合结构域特异于不同抗原)。
在一个实施方案中，V1和V2之间的二硫键是在下面列出的残基的两个之间的(除非上下文另有所指，否则在下面的列表中采用Kabat编号)。只要提及Kabat编号，则相关的参考资料是Kabat等人,1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA。在一个实施方案中，二硫键在选自包括下列的组的位置处：
·VH37+VL95C参见例如Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH44+VL100参见例如Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等人(1994)；或Journal of Biological Chemistry Vol.269 No.28pp.18327-18331 Reiter等人(1994)；或Protein Engineering,vol.10no.12pp.1453-1459 Rajagopal等人(1997)；
·VH44+VL105参见例如J Biochem.118,825-831 Luo等人(1995)；
·VH45+VL87参见例如Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH55+VL101参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)；
·VH100+VL50参见例如Biochemistry 29 1362-1367Glockshuber等人(1990)；
·VH100b+VL49；
·VH98+VL46参见例如Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH101+VL46；
·VH105+VL43参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.90pp.7538-7542Brinkmann等人(1993)；或Proteins 19,35-47 Jung等人(1994)；
·VH106+VL57参见例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)
以及位于分子中的可变区对的与其对应的位置处。
上面列出的氨基酸对位于有利于用半胱氨酸进行取代的位置处以使得可形成二硫键。半胱氨酸可通过已知的技术来工程改造至这些期望的位置中。因此，在一个实施方案中，根据本发明的工程改造的半胱氨酸是指其中给定氨基酸位置处的天然存在的残基已被半胱氨酸残基取代。
可以使用本领域中已知的任何方法进行工程改造的半胱氨酸的引入。这些方法包括但不限于，PCR延伸重叠诱变，定点诱变或盒式诱变(参见，一般地，Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989；Ausbel等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。定点诱变试剂盒可商购获得，例如Quik
Figure BDA0000774787070000101
定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)。盒式诱变可以基于Wells等人,1985,Gene,34:315-323中所描述的来进行。可选择地，突变体可以通过全基因合成通过退火、连接和PCR扩增以及重叠寡核苷酸的克隆来制备。
因此，在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(V1/V2)可以通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1中且一个在V2中，其中所述半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VHl00b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(V1/V2)可以通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1中且一个在V2中，其在CDR之外，其中所述半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。
在一个实施方案中，V1是重链可变结构域并且V2是轻链可变结构域，并且V1和V2通过两个工程改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1的位置VH44处并且另一个在V2的VL100处。
在一个实施方案中，VH和V1是均来自重链或轻链的可变区，特别是均来源于两个不同的重链可变区。
在一个实施方案中，VL和V2是均来自重链或轻链的可变区，特别是均来源于两个不同的轻链可变区。
本文所用的“同源对”是指来自单一抗体的可变结构域对，其是在体内产生的，即从宿主中分离的天然存在的可变结构域配对。因此，同源对是VH和VL对。在一个实例中，同源对协作地结合抗原。
本文所用的“可变区”是指抗体链中包含CDR和合适的框架的区域。
用于本公开内容的可变区通常将来源于抗体，其可以通过本领域已知的任何方法产生。
本文所用的“来源于”是指这样的事实：所采用的序列或与所采用的序列高度相似的序列获自原始的遗传材料，例如抗体的轻链或重链。
本文所用的“高度相似”意欲指在其全长上具有95％或更高的相似度例如96、97、98或99％相似度的氨基酸序列。
针对抗原多肽产生的抗体可以通过将所述多肽施用至动物(当动物的免疫是必要的时)，优选非人动物，使用公知且常规的方案(参见例如Handbook of ExperimentalImmunology,D.M.Weir(ed.),Vol4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)来获得。可对许多温血动物例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪进行免疫。然而，小鼠、兔、猪和大鼠一般是最合适的。
单克隆抗体可以通过本领域中已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)。
抗体还可以使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达从选择用于产生特异性抗体的单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA，通过例如Babcook,J.等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377中描述的方法来产生。
用于本发明的抗体还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示法来产生并且包括由Brinkman等人(J.Immunol.Methods,1995,182:41-50)、Ames等人(J.Immunol.Methods,1995,184:177-186)、Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958)、Persic等人(Gene,19971879-18)、Burton等人(Advances in Immunology,1994,57:191-280)和WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；5,969,108和WO20011/30305中公开的方法。
在一个实施方案中，根据本公开内容的双特异性分子是人源化的。
本文所用的“人源化”(包括CDR移植抗体)是指具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的分子(参见，例如US 5,585,089；WO91/09967)。将理解可仅需要转移CDR的特异性决定残基而不是整个CDR(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选地还包含来源于CDR所来源于的非人物种的一个或多个框架残基。
如本文所用，术语“人源化抗体分子”是指其中重链和/或轻链含有移植至受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架的来自供体抗体(例如，鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(包括，如果需要的话，一个或多个修饰的CDR)的抗体分子。关于综述，参见Vaughan等人,Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不转移整个CDR，而是只将来自本文中上述CDR任一个的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自本文中上述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自本文中上述的每一个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。
当移植CDR或特异性决定残基时，可关于CDR所来源于的供体抗体的种类/类型使用任何适当的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体框架区以及本文提供的一个或多个CDR的可变结构域。
可用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链以及EU、LAY和POM可用于重链和轻链。可选择地，可使用人种系序列；这些可获自：http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/。
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于同一抗体并且如果需要的话，可包括具有来源于不同链的框架区的复合链。
框架区不需要具有与受体抗体的框架区完全相同的序列。例如，不常见的残基可以被改变成对于该受体链种类或类型更频繁出现的残基。或者，受体框架区中所选择的残基可被改变以使得它们对应于在供体抗体中相同位置处发现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应保持在恢复供体抗体的亲和力所需的最低程度。用于选择受体框架区中可能需要被改变的残基的方案示于WO91/09967中。
在一个实施方案中，本公开内容的双特异性抗体是完全人的，特别是一个或多个可变结构域是完全人的。
完全人的分子是其中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)均是人来源的或与人来源的序列基本上相同并且不一定来自同一抗体的分子。完全人抗体的实例可包括例如通过上述噬菌体展示法产生的抗体，以及通过其中鼠免疫球蛋白可变区和任选恒定区基因已被其人对应物取代的小鼠产生的抗体，例如如在EP0546073B1、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474和EP0463151中一般性描述的。
Cx是来自轻链或重链特别是重链的恒定结构域。
式(I)的多肽中的Cx对应于式(Ia)的多肽中的CH1。在一个实施方案中，Cx相当于CH1。
在一个实施方案中，CH1结构域是来自重链的天然存在的结构域1或其衍生物。在一个实施方案中，CH片段由CH1结构域组成。
Cy是来自轻链或重链特别是轻链的恒定结构域。
式(II)的多肽中的Cy对应于式(IIa)的多肽中的CL。在一个实施方案中，Cy相当于CL。
在一个实施方案中，轻链中的CL片段是恒定κ序列或恒定λ序列或其衍生物。
