CN108025055A - 多价肠道病毒疫苗组合物及其相关用途 - Google Patents

Abstract

本披露涉及多价肠道病毒疫苗组合物及其相关用途。在某些实施例中，本披露涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物包含肠道病毒(例如HRV)血清型或重组产生的变体或重组产生的病毒衣壳蛋白的多价混合物。在某些实施例中，本披露涉及免疫方法，所述方法包括将有效量的本文披露的组合物给予至被诊断为患有肠道病毒感染、展现出肠道病毒感染的症状或处于肠道病毒感染风险的受试者。

Description

多价肠道病毒疫苗组合物及其相关用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年6月15日提交的美国临时申请号62/175,832的优先权权益，出于所有目的将其通过引用以其全文并入本文。

背景技术

人类鼻病毒(HRV)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属中的正链RNA病毒，是感冒的最常见原因并且是人类中传染性疾病的最常见原因。HRV是儿童的社区获得性肺炎的主要原因。感冒是一种社会经济负担，并且鼻病毒感染可在免疫受损的人群、老年人和少年儿童群体以及患有慢性呼吸系统疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)的人群中导致严重并发症。用HRV激发和HRV疫苗对人类志愿者所做的研究证实病毒中和抗体(nAb)与保护相关。已经鉴定出超过100种血清型的这一事实阻碍了HRV疫苗的开发。Hamory等人报道了对两种10价鼻病毒疫苗的人类不良反应[J Infect Dis.[感染病学杂志]1975,132(6):623-9]。因此，有必要找到一种改进的疫苗接种途径。

Matz报道了vapendavir用于治疗患哮喘的成年人的自然获得性鼻病毒感染的用途。Am J Respir Crit Care Med[美国呼吸与重症护理医学杂志]，2013,187:A5497。

Edlmayr等人报道了用来自人类鼻病毒的重组VP1诱导的抗体展现出交叉中和。Eur Respir J[欧洲呼吸杂志],2011,37:44-52。

Glanville等人报道了用保守的鼻病毒衣壳蛋白免疫诱导的交叉血清型T细胞免疫。PLoS Pathog[科学公共图书馆·病原体]2013,9:e1003669。还参见美国公开的申请号2016/0095916和2006/0088549。

本文引用的参考文献并非对现有技术的承认。

发明内容

本披露涉及多价肠道病毒疫苗组合物及其相关用途。在某些实施例中，本披露涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物包含多价的即人类鼻病毒(HRV)血清型、代表多种血清型的重组产生的多价HRV毒株或代表多种血清型的重组产生的多价HRV衣壳蛋白的混合物。在某些实施例中，本披露涉及免疫方法，所述方法包括将有效量的本文披露的组合物给予至被诊断为患有HRV感染、展现出HRV感染的症状或处于HRV感染风险的受试者。

在某些实施例中，本披露涉及包含多于10种肠道病毒属的血清型的灭活或减弱病毒以及氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或其混合物的组合物，例如包含多于10种人类鼻病毒的血清型的灭活病毒以及含有氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或其混合物的佐剂的组合物。

在某些实施例中，本文披露的组合物为液体形式，其中每种血清型的浓度为大于1×10³或10⁴TCID₅₀/剂量。

在某些实施例中，有效量是免疫有效量，例如诱导针对多种血清型的保护性免疫应答持续多于6、12、18或24个月。

在某些实施例中，疫苗组合物包含多于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100种HRV血清型、代表血清型的重组变体、或代表血清型的重组衣壳蛋白。

在某些实施例中，本披露涉及包含以下血清型的灭活HRV的组合物：HRV-A16、HRV-A36、HRV-A78、HRV-A38、HRV-A2、HRV-B14、HRV-A9、HRV-A29、HRV-A13、和HRV-A76。在某些实施例中，所述组合物进一步包含HRV-A11、HRV-A44、HRV-A60、HRV-A49、HRV-A41、HRV-A32、和HRV-A58中的一种或多种血清型。在某些实施例中，所述组合物进一步包含HRV-A33、HRV-A50、HRV-A39、HRV-B26、HRV-A21、HRV-A94、HRV-A51、HRV-A55、HRV-A45、和HRV-A1B中的一种或多种血清型。在某些实施例中，所述组合物进一步包含HRV-A100、HRV-A10、HRV-A66、HRV-A77、HRV-A40、HRV-A85、HRV-A54、HRV-A34、HRV-A24、HRV-A30、HRV-A75、HRV-A96、HRV-A19、HRV-A88、HRV-A7、HRV-A80、HRV-A68、HRV-A53、HRV-A89、HRV-A31、HRV-A56、HRV-A59、HRV-A64、和HRV-A81中的一种或多种血清型。

在某些实施例中，本披露涉及包含具有如下血清型的灭活HRV的组合物：HRV-A16、HRV-A36、HRV-A78、HRV-A38、HRV-A2、HRV-B14、HRV-A9、HRV-A13、HRV-A29、HRV-A76、HRV-A60、HRV-A49、HRV-A41、HRV-A32、HRV-A58、和HRV-A11。

在某些实施例中，所述组合物进一步包含HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A9、HRV-A11、HRV-B14、HRV-A16、HRV-A21、HRV-B26、HRV-A29、HRV-A32、HRV-A33、HRV-A36、HRV-A38、HRV-A39、HRV-A41、HRV-A45、HRV-A49、HRV-A50、HRV-A51、HRV-A55、HRV-A58、HRV-A60、HRV-A76、HRV-A78、HRV-A94、HRV-A7、HRV-A10、HRV-A13、HRV-A19、HRV-A24、HRV-A30、HRV-A31、HRV-A34、HRV-A40、HRV-A53、HRV-A54、HRV-A56、HRV-A59、HRV-A64、HRV-A66、HRV-A68、HRV-A75、HRV-A77、HRV-A80、HRV-A81、HRV-A85、HRV-A88、HRV-A89、HRV-A96、和HRV-A100中的一种或多于10种、或11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种或更多种血清型。

在某些实施例中，本披露涉及通过以下方法产生的灭活HRV，所述方法为：将HRV血清型与细胞在使得所述HRV感染所述细胞的条件下混合；在使得所述HRV复制的条件下，在培养基中培养所述细胞，并且收获并任选地纯化和/或浓缩所述病毒以在等于或大于1×10⁶ 50％组织培养感染剂量单位(TCID₅₀)/mL的终浓度下提供HRV；并且将所述HRV与HRV灭活剂在用于提供灭活HRV的条件下混合。

在某些实施例中，所述细胞是人类永生细胞或其他细胞系。在某些实施例中，所述培养基包含蛋白白蛋白。

在某些实施例中，本披露涉及编码感染性HRV RNA的重组核酸，所述感染性HRVRNA编码包含侧接5’和3’非翻译HRV区的VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、和3D的多蛋白，其中VP4、VP2、VP3、和VP1蛋白序列中的1、2、3个或全部来自第一HRV血清型并且2A、2B、2C、3A、3B、3C、和3D蛋白序列中的至少一个来自第二HRV血清型，其中所述第一HRV血清型和所述第二HRV血清型针对VP4、VP2、VP3、和VP1蛋白中的1、2、3个或全部不具有相同的血清型序列。

在某些实施例中，第二HRV血清型是HRV-A16或HRV-A80。

在某些实施例中，VP4、VP2、VP3、VP1、和2A来自HRV-A36、HRV-A78、HRV-A38、HRV-A2、HRV-B14、HRV-A9、HRV-A13、HRV-A29、或HRV-A76，并且2B、2C、3A、3B、3C、和3D蛋白序列来自HRV-A16或HRV-A80。

