CN108060141A - Vp2基因和np基因重组腺病毒及其应用 - Google Patents

Vp2基因和np基因重组腺病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用，从IBDV和AIV的SD株中分别扩增出VP2基因和NP基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315‑MCS‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315‑VP2‑NP‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有VP2基因和NP基因的重组腺病毒pBH‑VP2‑NP‑EGFP。该重组腺病毒可以刺激机体产生抗体，用琼扩法测定IBDV抗体含量达到有效抗体水平，血凝抑制试验方法测定AIV抗体含量均显著优于对照组pBH‑EGFP；攻毒试验结果表明，保护率达到90％。

Description

VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，进一步涉及重组病毒的构建技术，具体涉及VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用。
背景技术
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursaldisease virus，IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊，从而导致免疫抑制，增加了机体对其它病原体的易感性，降低对其它疫苗的反应性。该疾病发病率高，病程较短，发病鸡主要表现为腹泻、颤抖、极度虚弱严重者引起死亡,对养殖业的危害巨大，而且幼鸡感染之后可导致免疫抑制，诱发多种疫苗免疫失效。该病毒为双链RNA病毒，有单层衣壳，无囊膜。IBDV病毒颗粒有五种蛋白构成，其中VP2蛋白是IBDV的构象保护性抗原，可以诱导产生具有保护性的中和抗体，VP2中和抗体可以引发机体对于法氏囊强毒攻击的保护。
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属甲型流感病毒，主要引起禽类呼吸系统疾病、产蛋下降及高死亡率等症状的急性传染病。AIV的亚型众多，容易发生基因突变和重排，给禽流感免疫造成很大的困难。该病毒为单股负链RNA，包含8个独立的RNA片段，其中核蛋白(NP)具有种群和型特异性，能产生具有交叉保护作用的抗体和细胞免疫反应，其高度保守，在固定毒株与野毒株之间变异较小。
目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，但是它们存在着免疫持续时间短且可能会诱导潜伏感染等弊端。基因工程苗安全有效，克服了弱毒苗和灭活苗的不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。因此，构建表达IBDV VP2基因和AIV NP基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用，以解决现有技术中缺乏一种此类重组病毒构建方法的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，是由以下方法制备的：
1)从IBDV中扩增出VP2基因；从AIV的SD株中扩增出NP基因；
2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP；
3)将重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP。
作为优选，步骤1)中VP2基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以IBDV的总RNA为模板，RT-PCR扩增获得VP2基因。
作为优选，步骤1)中NP基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以AIV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得NP基因。
作为优选，所述RT-PCR的反应体系如下：One step PrimeScript Enzyme Mix 2μL，2×step buffer 12.5μL，正向引物1μL，反向引物μL，RNA polymerase 1.5μL，用RNase-free ddH2O补齐至25μL。
作为优选，所述RT-PCR的反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，如此32个循环；72℃延伸10min。
作为优选，步骤2)中是先是将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上；经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP连接。
同时，本发明提供了上述述重组腺病毒用于制备预防禽传染性法氏囊病和禽流感的生物制品中的应用。
本发明以方法特征表征了一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，该技术方案将IBDV的主要保护性抗原(VP2)和AIV核蛋白(NP)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，检测免疫鸡后机体内产生抗体水平以及攻毒保护率，评价研制的预防IBD和AIV二联基因工程活载体疫苗。
本发明的有益效果是：分别将IBDV的VP2基因和AIV的NP基因与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP，籍此研制同时预防IBD和AIV的基因工程活载体疫苗。通过对免疫鸡的两种抗体水平检测，评价了重组腺病毒的免疫效果。研究结果表明，重组腺病毒可以刺激机体产生抗体，免疫重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP的SPF鸡，免疫后6w，用琼扩法测定IBDV抗体含量，达到有效抗体水平(1:32)，血凝抑制试验(HI)方法测定AIV抗体含量达到26，均显著优于对照组pBH-EGFP(阴性)；攻毒试验结果表明，保护率达到90％。本发明研制出的重组腺病毒为IBD的基因工程活载体疫苗提供了技术基础。
附图说明
图1是VP2基因和NP基因RT-PCR/PCR扩增结果图(M:DL2502bp DNA分子质量标准；1：NP基因RT-PCR产物2：VP2基因RT-PCR产物)。
图2是重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP质粒双酶切结果图(M.DL2502DNA分子质量标准；1.pDC315-VP2-NP-EGFP经EcoR I和Sal I的双酶切产物；2：pDC315-VP2-NP-EGFP经BamHI和XhoI的双酶切产物)。
图3是重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP感染HEK293细胞图(20×)(A.正常HEK293细胞图；B.荧光显微镜下正常HEK293细胞图；C.重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP感染HEK293细胞图；D.重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP感染HEK293细胞荧光图)。
图4是Western-blotting检测VP2蛋白和NP蛋白在HEK293细胞中的表达图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
传染性法氏囊病(IBD)和禽流感(AI)均是严重危害养鸡业的急性传染病。目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中等毒力和强毒三类。弱毒活疫苗对SPF鸡安全，但对有母源抗体鸡群的免疫保护力效果不理想。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然要高很多，但由于具有一定的致病力而损伤法氏囊。同时，由于母源抗体的干扰以及IBDV的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。由于禽流感病毒变异性强，其灭活疫苗不能完全保护。因此，安全有效的基因工程疫苗是近些年的研究热点之一。目前腺病毒载体系统已经相当成熟，相比其他载体具有明显的优势，国内外均有很多以腺病毒为载体制备疫苗的报道。对IBDV的研究也已相当清晰，有报道利用其它活载体研制IBD和AIV的基因工程疫苗，且免疫攻毒试验证实对鸡有一定的保护作用。因此，本发明利用传染性法氏囊病的VP2基因和禽流感AIV的NP基因构建重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP，籍此为IBD和AI的基因工程活载体疫苗提供了技术基础。
本发明VP2基因和NP基因构建重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP的方法，包括以下步骤：
1)IBDVVP2基因和AIV NP基因片段的扩增与T-A克隆；
2)构建重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP；
3)在HEK293细胞中重组和包装病毒pBH-VP2-NP-EGFP。
具体包括步骤如下：
(1)采用常规方法分离得到一株野生型IBDV病毒，从中扩增出VP2基因；同时从AIV的SD株中扩增出NP基因；
(2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP；
(3)将重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP。
上述的VP2基因和NP基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备预防禽传染性法氏囊病和禽流感的生物制品中的应用。
也就是说：从IBDV和AIV的SD株中扩增出目的基因；将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上；经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP连接；利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315-VP2-NP-EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，经Western-blotting鉴定重组腺病毒；重组腺病毒纯化后，经TCID50方法测定重组腺病毒的滴度；将重组腺病毒对鸡免疫攻毒，通过检测抗体水平，记录攻毒保护率，评价研制的重组腺病毒免疫鸡的效果。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1材料与方法
1.1VP2基因和NP基因的扩增
用常规方法分离得到一株野生型IBDV病毒，将其接种于DF1细胞，AIV SD株接种鸡胚成纤维细胞，分别收集细胞毒液，利用Trizol法提取总RNA，使用特异性引物(划线部分为酶切位点)，对总RNA进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得VP2基因和NP基因。VP2基因和NP基因引物引物见表1，PCR反应体系见表2,T-A克隆反应体系见表3。
表1扩增VP2基因片段的引物序列
表2VP2基因(NP)RT-PCR反应体系
注：反应程序为94℃预变性5min；{94℃变性30s；55℃退火40s；72℃延伸1min}32个循环，72℃延伸10min。
表3T-A克隆反应体系
1.2重组穿梭载体的构建
将获得的VP2基因和NP基因先后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP用相应的酶进行双酶切(酶切反应体系见表5、表6)，再将其用T4连接酶16℃连接12h(反应体系见表6)。经菌液PCR、酶切及测序鉴定，筛选出正确的重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP。
表5酶切反应体系
表6酶切反应体系
表7T4连接酶连接体系
1.3腺病毒的重组与包装
取脂质体24.0μL，并将其与4μg腺病毒穿梭质粒pDC315-VP2-NP-EGFP和8μg腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre混匀，共转染HEK293细胞，使其在HEK293细胞中重组与包装14d左右，收集CPE细胞，反复冻融并收集病毒，冻存-80℃。
将收集的重组腺病毒接种到正常的HEK293细胞，观察细胞病变情况及荧光显微镜观察细胞荧光情况。收集重组腺病毒感染48h后的HEK293细胞，然后通过western-blotting检测VP2蛋白和NP蛋白的表达情况。
1.4重组腺病毒滴度的测定
利用腺病毒纯化试剂盒，将重组腺病毒纯化，再根据TCID50法检测重组腺病毒的滴度。
1.5免疫攻毒试验
采用80只1日龄SPF鸡作为试验动物，将鸡随机分为4组，每组20只，分别设置为试验组：pBH-VP2-NP-EGFP组。对照组：pBH-EGFP组、空白对照组、攻毒对照组。在鸡28日龄时，对免疫组免疫107TCID50/0.2mL的pBH-VP2-EGFP、pBH-EGFP。免疫后4w，将每组鸡随机取10只用法氏囊病毒BC 6-85毒株104BID50/0.2mL进行攻毒，攻毒后3d剖检，记录法氏囊病变鸡的数量；另外10只用禽流感病毒(H9亚型)SD株2×106.0EID50/0.2mL进行滴鼻攻毒，攻毒后3d剖检，记录禽流感病变鸡的数量。
2结果与分析
2.1VP2基因和NP基因的RT-PCR扩增结果
利用VP2基因引物对提取IBDV的RNA进行RT-PCR扩增，经测序，获得大小为1380bp左右的预期片段，利用NP基因引物对提取AIV的RNA进行RT-PCR扩增，经测序，获得大小为1497bp左右的预期片段(图1)。
2.2扩增的VP2基因和NP基因测序结果分析
将测序后的VP2基因的核苷酸序列分别与GenBank中VP2和NP基因核苷酸序列进行Blast对比分析，同源性均达到99％以上。
2.3腺病毒重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP PCR及双酶切结果
对重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP进行PCR鉴定，分别利用限制性内切酶BamHI、XhoI和EcoRI、SalI对重组穿梭载体进行双酶切，得到与目的条带相符的1380bp和1497bp的条带，表明重组穿梭载体构建成功(见图2)。
2.4重组腺病毒感染HEK293细胞