本文所用的天然存在的结构域的衍生物意欲指其中天然存在的序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸已被取代或删除，例如以优化结构域的性质，例如通过消除非期望的性质但其中保留结构域的表征特性。
在一个实施方案中，X是接头，例如适合用于连接CH1和V1部分的肽。
在一个实施方案中，X是接头，例如适合用于连接CL和V2部分的肽。
在一个实施方案中，肽接头的长度为50个氨基酸或更短，例如20个氨基酸或更短。
在一个实施方案中，接头选自序列13至77所示的序列。
在一个实施方案中，接头选自SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:104所示的序列。
表1：铰链接头序列
SEQ ID NO: 序列
13 DKTHTCAA
14 DKTHTCPPCPA
15 DKTHTCPPCPATCPPCPA
16 DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
17 DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
18 DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
19 DKTHTCCVECPPCPA
20 DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
21 DKTHTCPSCPA
表2：柔性接头序列
Figure BDA0000774787070000151
Figure BDA0000774787070000161
序列24至28中的(S)是任选的。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO：62)，PPPP(SEQ ID NO：63)和PPP。
在一个实施方案中，肽接头是白蛋白结合肽。
白蛋白结合肽的实例提供于WO2007/106120中并且包括：
表3
SEQ ID NO: 序列
64 DLCLRDWGCLW
65 DICLPRWGCLW
66 MEDICLPRWGCLWGD
67 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
68 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
69 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
70 EDICLPRWGCLWEDD
71 RLMEDICLPRWGCLWEDD
72 MEDICLPRWGCLWEDD
73 MEDICLPRWGCLWED
74 RLMEDICLARWGCLWEDD
75 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
76 RAPESFVCYWETICFERSEQ
77 EMCYFPGICWM
有利地，使用白蛋白结合肽作为接头可以增加双特异性抗体分子的半衰期。
为避免疑义，V2仍然存在于抗体分子中，并且借助于与V1配对而保留在其中，包括当二硫键存在于V1和V2之间时。
在一个实施方案中，本公开内容的双特异性抗体分子能够选择性结合两种不同的目标抗原。
在一个实施方案中，与Vxx/Vyy、Vx/Vy、VH/VL和V1/V2结合的目标抗原独立地选自细胞相关蛋白，例如在细胞如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，以及可溶性蛋白。
目标抗原还可以是任何医学相关的蛋白例如在疾病或感染期间上调的蛋白，例如受体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘附分子，例如整联蛋白如β1整联蛋白，例如VLA-4、E-选择素、P-选择素或L-选择素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134(OX40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHC I类和MHC II类抗原和VEGF，以及在适当的情况下，其受体。
可溶性抗原包括白细胞介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17、IL-23，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE，干扰素如干扰素α、干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF，和血小板衍生的生长因子例如PDGF-α和PDGF-β以及在适当的情况下，其受体。其它抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒如流感、EBV、HepA、B和C，生物恐怖试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。
在一个实施方案中，可将本发明的抗体融合蛋白用于功能性改变目标抗原的活性。例如，抗体融合蛋白可直接地或间接地中和、拮抗或激动所述抗原的活性。
在一个实施方案中，与VH和VL结合的目标抗原是OX40。在一个实施方案中，多特异性抗体的Vx-Cx或VHCH1部分具有SEQ ID NO:3给出的序列。在一个实施方案中，多特异性抗体的Vy-Cy或VL-CL部分具有SEQ ID NO:7给出的序列。
在一个实施方案中，与VH/VL或V1/V2结合的目标抗原提供招募效应子功能的能力，例如补体途径激活和/或效应细胞招募。
效应子功能的招募可因效应子功能与细胞相关联而是直接的，所述细胞在其表面上具有招募分子。当根据本公开内容的分子中的结合结构域(例如V1/V2)与招募多肽的结合引起例如因子的释放(其进而可直接地或间接地招募效应子功能)时，可发生间接招募，或者间接招募可通过信号转导途径的激活发生。实例包括TNFα、IL-2、IL6、IL8、IL17、IFNγ、组胺、C1q、调理素以及经典的和替代的补体活化级联的其它成员，如C2、C4、C3-转化酶以及C5至C9。
如本文所用，“招募多肽”包括FcγR例如FcγRI、FcγRII和FcγRIII，补体途径蛋白例如但不限于C1q和C3，CD标志蛋白(分化群标志物)例如但不限于CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20和CD22。属于CD标志蛋白其它招募多肽包括CD1、CD1d、CD2、CD5、CD8、CD9、CD10、CD11、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD40、CD43、CD44、CD45、CD46、CD49、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62、D62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD66e、CD68、CD70、CD71、CD72、CD79、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD88、CD89、CD90、CD94、CD95、CD98、CD106、CD114、CD116、CD117、CD118、CD120、CD122、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD137、CD138、CD141、CD142、CD143、CD146、CD147、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD162、CD164、CD169、CD184、CD206、CD209、CD257、CD278、CD281、CD282、CD283和CD304，或者它们任一个的保留直接或间接地招募细胞介导的效应子功能的能力的片段。招募多肽还包括具有效应子功能的免疫球蛋白分子例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。
在一个实施方案中，根据本公开内容的分子中的结合结构域(例如V1/V2)具有针对补体途径蛋白的特异性，其中C1q是特别优选的。
此外，本发明的分子可借助于结合核素螯合蛋白的单结构域抗体用于螯合放射性核素。这样的融合蛋白可在成像或放射性核素靶向方法中用于治疗。
在一个实施方案中，根据本公开内容的分子中的一个结合结构域(例如V1/V2)具有针对CD标志蛋白的特异性，其中CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8CD45、CD16和CD35是特别优选的。
在一个实施方案中，根据本公开内容的分子中的结合结构域(例如V1/V2)具有针对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性，例如用于通过结合至所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1来给具有针对所述目标抗原的特异性的抗体片段提供延长的半衰期。
如本文所用，“血清载体蛋白”包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白、或其任一个的片段。
如本文所用，“循环免疫球蛋白分子”包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgM和IgD或其任一个的片段。
CD35/CR1是存在于具有36天半衰期(28至47天的正常范围；Lanaro等人，1971,Cancer,28(3):658-661)的红血细胞上的蛋白。
在一个实施方案中，V1/V2特异于的蛋白是血清载体蛋白，例如人血清载体。在最优选的实施方案中，血清载体蛋白是人血清白蛋白。
白蛋白结合可变区和CDR公开于图1中所示的构建体。
因此，在一个实施方案中，提供了包含以下三种多肽或由所述多肽组成的双特异性抗体分子：
a)式(Ia)的重链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(IIa)的轻链：
VL-CL
c)式(III)的多肽：
V2
其中
VH表示重链可变结构域，
CH1表示重链恒定区的结构域1，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
VL表示轻链可变结构域，
CL表示来自轻链的恒定区，
V2表示可变区，
其中VH和VL是对齐以形成结合结构域的可变区的同源对并且V1和V2是对齐以形成结合结构域任选其之间的二硫键的可变区的同源对，例如其中V1和V2能够体内结合白蛋白，特别是人血清白蛋白。
在一个实施方案中，V1或V2包括选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:86的序列。在一个实施方案中，V1具有SEQ ID NO:4给出的序列并且V2具有SEQID NO:8给出的序列。在一个实施方案中，V1具有SEQ ID NO:86给出的序列并且V2具有SEQID NO:83给出的序列。
在一个实例中，V1或V2(特别是V1)是包含SEQ ID NO:87给出的CDRH-1的序列、SEQID NO:88给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:89给出的CDRH-3的序列的VH结构域。在一个实例中，V1或V2(特别是V1)是包含SEQ ID NO:93给出的CDRH-1的序列、SEQ ID NO:94给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:95给出的CDRH-3的序列的VH结构域。
