CN108037089A - 一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法，本发明属于食品安全、环境健康领域。本发明的方法包括如下步骤：(1)样品预处理与在线清洗；(2)样品测定；(3)结果判定：计算U:max{|A‑Ai|/A*100％,i＝1,2,...,n}，A＝(A1+A2+…+An)/n。(4)评价方法：U≤U_标准值，数据可靠，U＞U_标准值，数据不可靠。(5)结果计算：将测定结果带入标准曲线。本发明的方法具有检测速度快、操作简便且分析费用低的优点，方法简便快捷，提高自动化程度，污染小，环境友好。

Description

一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法

技术领域

本发明属于食品安全、环境健康领域，更具体说是一种简单快速的测定鸡肉脂肪中四环素的方法。

技术背景

四环素是一种广谱抗生素，主要应用于抗疟疾治疗和控制细菌感染。由于其成本低及不含副作用，其广泛应用于抗革兰氏阴性和阳性菌、厌氧菌、支原体，以及作为饲料添加剂促进生长和增重。然而，四环素广泛滥用造成了严重的问题。四环素残留于动物组织可能造成细菌演化出抗药性或产生毒性危害人体健康。四环素脂溶性较高。因此，四环素易在动物体内残留，在动物脂肪的富集尤其高。另外，环境介质中抗生素种类和含量随着畜禽和水产养殖业的快速发展逐年增加，抗生素进入土壤、水和沉积物等环境介质，经吸附-解吸、迁移和降解等过程重新分配，其降解方式主要有水解、光解和生物降解。残留抗生素已证实可影响环境介质中微生物的生物量、活性和群落结构，并诱导产生抗性基因，使成为危害巨大的超级细菌。

目前测定四环素残留的方法主要有模型法、毛细管电泳和液相色谱。但用于动物制食品的方法较少，可能是由于其成分复杂。目前报道的测定鸡肉脂肪四环素的方法只有一种，其利用紫外液相色谱和液相色谱-质谱连用测定，但其使用成本高，操作繁琐。测定四环素最大的难点是生物样品的处理。处理主要包括适当溶剂萃取步骤、清洗和预浓缩阶段。通常萃取方法使用Ph 3-5的酸缓冲液，均匀化然后离心。有时使用超声破碎提高萃取效率。有时，为排除复杂基体干扰分离四环素，需要采用固相萃取或液液萃取。

根据文献报道，测定动物组织、猪肉脂肪、鸡蛋和血液中的四环素有许多分析方法。但其预处理步骤冗长复杂。另一方面，液液萃取这种成熟方法使用已久，其基于溶质在互不相溶两液相中的分配。然而，这种方法耗时长，需要大量有毒有机溶剂。因此需要开发微型化、自动化、清洁的步骤替代传统样品处理方法。

液液微萃取技术是一种广泛使用的方法，其简便快速，而且有机溶剂消耗少因而环境友好。其避免了传统液液萃取技术耗时长，有毒有机溶剂消耗量大的缺点。液液微萃取方法有不同的分类：单滴微萃取、分散液液微萃取、反相分散液液微萃取。

发明内容

发明目的：针对现有的鸡肉脂肪中四环素残留的测定方法复杂冗长，样品预处理困难，使用仪器要求高，成本高，且使用大量有机溶剂，污染环境，本发明开发了一种新型简单低廉的反向液液微萃取鸡肉脂肪中四环素的方法，方法采用酸化水作为萃取剂(400ul)，实验设计了一种管道流动注射系统用于光谱测定分析包含四环素的萃取剂注入连续流进样口，提取时间仅需10-15分钟，方法简便快捷，提高自动化程度，污染小，环境友好。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法，包括如下步骤：

(1)取不含抗生素的鸡，称取固态鸡肉脂肪并分成若干份，每份0.2～0.4g,每份分别加入一系列不同质量的四环素标准溶液，加热至80℃±1℃得到标准液体样品，将标准液体样品真空过滤，然后向其中加入300-500μL提取液，所述提取液为酸化水，振荡混合，然后离心，将下层液体引入流动注射系统检测，光谱测定波长为根据浓度和吸光值得到检测标准曲线；

(2)样品检测：称取待检测鸡肉的固态鸡肉脂肪0.2～0.4g，加热至80℃±1℃得到液体样品，然后用步骤(1)检测标准液体样品的方法进行检测，重复若干次，得到系列吸光度值A1,A2,...,An，平均吸光度为A，其中，n为重复检测次数，得到不确定度U为max{|A-Ai|,i＝1,2,...,n}；

(3)结果判读：

当U≤U_标准值，数据可靠，其中U_标准值来源于标准CAC/GL59–2006，当浓度为1μg/kg～1000μg/kg时，不确定度U_标准值限值为16-53％，此时将测得的平均吸光度带入步骤(1)所得到的标准曲线得到待测鸡肉中四环素的量；

当U＞U_标准值，数据不可靠，则将样品稀释一定浓度后重复步骤(2)的步骤，根据稀释倍数计算鸡肉中四环素的量。

其中，在步骤(1)中，每份固态鸡肉脂肪中含有的四环素的量在0～1600μg/kg范围内。

优选地，所述酸化水的pH为1.2～1.3。

步骤(1)中，离心条件为1500rpm转速离心5～10min。

所述流动注射系统包括依次连接的样品管、小型棉柱、针筒尼龙过滤器、蠕动泵、混合反应器、紫外检测器组成，另有提取液作为载液通过蠕动泵进入混合反应器；待测样品在引入流动注射系统进行检测前，对所需检测样品进行在线清洗。

在线清洗的步骤为：将待测样品放置于样品管中，然后依次通过微型棉柱、针筒尼龙过滤器；取样管通过管路连接微型棉花柱，微型棉花柱长1.5cm直径0.3cm，再连接针筒尼龙过滤器，针筒尼龙过滤器孔径0.45μm。

优选地，所述流动注射系统具有可调节样品流量的进样阀。

所述提取液为为0.0100MOL/L的HCl。

所述混合反应器为长度200mm的静态混合反应器。

具体地，所述四环素标准溶液通过如下方法配制：将适量盐酸四环素溶于甲醇中，得到1mg/L的四环素储备液，存放于-18℃冰箱中备用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的主要优势在于萃取/预浓缩步骤。这种反向液液微萃取技术仅使用400μL酸化水作为提取液，其步骤简便，清洁，环境友好，提取液很容易注入FIA系统进样阀。本发明采用的自动化流动注射分析分光光度法是一种良好的测定鸡肉脂肪DOC的方法，同时本发明方法简单、快速、成本低，因为其只采用一个简单的提取步骤，分光光度计及流动注射系统。

附图说明

图1为本发明方法检测的流程示意图；

图2为本发明快速检测流程图。

具体实施方式

如图1所示，本发明提出了一种一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法，包括如下步骤：

(1)取不含抗生素的鸡，称取固态鸡肉脂肪并分成若干份，每份0.2～0.4g,每份分别加入一系列不同质量的四环素标准溶液使每份固态鸡肉脂肪中含的四环素的量为0～1600μg/kg加热至80℃±1℃得到标准液体样品，将标准液体样品真空过滤，然后向其中加入300-500μL提取液，所述提取液为酸化水，酸化水的pH为1.2～1.3，振荡混合10min，然后1500rpm转速离心5～10min，将下层液体引入流动注射系统检测，光谱测定波长为根据浓度和吸光值得到检测标准曲线；流动注射系统包括依次连接的样品管、小型棉柱、针筒尼龙过滤器、蠕动泵、混合反应器、紫外检测器组成，另有提取液作为载液通过蠕动泵进入混合反应器；待测样品在引入流动注射系统进行检测前，对所需检测样品进行在线清洗；在线清洗的步骤为：将待测样品放置于样品管中，然后依次通过微型棉柱、针筒尼龙过滤器；取样管通过管路连接微型棉花柱，微型棉花柱长1.5cm直径0.3cm，再连接针筒尼龙过滤器。

(2)样品检测：称取待检测鸡肉的固态鸡肉脂肪0.2～0.4g，加热至80℃±1℃得到液体样品，然后用步骤(1)检测标准液体样品的方法进行检测，重复若干次，得到系列吸光度值A1,A2,...,An，平均吸光度为A，其中，n为重复检测次数，得到不确定度U为max{|A-Ai|,i＝1,2,...,n}；

(3)结果判读：

当U≤U_标准值，数据可靠，其中U_标准值来源于标准CAC/GL59–2006，当浓度为1μg/kg～1000μg/kg时，不确定度U_标准值限值为16-53％，此时将测得的平均吸光度带入步骤(1)所得到的标准曲线得到待测鸡肉中四环素的量；

当U＞U_标准值，数据不可靠，则将样品稀释一定浓度后重复步骤(2)的步骤，根据稀释倍数计算鸡肉中四环素的量。

下面通过具体实施例详细说明本发明。

实施例1标准曲线的测定。

(1)样品预处理与在线清洗：从生态农场获取鸡肉，确保不含抗生素。称取待测固态鸡肉脂肪重量4份，每份0.2g，加热到80℃±1℃。在4份脂肪样品中分别加入一定量四环素，使其浓度分别为0、800、1200、1600μg/kg。液态样品经过8μm滤膜真空过滤，放入15mL聚丙烯离心管，加入300-500μL提取液，提取液为酸化水，pH为1.2-1.3；放入旋转振荡器振荡10min是物质充分接触。最后，将混合液以1500rpm转速离心5min，将下层液体(水相)作为标准待测样品引入流动注射系统；

(2)样品测定：将步骤(1)得到的标准待测样品放置于样品管中，然后依次通过微型棉柱、针筒尼龙过滤器；取样管通过管路连接微型棉花柱长1.5cm直径0.3cm，再连接针筒尼龙过滤器孔径0.45μm，其作用是实现在线清洗，避免杂质进入后续系统，然后通过蠕动泵进入混合反应器混合，蠕动泵和混合反应器之间设置进样阀，进样阀控制样品流速和流量。最后样品在检测器中检测，光谱测定波长为测得4份样品吸光度分别为0.02、0.13、0.19、0.27。

(3)结果计算：

根据步骤(1)和(2)的四环素浓度及其对应吸光度，绘制标准曲线，得到标准曲线为方程为C＝6461.3A-85.349，R²＝0.9923。

实施例2：

(1)样品预处理与在线清洗：称取某待测固态鸡肉脂肪重量0.2g，加热到80℃±1℃。液态样品经过8μm滤膜真空过滤，放入15mL聚丙烯离心管，加入300-500μL提取液，提取液为酸化水，pH为1.2-1.3；放入旋转振荡器振荡10min是物质充分接触。最后，将混合液以1500rpm转速离心5min，将下层液体(水相)作为待测样品引入流动注射系统。

(2)样品测定：将待测样品放置于样品管中，然后依次通过微型棉柱、针筒尼龙过滤器；取样管通过管路连接微型棉花柱长1.5cm直径0.3cm，再连接针筒尼龙过滤器孔径0.45μm，其作用是实现在线清洗，避免杂质进入后续系统，通过蠕动泵进入混合反应器混合，蠕动泵和混合反应器之间设置进样阀，进样阀控制样品流速和流量。最后样品在检测器中检测，光谱测定波长为测定吸光度A。提取时间仅需10-15分钟。废液单独收集处理，防止二次污染。以上实验步骤重复3次，测得三次吸光度值A1、A2、A3。

(3)结果判定：

将步骤(2)测得的吸光度进行整理：A1,A2,A3的值分别为0.105、0.113、0.111，平均值A为0.110，则不确定度U＝max{|A-Ai|/A*100％,i＝1,2,3}＝4.5％。

(4)评价方法：

根据标准CAC/GL59–2006，当浓度为1μg/kg–1000μg/kg时，不确定度U限值为16-53％。

将步骤(3)计算结果进行整理，

U<U_标准值，符合标准，数据可靠。

(5)结果计算：

将三次测定结果的平均值A带入实施例1所得标准曲线，得到某鸡肉脂肪样品四环素含量为625.4μg/kg。

对于四环素超标的样品可以经稀释后用上述方法进行测定。

Claims (10)

1.一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取不含抗生素的鸡，称取固态鸡肉脂肪并分成若干份，每份0.2～0.4g,每份分别加入一系列不同质量的四环素标准溶液，加热至80℃±1℃得到标准液体样品，将标准液体样品真空过滤，然后向其中加入300-500μL提取液，所述提取液为酸化水，振荡混合，然后离心，将下层液体引入流动注射系统检测，光谱测定波长为根据浓度和吸光值得到检测标准曲线；

(2)样品检测：称取待检测鸡肉的固态鸡肉脂肪0.2～0.4g，加热至80℃±1℃得到液体样品，然后用步骤(1)检测标准液体样品的方法进行检测，重复若干次，得到系列吸光度值A1,A2,...,An，平均吸光度为A，其中，n为重复检测次数，得到不确定度U为max{|A-Ai|,i＝1,2,...,n}；

(3)结果判读：

当U≤U_标准值，数据可靠，其中U_标准值来源于标准CAC/GL59–2006，当浓度为1μg/kg～1000μg/kg时，不确定度U_标准值限值为16-53％，此时将测得的平均吸光度带入步骤(1)所得到的标准曲线得到待测鸡肉中四环素的量；

当U＞U_标准值，数据不可靠，则将样品稀释一定浓度后重复步骤(2)的步骤，根据稀释倍数计算鸡肉中四环素的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，每份固态鸡肉脂肪中含有的四环素的量在0～1600μg/kg范围内。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸化水的pH为1.2～1.3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，离心条件为1500rpm转速离心5～10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动注射系统包括依次连接的样品管、小型棉柱、针筒尼龙过滤器、蠕动泵、混合反应器、紫外检测器组成，另有提取液作为载液通过蠕动泵进入混合反应器；待测样品在引入流动注射系统进行检测前，对所需检测样品进行在线清洗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在线清洗的步骤为：将待测样品放置于样品管中，然后依次通过微型棉柱、针筒尼龙过滤器；取样管通过管路连接微型棉花柱，微型棉花柱长1.5cm直径0.3cm，再连接针筒尼龙过滤器。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流动注射系统具有可调节样品流量的进样阀。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提取液为为0.0100MOL/L的HCl。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合反应器为长度200mm的静态混合反应器。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四环素标准溶液通过如下方法配制：将适量盐酸四环素溶于甲醇中，得到1mg/L的四环素储备液，存放于-18℃冰箱中备用。