CN108051550A - 一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法，所述方法包括以下步骤：培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值；比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类。本发明所述方法能够快速、准确地确定培养基中主要酸性物质的种类，有利于后续有针对性地脱除或中和培养基中的酸性产物，提高效率和性价比。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法。
背景技术
细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术，利用细胞培养生产具有重要医学价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已经成为医药生物技术产业的重要部分。
细胞环境中代谢废物的积累是抑制细胞生长的主要因素，这些代谢废物包括二氧化碳、乳酸和氨。其中，二氧化碳和乳酸是培养基中最主要的酸性代谢废物，随着细胞培养规模和密度的增大，二氧化碳和乳酸在细胞培养基中逐渐累积，对细胞的正常生理功能产生抑制甚至毒害作用。而氨的积累使细胞内UDP氨基己糖增加，影响细胞的生长和蛋白质的糖基化过程，抑制Gln的代谢，使Asp和Glu消耗增加。
因此，对细胞培养基中二氧化碳、乳酸和氨等进行较为准确地检测以及有效脱除或中和，对优化细胞培养和提高产量而言具有重要意义。
目前，单独检测细胞培养基中二氧化碳和乳酸含量的方法较为复杂，例如滴定法、吸光度法等，因此，现有技术一般通过一次性测定培养基pH值的方法对其中二氧化碳和乳酸含量进行估算。该方法只能大致知晓培养基中二氧化碳和乳酸的总含量，无法获知其中酸性物质主要是二氧化碳还是主要是乳酸，难以有针对性地将实际的酸性物质脱除。
另外，目前现有技术也缺少能够行之有效地将二氧化碳和氨脱除的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法，所述方法能够简单、快速地测定培养基中酸性物质的类型，对酸性物质进行定性分析，便于后续做出有针对性地应对，提高酸性废物的脱除或中和效率。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；
(2)在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；
(3)摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值；
(4)比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质；
若C值－B值≤0.2，且A值－C值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。
具体实施方式
一种确定细胞培养基中的主要酸性物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；
(2)、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；
(3)、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值；
(4)、比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质；
若C值－B值≤0.2，且A值－C值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。
本发明所述方法通过pH值测定和前后pH值的比较即可快速判定细胞培养基中主要酸性物质的种类，与单次测量培养基pH值的方法相比，其能够较准确地辨别主要酸性物质的三种类型，1、二氧化碳；2、乳酸；3、二氧化碳和乳酸。继而，能够为后续有针对性地脱除或中和酸性物质提供准确的应对措施，提高脱除或中和的效率和性价比。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括以下步骤：
(5)、根据步骤(4)的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的pH值：
当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳；
当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，之后添加碱性物质，中和所述乳酸。
本发明所述方法还包括调节pH值的步骤，其中，所述pH值调节步骤根据培养基中主要酸性物质的不同而选择通入压缩空气和/或添加碱性物质，从而有针对性地减少酸性废物在培养基中积累，有利于细胞的生长和代谢。
在一些具体的实施方式中，所述压缩空气从所述细胞培养基的底层通入；
优选地，所述压缩空气还从细胞培养基的表层通入；
更优选地，从底层通入的压缩空气和/或从表层通入的压缩空气的压力为0.015～0.02MPa；
最优选地，所述表层持续通入压缩空气，所述底层根据步骤(4)的分析结果启动或停止通入压缩空气。
本发明所述方法优选地以通入压缩空气的方法脱除培养基中的二氧化碳，其中压缩空气的通入，不但能够是二氧化碳从液相的培养基中转移到气相的压缩空气中，同时，代谢废物氨也能够随二氧化碳一起脱离液相加入气相，因此，本发明所述方法能够同时脱除两种代谢废物。另外，与传统添加碱性物质的调节方法相比，本发明所述方法不用产生负产物，有利于提高细胞培养产物的品质。