在一个实施方案中，V1或V2(特别是V2)是包含SEQ ID NO:90给出的CDRL-1的序列、SEQ ID NO:91给出的CDRL2的序列和SEQ ID NO:92给出的CDRL-3的序列的VL结构域。在一个实施方案中，V1或V2(特别是V2)是包含SEQ ID NO:96给出的CDRL-1的序列、SEQ IDNO:97给出的CDRL2的序列和SEQ ID NO:98给出的CDRL-3的序列的VL结构域。
在一个实例中，V1或V2(特别是V1)是包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:86、SEQ NO:99或SEQ ID NO:100给出的序列的VH结构域。
在一个实例中，V1或V2(特别是V2)是包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:83、SEQ NO:101或SEQ ID NO:102给出的序列的VL结构域。
在一个实例中，V1是包含SEQ NO:99给出的序列的VH结构域并且V2是包含SEQ NO:101给出的序列的VL结构域。
在一个实例中，V1是包含SEQ NO:100给出的序列的VH结构域并且V2是包含SEQNO:102给出的序列的VL结构域。
在一个实例中，多肽Ia具有SEQ ID NO:6给出的序列。
在一个实例中，多肽IIa具有SEQ ID NO:7给出的序列。
在一个实例中，多肽Ib具有SEQ ID NO:3给出的序列。
在一个实例中，多肽IIb具有SEQ ID NO:5给出的序列。
在一个实例中，多肽Ia具有SEQ ID NO:6给出的序列，多肽IIa具有SEQ ID NO:7给出的序列并且V2具有SEQ ID NO:8给出的序列。
在一个实例中，多肽Ib具有SEQ ID NO:3给出的序列，多肽IIb具有SEQ ID NO:5给出的序列并且V1具有SEQ ID NO:4给出的序列。
本发明还提供了与本文公开的序列或抗体具有80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似性的序列。
如本文所用，“同一性”表示在比对的序列中的任何特定位置上，氨基酸残基在序列之间是相同的。如本文所用，“相似性”表示在比对的序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以相互取代的其它氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸，精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
同一性和相似性的程度可以容易地计算(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991,BLASTTM软件可获自NCBI(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656,)。
在可选择的方面，本发明提供了连接至二硫键稳定的scFv的Fab或Fab'片段，其中所述二硫键稳定的scFv(dsscFv)直接地或经由接头例如本文中所描述的接头连接至Fab或Fab'片段的重链或轻链的C-末端。优选Fab-dsscFv融合蛋白是双特异性的。在一个实例中，dsscFv结合血清载体蛋白例如人血清白蛋白。在一个实例中，dsscFv通过SEQ ID NO:78给出的接头连接至Fab或Fab'片段的重链的C-末端。在一个实例中，dsscFv通过SEQ ID NO:103给出的接头连接至Fab或Fab'片段的轻链的C-末端。在一个实例中，Fab-dsscFv的重链具有SEQ ID NO:9给出的序列并且和轻链具有SEQ ID NO:10给出的序列。在一个实例中，Fab-dsscFv的重链具有SEQ ID NO:11给出的序列并且轻链具有SEQ ID NO:12给出的序列。
在一个实施方案中，本公开内容的双特异性抗体分子被加工以提供针对靶抗原的改善的亲和力。这样的变体可以通过许多亲和力成熟方案来获得，包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)，链改组(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)，使用大肠杆菌的增变株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)，DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)，噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)讨论了这些亲和力成熟方法。
如在此上下文中使用的“改善的亲和力”是指相对于起始分子的改善。
如果需要，用于本发明的抗体可缀合至一种或多种效应分子。将理解效应分子可以包括单个效应分子或连接起来以形成可附着至本发明的抗体的单个部分的两个或更多个这样的分子。当期望获得连接至效应分子的抗体片段时，这可以通过其中抗体片段直接或经由偶联剂连接至效应分子的标准化学或重组DNA方法来制备。用于将这样的效应分子缀合至抗体的技术是本领域熟知的(参见，Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery,2nd Ed.,Robinson et al.,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括例如，描述于WO 93/06231,WO 92/22583,WO 89/00195,WO 89/01476和WO03031581中的那些。可选择地，当效应分子是蛋白质或多肽时，连接可使用重组DNA方法来实现，例如如WO 86/01533和EP0392745中所描述的。
本文所用的术语“效应分子”包括例如，生物活性蛋白例如酶，其它的抗体或抗体片段，合成的或天然存在的聚合物，核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核素特别是放射性碘化物、放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒以及报告基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱来检测的化合物。
其它效应分子可包括螯合的放射性核素例如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或者药物，例如但不限于，烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。
其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于，蛋白水解酶，水解酶，裂解酶，异构酶，转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于，免疫球蛋白，毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织纤维蛋白溶酶原激活物，血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素或内皮抑素，或者，生物反应调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。
其它效应分子可包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性核素，正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)，以及非放射性顺磁金属离子。对于可缀合至抗体用作诊断剂的金属离子，通常参见美国专利No.4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括125I,131I,111In和99Tc。
在另一实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。这种类型的合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如在WO05/117984中所述的那些。
当效应分子是聚合物时，其可通常是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或分支或不分支的多糖例如同或杂-多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包括乳糖，直链淀粉，葡聚糖，糖原或其衍生物。如本文所用的“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应基团如马来酰亚胺等。反应基团可以直接地或通过接头区段连接至聚合物。将理解，这样的基团的残基将在一些情况下作为抗体片段与聚合物之间的连接基团而形成产物的部分。聚合物的大小可根据需要而不同，但通常将在从500Da至50000Da，例如从5000至40000Da例如从20000至40000Da的平均分子量范围内。聚合物大小可具体地基于产物的预期用途例如定位至某些组织如肿瘤或延长循环半衰期的能力来进行选择(关于综述参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当产物旨在离开循环并穿透组织，例如用于肿瘤的治疗时，可有利地使用小分子量聚合物，例如具有约5000Da的分子量。对于其中产物保留在循环中的应用，可有利地使用较高分子量的聚合物，例如具有从20000Da至40000Da的范围内的分子量。
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别地具有约15000Da至约40000Da范围内的分子量。
在一个实例中，用于本发明的抗体附着至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体的实例中，抗体是抗体片段并且可通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基来附着PEG分子。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中，或者可使用重组DNA方法被工程改造至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971,WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是经修饰的Fab片段，其中所述修饰是一个或多个氨基酸至其重链的C-末端的添加以允许效应分子的附着。适当地，所述额外的氨基酸形成含有一个或多个效应分子可附着于的半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。可将多个位点用于连接两个或多个PEG分子。
合适的PEG分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基进行共价连接。附着至经修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于该片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键通常将是二硫键或，特别是硫-碳键。当巯基被用作连接点时，可使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可在如上所述的聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可以是含有巯基反应基团(例如α-卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺，酰亚胺例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物)的任何聚合物。这样的起始材料可商购获得(例如，从Nektar，前身是ShearwaterPolymers Inc.,Huntsville,AL,USA)，或者可以用常规的化学方法从商购可得的起始材料制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar，其前身是Shearwater；RappPolymere；以及SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar，其前身是Shearwater)。