将腺病毒大骨架与重组穿梭载体在脂质体的作用下共转染HEK293细胞，细胞出现CPE，而对照组正常生长，说明重组腺病毒包装成功。取转染成功的原代重组腺病毒感染正常HEK293细胞，细胞变大变圆呈葡萄串状并出现绿色荧光，对照组细胞状态正常，表明重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP在HEK293细胞中表达含目的基因的重组绿色荧光蛋白(图3)。
2.5Western-blotting检测VP2蛋白表达的结果
Western-blotting结果显示：重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP得到了104Da的目的条带，其中VP2蛋白分子质量约为48kDa，NP蛋白分子质量约为56kDa；在约43KDa处得到与内参β-actin蛋白分子质量相当的特异性条带(图4)。
2.6重组病毒的滴度测定结果
对纯化后的重组腺病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度，对各感染组病毒测定滴度，按照KarBer法计算重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP和pBH-EGFP的滴度为1010.25TCID50/mL和1011TCID50/mL。
2.7琼扩检测抗体水平
免疫后对照组与pBH-EGFP组鸡的抗体水平均为阴性，重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP组的抗体水平随时间的增加而逐渐升高，免疫后6w抗体水平最高，达到1:27.2。
2.8血清学方法检测抗体水平
免疫后对照组与pBH-EGFP组鸡的抗体水平均为阴性，重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP组的抗体水平随时间的增加而逐渐升高，免疫后4w抗体水平最高，达到26。
2.9攻毒保护试验
免疫后第4w攻毒，观察记录死亡情况，3d后进行剖检。法氏囊病毒攻毒的对照组和pBH-EGFP组鸡全部死亡，并且法氏囊有不同程度的萎缩，重组腺病毒pBH-VP2-EGFP组的保护率达到90％；禽流感病毒攻毒的对照组和pBH-EGFP组鸡全部死亡，重组腺病毒pBH-VP2-EGFP组的保护率达到90％。
表8攻击法氏囊病毒BC 6-85毒株后重组腺病毒疫苗产生的保护作用
表9攻击禽流感病毒(H9亚型)SD株后重组腺病毒疫苗产生的保护作用
3结论
3.1从IBDV的常规毒株和AIV SD毒株中分别扩增出VP2基因和NP基因，并分别成功连接到pMD19-T载体上，分别获得pMD-VP2和pMD-NP克隆质粒。
3.2成功获得重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP。
3.3成功获得重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP，且能表达VP2蛋白。
3.4收获的重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFPP和pBH-EGFP的滴度为1010.25TCID50/mL和1011TCID50/mL，符合后续动物试验的所需的滴度要求。
3.5构建的重组腺病毒免疫鸡的抗体水平及攻毒保护效果，均显著高于对照组并达到有效抗体水平，保护率达到90％。
本发明的创新之处在于，首次将IBDV的主要保护性抗原(VP2基因)和AIV的核蛋白(NP基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，检测免疫鸡后机体内产生抗体水平，显著高于对照组且保护率达到90％。因此，本发明利用传染性法氏囊病的VP2基因构建重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP，籍此为IBD和AI的基因工程活载体疫苗提供了技术基础。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司
<120> VP2基因和NP基因重组腺病毒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
<210> 3
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
<210> 4
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4

Claims (7)

1.一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于是由以下方法制备的：
1)从IBDV中扩增出VP2基因；从AIV的SD株中扩增出NP基因；
2)将获得的目的基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP；
3)将重组穿梭载体pDC315-VP2-NP-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-VP2-NP-EGFP。
2.根据权利要求1所述的一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于步骤1)中VP2基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以IBDV的总RNA为模板，RT-PCR扩增获得VP2基因。
3.根据权利要求1所述的一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于步骤1)中NP基因的扩增包括以下操作：以序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的DNA片段分别作为正向引物和反向引物，以AIV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得NP基因。
4.根据权利要求2或3所述的一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于所述RT-PCR的反应体系如下：One step PrimeScript Enzyme Mix 2μL，2×step buffer 12.5μL，正向引物1μL，反向引物μL，RNA polymerase 1.5μL，用RNase-free ddH2O补齐至25μL。
5.根据权利要求4所述的一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于所述RT-PCR的反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，如此32个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求1所述的一种VP2基因和NP基因重组腺病毒，其特征在于步骤2)中是先是将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上；经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP连接。
7.权利要求1～3任一项所述重组腺病毒用于制备预防禽传染性法氏囊病和禽流感的生物制品中的应用。
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