本发明所述方法还进一步限定所述压缩空气的通入方式，其中，优选地，所述压缩空气从培养基的底部通入，该压缩空气通入方式可以延长空气在培养基中的流动路径，增加二氧化碳和氨的转移量；更优选地，本发明所述方法还在液相表层通入压缩空气，可避免底层压缩空气在流动过程中溶解在培养基中，增加底层压缩空气的溢出。
在一些具体的实施方式中，所述方法在通入压缩空气和/或添加碱性物质的同时，重复所述步骤(2)～(4)，直至C值－B值≤0.2和/或A值－C值≤0.2。本发明所述方法通过重复所述步骤(2)～(4)实现对酸性物质的实时监控，从而可以准确地判定pH值调节的终点，避免调节力度过大或过低。
在一些具体的实施方式中，为将生物反应器的气压维持在固定值从而增加所述生物反应器培养细胞的安全性，所述方法还包括以下步骤：
(6)、对所述生物反应器的气压进行监测并及时排除气体从而将所述生物反应器的气压维持在固定值；
优选地，所述监测为自动化监测；更优选地，所述自动化监测为实时监测；
优选地，所述气体通过排气阀排出，更优选地，所述排气阀为自动排气阀；最优选地，所述自动排气阀的开度大小可调节；
优选地，所述生物反应器的固定气压值为0.005～0.01MPa。
在一些具体的实施方式中，为避免排出气体的湿度过大造成空气滤芯堵塞，本发明所述方法还包括在排出气体之前对气体进行冷凝的步骤。
在一些具体的实施方式中，为避免废弃污染环境以及带来安全隐患，本发明所述方法还包括对排出的气体进行废气处理的步骤。
在一些具体的实施方式中，所述生物反应器为大型生物反应器，优选地，所述大型生物反应器的体积为3000～6000L。
在一些具体的实施方式中，所述步骤(1)中的pH值通过pH计或pH试纸的方式加以测定，优选地，通过pH计的方式加以测定；
所述步骤(2)中的pH值通过pH计或pH试纸的方式加以测定，优选地，通过pH计的方式加以测定；
所述步骤(3)中的pH值通过pH计或pH试纸的方式加以测定，优选地，通过pH计的方式加以测定。
在一些具体的实施方式中，所述细胞为植物细胞或动物细胞；
在一些具体的实施方式中，优选地，所述细胞为动物细胞；
在一些具体的实施方式中，更优选地，所述动物细胞为用于生产抗原或病毒的细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述方法通过pH值测定和前后pH值的比较即可快速判定细胞培养基中主要酸性物质的种类，与单次测量培养基pH值的方法相比，其能够较准确地辨别主要酸性物质的三种类型，1、二氧化碳；2、乳酸；3、二氧化碳和乳酸。继而，为后续有针对性地脱除酸性物质提供准确的应对措施，提高脱除或中和的效率和性价比。
(2)本发明所述方法优选地以通入压缩空气的方法脱除培养基中的二氧化碳，其中压缩空气的通入，不但能够是二氧化碳从液相的培养基中转移到气相的压缩空气中，同时，部分代谢废物氨也能够随二氧化碳一起脱离液相加入气相，因此，本发明所述方法能够同时脱除两种代谢废物。另外，与传统添加碱性物质的调节方法相比，本发明所述方法不用产生负产物，有利于提高细胞培养产物的品质。
(3)本发明所述方法还进一步限定所述压缩空气的通入方式，其中，优选地，所述压缩空气从培养基的底部通入，该压缩空气通入方式可以延长空气在培养基中的流动路径，增加二氧化碳和氨的转移量；更优选地，本发明所述方法还在液相表层通入压缩空气，可避免底层压缩空气在流动过程中溶解在培养基中，增加底层压缩空气的溢出。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
一种用于确定细胞培养基的主要酸性物质并调节培养基pH值的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、在培养开始前，测定细胞培养基的基础pH值，记为A值。
(2)、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值。
(3)、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值。
(4)、比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质。
若C值－B值≤0.2，且A值－C值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。
(5)、根据步骤(4)的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的pH值：
当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳。
当所述细胞培养基中主要酸性物质为乳酸时，向所述生物反应器中添加1mol/LNaOH溶液以中和所述乳酸。
当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，添加1mol/L NaOH溶液以中和乳酸。
其中，所述压缩空气的通入方式如下所示：从细胞培养基的底层和表层分别通入压缩空气，所述压缩空气的压力均为0.015～0.02MPa，所述压缩空气均经过两级空气过滤器净化。
(6)、在通入压缩空气和/或添加碱性物质的同时，重复所述步骤(2)～(4)，直至C值－B值≤0.2和/或A值－C值≤0.2。
(7)、对生物反应器内的气压实施自动化实时监测，当气压值大于0.01MPa时，通过自动排气阀将废气排出，从而将反应器的气压维持在0.005～0.01MPa；所述废气在排出前经过冷凝装置冷凝，防止废弃湿度过大造成滤芯堵塞，所述废气在排出后经废气处理装置处理以保证排出气体的生物安全性。
对比例1
参照实施1所述方法测定细胞培养基的pH值并加以调整，区别仅在于，对比例1仅测定培养前所述培养的pH值，记为A值，以及培养过程中所述培养基的pH值，记为B值；如果A值－B值＞0.2则添加1mol/L的NaOH溶液调节pH值，直至A值－B值≤0.2。
对比例2
参照实施例1所述方法测定细胞培养基的pH值并加以调整，区别仅在于，对比例2在通入压缩空气时仅从反应器的底部通入。