在一个实施方案中，分子中的Fab或Fab'是PEG化的，即具有共价附着至其的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP1090037中公开的方法(还参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications",1997,J.Milton Harris and S.Zalipsky(eds),AmericanChemical Society,Washington DC和"Bioconjugation Protein Coupling Techniquesfor the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam and A.Dent,Grove Publishers,NewYork；Chapman,A.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 2002,54:531-545)。在一个实例中，PEG附着至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至经修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可被共价连接至马来酰亚胺基团并且赖氨酸残基上的每个胺基可附着具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此附着至Fab片段的PEG的总分子量可以是大约40,000Da。
具体的PEG分子包括Ν,Ν'-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺，也称为PEG2MAL40K(可获自Nektar，其前身是Shearwater)。
PEG接头的替代来源包括NOF，其供给GL2-400MA2(其中在下述结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)并且n是约450：
Figure BDA0000774787070000281
m是2或5
也就是说每个PEG为约20,000Da。
其它可选择的PEG效应分子为以下类型：
Figure BDA0000774787070000282
其可获自Dr Reddy、NOF和Jenkem
在一个实施方案中，提供了PEG化的(例如用本文所述的PEG)抗体，通过在或大致在链中氨基酸226例如重链的氨基酸226(通过连续编号)处的半胱氨酸氨基酸残基进行附着。
在一个实施方案中，提供了编码本公开内容的分子的多核苷酸序列，例如DNA序列。
在一个实施方案中，提供了编码本公开内容的分子的一个或多个例如两个或多个多肽组分的多核苷酸序列，例如
式(I)的多肽链：
(Vxx)nVx-Cx-X-V1
式(II)的多肽链：
(Vyy)nVy-Cy
或式(III)的多肽：
V2
其中
Vx表示可变结构域，
Vxx表示可变结构域，
Cx表示恒定区结构域，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
Vy表示可变结构域，
Vyy表示可变结构域，
Cy表示恒定区结构域，
V2表示可变结构域，
n独立地表示0或1。
在一个实施方案中，多核苷酸例如DNA包含在载体中。
可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员所熟知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York和Cold Spring Harbor Publishing生产的ManiatisManual。
还提供了包含含有编码本发明的抗体的一种或多种DNA序列的一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌例如大肠杆菌以及其它微生物系统或者还可使用真核例如哺乳动物的宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，包括在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。
为了产生包含重链和轻链的产物，可用两种载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽以及第二载体编码重链多肽。可选择地，可以使用单一载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。在一个实例中，可用三种载体转染细胞系，所述载体各自编码本发明的抗体分子的多肽链。在一个实例中，用三种载体转染细胞系，所述载体的每一个编码选自以下的不同多肽：
a)式(I)的多肽链：
(Vxx)nVx-Cx-X-V1；
b)式(II)的多肽链：
(Vyy)nVy-Cy
和c)式(III)的多肽：
V2
其中
Vx表示可变结构域，
Vxx表示可变结构域，
Cx表示恒定区结构域，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
Vy表示可变结构域，
Vyy表示可变结构域，
Cy表示恒定区结构域，
V2表示可变结构域，
n独立地表示0或1，
将理解转染至宿主细胞中的每种载体的比例可以变化以优化多特异性抗体产物的表达。在一个实施方案中，载体的比例为1:1:1。将理解本领域技术人员能够通过转染后蛋白表达水平的常规测试来确定最佳比例。
还将理解当两个或更多个，特别是三个或更多个的多肽组分由单一载体中的多核苷酸编码时，每种多肽组分的相对表达可以通过利用编码本发明的多肽成分的各多核苷酸的不同启动子而不同。
在一个实施方案中，载体包含在单个启动子的控制下编码本发明的多特异性抗体分子的所有三种多肽链的单一多核苷酸序列。
在一个实施方案中，载体包含编码本发明的多特异性抗体分子的所有三种多肽链的单一多核苷酸序列，其中编码各多肽链的各多核苷酸序列在不同的启动子的控制之下。
根据本公开内容的抗体和片段以良好的水平从宿主细胞表达。因此，抗体和/或片段的性质似乎是优化的并有利于商业加工。
本发明的抗体可用于病理状况的治疗和/或预防。
本发明还提供了包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子的药物或诊断组合物。因此，提供了本发明的抗体用于治疗和用于制备药剂的用途。
通常将提供组合物作为通常会包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，包括将本发明的抗体分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加和混合。
抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴随其它活性成分包括其它的抗体成分，例如抗-TNF、抗-IL-Ιβ、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体，或非抗体的成分例如黄嘌呤。其它合适的活性成分包括能够诱导耐受的抗体，例如抗-CD3或抗-CD4抗体。
在其它实施方案中，将根据本公开内容的抗体、片段或组合物与其它药物活性剂例如皮质类固醇(如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(例如沙丁胺醇，沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(如雷帕霉素，环磷酰胺，甲氨蝶呤)或可选择地CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是特异于靶的抗体。
药物组合物适当地包括治疗有效量的本发明的抗体。如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防目标疾病或病况，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，治疗有效量可最初在细胞培养测定中或在动物模型通常为啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中进行评估。动物模型还可用来确定施用的适当浓度范围和途径。这样的信息随后可用于确定在人类中施用的有用剂量和途径。
用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重性，受试者的一般健康，受试者的年龄、体重和性别，饮食，施用的时间和频率，药物组合物，反应敏感性以及对治疗的耐受性/反应性。这个量可以通过常规实验确定并在临床医师的判断范围内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。可选择地，剂量可以是1至500mg/天例如10至100、200、300或400mg/天。药物组合物可方便地提供于含有预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式中。
组合物可以单独地施用给患者或可以与其它试剂、药物或激素组合施用(例如同时，相继或分开)。
施用本发明的抗体分子的剂量取决于待治疗的病症的性质，炎症存在的程度，以及取决于抗体分子是预防性地使用还是用于治疗的现有病况。
给药频率将取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短半衰期(例如，2至10小时)，可能有必要给予每天一次或更多次剂量。可选地，如果抗体分子具有长半衰期(例如2至15天)，可能只需要给予每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次的剂量。
药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受该组合物的个体有害的抗体的产生并且不应具有毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的高分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中药学上可接受的载体还可包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助性物质例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质可存在于此类组合物中。这样的载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆剂和悬浮液，用于由患者摄取。
合适的施用形式包括适于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速浓注或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可采取于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并可含有配制剂例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，抗体分子可以是干燥形式，用于在使用之前与适当的无菌液体重建。