在某些实施例中，VP4、VP2、VP3、VP1、和2A来自HRV-A11、HRV-A44、HRV-A60、HRV-A49、HRV-A41、HRV-A32、和HRV-A58、HRV-A33、HRV-A50、HRV-A39、HRV-26、HRV-A21、HRV-A94、HRV-A51、HRV-A55、HRV-A45、和HRV-A1B、HRV-A100、HRV-A10、HRV-A66、HRV-A77、HRV-A40、HRV-A85、HRV-A54、HRV-A34、HRV-A24、HRV-A30、HRV-A75、HRV-A96、HRV-A19、HRV-A88、HRV-A7、HRV-A80、HRV-A68、HRV-A53、HRV-A89、HRV-A31、HRV-A56、HRV-A59、HRV-A64、或HRV-A81，并且2B、2C、3A、3B、3C、和3D蛋白序列来自HRV-A16或HRV-A80。

在某些实施例中，本披露涉及包含载体的组合物，所述载体包含本文披露的独特核酸，其中每个独特核酸编码针对VP4、VP2、VP3、VP1、和2A的不同序列。在某些实施例中，所述组合物包含多于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100个不同的独特核酸载体。

在某些实施例中，所述组合物进一步包含编码单个血清型的VP4、VP2、VP3、VP4、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、和3D蛋白序列的核酸。

在某些实施例中，本披露涉及疫苗组合物，其包含本文披露的任选地与佐剂组合的灭活的天然存在的或非天然存在的HRV血清型或核酸序列。

在某些实施例中，所述组合物进一步包含任选地与佐剂组合的重组产生的VP4、VP2、VP3、和/或VP1蛋白。在某些实施例中，所述组合物包含代表多于10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、或100种不同血清型的独特衣壳蛋白。

在某些实施例中，本披露涉及治疗或预防肠道病毒(例如HRV)感染的方法，所述方法包括将有效量的本文披露的组合物给予至对其有需要的受试者。

在某些实施例中，肠道病毒是灭活的并且以高于或约10³或10⁴TCID₅₀/剂量的浓度给予的多种人类鼻病毒。

在某些实施例中，给予一个剂量的疫苗，并且在第一个剂量之后多于3、5、7、9、11、或13天给予第二个剂量。

在某些实施例中，受试者小于一岁或二岁或三岁或五岁。在某些实施例中，受试者大于60岁、65岁、或70岁。在某些实施例中，受试者被诊断为患有哮喘、COPD、肺气肿、慢性支气管炎、囊性纤维化，或对1型糖尿病具有遗传易感性。

在某些实施例中，本披露涉及肠道病毒属的其他成员如肠道病毒物种的多价疫苗组合物。

附图说明

图1显示了在用10种混合的、灭活的HRV血清型疫苗接种后针对在小鼠中诱导的10种HRV血清型的病毒中和抗体的数据。通过肌肉内途径用灭活的HRVV-10对BALB/c小鼠(每组20只)进行疫苗接种。在疫苗接种后18天收集血清，并且在HeLa细胞中通过TCID₅₀还原测定对针对HRV-A16、HRV-A36、HRV-A78、HRV-A38、HRV-A2、HRV-B14、HRV-A9、HRV-A13、HRV-A29、HRV-A76、和HRV-A49(在X轴上从左到右)的血清nAb滴度(针对每组进行汇集)进行定量。包括在疫苗中的血清型在图中以黑线表示。HRVV-10诱导针对10个输入血清型(非HRV-A13)中的9个的nAb，并且HRVV-10诱导针对HRV-A49的nAb，所述HRV-A49是不包含在疫苗中但与HRV-A2处于相同抗原组的血清型。

图2展示了包含产生感染性HRV的HRV核酸的细菌人工染色体(BAC)载体。所述图展示了克隆到BAC载体中的HRV-A16构建体。所述HRV-A16核酸紧密侧接5'和3'核酶，并且由5’T7启动子驱动表达。HRV-A16BAC已经构建了侧接衣壳基因的Sac I和Cla I限制性酶位点，这使得衣壳-嵌合HRV的工程化和挽救成为可能。所述载体充当体外T7转录的模板。产生的RNA转染到HeLa细胞中，并且容易产生感染性HRV。

图3A显示了指示灭活的HRV-A16的免疫原性不受从1到10的增加的效价的影响的数据。用具有或不具有明矾佐剂的1价灭活的HRV-A16对小鼠(每组5只小鼠)进行肌肉内疫苗接种或者用具有明矾的3价、5价、7价、或10价灭活的HRV对小鼠(每组20只小鼠)进行肌肉内疫苗接种。HRV类型和灭活-TCID₅₀剂量在补充表1中指定。疫苗接种后18天收集血清，并针对每组进行汇集。针对HRV-A16、HRV-A36、和HRV-A78测量血清nAb滴度。虚线代表检测限(LOD)。

图3B显示了HRV-A36的数据。

图3C显示了HRV-A78的数据。

图4A显示了指示灭活的多价HRV的免疫原性与剂量相关的数据。用由低灭活-TCID₅₀/剂量输入滴度(x-轴)组成的10价HRV疫苗(与1975Hamory等人，研究10相似)加以明矾(灰色符号)对小鼠(2组，每组20只)进行疫苗接种，或者用具有高灭活-TCID₅₀/剂量输入滴度的10价HRV疫苗加以明矾(黑色符号)对所述小鼠进行疫苗接种。在初免18天后收集血清，针对每组进行汇集，并针对疫苗中指示的类型测量nAb滴度(y轴)。虚线代表LOD。不可检测的nAb被指定为LOD/2，并且低于LOD的一些符号被微移以便可视化。

图4B显示了增强后18天的数据。

图5A显示了指示在小鼠中针对10价和25价灭活HRV的广泛的nAb应答的数据。表5中说明了每个剂量的灭活TCID₅₀输入滴度。对20只小鼠进行疫苗接种，然后用10价HRV在第50天进行加强。在第18天(初免)和第68天(加强)收集血清。在汇集的血清中测量针对疫苗中指示类型的nAb水平。虚线代表LOD。不可检测的nAb被指定为LOD/2。

图5B显示了30只小鼠的数据，所述小鼠进行了疫苗接种，然后在第50天时用25价HRV进行了加强。

图6A显示了指示在初免和加强后恒河猴中针对25价灭活HRV的广泛的nAb应答的数据。表6中说明了每个剂量的灭活TCID₅₀输入滴度。用25价HRV+明矾对两只恒河猴(RM A和RM B)进行肌肉内疫苗接种。RM在第28天接受相同的加强疫苗接种，并在第46天收集血清以确定加强免疫接种后的nAb滴度。虚线代表LOD。不可检测的nAb被指定为LOD/2。

图6B显示了其中在初免和加强后用50价HRV+明矾对两只恒河猴(RM C和RM D)进行肌肉内疫苗接种的数据。

具体实施方式

在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的具体实施例，因此这些当然可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的，并不旨在是限制性的，因为本披露的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用于实施或测试本披露中，然而现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合于此，就好像每个单独的公开物或专利被确切地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合于此从而结合引用的公开物披露和描述所述方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前披露而本披露不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独地确认。

如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例的每一个具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

除非另外说明，本披露的实施例将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等的技术，所述技术是在本领域的技术之内。此类技术在文献中得到充分解释。

必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。

术语“鼻病毒”或“HRV”(人类鼻病毒)是指根据最新分类学的小核糖核酸病毒科肠道病毒属的任何成员。有三种不同的鼻病毒物种：人类鼻病毒A(HRV-A)，也称为A型鼻病毒；人类鼻病毒B(HRV-B)，也称为B型鼻病毒；和人类鼻病毒C(HRV-C)，也称为C型鼻病毒。