实验例1
测定细胞培养基的pH值，之后加入6000L大小生物反应器(参数设定：温度设定37±0.5℃、pH设定7.0±0.2、DO设定40～60％和适宜的搅拌速度)，培养悬浮型MDCK细胞，并在细胞密度达到要求后接入H5亚型禽流感病毒种子液进行培养，以制备H5亚型禽流感病毒抗原。
在培养过程中，取细胞培养基(共100次)，参照实施例1所述方法测定其pH值并确定所述培养基中的主要酸性物质类型。同时，通过高效液相色谱检测培养基中的乳酸含量，采用二氧化碳电极法测定培养基中的二氧化碳含量，对实施例1所述方法的检测结果进行验证。其中，实施例1所述方法对二氧化碳检测的准确性达92％，对乳酸含量检测的准确性达94％，整体检测准确率(即，在同一份样品中，对二氧化碳和乳酸的检测结果均正确)为88％。
根据上述检测结果可知，本发明实施例所述方法在判断培养基中主要酸性物质的类型时具有较高的准确性，符合规模化生产要求。
实验例2
使用6000L大小的发酵罐培养悬浮型MDCK细胞，并接种H5亚型禽流感病毒种子液以制备H5亚型禽流感病毒抗原。在培养过程中，分别采用实施例1和对比例1～2所述方法检测并调整细胞培养基的pH值。在培养结束后，分别统计采用实施例1和对比例1～2所述方法后，病毒抗原产量、病毒效价、NaOH溶液(1mol/L)的用量以及产生成本。具体检测结果如表1所示。
表1不同pH检测、调整方法对抗原生产的影响
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种确定细胞培养基中主要酸性物质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)、培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；
(2)、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；
(3)、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值；
(4)、比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；
如果C值－B值＞0.2，且A值－C值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质；
若C值－B值≤0.2，且A值－C值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
(5)、根据步骤(4)的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的pH值：
当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳；
当所述细胞培养基中主要酸性物质为乳酸时，向所述生物反应器中添加碱性物质，中和所述乳酸；
当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，添加碱性物质，中和乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述压缩空气从所述细胞培养基的底层通入；
优选地，所述压缩空气还从细胞培养基的表层通入；
更优选地，从底层通入的压缩空气和/或从表层通入的压缩空气的压力为0.015～0.02MPa；
最优选地，所述表层持续通入压缩空气，所述底层根据步骤(4)的分析结果启动或停止通入压缩空气。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法在通入压缩空气和/或添加碱性物质的同时，重复所述步骤(2)～(4)，直至C值－B值≤0.2和/或A值－C值≤0.2。
5.根据权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
(6)、对所述生物反应器的气压进行监测并及时排除气体从而将所述生物反应器的气压维持在固定值；
优选地，所述监测为自动化监测；更优选地，所述自动化监测为实时监测；
优选地，所述气体通过排气阀排出，更优选地，所述排气阀为自动排气阀；最优选地，所述自动排气阀的开度大小可调节；
优选地，所述生物反应器的固定气压值为0.005～0.01MPa。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在排出气体之前对气体进行冷凝的步骤。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述方法还包括对排出的气体进行废气处理的步骤。
8.根据权利要求1～4,6～7任一项所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为大型生物反应器，优选地，所述大型生物反应器的体积为3000～6000L。
9.根据权利1～4,6～7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)、所述步骤(2)和/或步骤(3)中的pH值通过pH计或pH试纸的方式加以测定；
优选地，所述步骤(1)、所述步骤(2)和/或步骤(3)中的pH值通过pH计的方式加以测定。
10.根据权利要求1～4,6～7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为植物细胞或动物细胞；
优选地，所述细胞为动物细胞；
更优选地，所述动物细胞为用于生产抗原或病毒的细胞。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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