经配制后，本发明的组合物可以直接施用给受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，可使组合物适合于施用给人受试者。
在一个实施方案中，在根据本公开内容的制剂中，最终制剂的pH不相似于抗体或片段的等电点值，因为如果所述制剂的pH为7，那么8-9或之上的pI可以是合适的。虽然不希望受理论的限制，但据信这可能最后提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留在溶液中。
本发明的药物组合物可通过任何数量的途径进行施用，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无痛皮下喷射器(hypospray)也可用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备成可注射物，如液体溶液或悬浮液。还可制备适合于在注射之前溶于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。优选皮下、通过吸入或局部施用本发明的抗体分子。
组合物的直接递送通常将通过注射皮下地、腹膜内、静脉内或肌肉内地或递送至组织的细胞间隙来实现。还可将组合物施用至感兴趣的特定组织。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
将理解组合物中的活性成分将是抗体分子。因此，其将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物将通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解但当其被胃肠道吸收后释放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的详尽讨论可见于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
在一个实施方案中，制剂被提供为用于局部施用(包括吸入)的制剂。
合适的可吸入的制剂包括可吸入粉剂，含有气体推进剂的计量气雾剂或不含气体推进剂的可吸入溶液(例如可喷雾溶液或悬浮液)。根据本公开内容的含有活性物质的可吸入粉剂可仅由上述活性物质或由上述活性物质与生理上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖，蔗糖，麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)，多元醇(例如山梨醇，甘露醇，木糖醇)，盐(例如氯化钠，碳酸钙)或这些彼此的混合物。适宜使用单糖或二糖，特别地但不排他地以其水合物的形式使用乳糖或葡萄糖。
用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米例如1-9微米，例如0.1至5μm，特别是1至5μm的粒度。活性物(例如抗体或片段)的粒度具有首要的重要性。
可用于制备可吸入气雾剂的气体推进剂是本领域已知的。合适的气体推进剂选自烃类例如正丙烷、正丁烷或异丁烷以及卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化的衍生物。上述气体推进剂可以独自地或以其混合物使用。
特别合适的气体推进剂是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。
含气体推进剂的可吸入气雾剂还可含有其它成分如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活化剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的装置。所有这些成分是本领域已知的。
根据本发明的含气体推进剂的可吸入气雾剂可含有按重量计高达5％的活性物质。根据本发明的气雾剂含有例如按重量计0.002至5％，按重量计0.01至3％，按重量计0.015％至2％，按重量计0.1至2％，按重量计0.5至2％或按重量计0.5％至1％的活性物。
可选择地，至肺的局部施用还可以是通过液体溶液或悬浮液制剂的施用，例如采用装置诸如喷雾器，例如连接至压缩器的喷雾器(例如，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的连接至Pari Master(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)。
在一个实施方案中，制剂被提供为含有用于通过喷雾递送的单位剂量的分离的安瓿。
在一个实施方案中，抗体以冻干形式提供，用于重建或可选择地作为悬浮液制剂。
本发明的抗体可分散在溶剂中，例如以溶液或悬浮液的形式进行递送。所述抗体可悬浮于适当的生理溶液中，例如生理盐水、药学上可接受的溶剂或缓冲溶液。本领域中已知的缓冲溶液可含有每1ml水中0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg氯化钠、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸、以及0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以获得约4.0至5.0的pH。如前所述，悬浮液可从例如冻干抗体制备。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域熟知的，并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂，磷酸盐缓冲剂，乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以封装在脂质体或可生物降解的微球体中。制剂通常将采用无菌制造工艺以基本上无菌的形式来提供。
这可包括产生和过滤灭菌用于所述制剂的缓冲溶剂溶液，在无菌缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体，和通过本领域技术人员熟悉的方法将制剂分配到无菌容器中。
根据本公开内容的可喷雾制剂可以例如提供为包装在箔膜中的单个剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)。每个小瓶含有一定体积例如2ml的溶剂/溶液缓冲液中的单位剂量。
本公开内容的抗体被认为是适合于通过喷雾输送。还可预见的是，本发明的抗体可以通过使用基因疗法来施用。为了实现此，将在适当的DNA元件控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入到患者，以使得抗体链从所述DNA序列表达并在原位装配。
病理状况或病症可以例如选自感染(病毒，细菌，真菌和寄生物)，与感染相关的内毒素休克，关节炎如类风湿性关节炎，哮喘例如重度哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，盆腔炎，阿尔茨海默氏病，炎性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，阴茎纤维性海绵体炎，腹腔疾病，胆囊疾病，藏毛症，腹膜炎，银屑病，血管炎，手术粘连，中风，I型糖尿病，莱姆病，脑膜脑炎，自身免疫性葡萄膜炎，免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性疾病例如多发性硬化症、狼疮(如系统性红斑狼疮)和格-巴二氏综合征，特应性皮炎，自身免疫性肝炎，纤维化性肺泡炎，格雷夫斯氏病，IgA肾病，特发性血小板减少性紫癜，美尼尔氏病，天疱疮，原发性胆汁性肝硬化，结节病，硬皮病，韦氏肉芽肿病，其它自体免疫疾病，胰腺炎，创伤(手术)，移植物抗宿主病，移植排斥，心脏疾病包括缺血性疾病例如心肌梗死以及动脉粥样硬化，血管内凝血，骨吸收，骨质疏松症，骨关节炎，牙周炎和胃酸过少(hypochlorhydia)。
本发明还提供了用于治疗或预防疼痛，特别是与炎症有关的疼痛的根据本发明的抗体分子。
因而提供了用于治疗的根据本发明的抗体和采用其进行治疗的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法。
在一个实施方案中，提供了用于纯化抗体(特别是根据本发明的抗体或片段)的方法，其包括以下步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，以使得杂质保留在柱子上并且抗体被保持在未结合部分中。所述步骤可以例如在pH约6-8下进行。
方法还可包括使用阳离子交换层析的初始捕获步骤，例如在约4至5的pH下进行。
方法还可包括额外的层析步骤以确保产物和过程相关的杂质被适当地从产物流中解析出来。
纯化过程还可包括一个或多个超滤步骤，例如浓缩和渗滤步骤。
如上文所用的“纯化的形式”意指至少90％的纯度，例如91，92，93，94，95，96，97，98，99％w/w或更纯。
基本上不含内毒素通常意指1EU/mg抗体产物或更低例如0.5或0.1EU/mg产物的内毒素含量。
基本上不含宿主细胞蛋白质或DNA通常意指视情况而定，400μg/mg抗体产物或更低例如100μg/mg或更低，特别是20μg/mg的宿主细胞蛋白质和/或DNA含量。
本发明的抗体分子还可用于诊断，例如牵涉OX40的疾病状态的体内诊断和成像。
在本说明书上下文的“包含”旨在意指“包括”。
当技术上适当时，本发明的实施方案可以进行组合。
实施方案在本文被描述为包括某些特征/元素。本公开内容还延伸至由所述特征/元素组成或基本上由其组成的单独的实施方案。
本发明在下列实施例中参考附图通过举例说明的方式进行进一步描述，其中：
实施例
实施例1：单接头Fab-dsFv
用于在哺乳动物细胞中表达的单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和 A26Fab-645dsscFv质粒的构建
用于单接头A26Fab-645dsFv和A26Fab-645dsFv的表达的A26Fab融合蛋白(参见图1)通过使用柔性接头SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:103)将645vL融合至A26轻链的Km3同种异型人κ恒定区C-末端或通过使用柔性接头SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO:78)将645vH融合至A26重链的γ1同种型人γ-1CH1恒定区的C末端来构建。此外，将点突变在645vL和645vH的框架区中所选定的残基处引入至DNA序列。突变(重链G44C和轻链G100C)被引入以创建645Fv的重链和轻链之间的链间二硫键。用于A26Fab-645dsscFv的表达的A26Fab融合蛋白(参见图1)如下构建。单链Fv(scFv)通过经由柔性接头GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:79)将645vL的N-末端连接至645vH的C末端来构建。将点突变在645vL的框架残基G100C和645vH的G44C处引入至DNA序列以制备二硫化物连接的scFv(dsscFv)。随后将645dsscFv通过使用柔性接头SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:104)融合至A26轻链的Km3同种异型人κ恒定区的C-末端，或通过使用柔性接头SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO:80)融合至A26重链的γ1同种型人γ-1CH1恒定区。A26Fab轻链-645dsvL、A26Fab重链-645dsvH、A26Fab轻链、A26Fab重链、645dsvL游离结构域、645dsvH游离结构域、A26Fab轻链-645dsscFv和A26Fab重链-645dsscFv被化学制备并单独克隆至哺乳动物表达载体中处于HCMV-ΜIΕ启动子和SV40EpolyA序列的控制之下。