HRV进一步根据其血清型进行分类，其中多于150多种已经见报道。

如本文所用，术语“血清型”是指一组鼻病毒内的亚类，并且取决于鼻病毒的VP1基因序列。鼻病毒的给定血清型可含有一个或几个以次要特征区分的毒株。根据其他几个参数对HRV进行分类，包括受体特异性、抗病毒敏感性和核苷酸序列同源性。HRV-A物种具体地包括以下83种血清型：HRV-A1A、HRV-A1B、HRV-A2、HRV-A7、HRV-A8、HRV-A9、HRV-A10、HRV-A11、HRV-A12、HRV-A13、HRV-A15、HRV-A16、HRV-A18、HRV-A19、HRV-A20、HRV-A21、HRV-A22、HRV-A23、HRV-A24、HRV-A25、HRV-A27、HRV-A28、HRV-A29、HRV-A30、HRV-A31、HRV-A32、HRV-A33、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A38、HRV-A39、HRV-A40、HRV-A41、HRV-A43、HRV-A44、HRV-A45、HRV-A46、HRV-A47、HRV-A49、HRV-A50、HRV-A51、HRV-A53、HRV-A54、HRV-A55、HRV-A56、HRV-A57、HRV-A58、HRV-A59、HRV-A60、HRV-A61、HRV-A62、HRV-A63、HRV-A64、HRV-A65、HRV-A66、HRV-A67、HRV-A68、HRV-A71、HRV-A73、HRV-A74、HRV-A75、HRV-A76、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A80、HRV-A81、HRV-A82、HRV-A85、HRV-A88、HRV-A89、HRV-A90、HRV-A94、HRV-A96、HRV-A100、HRV-A101、HRV-A102、HRV-A103、HRV-A104、HRV-A105、HRV-A106、HRV-A107、HRV-A108、和HRV-A109；HRV-B物种具体地包括以下32种血清型：HRV-B3、HRV-B4、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-B26、HRV-B27、HRV-B35、HRV-B37、HRV-B42、HRV-B48、HRV-B52、HRV-B69、HRV-B70、HRV-B72、HRV-B79、HRV-B83、HRV-B84、HRV-B86、HRV-B91、HRV-B92、HRV-B93、HRV-B97、HRV-B99、HRV-B100、HRV-B101、HRV-B102、HRV-B103、HRV-B104、HRV-B105、和HRV-B106；并且HRV-C物种具体地包括以下55种血清型：HRV-C1、HRV-C2、HRV-C3、HRV-C4、HRV-C5、HRV-C6、HRV-C7、HRV-C8、HRV-C9、HRV-C10、HRV-C11、HRV-C12、HRV-C13、HRV-C14、HRV-C15、HRV-C16、HRV-C17、HRV-C18、HRV-C19、HRV-C20、HRV-C21、HRV-C22、HRV-C23、HRV-C24、HRV-C25、HRV-C26、HRV-C27、HRV-C28、HRV-C29、HRV-C30、HRV-C31、HRV-C32、HRV-C33、HRV-C34、HRV-C35、HRV-C36、HRV-C37、HRV-C38、HRV-C39、HRV-C40、HRV-C41、HRV-C42、HRV-C43、HRV-C44、HRV-C45、HRV-C46、HRV-C47、HRV-C48、HRV-C49、HRV-C50、HRV-C51、HRV-C52、HRV-C53、HRV-C54、和HRV-C55。

HRV血清型也可以根据受体使用情况分为次要组病毒和主要组病毒。

次要组病毒，如HRV-A2，使用低密度脂蛋白受体家族作为受体。它们是酸不稳定的，并且对于脱壳具有绝对的低pH依赖性。诸如HRV-B14和HRV-A16的主要组病毒使用细胞间粘附分子1(ICAM-1)作为受体。它们通常也是酸不稳定的，但是与小组病毒不同的是，它们对于脱壳不具有绝对的低pH依赖性。

如本文所用的术语“受试者”是指任何动物、优选人类患者、牲畜或家养宠物。

如本文所用的术语“预防”和“防止”包括复发、扩散或发作的预防。并不旨在将本披露限制为完全预防。在一些实施例中，发作被延迟，或严重性被降低。

如本文所用的术语“治疗(treat)”和“治疗(treating)”并不限于受试者(如患者)被治愈并且疾病被根除的情况。相反，本披露的实施例还考虑了仅仅减轻症状和/或延缓疾病发展的治疗。

术语“核酸”是指核苷酸的聚合物或多核苷酸。所述术语用于表示一个单个分子或多个分子的集合。核酸可以是单链或双链的，并且可以包括编码区和各种控制元件的区域，如以下所述。

术语指定的多肽“编码核酸序列”是指包括基因的编码区的核酸序列或换言之编码基因产物的核酸序列。编码区可以按cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可以是单链的(即正义链)或双链的。如果需要允许适当地启动原始RNA转录物的转录和/或正确的加工，则可以紧邻基因的编码区放置适合的控制元件，如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等。可替代地，在本披露的表达载体中使用的编码区可以包含内源性增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷酸化信号等或内源性和外源性的两种控制元件的组合。

当就核酸分子而言时，术语“重组”是指包含通过分子生物学技术而连接在一起的核酸区段的核酸分子。当就蛋白质或多肽而言时，术语“重组”是指使用重组核酸分子表达的蛋白质分子。

术语“载体”或“表达载体”是指包含所希望的编码序列和用于可操作地连接的编码序列在具体宿主有机体或表达系统中的表达所必须的适当核酸序列的重组核酸，例如细胞的或无细胞的。在原核生物中的表达所必须的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选的)、以及核糖体结合位点，经常连同其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止以及聚腺苷酸化信号。重组载体通常含有可选择的标记。

“可选择标记”是引入编码多肽的重组载体的核酸，所述多肽赋予了适用于人工选择或鉴别的性状(报告基因)，例如，β-内酰胺酶赋予了抗生素抗性，其允许表达β-内酰胺酶的有机体在生长介质中抗生素的存在下存活。另一个实例是胸苷激酶，其使得宿主对更昔洛韦选择敏感。它可以是可筛选标记，所述可筛选标记允许人们基于预期的颜色的存在或不存在，在想要和不想要细胞之间进行区分。例如，lac-z基因产生β半乳糖苷酶，所述β半乳糖苷酶在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的存在下赋予蓝色。如果重组体插入使lac-z基因失活，那么产生的菌落是无色的。可以存在一个或多个可选择标记，例如，一种能够补充表达有机体不能合成的其生长所需的具体化合物(营养缺陷型)的酶和一种能够将化合物转化为对生长有毒的另一种化合物的酶。URA3(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)是尿嘧啶生物合成所必须的，并且可以补充营养缺陷型的ura3突变体的尿嘧啶。URA3还将5-氟乳清酸转化成有毒化合物5-氟尿嘧啶。另外考虑到的可选择标记包括赋予抗细菌抗性或者表达荧光蛋白的任何基因。实例包括但不限于以下基因：amp^r、cam^r、tet^r、杀稻瘟菌素^r、neo^r、hyg^r、abx^r、霉素磷酸转移酶II型基因(nptII)、p-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfp)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(luxAB)、双丙氨磷抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿拉伯糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶I(galT)、邻氨基苯甲酸合酶的反馈不敏感的α亚基(OASA1D)、2-脱氧葡萄糖(2-DOGR)、苄腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱氨酶、谷氨酸1-半醛氨基转移酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、耐盐基因(rstB)、铁氧还蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合成酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(lyr)、二氢二皮考啉酸合酶(dapA)、色氨酸合酶β1(AtTSB1)、脱卤素酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)、和D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。

在某些实施例中，本披露涉及一种包括编码本文中披露的HRV多蛋白或其嵌合蛋白的核酸的重组载体。当关于多肽使用时，术语“嵌合体”是指从不同基因获得的已经克隆在一起并且在翻译之后充当一个单一多肽序列的两个或更多个编码序列的表达产物。嵌合多肽还被称为“杂合”多肽。编码序列包括从相同或从不同病毒血清型中获得的那些。

当关于多肽使用时，术语“融合”是指含有连接至外源蛋白片段(融合配偶体)的感兴趣蛋白的嵌合蛋白。融合配偶体可以发挥多种功能，包括增强感兴趣多肽的溶解度，以及提供“亲和力标签”以允许从宿主细胞或从上清液或从两者纯化重组的融合多肽。如果需要，融合配偶体可以在纯化之后或纯化期间从感兴趣蛋白中去除。

在某些实施例中，所述重组载体任选地包括哺乳动物、人类、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母有关的复制原点或基因，如基因或反转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS核苷酸区段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、和vpx的基因或选自gag、pol、和env的结构基因。

在某些实施例中，所述重组载体任选地包括基因载体元件(核酸)如选择标记区域、lac操纵子、CMV启动子、杂合鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7RNA聚合酶启动子、SP6RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠后调节元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、反向末端重复(ITR)、FLAG标签编码区、c-myc标签编码区、金属亲和力标签编码区、链霉亲和素结合肽标签编码区、聚组氨酸标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、聚腺苷酸化编码区、SV40多腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点、或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、loxP位点、Cre重组酶编码区、或多克隆位点，如在小于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6、或7或更多个限制性位点或在小于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4或更多个限制性位点。

术语“基因”还涵盖一个结构基因的编码区并且包括邻近于所述编码区在5'和3'末端上距任一端约1kb距离定位以使得所述基因对应于全长mRNA的长度的序列。位于编码区的5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。定位在编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖一种基因的cDNA形式和基因组形式两者。一种基因的基因组形式或克隆包含间杂有称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列的编码区。内含子是转录成核RNA(mRNA)的基因的区段；内含子可以含有调节元件，如增强子。内含子被从核或初级转录物中移除或“剪切掉”；因此信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译期间起到指明新生多肽中氨基酸的序列或次序的作用。

除了含有内含子之外，一种基因的基因组形式还可以包括RNA转录物上存在的定位在所述序列的5'和3'末端上的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列定位在mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区可以含有调节序列，如控制或影响所述基因的转录的启动子和增强子。3'侧翼区可以含有指导转录的终止、转录后裂解和聚腺苷酸化的序列。

术语“异源基因”是指编码不处于其天然环境(即，通过人手改变过的)的因子的基因。例如，异源基因包括从一个病毒血清型引入到另一个血清型中的基因。异源基因还包括已经以一些方式改变(例如，突变、加入多个拷贝、连接至非天然启动子或增强子序列等)的生物体天然具有的基因。异源基因可包括包含病毒基因的cDNA形式的病毒基因序列；cDNA序列可以有义(以产生mRNA)或反义取向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)表达。异源基因与内源病毒基因的区别在于异源基因序列典型地连接至包含调节元件如启动子的核苷酸序列，所述启动子未被发现与由所述异源基因编码的蛋白的基因或与染色体中的病毒基因序列天然相关联，或与未在自然中发现的染色体的部分相关联(例如，在通常不表达基因的基因座中表达的基因)。

术语“转染”是指将外源核酸引入细胞中。转染可以通过本领域已知的多种方法完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、玻璃珠、电穿孔、微注射、脂质体融合、DNA或RNA脂转染、原生质体融合、病毒感染、基因枪法(即，粒子轰击)等等。

术语“纯化的”是指从其天然环境中去除的、隔离的或分离的分子(核酸或氨基酸序列)。因此，“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子是至少60％、优选至少75％、并且更优选至少90％不含与它们天然相关联的其他组分。如本文所使用的，术语“纯化的”或“纯化”还指从样品中去除污染物。

术语“宿主细胞”是指能够复制和/或转录和/或翻译异源基因的任何细胞。因此，“宿主细胞”是指任何真核生物或原核生物细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞以及昆虫细胞)，不论是位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。

“免疫有效量”是足以增强针对输入抗原的个体(例如人类)的自身免疫应答和/或提供针对后续暴露的保护的量。诱导的免疫水平可以例如通过测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量来监测(例如通过噬菌斑中和、补体固定、酶联免疫吸附或微量中和测定)。

“保护性免疫应答”是指当个体(例如人类)随后暴露于和/或被感染时由个体展现的针对上和/或下呼吸道疾病(例如，感冒和/或肺炎)的保护性免疫应答。

人类鼻病毒(HRV)和疫苗

HRV具有正义RNA基因组。RNA包含5'和3'非翻译区(NTR)，其具有3'末端poly(A)尾；以及编码单个多蛋白的开放阅读框。当转染到细胞中时，来自重组cDNA克隆的病毒体RNA和合成的基因组长度RNA具有感染性，产生病毒颗粒以及后续轮次的病毒复制。参见Yang等人[J Virol[病毒学杂志],2002,76:7485]。5'-NTR具有内部核糖体进入位点，但缺乏mRNA的5’端帽结构，因此细胞翻译绕过5'编码的病毒蛋白(VPg)。

多蛋白包含三个与病毒蛋白酶切割顺序相关的区段。N-末端区段P1含有4种衣壳蛋白：VP4、VP2、VP3和VP1。VP2、VP3和VP1暴露在衣壳的外部。P2和P3区段由非结构蛋白构成。所述包括2A(蛋白酶)、2B、2C、3A、3B(VPg)、3C(蛋白酶)、和3D(聚合酶)。前体包括2BC、3AB和3CD。

HRV属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属，并由编号血清型提及。有三种HRV：A、B和C。Cooney等人报告了90种鼻病毒血清型的抗原分组。Infect Immun[感染与免疫]37,642-647(1982)。存在HRV血清型的抗原组(其展现交叉中和)，其中一些血清型配对在使用动物中产生的高滴度抗血清时展现相互中和。HRV的分子流行病学显示血清型数量多而稳定，并且在HRV中不会像在流感中那样发生“抗原漂移”。

美国公开的专利申请号2010/0233677报道了80种人类鼻病毒(HRV)的基因组序列。下表1中引用了某些血清型的基因组序列。

表1提供了公共数据库上的血清型序列

混合灭活的HRV毒株或装配的毒株的空衣壳蛋白(所述毒株例如等于或大于代表的10、15、20、25、30、35、40、45、50种或更多种血清型)，可以引发保护性中和抗体(nAb)对大量HRV类型的应答。本文披露了任选地与期望的佐剂组合的多价HRV疫苗。在某些实施例中，HRV组合物包含多于9种血清型的灭活HRV和考虑了鼻内(i.n)或肌肉内(i.m)给予的方法。

对原本健康的成年人的感染会引起普通感冒的症状。因此，在某些实施例中，本披露涉及预防HRV感染的方法，其通过以定期或例行的时间表，例如每六个月、每一年或两年或更长的时间向受试者给予本文披露的组合物。呼吸道病毒感染与哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的加重的高百分比相关联。因此，在某些实施例中，本披露涉及管理或预防阻塞性呼吸道病症和疾病的加重，其包括将本文披露的组合物给予至被诊断为患有阻塞性呼吸道病症，如哮喘的肺部加重、COPD、肺气肿、慢性支气管炎、或囊性纤维化(“CF”)，展现出以上所列疾病的症状，或处于以上所列疾病的风险的受试者。

HRV C感染与儿童严重呼吸系统疾病相关联。因此，在某些实施例中，本披露涉及治疗或预防HRV感染，其包括给予本文所披露的组合物，例如包含作为减弱或灭活的(杀死的)病毒的HRV C血清型或重组病毒或者重组HRV C衣壳蛋白的组合物。

在生命早期的HRV感染可与儿童后期哮喘的发展相关联。因此，在某些实施例中，本披露考虑了预防哮喘，其包括将本文披露的组合物给予至小于2、3、4、5、或6个月、或两个月和六个月之间、六个月和一岁之间、或超过一岁的儿童。

在某些实施例中，本披露考虑了重组产生的衣壳-嵌合HRV，即由编码异源蛋白的HRV RNA产生，例如其中至少一个VP4、VP2、VP3、或VP1衣壳蛋白是HRV的第一血清型的序列并且至少一种非衣壳蛋白例如2A、2B、2C、3A、3B、3C和/或3D是第二血清型的序列，并且第一和第二血清型不是相同的血清型，因为它们是不同的，例如，VP4、VP2、VP3、VP1、和2A是HRV-A2的，而其余的蛋白是HRV-A16或HRV-A80的。

在某些实施例中，本文披露的组合物的任一种可包含其他抗病毒剂，例如：阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近(ampligen)、阿比朵尔、阿扎那韦、立普妥(atripla)、波西普韦、西多福韦、双汰芝、达芦那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、二十二烷醇、依度尿苷(edoxudine)、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸钠、磷乙酸钠(fosfonet)、更昔洛韦、伊巴他滨(ibacitabine)、imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、III型干扰素、Ⅱ型干扰素、I型干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、美替沙腙、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平、nexavir、奥司他韦(达菲)、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普利康那利(pleconaril)、鬼臼毒素、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、三氟胸苷、三协唯(trizivir)、醋胺金刚烷、特鲁瓦达、伐昔洛韦(valaciclovir/Valtrex)、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷、扎西他滨韦拉米啶(viramidine zalcitabine)、扎那米韦(瑞乐沙(Relenza))、齐多夫定、和/或vapendavir、其衍生物或盐。

Biota pharmaceuticals[Biota制药公司]正在研究vapendavir在具有症状性人类鼻病毒感染的患哮喘成年人中的用途。Matz,Am J Respir Crit Care Med[美国呼吸与重症护理医学杂志],187,2013:A5497。Vapendavir(3-乙氧基-6-(2-(1-(6-甲基哒嗪-3-基)哌啶-4-基)乙氧基)苯并[d]异噁唑)是具有抗病毒活性的衣壳粘合剂。认为作用机制为干扰感染周期的早期步骤。

在某些实施例中，本文披露的任何组合物可以用于本文披露的任何方法，其中将其他抗病毒剂，例如，vapendavir、其衍生物或盐组合给予。因此，在一些实施例中，本披露涉及通过给予与其他抗病毒剂例如vapendavir或其衍生物或盐组合的本文所披露的包含杀死的、灭活病毒、减弱病毒、VP4、VP2、VP3、和VP1蛋白、HRV血清型和/或重组HRV的组合物来预防或治疗任选地被HRV感染的患有基础呼吸疾病(包括中等到严重哮喘和慢性阻塞性肺病)的患者。

病毒定量

TCID₅₀是指50％组织培养感染剂量。这是传染性病毒滴度的标准量度。这种端点稀释测定定量在50％接种的组织培养细胞中产生细胞病变效应(CPE)所需的病毒量。当用于组织培养的背景时，将宿主细胞铺板并添加病毒的连续稀释液。孵育后，手动观察细胞死亡(即感染的细胞)百分比并记录每种病毒稀释度，并使用结果以在数学上计算TCID₅₀结果。Reed和Muench方法[Reed和Muench,Am.J.Hyg[美国卫生杂志],1938,27:493]可用于计算TCID₅₀端点滴度。简而言之，TCID₅₀方法允许增加来自感染了病毒连续稀释物的组织培养细胞(例如HeLa细胞)的平板中的病毒阳性孔的总数，并将数据转化为代表端点的滴度(组织培养感染剂量在这一点上为50％)。以下公式用于进行计算：

i.适当的距离＝

(在大于50％稀释度下的CPE％)–(50％)

(在大于50％稀释度下的CPE％)–(在小于50％稀释度下的CPE％)

ii.-Log＝大于50％CPE比率下的稀释度(即，10^-3是-3)

iii.((PD)+(-log(稀释度区间))

iv.TCID₅₀＝10^(ii+iii)

给药和剂量

在某些实施例中，本披露涉及如本文所描述的包含预防或治疗有效量的一种或多种HRV疫苗的组合物。HRV疫苗的混合物可以存在于相同的药物组合物(单一剂型)或分开的药物组合物(分开的剂型)中，其在同时或在不同的时间给予。所述组合物可以配制为用于在各种药物递送系统中使用。一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在组合物中以用于适当配制。病毒可以是冻干形式或溶解在生理上相容的溶液或缓冲液(如盐水或水)中。制备和配制的标准方法可以如例如在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学](第18版),编辑A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company[Mack出版公司],Easton[伊斯顿],Pa[宾夕法尼亚州]中所述的来使用。

对于疫苗用途，根据本公开产生的病毒可以直接在疫苗配制品中使用，或如所希望的使用技术人员众所周知的冻干方案来冻干。冻干的病毒将典型地维持在约4摄氏度下。当准备使用时，在稳定液(例如，盐水或包含SPG、Mg和HEPES)中，在有无佐剂的情况下重新构成冻干病毒，如在下文进一步描述的。

可以将经修饰的、减弱的、灭活的病毒或重组病毒衣壳引入具有生理上可接受的载体和/或佐剂的宿主中。有用的载体在本领域中是众所周知的，并且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘胺酸、透明质酸等。所得的水溶液可以被包装以供原样使用，或者被冻干，如上文所提及的在给药前将所述冻干制剂与无菌溶液组合。组合物可以含有如接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等等。可接受的佐剂包括弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、或明矾。

组合物旨在用于鼻内、肠胃外、局部、口服、或局部给予以用于预防性和/或治疗性治疗。典型地，组合物通过鼻内(例如通过气雾剂吸入或滴鼻剂)、肠胃外(例如通过肌肉内、皮下、或静脉内注射)、或通过口服摄取、或通过局部应用或关节内注射来给予。另外的给药途径包括血管内、动脉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜外内部以及眼内、巩膜内、眼眶内、直肠或局部给予。持续释放给予是通过诸如积存注射或易蚀性植入物或组分的方式，也特定地包括在本披露中。因此，本披露提供了用于粘膜或肠胃外给予的组合物，所述组合物包含溶解或悬浮于可接受载体(优选水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等等)中的上述药剂。所述组合物可以包含如接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等等。

所述组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以无菌过滤。所得的水性溶液可以被包装以用于以原样使用，或者被冻干，在给予前将所述冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常是3和11之间，例如5和9之间、6和8之间、或7和8之间，如7至7.5。所得的固体形式的组合物可以例如在片剂或胶囊的密封包装中以多个单剂量单位包装，每个单剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。所述组合物还可以包含冻干形式的一种或多种活性成分，其被重构以用于给药。

可以给予含有有效量疫苗的组合物以用于预防性和/或治疗性处理。在预防性应用中，可将组合物给予至对HRV感染易感性增加的受试者(例如，人类受试者)。本披露的组合物将以足以延迟、减少或预防临床或亚临床疾病发作的量给予至受试者(例如人类)。在治疗应用中，以足够治愈或至少部分地抑制病症的症状及其并发症的量将组合物给予至已经患有HRV感染的患者(例如，人类)。足够实现此目的的量被定义为“治疗有效剂量”。合适的剂量和方案的确定是本领域技术人员可以容易地确定的。对这种用途有效的量可以取决于疾病或病症的严重程度以及患者的体重和一般状态，但通常为每个患者每个剂量从约0.5mg至约3000mg范围的一种或多种药剂。

疫苗可以仅施用一次或以初免/加强方案给予。用于初始给予和加强给予的适合的方案由初始给予、接着通过随后给予在一个或多个每小时、每天、每周、或每月间隔的重复剂量作为典型。存在于本披露的组合物中的总有效量的药剂可以在一段相对较短的时间内作为大丸剂或通过输注作为一个单一剂量给予至一种哺乳动物，或可以使用一种分级治疗方案给予，其中在一段更长的时间段内给予多个剂量(例如，每4-6小时、8-12小时、14-16小时、或18-24小时、每2-4天、每1-2周、每月一次一个剂量)。

施加至哺乳动物(例如，人类)的存在于本披露的组合物内和用于本披露的方法中的治疗有效量的一种或多种药剂可以通过本领域技术人员在考虑哺乳动物的年龄、体重、免疫系统完整性、和病症方面的个体差异的情况下来确定。本披露的药剂以有效量给予至受试者(例如哺乳动物，诸如人类、小鼠、家畜(例如，牛、绵羊、或猪)、家养宠物(例如猫或狗)，所述有效量是在治疗的受试者中产生期望结果(例如，预防易感个体中的HRV感染或减轻感染个体的症状)的量。这样的治疗有效量可以由本领域技术人员凭经验来确定。

本披露的疫苗可以与其他疫苗接种途径以及其他治疗途径(例如，基于小分子的途径)组合使用。例如，病毒可以与包括相同或不同抗原的其他重组疫苗组合给予。本披露的组合方法可以包括将本披露的疫苗与其他形式的抗原共同给予。可替代地，本披露的疫苗可以按初免-加强策略与其他途径(例如亚单位或HBc途径(HBc-M2e；Fiers等人，VirusRes.[病毒研究]103:173-176,2004；WO 2005/055957；US 2003/0138769 A1；US 2004/0146524A1；US 2007/0036826 A1))组合使用，其中使用本披露的疫苗或其他途径作为初免，随后使用其他途径作为加强，或相反。此外，本披露包括初免-加强策略，其使用本披露的疫苗作为初免和加强剂两者。

本披露的疫苗可以使用标准方法给予至受试者，例如哺乳动物(例如，人类受试者)。在鼻内给予的情况下，所述组合物可以以滴鼻剂的形式或通过吸入雾化的或喷雾状配制品来给予。

本披露的组合物可以作为活的或杀死的疫苗或组装的衣壳蛋白给予至受试者，例如人类。减弱的活疫苗可以使用本领域技术人员已知的方法在鼻内给予(参见例如Grunberg等人，Am.J.Respir.Crit.Car.Med.[美国呼吸与重症护理医学杂志]156:609-616,1997)。本领域技术人员可以容易地确定适当的剂量和方案。作为例子，剂量范围可以是例如每个剂量10⁴至10⁹TCID₅₀。疫苗可有利地以单剂量给予，然而，如果本领域技术人员确定是必需的，则也可以进行加强。至于灭活的疫苗，病毒可以用例如福尔马林或UV或β-丙内酯处理来杀死，并且任选地与适当的佐剂(例如铝)一起以约10^4-9当量TCID₅₀/剂量鼻内或肌肉内给予。在这样的途径中，给予多于一个(例如2-3个)剂量可以是有利的。可以类似地使用一个或多个剂量鼻内或肌肉内给予重组产生的衣壳蛋白，任选地与适当的佐剂一起。

佐剂

对于疫苗应用，任选地，可以使用本领域技术人员已知的佐剂。在鼻内给予的情况下，可使用甲壳质微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等人,Microbes and Infection[微生物与感染]8:2706-2714,2006；Ozdemir等人,Clinical and Experimental Allergy[临床与实验过敏]36:960-968,2006；Strong等人,Clinical and Experimental Allergy[临床与实验过敏]32:1794-1800,2002)。其他适用于通过粘膜途径给予(例如鼻内或口服途径)的佐剂包括大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)或其突变体衍生物。在灭活的病毒和衣壳蛋白的情况下，可以使用肠胃外佐剂，包括例如铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝、或羟基磷酸铝化合物)，脂质体配制品，合成佐剂例如(像QS21)胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、或聚膦嗪。此外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入载体中。因此，可以将编码细胞因子如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、或IL-5的基因与外源抗原基因一起插入以产生导致增强的免疫应答的疫苗，或调节更特异性地针对细胞应答、体液应答或粘膜应答的免疫力。可替代地，细胞因子可以通过众所周知的方式(例如，直接接种、裸DNA、在病毒载体中等)与重组疫苗病毒同时或依次分开地递送。

实例

开发HRV疫苗的主要障碍是血清型的数量(>100)。已经发现，使用本文披露的方法，HRV血清型的数量可以部分地克服。关于组合疫苗(多价)的一个担心是独特的抗原会相互竞争或相互干扰。据发现，情况并非如此，因为当以单价、3价、5价、7价或10价组合物(图1和2)给予时，灭活的HRV血清型在小鼠中是有等同的免疫原性的。此外，将10个HRV高滴度参考血清型毒株(表2)共混以产生HRVV-10。HRVV-10针对10种HRV血清型在小鼠中引发了血清nAb(图3)。

表2.包括在HRVV-10中的HRV血清型

HRV原液

HRV原型毒株购自美国种质保存中心(ATCC)，并通过在T-75cm²烧瓶中的H1-HeLa细胞(ATCC)繁殖。在细胞病变效应的高峰处，将细胞刮落在培养基中，进行声处理，澄清细胞碎片，并且将50mL上清液等分并在液氮中快速冷冻。在96孔板中通过感染的H1-HeLa细胞的结晶紫染色法来滴定测量感染性。使用Reed和Muench端点稀释计算传代#1(P1)原液的TCID₅₀滴度。

通过在具有P1原液的10个T-182cm²烧瓶中在不含酚红的培养基中感染H1-HeLa细胞来产生滴度浓缩的P2原液。在感染高峰之前，从每个烧瓶中丢弃45mL培养基，并且将细胞刮落在剩余的5mL中，进行声处理，澄清碎片，并将5mL上清液汇集成两个25mL的等分试样并速冻。通过所述方法产生浓缩的HRV-A16P2原液，并实现了超过P1原液10倍的滴度增加。

由Abbott Labs[雅培公司]在1964年生产并由Chanock(其从事针对同源毒株激发的志愿者工作)测试的单价HRV疫苗包含大约10^5.5当量TCID₅₀/剂量的灭活HRV-A13，并且所述疫苗在人类受试者中诱导nAb[Buscho等人(1972)J.Immunol.[免疫学杂志]108:169]。失败的两种10价灭活的HRV疫苗中，每个剂量的10种血清型具有10^3.3当量TCID₅₀的输入滴度均值[Hamory等人J Infect Dis.[感染病学杂志]1975,132(6):623-9]。单价和10价人类疫苗都是不含有佐剂的。

HRV BAC

HRV-A16的cDNA克隆(图1)通过商业合成cDNA和分子组装而产生。HRV基因组和poly(A)尾由7199bp cDNA编码。转录由T7启动子(5'T7启动子-核酶-HRP-A16-核酶--T7终止子-3')引导。由于核酶切割，体外T7转录产生具有预测的内源性末端的7.2kb RNA。HRV衣壳蛋白(VP4、VP2、VP3、VP1)在构建体中侧接SacI和ClaI限制性位点(图1)。可以合成代表任何HRV类型的这种衣壳区的cDNA。可以产生和挽救重组的衣壳-嵌合HRV，例如，编码HRV-A2的VP4、VP2、VP3、VP4、和2A蛋白以及HRV-A16或HRV-A80的2B、2C、3A、3C、和3D蛋白的HRV-cap2/16。

体内测试

四组小鼠分别给予1种HRV血清型+明矾、3种HRV血清型+明矾、5种HRV血清型+明矾、或7种HRV血清型+明矾(表4)。在与明矾混合之前，使用甲醛(1:4000的比率)在37℃下将HRV毒株完全灭活72小时。每只小鼠肌肉内注射100微升的疫苗。HRVV-10的每个剂量由9微升灭活的各病毒原液(表2)、加上10微升铝胶、2％氢氧化铝胶体佐剂构成。

表3.

所有小鼠在第0天通过肌肉内途径用灭活的HRV+明矾进行疫苗接种，并在第18天收集血清。然后，在nAb测定中使用HRV测量血清中的端点中和抗体滴度。观察针对所有免疫HRV毒株(HRV-A13除外)的中和抗体滴度。

50价灭活的鼻病毒疫苗在恒河猴中具有广泛的免疫原性

使用BALB/c小鼠测试免疫原性。HRV在H1-HeLa细胞中繁殖并使用福尔马林灭活感染性。来自初试小鼠的血清中没有可检测的针对HRV-A16的nAb。明矾佐剂增强了由肌肉内灭活的HRV-A16诱导的nAb应答(图3)。对于由灭活的HRV-A16诱导的nAb应答或针对3价疫苗中的3种类型(HRV-A16、HRV-A36和HRV-A78)的nAb应答没有效价影响(比较1价、3价、5价、7价和10价)(图3)。提供了灭活前输入病毒的50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)滴度(灭活-TCID₅₀)。

表4.

Hamory等人报道了两种不同的10价灭活的HRV制剂针对受体受试者中仅30％-40％的输入病毒类型诱导nAb滴度。J Infect Dis[感染病学杂志]132,623-629(1975)。然而，灭活前病毒的输入滴度范围为从10^1.5至10^5.5TCID₅₀/mL，并且然后将它们稀释10倍以产生10价1.0ml的剂量，其作为初免和加强在没有佐剂的情况下在肌肉内给予。低输入抗原剂量可导致对10价灭活HRV的不良nAb应答。重构Harmony中的10价疫苗，尽可能具有可获得的HRV类型，每个疫苗剂量的灭活TCID₅₀超过10¹-10⁵，并将其以每个剂量的灭活TCID₅₀>10⁵至>10⁷的输入滴度范围与相同类型的10价疫苗进行比较。Hamory疫苗在初免疫苗接种后没有导致可检测的nAb。加强疫苗接种后，针对具有最高输入滴度的五种类型检测到了nAb(图3)。高滴度疫苗在初免疫苗接种后针对10种类型中的5种产生了nAb，并且在加强后，针对10种类型都产生了nAb(图4)。

在所述模型中，在加强疫苗接种之后，对于诱导nAb，每个疫苗剂量阈值显现灭活的TCID₅₀为10⁴(图4b)。在此滴度之上，输入负荷与nAb诱导之间没有相关性。

人们使用的可注射疫苗通常以0.5ml剂量给予。小鼠的肌肉内疫苗体积为0.1mL。在作为可缩放的原型的小鼠中测试到每0.1mL HRV疫苗为25价。为了适应体积调节，对于每类型每个剂量，与10价组合物相比，25价灭活的HRV疫苗具有低7.4倍的平均灭活TCID₅₀。

表5.

¹用于初免疫苗接种。

²用于加强疫苗接种。在初免和加强疫苗接种的中间时期，我们获得了11种输入类型(粗体字)的更高滴度的病毒原液。更高滴度的这十一种被用于加强疫苗接种。

在初免和加强后，10价灭活的HRV疫苗对100％的输入类型诱导nAb(图5a)。由10价灭活的HRV诱导的nAb在加强后的203天内持续存在。25价灭活的HRV初免疫苗接种在25种病毒类型的18种(72％)中诱导了nAb，并且25价加强针对25种类型中的24种(96％)产生了nAb(图8b)。由初免+加强产生的平均nAb滴度对于10价为2⁷，并且对于25价为2^6.8。所述数据证实用简单的疫苗途径广泛地中和了不同的HRV类型。

为了增加疫苗效价，恒河猴(RM)和1.0ml肌肉内疫苗体积被选中。两只RM用25价灭活的HRV进行疫苗接种，并且两只RM用50价灭活的HRV进行疫苗接种。RM A和RM B中的免疫前血清对于包含在25价疫苗中的25种HRV类型没有可检测的nAb。每个剂量的灭活TCID₅₀滴度在RM中比在小鼠中高。

表6.

在初免疫苗接种后，25价疫苗针对输入病毒的96％(RM A)和100％(RM B)诱导nAb。在初免疫苗接种后，50价疫苗针对输入病毒的90％(RM C)和82％(RM D)诱导nAb。RM中初免疫苗接种后，nAb的广度优于在小鼠中观察到的，这可能是由于RM疫苗中的动物物种差异和/或更高的灭活TCID₅₀输入滴度所致。加强疫苗接种后，针对在25价HRV-疫苗接种的RM的100％类型有血清nAb滴度(图6A)，并且在50价HRV疫苗接种的RM的98％(50中有49个)的病毒类型中有血清nAb滴度(图6B)。在RM中由初免+加强产生的平均nAb滴度针对25价为2^9.3，并且针对50价为2^8.6。nAb应答是类型特异性的，无交叉中和性，因为25价疫苗针对10种非疫苗类型诱导的nAb最少。针对50价灭活的HRV疫苗的nAb应答在RM中是广泛和有效的。

基于这些实验，据估计，每类型每个剂量10^4-5灭活TCID₅₀将是有用的。因此，HRV原液滴度≥10⁷TCID₅₀/ml对于含有明矾佐剂的0.5ml剂量的潜在83价HRV A配制品将是有用的。用于我们的疫苗接种的HRV原液是在H1-HeLa细胞中生产的。

在H1-HeLa和WI-38中比较了10种HRV类型的感染产率，这可以进行用于疫苗生产的资格认定。从WI-38细胞中也获得了适当的产率。

材料与方法

从美国种质保存中心(ATCC)获得H1-HeLa(CRL-1958)和WI38(CCL-75)细胞，并在具有Richter’s改良、不添加酚红(MEM)(ThermoFisher[赛默飞世尔公司])、补充以10％的胎牛血清的最小基本培养基中培养。使用LookOut Mycoplasma检测试剂盒(Sigma[西格玛公司])测试HeLa-H1细胞，并且这些是支原体阴性的。HRV-A7(VR-1601)、HRV-A9(VR-1745)、HRV-A11(VR-1567)、HRV-A13(VR-286)、HRV-B14(VR-284)、HRV-A16(VR-283)、HRV-A19(V4-1129)、HRV-A24(VR-1134)、HRV-A29(VR-1809)、HRV-A30(VR-1140)、HRV-A31(VR-1795)、HRV-A32(VR-329)、HRV-A36(VR-509)、HRV-A38(VR-511)、HRV-A40(VR-341)、HRV-A41(VR-1151)、HRV-A49(VR-1644)、HRV-A53(VR-1163)、HRV-A56(VR-1166)、HRV-A58(VR-1168)、HRV-A59(VR-1169)、HRV-A60(VR-1473)、HRV-A64(VR-1174)、HRV-A66(VR-1176)、HRV-A68(VR-1178)、HRV-A75(VR-1185)、HRV-A76(VR-1186)、HRV-A77(VR-1187)、HRV-A78(VR-1188)、HRV-A80(VR-1190)、HRV-A81(VR-1191)、HRV-A85(VR-1195)、HRV-A88(VR-1198)、HRV-A89(VR-1199)、HRV-A96(VR-1296)、和HRV-A100(VR-1300)原型毒株购自ATCC。HRV-A1B、HRV-A10、HRV-A21、HRV-B26、HRV-A33、HRV-A34、HRV-A39、HRV-A45、HRV-A50、HRV-A51、HRV-A54、HRV-A55、HRV-A94毒株获得自疾病控制与预防中心。研究中的HRV是物种A(HRV-B14除外)，并且代表A物种。

HRV原液在H1-HeLa细胞中产生。将大约0.5ml的HRV接种到T-182烧瓶中的亚汇合H1-HeLa单层细胞上。在室温下摇动吸附1小时后，添加50ml HRV感染培养基(MEM补充有2％FBS、20mM HEPES、10mM MgCl₂、1X非必需氨基酸[Gibco目录11140-050])，并且允许感染在32℃下在5％CO₂湿润的培育箱中进行，直到感染后1至3天单层显现完全参与细胞病变效应(CPE)。刮落细胞，并且将细胞和培养基(大约50ml)转移到两个预先冷却的50ml锥形聚丙烯管中并保持在冰上，同时使用配备有固定在一个环架上的¹/₂英寸直径角状破碎器和¹/₄英寸直径锥形微探针的Sonic Dismembrator Model500(Fisher Scientific[赛默飞世尔公司])对每个悬浮液进行声处理。声处理是由操作人员在具有耳部保护的密闭室内，以10％的幅度，1秒开/1秒关的间隔和每1毫升材料1次脉冲下进行的。声处理比冻融会产生更高的滴度。通过以931×g离心10分钟，将悬浮液澄清。将上清液转移到冷冻管中，在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃下。为了比较H1-HeLa和WI-38细胞中的HRV产率，以0.1TCID₅₀/细胞的感染复数(MOI)感染T-75烧瓶的亚汇合细胞，并且弃去20ml培养基，之后在剩下的5ml中刮落细胞，然后用声处理。对于原液，通过用连续稀释的样品在96孔板中感染亚汇合的H1-HeLa细胞，用0.1％结晶紫/20％甲醇感染6天后对细胞染色，对孔的CPE评分，并使用在“估测50％端点的简单方法”中报告的Reed和Muench方法a(Am J Hyg[美国卫生杂志]27,493-497(1938))计算端点滴度，来测定TCID₅₀/mL滴度。

如上所述从H1-HeLa细胞单层收获HRV原液，并通过低速短暂离心(931×g，10分钟，4℃)去除大的细胞碎片进行澄清。为了通过亲和层析从粗制病毒原液中去除过量的白蛋白，根据制造商的说明使用系统(GE Healthcare[GE医疗集团])将上清液加载到HiTrap Blue HP柱(GE医疗集团)上。随后通过HiTrap Capto Core 700柱(GE医疗集团)将流经液加载以通过尺寸排阻层析(SEC)精制病毒制品。使用带有20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)的系统(GE医疗集团)捕获来自HiTrap Blue HP和HiTrap CaptoCore 700的流经液。将来自SEC的流经液用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)透析过夜，然后加载到HiTrap Q XL柱(GE医疗集团)上，并通过离子交换层析分离成级分。使用具有0.1MTris-HCl缓冲液(pH 8.0)和氯化钠梯度的系统(GE医疗集团)洗脱含有病毒的级分。收集在280nM处显示高吸收峰的级分，并通过TCID₅₀端点稀释测定分析病毒滴度，并通过银染(赛默飞世尔科技)在10％SDS-PAGE凝胶上可视化级分纯度。如下所述，将高病毒滴度和纯度的HRV-A16、HRV-A36和HRV-A78的级分合并以用于福尔马林灭活。

将年轻的成年(3-5kg，2-4岁，2只雌性和2只雄性)印度恒河猴(猕猴；RM)以盲检方式被分配到两个疫苗组(25价和50价)，每组一只雄性和一只雌性。在免疫之前，通过添加0.025％福尔马林，然后在37℃下搅拌72小时孵育，灭活所有HRV类型。在H1-HeLa细胞中通过端点TCID₅₀滴定确认感染性的完全灭活。与由β-丙内酯的替代性灭活相比，通过这种方法的福尔马林灭活导致小鼠的免疫原性更强，这表明福尔马林灭活保留了抗原决定簇。根据制造商的说明，用与100μg的2％铝胶佐剂(氢氧化铝湿凝胶悬浮液，明矾)(Sigma[西格玛公司]目录号A8222或Invivogen公司目录号vac-alu)混合的灭活HRV毒株对小鼠进行肌肉内疫苗接种。每只小鼠的总体积为100μL，以每只大腿50μL给予。在那时给予小鼠第二次相同的疫苗接种(加强)。用与500μg 2％铝胶佐剂混合的灭活HRV毒株对RM进行肌肉内疫苗接种。每只RM的总体积为1毫升，在一条腿上给予。在四周时，用相同的疫苗接种对RM进行加强。

在小鼠中，从下颌下静脉中将外周血收集到微量离心管中。将样品在室温下孵育20分钟以凝结。将管离心7500×g持续10分钟以分离血清。将血清样品从每组的小鼠中汇集，并且储存在-80℃下直至使用。在氯胺酮(10mg/kg)或舒泰(Telazol)(4mg/kg)麻醉下的禁食动物中，进行涉及RM的静脉切开术。用氯胺酮或舒泰麻醉后，将动物从股静脉放血。在血清分离管(SST)中收集血液后，将样品在室温下孵育30分钟。将管离心2500×g持续15分钟以分离血清。将来自个体RM的血清样品储存在-80℃下直至使用。

将H1-HeLa细胞接种在96孔板中以在24小时后达到80％-90％汇合率。将热灭活(56℃，30分钟)的血清样品在MEM中进行2倍连续稀释，并以等体积添加至500TCID₅₀/mL待测试的每种类型的HRV。将病毒和血清混合物在37℃下孵育1小时。然后，将50μL血清-病毒混合物一式三份转移到96孔板中的H1-HeLa细胞单层上，并将板在4℃下以2,095×g离心30分钟。对于每种类型，添加无血清对照以测试输入500TCID₅₀。我们在每个测定中作为标准测试了针对HRV-A16的汇集的HRV-A16抗血清。在离心后，每孔添加150μL HRV感染培养基。将96孔板在32℃和5％CO₂下孵育6天，并且然后如上所述用结晶紫染色。对各孔的CPE存在或不存在进行评分。通过Reed和Muench的方法测定中和抗体端点滴度和95％置信区间。95％置信区间指示在单个nAb实验中三个技术重复的变异性。

Claims (12)

1.一种组合物，所述组合物包含多于10种血清型肠道病毒的灭活病毒以及含有氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)或其混合物的佐剂。

2.处于液体形式的如权利要求1所述的组合物，其中每种血清型的浓度为大于1×10³TCID₅₀/mL。

3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含以下血清型：HRV-A16、HRV-A36、HRV-A78、HRV-A38、HRV-A2、HRV-B14、HRV-A9、HRV-A13、HRV-A29、HRV-A76、HRV-A60、HRV-A49、HRV-A41、HRV-A32、HRV-A58、和HRV-A11。

4.如权利要求1所述的组合物，其中鼻病毒是福尔马林灭活的，并通过下述方法产生：

将血清型与细胞在使得所述病毒在所述细胞中复制的条件下混合；在培养基中培养所述细胞并任选地纯化和/或浓缩所述病毒，使得终浓度等于或大于1×10⁶TCID₅₀/mL；并且

将所述病毒与甲醛在使得产生灭活病毒的条件下混合。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述细胞是人类永生细胞或其他细胞系。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述产生方法还包括通过尺寸排阻层析和/或离子交换层析纯化复制的病毒。

7.一种治疗或预防人类鼻病毒感染的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求1-6所述的免疫组合物给予至对其有需要的受试者。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述人类鼻病毒是灭活的并且以每个剂量高于1×10³TCID₅₀的浓度给予。

9.如权利要求8所述的方法，其中给予了一个剂量的疫苗并且在第一个剂量之后多于3天给予第二个剂量。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者小于五岁。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者大于60岁。

12.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有哮喘、COPD、肺气肿、慢性支气管炎、或囊性纤维化。