单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和A26Fab-645dsscFv的HEK293表达
用相关质粒利用Invitrogen’s 293fectin转染试剂根据制造商的说明书转染HEK293细胞。如下混合质粒以表达不同的构建体；对于A26Fab-645dsFv，质粒是A26Fab重链-(S,3xG4S/T)-645dsvH和A26Fab轻链-(S,3xG4S)-645dsvL；对于单接头A26Fab-645dsFv(LC-vL连接的)，质粒是A26Fab重链，645dsvH和A26Fab轻链-(S,3xG4S)-645dsvL；对于单接头A26Fab-645dsFv(HC-vH连接的)，质粒是A26Fab重链-(S,3xG4S/T)-645dsvH，A26Fab轻链和645dsvL；对于A26Fab-645dsscFv(HC-scFv)，质粒是A26Fab重链-(S,2xG4S/T)-645dsscFv(vH-4xG4S-vL)和A26Fab轻链；以及对于A26Fab-645dsscFv(LC-scFv)，质粒是A26Fab重链和A26Fab轻链-(S,2xG4S)-645dsscFv(vH-4xG4S-vL)。此外，用于转染的质粒的比例也是不同的，对于2质粒组合，比例为1:1，而对于3质粒组合，对几种不同的比例进行了测试。将总共50μg的质粒DNA用125μl的293fectin+4.25ml的Optimem培养基在室温温育20分钟。随后将混合物添加至以1x106个细胞/ml悬浮的50ml HEK293细胞并在37℃振荡温育。在第7天通过在1500g离心以除去细胞来收获上清液，并使上清液通过0.22μm的过滤器。表达水平由蛋白-G HPLC测定。
所有构建体的表达水平都是相当的，参见表4，其范围是3-15μg/ml。Fab-dsFv以13-14μg/ml表达，Fab-dsscFv以7-15μg/ml表达以及单接头Fab-dsFv以3-13μg/ml表达。已有文献报道缺乏vL和vH之间的接头或将vL和vH带至一起的二聚化基序的Fv区的表达具有比连接的Fv显著更低的表达水平。这在本数据中未观察到，其中在各类型的构建体的最佳表达之间没有观察到显著的差异。
表4
Figure BDA0000774787070000391
Figure BDA0000774787070000401
HEK293表达的单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和A26Fab-645dsscFv的 BIAcore分析
Fab-dsFv、Fab-dsscFv和单接头Fab-dsFv构建体的相互作用的结合亲和力和动力学参数通过使用CM5传感器芯片和HBS-EP(10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液在BIAcore T100上进行的表面等离子体共振(SPR)来进行测定。单接头Fab-dsFv样品通过使用人F(ab’)2-特异性的山羊Fab(JacksonImmunoResearch,109-006-097)或自身产生的抗人CH1单克隆抗体来捕获至传感器芯片表面。捕获抗体的共价固定通过标准的胺偶联化学来实现。
每个测定循环由下列组成：首先使用1分钟注射捕获Fab-dsFv、Fab-dsscFv或单接头Fab-dsFv构建体，在此之前是由3分钟抗原注射组成的缔合阶段，随后监测解离5分钟。在每个循环后，捕获表面用40mM HCl的2x 1分钟注射随后5mM NaOH的30秒注射来再生。使用的流速为10μl/分钟的捕获，30μl/分钟的缔合和解离阶段，以及10μl/分钟的再生。
对于动力学测定，进行人血清白蛋白50-6.25nM的滴定或25nm的OX40的单一浓度。空白流动池用于参照扣除并且包括缓冲液-空白注射以扣除仪器噪声和偏差。
通过使用BIAcore T100评估软件将所得的传感图同步全局拟合至标准的1:1结合模型来测定动力学参数。
所有样品的缔合速率、解离速率和亲和力对于两种抗原(人血清白蛋白(HSA)和人OX40)均是相似的，参见表5。因此，不同构建体中不同接头的存在和位置对任一可变区针对其抗原的亲合力不具有显著的效应。
表5
Figure BDA0000774787070000411
Figure BDA0000774787070000421
Figure BDA0000774787070000431
Figure BDA0000774787070000441
HEK293表达的单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和A26Fab-645dsscFv的蛋 白-G纯化
使用10kDa分子量截留离心浓缩器将约50ml的HEK293上清液浓缩约25倍至约2ml。将浓缩的上清液施加至在20mM磷酸盐、40mM NaCl pH7.4中平衡的1ml HiTrap蛋白-G FF柱(GE Healthcare)。将该柱用20mM磷酸盐、40mM氯化钠pH7.4洗涤，并用0.1M甘氨酸/HClpH2.7洗脱结合的物质。收集洗脱峰并用2M Tris/HCl pH8.5将pH调节至约pH7。使用10kDa分子量截留离心浓缩器将pH调节的洗脱液浓缩并将缓冲液换成PBS pH7.4。
蛋白-G纯化的、HEK293表达的单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和A26Fab- 645dsscFv的SDS-PAGE分析
当需要时用水稀释样品随后添加10μL 4x Bis-Tris LDS样品缓冲液和用于还原样品的4μL 10X还原剂至26μl。将样品涡旋混合，在100℃下温育3分钟，冷却并于12500rpm离心30秒。将制备的样品装载到4-20％丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝胶并在125V恒压运行110分钟。将凝胶用考马斯蓝蛋白质染色法进行染色，参见图2。
还原性SDS-PAGE凝胶具有在迁移位置和染色强度方面的带型，其对于所有正确表达的构建体是恒定的。对于泳道2的Fab-dsFv，在约36和约37kDa处应存在2条具有基本上相同染色的带。对于泳道3的Fab-dsscFv(LC-scFv)，在约51和约23kDa处应存在2条带，其中上面的带具有大致两倍的染色。对于泳道4的Fab-dsscFv(HC-scFv)，在约50和约26kDa处应存在2条带，其中上面的带具有大致两倍的染色。对于泳道6-9的单接头Fab-dsFv的(LC-vL)中，在约36、约23和约13kDa处应存在3条带，其中上面的带至下面的带的染色的大致比例为3:2:1。对于泳道10-12的单接头Fab-dsFv(HC-vH)，在约37、约26和约12kDa处应存在3条带，其中上面的带至下面的带的染色的大致比例为3:2:1。
纯化的蛋白-G、表达的HEK293、单接头A26Fab-645dsFv、A26Fab-645dsFv和A26Fab-645dsscFv的G3000SEC-HPLC分析
将50μg的样品注射到TSK Gel G3000SWXL,7.8x300mm柱(Tosoh)上，并用等度梯度的200mM磷酸盐pH 7.0以1ml/min进行显影。信号检测为280nm处的吸光度，参见图3。在蛋白-G纯化后，A26Fab-645dsFv为约45％的单体，A26Fab-645dsscFv具有范围55-60％的稍微更多的单体，而单接头A26Fab-645dsFv均为超过80％的单体其中一些是100％单体。
实施例2
用于在哺乳动物细胞中表达的单接头A26Fab-645dsFv和A26Fab-648dsFv三基因质粒的构建
三基因质粒通过首先从如实施例1/图1中描述的单接头Fab-dsFv形式的单基因组件产生中间双基因载体来构建。将编码包括hCMV-MIE启动子、重链和SV40polyA区的重链的表达的基因片段亚克隆在哺乳动物表达载体中的轻链基因的下游。分别地，重链是A26Fab重链或通过接头(S,3xG4S)连接至645dsvH或648dsvH的A26Fab重链，并且轻链是通过接头(S,3xG4S)连接至645dsvL或648dsvL的A26Fab轻链或A26Fab轻链。这产生针对每种形式的中间双基因质粒。为了构建三基因质粒，随后将编码游离的同源V区(645dsvL，648dsvL，645dsvH或648dsvH)的表达的片段亚克隆在中间载体中的重链基因下游的独特限制性位点上。对于之后的稳定细胞系的产生，将哺乳动物选择标记最后亚克隆到表达质粒中。这提供了一组用于以相同基因比例表达单接头Fab-dsFv的包含相关基因的质粒，具有或不具有哺乳动物选择标记。这些质粒将用于在瞬时哺乳动物表达系统中的初步评估以与从单基因质粒表达的单接头Fab-dsFv的％单体(图3)相比较。
单接头A26Fab-645dsFv和A26Fab-648dsFv在CHO细胞中从三基因质粒的瞬时表达
将CHO细胞在补充有1x L-glutaMAX(Life Technologies)的CD CHO培养基中生长至具有>99％存活率的指数期。在Earle平衡盐溶液(Life Technologies)中洗涤制备的细胞并将质粒DNA根据内部建议电穿孔至CHO细胞中。将转染的细胞转移至补充有1x L-glutaMAX和1x抗真菌溶液(Life Technologies)的CD CHO培养基并在37℃、8％CO2，在定轨摇床上温育24小时，以140rpm振荡。温育后，或者当培养物达到至少2x 106细胞ml-1的活细胞密度时，将温度降低至32℃。随后在转染后72小时后，添加3mM丁酸钠(Sigma Aldrich)，并在32℃、8％CO2、140rpm振荡下将培养物再温育另外的11天。上清液通过离心收获，并通过0.45μΜ和0.22μΜ无菌过滤器连续过滤。表达滴度由蛋白G HPLC针对Fab片段标准进行定量。
三基因质粒的表达水平取决于哺乳动物选择标记的存在，参见图5。表达滴度在从没有哺乳动物选择标记的表达质粒表达的单接头A26Fab-dsFv蛋白中较高，但如果从具有哺乳动物选择标记的质粒表达，则获得较低但可比较的水平，如因额外基因表达所需要的代谢负担而会预期的。此外，观察到的是，对于包含连接至645dsvL或648dsvL链的A26Fab轻链的蛋白观察到较高的表达滴度。
在CHO细胞中从三基因质粒表达的单接头A26Fab-645dsFv和A26Fab-648dsFv的蛋 白G纯化
将200ml上清液使用10kDa分子量截留离心浓缩器浓缩约20倍。将浓缩的上清液施加至在20mM磷酸盐、40mM NaCl pH7.4中平衡的1ml HiTrap蛋白-G FF柱(GE Healthcare)。将该柱用20mM磷酸盐、40mM NaCl pH7.4洗涤，并用0.1M甘氨酸/HCl pH2.7洗脱结合的物质。收集洗脱峰并用Tris/HCl pH8.5将pH调节至约pH7。使用10kDa分子量截留离心浓缩器将pH调节的洗脱液浓缩并将缓冲液换成PBS pH7.4。蛋白浓度在A280分光光度评估。
在CHO细胞中从三基因质粒表达的蛋白-G纯化的单接头A26Fab-645dsFv和 A26Fab-648dsFv的SDS-PAGE分析
当需要时在PBS中稀释蛋白样品。随后向8.25μl的后续样品中，加入3.75μl的4xBis-Tris LDS样品缓冲液(Life Technologies)、1.5μl的100mM N-乙基马来酰亚胺和1.5μl的10X还原剂用于还原的样品。将样品涡旋混合，在100℃下温育3分钟，冷却并在13200rpm下离心30秒。将制备的样品装载到4-20％丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝胶(LifeTechnologies)，并在恒压125V下在Tris-甘氨酸缓冲液中运行150分钟。SDS-PAGE蛋白标准Seeblue2(Life Technologies)用作标准标志物。将凝胶用InstantBlue考马斯蓝蛋白染色(Expedeon)进行染色并用蒸馏水脱色，参见图6。
还原性SDS-PAGE凝胶具有在迁移位置和染色强度方面的带型，其对于所有正确表达的构建体是恒定的。对于所有的单接头Fab-dsFv，在约36-37(i),约24-26(ii)和约12-13kDa(iii)处应存在3条带，其中上面的带至下面的带的染色的大致比例为3:2:1。
在CHO细胞中从三基因质粒表达的蛋白-G纯化的单接头A26Fab-645dsFv和 A26Fab-648dsFv的G3000SEC-HPLC
将50ul样品注入TSK Gel G3000SWXL，7.8x300mm柱(Tosoh)，并用等度梯度的200mM磷酸盐pH 7.0以1ml/min进行显影。信号检测为280nm处的吸光度，参见图7。所有从三基因质粒表达的单接头A26Fab-645dsFv(无论哺乳动物选择标记的存在或表达水平)实现超过90％的单体，其中大部分是100％单体。此数据与从单基因质粒表达的单体的单接头A26Fab-dsFv(图3)是高度一致的。这还表明编码该形式的相关基因的相同基因比例(如存在于三基因质粒构型中的)最适用于单体的单接头Fab-dsFv的表达。
Figure IDA0000774787160000011
Figure IDA0000774787160000021
Figure IDA0000774787160000031
Figure IDA0000774787160000041
Figure IDA0000774787160000051
Figure IDA0000774787160000061
Figure IDA0000774787160000071
Figure IDA0000774787160000081
Figure IDA0000774787160000091
Figure IDA0000774787160000101
Figure IDA0000774787160000111
Figure IDA0000774787160000121
Figure IDA0000774787160000131
Figure IDA0000774787160000141
Figure IDA0000774787160000151
Figure IDA0000774787160000161
Figure IDA0000774787160000171
Figure IDA0000774787160000181
Figure IDA0000774787160000191
Figure IDA0000774787160000201
Figure IDA0000774787160000211
Figure IDA0000774787160000221
Figure IDA0000774787160000231
Figure IDA0000774787160000241
Figure IDA0000774787160000251

Claims (16)

1.多特异性抗体分子，其由以下三种多肽组成：
a)式(I)的多肽链：
(Vxx)nVx-Cx-X-V1；和
b)式(II)的多肽链：
(Vyy)nVy-Cy
c)式(III)的多肽：
V2
其中
Vx表示可变结构域，
Vxx表示可变结构域，
Cx表示CH1或CL，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
Vy表示可变结构域，
Vyy表示可变结构域，
Cy表示CH1或CL，
V2表示可变结构域，
n独立地表示0或1，
其中CH1表示重链恒定结构域的结构域1，CL表示轻链恒定区，
其中式(I)的多肽链和式(II)的多肽链对齐以使得恒定结构域Cx和Cy进行配对并且Cx或Cy中的仅一个是CH1，可变结构域Vx和Vy一起形成结合结构域，可变结构域Vxx和Vyy一起形成结合结构域，以及可变结构域V1和V2一起形成结合结构域，并且
其中可变结构域对V1/V2通过两个工程改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1中且一个在V2中，其中工程改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57，其中根据Kabat进行编号。
2.双特异性抗体分子，其由以下三种多肽组成：
a)式(Ia)的重链：
VH-CH1-X-V1；和
b)式(IIa)的轻链：
VL-CL
c)式(III)的多肽：
V2
其中
VH表示重链可变结构域，
CH1表示重链恒定结构域的结构域1，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
VL表示轻链可变结构域，
CL表示轻链恒定区，
V2表示可变结构域，
其中可变结构域V1和V2一起形成结合结构域，并且
其中可变结构域对V1/V2通过两个工程改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1中且一个在V2中，其中工程改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57，其中根据Kabat进行编号。
3.双特异性抗体分子，其由以下三种多肽组成：
a)式(Ib)的重链：
VH-CH1；和
b)式(IIb)的轻链：
VL-CL-X-V2
c)式(III)的多肽：
V1
其中：
VH表示重链可变结构域，
CH1表示重链恒定结构域的结构域1，
X表示接头，
V1表示可变结构域，
VL表示轻链可变结构域，
CL表示轻链恒定区，
V2表示可变结构域，
其中可变结构域V1和V2一起形成结合结构域，并且
其中可变结构域对V1/V2通过两个工程改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基一个在V1中且一个在V2中，其中工程改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57，其中根据Kabat进行编号。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子，其中V1表示重链可变结构域并且V2表示轻链可变结构域。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子，其中可变结构域对V1/V2具有针对血清载体蛋白的特异性。
6.根据权利要求5所述的多特异性或双特异性抗体分子，其中V1包含SEQ ID NO:87给出的CDRH-1的序列、SEQ ID NO:88给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:89给出的CDRH-3的序列，并且V2包含SEQ ID NO:90给出的CDRL-1的序列、SEQ ID NO:91给出的CDRL2的序列和SEQID NO:92给出的CDRL-3的序列。
7.根据权利要求5所述的多特异性或双特异性抗体分子，其中V1包含SEQ ID NO:93给出的CDRH-1的序列、SEQ ID NO:94给出的CDRH2的序列和SEQ ID NO:95给出的CDRH-3的序列，并且V2包含SEQ ID NO:96给出的CDRL-1的序列、SEQ ID NO:97给出的CDRL2的序列和SEQID NO:98给出的CDRL-3的序列。
8.根据权利要求1或2所述的多特异性或双特异性抗体分子，其中X具有SEQ ID NO:78给出的序列。
9.根据权利要求3所述的双特异性抗体分子，其中X具有SEQ ID NO:103给出的序列。
10.多核苷酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子的所述三种多肽。
11.载体，其包含权利要求10中所定义的多核苷酸。
12.宿主细胞，其包含权利要求11所述的载体或权利要求10所述的多核苷酸。
13.包含三种载体的宿主细胞，其中每种载体包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子的不同多肽链的多核苷酸。
14.方法，其包括从权利要求12或13中定义的宿主细胞表达权利要求1至9中任一项所定义的多特异性或双特异性抗体分子。
15.药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子和至少一种赋形剂。
16.治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的多特异性或双特异性抗体分子或根据权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的患者的药物中的用途。
CN201380072293.8A 2012-12-21 2013-12-20 单接头FabFv抗体和制备其的方法 Active CN105026431B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1223276.5A GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2012-12-21 Antibodies and methods of producing same
GB1223276.5 2012-12-21
PCT/EP2013/077758 WO2014096390A1 (en) 2012-12-21 2013-12-20 Single linker fabfv antibodies and methods of producing same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105026431A CN105026431A (zh) 2015-11-04
CN105026431B true CN105026431B (zh) 2021-06-25

Family

ID=47682492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072293.8A Active CN105026431B (zh) 2012-12-21 2013-12-20 单接头FabFv抗体和制备其的方法

Country Status (10)

Country Link
US (2) US10457748B2 (zh)
EP (1) EP2935336B1 (zh)
JP (1) JP6411362B2 (zh)
CN (1) CN105026431B (zh)
BR (1) BR112015014872B1 (zh)
CA (1) CA2895608C (zh)
ES (1) ES2689470T3 (zh)
GB (1) GB201223276D0 (zh)
RU (1) RU2714159C2 (zh)
WO (1) WO2014096390A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104583239B (zh) 2012-05-10 2018-09-18 生物蛋白有限公司 多特异单克隆抗体
US20150203591A1 (en) * 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201506869D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506868D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method for protein purification
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA3022494A1 (en) * 2016-05-01 2017-11-09 Ucb Biopharma Sprl Affinity engineered serum protein carrier binding domain
GB201621591D0 (en) * 2016-12-19 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecules and method
US20210139589A1 (en) * 2017-06-22 2021-05-13 Apexigen, Inc Anti-vista antibodies and methods of use
EP3902823A1 (en) 2018-12-24 2021-11-03 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
GB201919058D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibodies
GB201919062D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA3175034A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 UCB Biopharma SRL Autonomous knob domain peptides
JP2023547795A (ja) 2020-10-15 2023-11-14 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル Ｃｄ４５を多量体化する結合分子
CA3200847A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011036460A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Ucb Pharma S.A. Disulfide stabilised multivalent antibodies

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5454806A (en) 1992-11-06 1995-10-03 Terumo Kabushiki Kaisha Medical device
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5685727A (en) 1995-01-20 1997-11-11 Ocean Design, Inc. Underwater mateable connector
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
PT1012259E (pt) * 1997-06-04 2009-11-06 Oxford Biomedica Ltd Vector dirigido a tumor
AU2719099A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Multipurpose antibody derivatives
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO2000002809A1 (en) 1998-07-10 2000-01-20 East/West Industries, Inc. Floor crane with rotatable boom
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
PT1570267E (pt) 2002-12-03 2012-01-03 Ucb Pharma Sa Ensaio para a identificação de células produtoras de anticorpos
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
KR101336204B1 (ko) 2006-08-18 2013-12-03 주식회사 케이티 다시점 비디오에서 전역변이를 이용하여 상이한 시점의 화면들을 압축 또는 복호하는 인코더와 인코딩하는 방법 및디코더와 디코딩하는 방법
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
EP2069401A4 (en) 2007-07-31 2011-02-23 Medimmune Llc MULTISPECIENT EPITOP BINDING PROTEINS AND THEIR USE
WO2009021754A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
WO2010035012A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
BRPI1010297A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-06 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos trivalentes.
WO2010115552A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
TW201100543A (en) * 2009-05-27 2011-01-01 Hoffmann La Roche Tri-or tetraspecific antibodies
CN102597298B (zh) 2009-09-09 2014-09-17 耳蜗有限公司 具有通过多个涂层形成的基本上连续的阻挡层的绝缘传导元件
US20120283415A1 (en) * 2009-09-10 2012-11-08 Ucb Pharma S.A. Multivalent Antibodies
GB0920127D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
CA2807278A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CA2807269A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
JP6431370B2 (ja) * 2011-07-13 2018-11-28 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 組換えＤｓｂＣを発現する細菌宿主系統
UA112203C2 (uk) * 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
US9803004B2 (en) * 2011-11-11 2017-10-31 Ucb Biopharma Sprl Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
GB201506870D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506869D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011036460A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Ucb Pharma S.A. Disulfide stabilised multivalent antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A new model for intermediate molecular weight recombinant bispecific and trispecific antibodies by efficient heterodimerization of single chain variable domains through fusion to a Fab-chain";SCHOONJANS R;《BIOMOLECULAR ENGINEERING》;20010601;1389-0344 *
"Fab-scFv fusion protein: an efficient approach to production of bispecific antibody fragments";LU D;《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》;20020915;213 - 226 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160017057A1 (en) 2016-01-21
WO2014096390A1 (en) 2014-06-26
JP6411362B2 (ja) 2018-10-24
US11401349B2 (en) 2022-08-02
ES2689470T3 (es) 2018-11-14
CN105026431A (zh) 2015-11-04
CA2895608A1 (en) 2014-06-26
EP2935336B1 (en) 2018-07-04
EP2935336A1 (en) 2015-10-28
BR112015014872B1 (pt) 2024-02-06
US10457748B2 (en) 2019-10-29
RU2015129762A (ru) 2017-01-27
JP2016501906A (ja) 2016-01-21
BR112015014872A2 (zh) 2017-08-15
US20200055959A1 (en) 2020-02-20
RU2714159C2 (ru) 2020-02-12
CA2895608C (en) 2021-05-25
GB201223276D0 (en) 2013-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105026431B (zh) 单接头FabFv抗体和制备其的方法
US20220267476A1 (en) Multispecific antibody constructs
EP3161008B1 (en) Multi-specific antibody constructs
US20200277366A1 (en) MULTI-SPECIFIC ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR TNF-ALPHA, IL-17A and IL-17F
JP7016367B2 (ja) 多特異性抗体の凝集を低減するための抗体フレームワーク
RU2784673C2 (ru) Конструкции полиспецифических антител
EA042715B1 (ru) Каркасы антител для снижения агрегирования полиспецифических антител

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Brussels

Applicant after: UCB biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: Brussels

Applicant before: UCB BIOPHARMA SPRL

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant