KR20180086180A - 다가 엔테로바이러스 백신 조성물 및 이와 관련된 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 다가 엔테로바이러스 백신 조성물 및 이와 관련된 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시는 다가의, 엔테로바이러스(예를 들어 HRV) 항원형의 혼합물 또는 재조합으로 생산된 변종 또는 재조합으로 생산된 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물의 유효량을 엔테로바이러스 감염의 증상을 나타내거나 이의 위험이 있는 것으로 진단받은 대상에 투여하는 것을 포함하는 면역화의 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은, 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 이에 포함되는, 2015년 6월 15일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/175,832호의 우선권의 이익을 주장한다.
인간 리노바이러스(HRV)는 인간에서 감염성 질환의 가장 흔한 원인이고 감기의 가장 흔한 원인인 피코르나바이러스 과(Picornaviridae virus family)의 엔테로바이러스(Enterovirus) 속의 양성 가닥 RNA 바이러스이다. HRV는 아동에서 지역사회-감염 폐렴의 주요 원인이다. 감기는 사회경제적 부담이고, 리노바이러스 감염은 면역손상된 노년 및 젊은 집단뿐 아니라 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)과 같은 만성 호흡기 질환이 있는 집단에서 심각한 합병증을 유도할 수 있다. HRV 백신 및 HRV 문제가 있는 인간 지원자에 대한 연구에서는 바이러스-중화 항체(nAb)가 보호와 상관관계가 있음을 보여주었다. HRV에 대한 백신의 개발에서는 100개가 넘는 항원형이 확인되었다는 사실이 방해가 되었다. Hamory 등은 두 개의 10가 리노바이러스 백신에 대한 저조한 인간 반응을 보고하였다[J Infect Dis. 1975, 132(6):623-9]. 따라서, 개선된 백신접종 접근법을 발견할 필요가 존재한다.
Matz는 성인 천식환자에서 자연적으로 획득된 리노바이러스 감염의 치료를 위한 바펜다비르의 용도를 보고한다. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187:A5497.
Edlmayr 등은 인간 리노바이러스로부터 재조합 VP1으로 유도된 항체가 교차-중화를 나타내는 것을 보고한다. Eur Respir J, 2011, 37:44-52.
Glanville 등은 보존된 리노바이러스 캡시드 단백질로의 면역화에 의해 유도된 교차-항원형 T 세포 면역을 보고한다. PLoS Pathog 2013, 9:e1003669. 또한, 미국 공개 출원번호 2016/0095916 및 2006/0088549 참조.
본원에 인용되는 참고문헌은 선행기술로 인정되는 것이 아니다.
본 개시는 다가 엔테로바이러스 백신 조성물 및 이와 관련된 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시는 다가의, 즉 인간 리노바이러스(HRV) 항원형의 혼합물, 복수의 항원형을 나타내는 다가의 재조합으로 생산된 HRV 균주, 또는 복수의 항원형을 나타내는 다가의 재조합으로 생산된 HRV 캡시드 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물의 유효량을 HRV 감염의 증상을 나타내거나 이의 위험이 있는 것으로 진단받은 대상에 투여하는 것을 포함하는 면역화의 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 개시는 엔테로바이러스 속의 10개보다 많은 항원형의 불활성화 또는 약독화 바이러스 및 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 명반(황산알루미늄칼륨), 또는 이의 혼합물을 포함하는 조성물, 예를 들어 인간 리노바이러스의 10개보다 많은 항원형의 불활성화 바이러스 및 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 명반(황산알루미늄칼륨), 또는 이의 혼합물을 포함하는 애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시되는 조성물은 액체 형태이고 여기에서 각각의 항원형은 용량 당 1×103 또는 104 TCID50보다 큰 농도이다.
특정 구현예에서, 유효량은 면역학적으로 유효한 양, 예를 들어 6, 12, 18, 또는 24개월보다 길게 복수의 항원형에 대한 보호적 면역 반응을 유도하는 양이다.
특정 구현예에서, 백신 조성물은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개보다 많은 HRV 항원형, 항원형을 나타내는 재조합 변이체, 또는 항원형을 나타내는 재조합 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 다음 항원형의 불활성화 HRV를 포함하는 조성물에 관한 것이다: HRV-A16, HRV-A36, HRV-A78, HRV-A38, HRV-A2, HRV-B14, HRV-A9, HRV-A29, HRV-A13, 및 HRV-A76. 특정 구현예에서, 조성물은 HRV-A11, HRV-A44, HRV-A60, HRV-A49, HRV-A41, HRV-A32, 및 HRV-A58 중 하나 이상의 항원형을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 HRV-A33, HRV-A50, HRV-A39, HRV-B26, HRV-A21, HRV-A94, HRV-A51, HRV-A55, HRV-A45, 및 HRV-A1B 중 하나 이상의 항원형을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 HRV-A100, HRV-A10, HRV-A66, HRV-A77, HRV-A40, HRV-A85, HRV-A54, HRV-A34, HRV-A24, HRV-A30, HRV-A75, HRV-A96, HRV-A19, HRV-A88, HRV-A7, HRV-A80, HRV-A68, HRV-A53, HRV-A89, HRV-A31, HRV-A56, HRV-A59, HRV-A64, 및 HRV-A81 중 하나 이상의 항원형을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 다음 항원형 HRV-A16, HRV-A36, HRV-A78, HRV-A38, HRV-A2, HRV-B14, HRV-A9, HRV-A13, HRV-A29, HRV-A76, HRV-A60, HRV-A49, HRV-A41, HRV-A32, HRV-A58, 및 HRV-A11의 불활성화 HRV를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 조성물은 HRV-A1B, HRV-A2, HRV-A9, HRV-A11, HRV-B14, HRV-A16, HRV-A21, HRV-B26, HRV-A29, HRV-A32, HRV-A33, HRV-A36, HRV-A38, HRV-A39, HRV-A41, HRV-A45, HRV-A49, HRV-A50, HRV-A51, HRV-A55, HRV-A58, HRV-A60, HRV-A76, HRV-A78, HRV-A94, HRV-A7, HRV-A10, HRV-A13, HRV-A19, HRV-A24, HRV-A30, HRV-A31, HRV-A34, HRV-A40, HRV-A53, HRV-A54, HRV-A56, HRV-A59, HRV-A64, HRV-A66, HRV-A68, HRV-A75, HRV-A77, HRV-A80, HRV-A81, HRV-A85, HRV-A88, HRV-A89, HRV-A96, 및 HRV-A100 중 하나 또는 10개보다 많이, 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 항원형을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 HRV가 세포를 감염시키는 조건 하에 HRV 항원형을 세포와 혼합하고; HRV가 복제하는 조건 하에 배지 중에서 세포를 배양하고, 바이러스를 수확하고, 선택적으로 정제 및/또는 농축하여 mL 당 1×106 50퍼센트 조직 배양 감염 용량 단위(fifty percent tissue culture infectious dose units, TCID50)와 같거나 이보다 큰 최종 농도로 HRV를 제공하고; 그리고 불활성화 HRV를 제공하는 조건 하에 HRV를 HRV-불활성화 물질과 혼합하는 공정에 의해 생산되는 불활성화 HRV에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 세포는 인간 불멸 세포 또는 다른 세포주이다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 단백질 알부민을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 5' 및 3' 비번역 HRV 영역을 측면으로 하는, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D를 포함하는 폴리단백질을 암호화하는 감염성 HRV RNA를 암호화하는 재조합 핵산과 관련되는데, 여기에서 VP4, VP2, VP3, 및 VP1 단백질 서열의 하나, 둘, 셋, 또는 전부는 제1 HRV 항원형 유래이고 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D 단백질 서열의 적어도 하나는 제2 HRV 항원형 유래로, 여기에서 제1 HRV 항원형 및 제2 HRV 항원형은 VP4, VP2, VP3, 및 VP1 단백질의 하나, 둘, 셋, 또는 전부에 대해 동일한 항원형 서열을 갖지 않는다.
특정 구현예에서, 제2 HRV 항원형은 HRV-A16 또는 HRV-A80이다.
특정 구현예에서, VP4, VP2, VP3, VP1, 및 2A는 HRV-A36, HRV-A78, HRV-A38, HRV-A2, HRV-B14, HRV-A9, HRV-A13, HRV-A29, 또는 HRV-A76 유래이고, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D 단백질 서열은 HRV-A16 또는 HRV-A80 유래이다.
특정 구현예에서, VP4, VP2, VP3, VP1, 및 2A는 HRV-A11, HRV-A44, HRV-A60, HRV-A49, HRV-A41, HRV-A32, 및 HRV-A58, HRV-A33, HRV-A50, HRV-A39, HRV-26, HRV-A21, HRV-A94, HRV-A51, HRV-A55, HRV-A45, 및 HRV-A1B, HRV-A100, HRV-A10, HRV-A66, HRV-A77, HRV-A40, HRV-A85, HRV-A54, HRV-A34, HRV-A24, HRV-A30, HRV-A75, HRV-A96, HRV-A19, HRV-A88, HRV-A7, HRV-A80, HRV-A68, HRV-A53, HRV-A89, HRV-A31, HRV-A56, HRV-A59, HRV-A64, 또는 HRV-A81 유래이고, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D 단백질 서열은 HRV-A16 또는 HRV-A80 유래이다.
특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 특유의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물과 관련되는데, 여기에서 각각의 특유의 핵산은 VP4, VP2, VP3, VP1, 및 2A에 대한 상이한 서열을 암호화한다. 특정 구현예에서, 조성물은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개보다 많은 상이한 특유의 핵산 벡터를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 단일 항원형의 VP4, VP2, VP3, VP4, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D 단백질 서열을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는, 선택적으로 애주번트와 조합하여, 본원에 개시되는 불활성화된, 천연적으로 존재하거나 천연적으로 존재하지 않는 HRV 항원형 또는 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 조성물은, 선택적으로 애주번트와 조합하여, 재조합으로 생산된 VP4, VP2, VP3, 및/또는 VP1 단백질을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개보다 많은 상이한 항원형을 나타내는 특유의 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 엔테로바이러스(예를 들어 HRV) 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 엔테로바이러스는 불활성화되고 용량 당 약 103 또는 104 TCID50 또는 이보다 높은 농도로 투여되는 복수의 인간 리노바이러스이다.
특정 구현예에서, 1 용량의 백신이 투여되고 제2 용량은 제1 용량 이후 3, 5, 7, 9, 11, 또는 13일보다 긴 시간 이후 투여된다.
특정 구현예에서, 대상은 1세 또는 2세 또는 3세 또는 5세 미만이다. 특정 구현예에서, 대상은 60세, 65세, 또는 70세보다 나이가 많다. 특정 구현예에서, 대상은 천식, COPD, 기종, 만성 기관지염, 낭포성 섬유증으로 진단받거나, 유전적으로 제1형 당뇨병 성향이 있다.
특정 구현예에서, 본 개시는 엔테로바이러스 종과 같은, 엔테로바이러스 속의 다른 구성원의 다가 백신 조성물에 관한 것이다.
본 개시를 더욱 구체적으로 기술하기 전에, 이 개시는 기술된 특정 구현예로 제한되지 않고, 물론 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본 개시의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하는 목적을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 개시가 속하는 해당 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 개시의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다.
각각의 개별 공보 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 명확하게 개별적으로 표시되는 것과 같이, 이 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 본원에 참조로 포함되고, 공보가 인용되는 것과 관련되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 공보의 인용은 출원일 이전의 이의 개시에 대한 것이고 본 개시가 이전의 개시 때문에 이러한 공보에 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공개 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개 날짜와 다를 수 있다.
이 개시를 읽는 해당 분야의 당업자에게 명백할 것과 같이, 본원에 기술되고 예시되는 개별 구현예 각각은 본 개시의 범위 또는 의미로부터 벗어나지 않고 임의의 다른 몇 가지 구현예의 특징으로부터 용이하게 분리하거나 이와 조합될 수 있는 별개의 요소 및 특징을 갖는다. 인용된 임의의 방법은 인용된 사례의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본 개시의 구현예는, 달리 지시되지 않는 한, 해당 분야의 기술 범위 내에 있는 의약, 유기 화학, 생화학, 분자 생물학, 약물학 등의 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다.
용어 "리노바이러스" 또는 "HRV"(인간 리노바이러스)는 최근의 분류 체계에 따라 피코르나바이러스 과(family Picornaviridae) 엔테로바이러스 속(genus Enterovirus)의 임의의 구성원을 의미한다. 3 가지 상이한 종의 리노바이러스가 있다: A형 리노바이러스로도 불리는 인간 리노바이러스 A(HRV-A), B형 리노바이러스로도 불리는 인간 리노바이러스 B(HRV-B) 및 C형 리노바이러스로도 불리는 인간 리노바이러스 C(HRV-C).
HRV는 이들의 항원형에 따라 추가로 분류되는데, 이 중에서 150 개가 넘는 것이 보고되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원형(serotype)"은 리노바이러스의 군 내의 하위구분을 말하고 리노바이러스의 VP1 유전자 서열에 의존한다. 주어진 리노바이러스의 항원형은 제2 특징으로 구분되는 하나 또는 몇 개의 균주를 포함할 수 있다. HRV는 수용체 특이성, 항바이러스 감수성 및 뉴클레오티드 서열 상동성을 포함하는 몇 개의 다른 파라미터에 따라 분류된다. HRV-A 종은 특히 다음 83개 항원형을 포함하고: HRV-A1A, HRV-A1B, HRV-A2, HRV-A7, HRV-A8, HRV-A9, HRV-A10, HRV-A11, HRV-A12, HRV-A13, HRV-A15, HRV-A16, HRV-A18, HRV-A19, HRV-A20, HRV-A21, HRV-A22, HRV-A23, HRV-A24, HRV-A25, HRV-A27, HRV-A28, HRV-A29, HRV-A30, HRV-A31, HRV-A32, HRV-A33, HRV-A34, HRV-A36, HRV-A38, HRV-A39, HRV-A40, HRV-A41, HRV-A43, HRV-A44, HRV-A45, HRV-A46, HRV-A47, HRV-A49, HRV-A50, HRV-A51, HRV-A53, HRV-A54, HRV-A55, HRV-A56, HRV-A57, HRV-A58, HRV-A59, HRV-A60, HRV-A61, HRV-A62, HRV-A63, HRV-A64, HRV-A65, HRV-A66, HRV-A67, HRV-A68, HRV-A71, HRV-A73, HRV-A74, HRV-A75, HRV-A76, HRV-A77, HRV-A78, HRV-A80, HRV-A81, HRV-A82, HRV-A85, HRV-A88, HRV-A89, HRV-A90, HRV-A94, HRV-A96, HRV-A100, HRV-A101, HRV-A102, HRV-A103, HRV-A104, HRV-A105, HRV-A106, HRV-A107, HRV-A108, 및 HRV-A109; HRV-B 종은 특히 다음 32개 항원형을 포함하고: HRV-B3, HRV-B4, HRV-B5, HRV-B6, HRV-B14, HRV-B17, HRV-B26, HRV-B27, HRV-B35, HRV-B37, HRV-B42, HRV-B48, HRV-B52, HRV-B69, HRV-B70, HRV-B72, HRV-B79, HRV-B83, HRV-B84, HRV-B86, HRV-B91, HRV-B92, HRV-B93, HRV-B97, HRV-B99, HRV-B100, HRV-B101, HRV-B102, HRV-B103, HRV-B104, HRV-B105, 및 HRV-B106; 그리고 HRV-C 종은 특히 다음 55개 항원형을 포함한다: HRV-C1, HRV-C2, HRV-C3, HRV-C4, HRV-C5, HRV-C6, HRV-C7, HRV-C8, HRV-C9, HRV-C10, HRV-C11, HRV-C12, HRV-C13, HRV-C14, HRV-C15, HRV-C16, HRV-C17, HRV-C18, HRV-C19, HRV-C20, HRV-C21, HRV-C22, HRV-C23, HRV-C24, HRV-C25, HRV-C26, HRV-C27, HRV-C28, HRV-C29, HRV-C30, HRV-C31, HRV-C32, HRV-C33, HRV-C34, HRV-C35, HRV-C36, HRV-C37, HRV-C38, HRV-C39, HRV-C40, HRV-C41, HRV-C42, HRV-C43, HRV-C44, HRV-C45, HRV-C46, HRV-C47, HRV-C48, HRV-C49, HRV-C50, HRV-C51, HRV-C52, HRV-C53, HRV-C54, 및 HRV-C55.
HRV 항원형은 또한 수용체 사용에 따라 소수-군 바이러스 및 주요-군 바이러스로 분류될 수 있다.
HRV-A2와 같은 소수-군 바이러스는 저-밀도 리포단백질 수용체 패밀리를 수용체로 사용한다. 이들은 산에 불안정하고 탈각에 있어서 낮은 pH에 대한 절대적 의존성을 갖는다. HRV-B14 및 HRV-A16과 같은 주요-군 바이러스는 세포간 부착 분자 1(ICAM-1)을 수용체로 사용한다. 이들 또한 대체로 산에 불안정하지만, 소수-군 바이러스와 달리, 탈각에 있어서 낮은 pH에 대한 절대적 의존성을 갖지 않는다.
본원에서 사용되는 "대상"은 임의의 동물, 바람직하게는 인간 환자, 가축, 또는 가정용 애완동물을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "방지하다" 및 "방지하는 것"은 재발, 확산 또는 발병의 방지를 포함한다. 본 개시는 완전한 방지로 제한되도록 의도되지 않는다. 일부 구현예에서는, 개시가 지연되거나 중증도가 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 및 "치료하는 것"은 대상(예를 들어, 환자)이 치유되고 질환이 박멸되는 사례로 제한되지 않는다. 오히려, 본 개시의 구현예는 또한 단지 증상을 감소시키고/시키거나 질환 진행을 지연시키는 처치를 고려한다.
용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 폴리머 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 이 용어는 단일 분자, 또는 분자의 집합을 지칭하도록 사용된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 아래 기술되는 바와 같이 암호화 영역 및 다양한 조절 요소의 영역을 포함할 수 있다.
명시된 폴리펩티드를 "암호화하는 핵산 서열"이라는 용어는 유전자의 암호화 영역을 포함하는 핵산 서열 또는, 달리 말하면 유전자 산물을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 단일-가닥(즉, 센스 스트랜드) 또는 이중-가닥일 수 있다. 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 폴리아데닐화 신호 등과 같은 적절한 조절 요소가, 필요에 따라 적절한 전사의 개시 및/또는 일차 RNA 전사체의 정확한 처리를 허용하도록 유전자의 암호화 영역에 근접하여 위치할 수 있다. 대안으로서, 본 개시의 발현 벡터에서 이용되는 암호화 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 개재 서열, 폴리아데닐화 신호 등, 또는 내인성 및 외인성 조절 요소 둘 다의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "재조합체"는 핵산 분자를 언급할 때 분자 생물학적 기법에 의해 함께 연결된 핵산의 분절로 구성되는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "재조합체"는 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때 재조합 핵산 분자를 사용하여 발현되는 단백질 분자를 의미한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 특정 숙주 유기체 또는 발현 시스템, 예를 들어 세포 또는 무-세포에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 발현을 위해 필요한 적절한 핵산 서열 및 요망되는 암호화 서열을 포함하는 재조합 핵산을 말한다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 보통 프로모터, 오퍼레이터(선택적), 및 리보솜 결합 부위를, 종종 다른 서열과 함께 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 그리고 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 전형적인 재조합 벡터는 선택 가능한 표지를 포함한다.
"선택 가능한 표지"는 인공적인 선택 또는 확인(리포터 유전자)을 위해 적절한 특성을 부여하는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 벡터로 도입되는 핵산으로, 예를 들어 베타-락타마제는 항생제 저항성을 부여하는데, 이는 베타-락타마제를 발현하는 유기체가 성장 배지에 항생제 존재시 생존하도록 허용한다. 다른 예는 티미딘 키나제로, 이는 숙주를 간시클로비르 선택에 대하여 감수성으로 만든다. 예상된 색상의 존재 또는 부재를 기반으로 원하는 세포 및 원치 않는 세포 사이에 구분을 허용하는 것은 확인 가능한 표지일 수 있다. 예를 들어, lac-z-유전자는 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)의 존재 중 청색을 내는 베타-갈락토시다제 효소를 생산한다. 재조합체 삽입이 lac-z-유전자를 불활성화한다면, 생성되는 콜로니는 무색이다. 하나 이상의 선택 가능한 표지, 예를 들어, 이의 성장에 요구되는(영양요구성) 특정 화합물을 유기체가 합성하지 못하는 것을 보완할 수 있는 효소가 존재할 수 있고 화합물을 성장에 독성인 다른 것으로 전환할 수 있다. 오로티딘-5' 포스페이트 데카복실라제 URA3는 우라실 생합성에 필요하고 우라실에 대한 영양요구성인 ura3 돌연변이체를 보완할 수 있다. URA3은 또한 5-플루오로오로트산을 독성 화합물인 5-플루오로우라실로 전환시킨다. 추가로 고려되는 선택 가능한 표지는 항생물질 저항성을 부여하거나 형광 단백질을 발현하는 임의의 유전자를 포함한다. 예로는 다음 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: ampr, camr, tetr, 블라스티시딘r, neor, hygr, abxr, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유형 II 유전자(nptII), p-글루쿠로니다제(gus), 녹색 형광 단백질(gfp), egfp, yfp, mCherry, p-갈락토시다제(lacZ), lacZa, lacZAM15, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(cat), 알칼리 포스파타제(phoA), 박테리아 루시퍼라제(luxAB), 비알라포스 저항성 유전자(bar), 포스포만노오스 이성질화효소(pmi), 자일로오스 이성질화효소(xylA), 아라비톨 데하이드로게나제(atlD), UDP-글루코오스:갈락토오스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 I(galT), 안트라닐레이트 합성효소의 피드백-불감성 α 서브유닛(OASA1D), 2-데옥시글루코오스(2-DOGR), 벤질아데닌-N-3-글루쿠로니드, 대장균(E. coli) 트레오닌 데아미나제, 글루타메이트 1-세미알데히드 아미노트랜스퍼라제(GSA-AT), D-아미노산 산화효소(DAAO), 내염성 유전자(rstB), 페레독신-유사 단백질(pflp), 트레할로오스-6-P 합성효소 유전자(AtTPS1), 리신 라세미화효소(lyr), 디하이드로디피콜리네이트 합성효소(dapA), 트립토판 합성효소 베타 1(AtTSB1), 데할로게나제(dhlA), 만노오스-6-포스페이트 리덕타제 유전자(M6PR), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT), 및 D-세린 암모니아리아제(dsdA).
특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 HRV 폴리단백질 또는 이의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 용어 "키메라"는 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 함께 클로닝되고 번역 후 단일 폴리펩티드 서열로서 작용하는, 상이한 유전자로부터 얻어지는 둘 이상의 암호화 서열의 발현 산물을 말한다. 키메라 폴리펩티드는 또한 "혼성체" 폴리펩티드로서 언급된다. 암호화 서열은 동일하거나 상이한 바이러스 항원형으로부터 얻어지는 것을 포함한다.
용어 "융합"은 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 외인성 단백질 단편(융합 파트너)과 연결된 관심 있는 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 말한다. 융합 파트너는, 숙주 세포 또는 상등액으로부터, 또는 둘 다로부터 재조합 융합 폴리펩티드의 정제를 허용하도록 "친화성 태그"를 제공하는 것뿐 아니라, 관심 있는 폴리펩티드의 용해성의 증진을 포함하는 다양한 기능을 할 수 있다. 요망될 경우, 융합 파트너는 정제 후 또는 도중에 관심 있는 단백질로부터 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 재조합 벡터는 선택적으로 포유류, 인간, 곤충, 바이러스, 박테리아, 박테리아 플라스미드, 효모 관련 복제의 기점 또는 유전자, 예를 들어 유전자 또는 레트로바이러스 유전자 또는 렌티바이러스 LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS, 및 INS 뉴클레오티드 분절 또는 tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, 및 vpx로부터 선택되는 유전자 또는 gag, pol, 및 env로부터 선택되는 구조 유전자를 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 벡터는 선택적으로 유전자 벡터 요소(핵산), 예를 들어 선택 가능한 표지 영역, lac 오페론, CMV 프로모터, 혼성체 닭 B-액틴/CMV 인핸서(CAG) 프로모터, tac 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터, SP6 RNA 폴리머라제 프로모터, SV40 프로모터, 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 서열, cis-작용 우드척 조절 후 조절 요소(WPRE), 스캐폴드-부착 영역(SAR), 역전 말단 반복부(ITR), FLAG 태그 암호화 영역, c-myc 태그 암호화 영역, 금속 친화성 태그 암호화 영역, 스트렙타비딘 결합 펩티드 태그 암호와 영역, 폴리His 태그 암호화 영역, HA 태그 암호화 영역, MBP 태그 암호화 영역, GST 태그 암호화 영역, 폴리아데닐화 암호화 영역, SV40 폴리아데닐화 신호, SV40 복제의 기점, Col E1 복제의 기점, f1 기점, pBR322 기점, 또는 pUC 기점, TEV 프로테아제 인식 부위, loxP 부위, Cre 재조합효소 암호화 영역, 또는 50 또는 60개 미만 뉴클레오티드의 연속 분절 내에 5, 6, 또는 7개 이상의 제한 부위를 갖거나 20 또는 30개 미만 뉴클레오티드의 연속 분절에 3 또는 4개 이상의 제한 부위를 갖는 것과 같은 다중 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "유전자"는 또한 구조 유전자의 암호화 영역을 포괄하고, 유전자가 전체-길이 mRNA의 길이에 상응하도록 양 말단에서 약 1 kb 거리의 5' 및 3' 말단 둘 다에서 암호화 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함한다. 암호화 영역의 5'에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열로 언급된다. 암호화 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열로 언급된다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 형태의 유전자 둘 다를 포괄한다. 유전자의 게놈 형태 및 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 칭하는 비-암호화 서열로 중단되는 암호화 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA(mRNA)로 전사되는 유전자의 분절로; 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사체로부터 제거 또는 "스플라이싱"되고; 따라서 인트론은 메신저 RNA(mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역 중에 발생기 폴리펩티드에서 아미노산의 서열 또는 순서를 명시하도록 기능한다.
인트론을 포함하는 것에 추가하여, 게놈 형태의 유전자는 또한 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 둘 다에 위치하는 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 "측면" 서열 또는 영역으로 언급된다(이들 측면 서열은 mRNA 전사체에 존재하는 비-번역 서열의 5' 또는 3'에 위치한다). 5' 측면 영역은 유전자의 전사를 조절하거나 이에 영향을 미치는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 3' 측면 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 "이종 유전자"는 천연의 환경에 존재하지 않는(즉, 사람의 손으로 변경된) 인자를 암호화하는 유전자를 말한다. 예를 들어, 이종 유전자는 하나의 바이러스 항원형으로부터 다른 항원형으로 도입되는 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 또한 어떤 방식(예를 들어, 돌연변이되거나 다중 복제로 첨가되거나, 비-천연 프로모터 또는 인핸서 서열에 연결되는 등)으로 변경된 유기체에 자생인 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 cDNA 형태의 바이러스 유전자를 포함하는 바이러스 유전자 서열을 포함할 수 있고; cDNA 서열은 (mRNA를 생산하는) 센스 또는 (mRNA 전사체에 상보적인 안티-센스 RNA 전사체를 생산하는) 안티-센스 배향 중 하나로 발현될 수 있다. 이종 유전자 서열은 전형적으로, 염색체에서 바이러스 유전자 서열과, 또는 이종 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 유전자와 자연적으로 연관되는 것으로 발견되지 않거나, 자연에서 발견되지 않는 염색체의 일부와 연관되는(예를 들어, 유전자가 정상적으로 발현되지 않는 자리에서 발현되는 유전자), 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열과 연결된다는 점에서, 이종 유전자는 내인성 바이러스 유전자와 구분된다.
용어 "형질감염"은 외래 핵산의 세포로의 도입을 의미한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 글라스 비드, 전기천공, 현미주입, 리포솜 융합, DNA 또는 RNA의 리포펙션, 원형질체 융합, 바이러스 감염, 바이올리스틱(즉, 유전자총) 등을 포함하는 해당 분야에 알려진 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "정제된"은 천연의 환경으로부터 제거, 단리 또는 분리된 분자, 핵산 또는 아미노산 서열을 말한다. "단리된 핵산 서열"은 이에 따라 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된" 분자는 천연적으로 관련된 다른 성분이 적어도 60% 없는, 바람직하게는 적어도 75% 없는, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 90% 없는 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된" 또는 "정제하는 것"은 또한 샘플로부터 오염원을 제거하는 것을 의미한다.
용어 "숙주 세포"는 이종 유전자를 복제 및/또는 전사 및/또는 번역할 수 있는 임의의 세포를 말한다. 따라서, "숙주 세포"는 시험관내 또는 생체내 위치하는, 임의의 진핵 또는 원핵 세포(예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포, 및 곤충 세포)를 말한다. 예를 들어, 숙주 세포는 유전자이식 동물에 위치할 수 있다.
"면역학적으로 유효한 양"은 투입 항원에 대하여 개체(예를 들어, 인간) 자신의 면역 반응을 증진시키고/시키거나 차후의 노출에 대한 보호를 제공하기에 충분한 양이다. 도입된 면역의 수준은, 예를 들어 플라크 중화, 보체 고정, 효소-결합 면역흡착, 또는 마이크로중화 분석에 의해, 예를 들어 분비 및/또는 혈청 항체를 중화하는 양을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
"보호적 면역 반응"은 개체가 차후 노출 및/또는 감염시 상부 및/또는 하부 기도 질환(예를 들어, 감기 및/또는 폐렴)에 대하여 보호적인, 개체(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 면역 반응을 의미한다.
인간 리노바이러스(HRV) 및 백신
HRV는 포지티브 센스 RNA 게놈을 갖는다. RNA는 단일 폴리단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임이 있는 3'-말단 폴리(A) 꼬리를 갖는 5' 및 3' 비번역 영역 (NTR)을 포함한다. 재조합 cDNA 클론으로부터 유래되는 합성 게놈-길이 RNA 및 비리온 RNA는 세포로 형질감염시 감염성으로, 바이러스 입자 및 다음 차례의 바이러스 복제를 야기한다. Yang et al. [J Virol, 2002, 76:7485] 참조. 5'-NTR은 내부 리보솜 유입 부위를 갖지만, mRNA의 5'-말단 캡 구조는 결여되어, 세포 번역은 5' 암호화 바이러스 단백질(VPg)을 우회한다.
폴리단백질은 바이러스 프로테아제에 의한 절단 순서와 관련된 3개의 분절을 포함한다. N-말단 분절 P1은 4 개의 캡시드 단백질 VP4, VP2, VP3, 및 VP1을 포함한다. VP2, VP3, 및 VP1은 캡시드의 외부에 노출된다. P2 및 P3 분절은 비구조 단백질로 구성된다. 이들은 2A(프로테아제), 2B, 2C, 3A, 3B(VPg), 3C(프로테아제), 및 3D(폴리머라제)를 포함한다. 전구체는 2BC, 3AB, 및 3CD를 포함한다.
HRV는 피코르나바이러스 과(Picornaviridae family)의 엔테로바이러스 속(Enterovirus genus)이고 번호를 붙인 항원형으로 언급된다. HRV의 3개 종, A, B, 및 C가 있다. Cooney 등은 90가지 리노바이러스 항원형의 항원 분류를 보고한다. Infect Immun 37, 642-647 (1982). 동물에서 생성된 고역가 항-혈청을 사용한 상호 중화를 나타내는 일부 항원형 페어링과 함께, 교차-중화를 나타내는 HRV 항원형의 항원 군이 존재한다. HRV의 분자 역학에서는 항원형이 많지만 안정적이고, "항원 이동"이 HRV에서는 인플루엔자에서 일어나는 것처럼 일어나지 않는 것을 보여준다.
U.S. 공개 특허 출원번호 2010/0233677는 80개 인간 리노바이러스(HRV)의 게놈 서열을 보고한다. 특정 항원형의 게놈 서열은 아래 표 1을 참고로 한다.
불활성화 HRV 균주 또는 균주의 집합된 빈 캡시드 단백질, 예를 들어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 이상과 같거나 이보다 큰 묘출 항원형을 혼합하는 것은 실질적인 수의 HRV 유형에 대한 보호적 중화 항체(nAb) 반응을 이끌어낼 수 있다. 선택적으로 바람직한 애주번트와 조합한 다가 HRV 백신이 본원에 개시된다. 특정 구현예에서, HRV 조성물은 9개보다 많은 항원형의 불활성화 HRV를 포함하고 방법은 비강내(i.n) 또는 근육내(i.m) 투여를 고려한다.
다르게는 건강한 성인에서의 감염은 보통의 감기 증상을 야기한다. 따라서 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물을 대상에 주기적 또는 일상적 계획에 따라, 예를 들어 6개월마다, 1 또는 2년마다 또는 더 긴 간격으로 투여하는 것에 의해 HRV 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 호흡기 바이러스 감염은 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 악화의 높은 비율과 관련된다. 따라서 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물을 천식, COPD, 기종, 만성 기관지염, 또는 낭포성 섬유증("CF")의 폐 악화와 같은 기도 폐쇄 병태의 증상을 나타내거나 이의 위험이 있는 것으로 진단받은 대상에 투여하는 것을 포함하는, 기도 폐쇄 병태 또는 질환의 악화를 관리 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
HRV C 감염은 아동에서 중증 호흡기 질환과 관련된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물, 예를 들어 HRV C 항원형 또는 재조합 바이러스를 약독화 또는 불활성화(사멸) 바이러스의 형태로, 또는 재조합 HRV C 캡시드 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, HRV 감염을 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
어린 시절의 HRV 감염은 이후 유년기에 천식의 발생과 관련될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 조성물을 2, 3, 4, 5, 또는 6개월령 미만, 또는 2개월령 내지 6개월령 사이, 6개월령 내지 1세 사이, 또는 1세보다 많은 아동에게 투여하는 것을 포함하는, 천식을 예방하는 것을 고려한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 재조합으로 생산된, 즉, 예를 들어 이종 단백질을 암호화하는 HRV RNA로부터 생산된, 캡시드-키메라 HRV를 고려하는데, 여기에서 적어도 하나의 VP4, VP2, VP3, 또는 VP1 캡시드 단백질은 HRV의 제1 항원형의 서열이고 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및/또는 3D와 같은 적어도 하나의 비-캡시드 단백질은 제2 항원형의 서열이고, 제1 및 제2 항원형은 동일한 항원형이 아니고, 이들은 상이한데, 예를 들어 VP4, VP2, VP3, VP1, 및 2A는 HRV-A2의 것이고 나머지 단백질은 HRV-A16 또는 HRV-A80의 것이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시되는 임의의 조성물은 다른 항바이러스 물질, 예를 들어 아바카비르, 아시클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 암프레나비르, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비르, 아트리플라, 보세프레비르, 시도포비르, 콤비비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비르, 팜시클로비르, 포미비르센, 포삼프레나비르, 포스카르넷, 포스포넷, 간시클로비르, 이바시타빈, 이무노비르, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비르, 이노신, 인터페론 유형 III, 인터페론 유형 II, 인터페론 유형 I, 라미부딘, 로피나비르, 로비리드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 오셀타미비르(타미플루), 페그인터페론 알파-2a, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 랄테그라비르, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 피라미딘, 사퀴나비르, 스타부딘, 테노포비르, 테노포비르 디소프록실, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비르(발트렉스), 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘 잘시타빈, 자나미비르(렐렌자), 지도부딘, 및/또는 바펜다비르, 이의 유도체 또는 염을 포함할 수 있다.
Biota 파마슈티컬즈는 증상을 보이는 인간 리노바이러스 감염이 있는 성인 천식 환자에서 바펜다비르의 사용을 연구하는 중이다. Matz, Am J Respir Crit Care Med, 187, 2013:A5497. 바펜다비르(3-에톡시-6-(2-(1-(6-메틸피리다진-3-일)피페리딘-4-일)에톡시)벤조[d]이속사졸)은 항바이러스 활성을 갖는 캡시드 결합제이다. 작용 기전은 감염 주기에서 초기 단계에 간섭하는 것으로 생각된다.
특정 구현예에서, 본원에 개시되는 임의의 조성물은 본원에 개시되는 임의의 방법을 위해 사용될 수 있는데, 여기에서 다른 항바이러스제, 예를 들어 바펜다비르, 이의 유도체 또는 염이 조합으로 투여된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시되는 사멸된, 불활성화 바이러스, 약독화 바이러스, VP4, VP2, VP3, 및 VP1 단백질, HRV 항원형 및/또는 재조합 HRV를 포함하는 조성물을, 바펜다비르 또는 이의 유도체 또는 염과 같은 다른 항바이러스제와 조합으로 투여하는 것에 의해, 선택적으로 HRV에 감염된, 중등도 내지 중증 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환을 포함하는 근원적인 호흡기 질환이 있는 환자를 예방 또는 치료하는 것에 관한 것이다.
바이러스 정량화
TCID50는 50% 조직 배양 감염 용량을 말한다. 이는 감염성 바이러스 역가의 표준 척도이다. 이 종말점 희석 분석은 접종된 조직 배양 세포의 50%에서 세포변성 효과(CPE)를 생산하기 위해 요구되는 바이러스의 양을 정량화한다. 조직 배양의 맥락에서 사용될 때, 숙주 세포를 플레이팅하고 바이러스의 연속 희석물을 첨가한다. 배양 후, 사멸 세포(즉, 감염된 세포)의 백분율을 수동으로 관찰하고 각각의 바이러스 희석에 대하여 기록하고, 결과를 사용하여 TCID50 결과를 수학적으로 계산한다. Reed 및 Muench 방법[Reed and Muench, Am. J. Hyg, 1938, 27: 493]은 TCID50 종말점 역가를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 간단하게, TCID50 방법은 바이러스의 연속 희석물로 감염된 조직 배양 세포(예를 들어, HeLa 세포)의 플레이트로부터 바이러스 양성 웰의 총 수를 더하고, 이 데이터를 종말점(조직 배양 감염 용량이 이 점에서 50%임)을 나타내는 역가로 전환하도록 한다. 다음 공식이 계산을 수행하는 데 사용된다:
i. 비례 거리(Proportionate Distance) =
(50% 넘는 희석에서의 % CPE) - (50%)
(50% 넘는 희석에서의 % CPE) - (50% 아래 희석에서의 % CPE)
ii. -Log = 50% CPE 비율 넘는 희석(즉, 10-3은 -3일 것임)
iii. ((PD)+(-log(희석 간격))
iv. TCID50 = 10(ii + iii)
투여 및 투여량
특정 구현예에서, 이 개시는 본원에 기술되는 하나 이상의 HRV 백신의 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양을 포함하는 조성물에 관한 것이다. HRV 백신의 혼합물은, 동시 또는 상이한 시간에 투여되는, 동일한 약제학적 조성물(단일 제형) 또는 별개의 약제학적 조성물(별개의 제형)에 존재할 수 있다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서의 사용을 위해 제형화될 수 있다. 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체가 또한 적절한 제형화를 위해 조성물에 포함될 수 있다. 바이러스는 생리적으로 혼화 가능한 용액 또는 완충액, 예를 들어 식염수 또는 물에 용해되거나 동결건조된 형태일 수 있다. 제조 및 제형화의 표준 방법은, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa에 기술된 것과 같이 사용될 수 있다.
백신 용도를 위해, 본 개시에 따라 생산된 바이러스는 백신 제형으로 직접 사용되거나, 요망될 경우 당업자에게 잘 알려진 동결건조 프로토콜을 사용하여 동결건조될 수 있다. 동결건조된 바이러스는 전형적으로 약 4℃에서 유지될 것이다. 사용 준비 시 동결건조된 바이러스는, 아래에서 추가로 기술되는 바와 같이, 애주번트와 함께 또는 없이, 안정화 용액, 예를 들어 식염수에서 또는 SPG, Mg, 및 HEPES를 포함하여 재구성된다.
변형된, 약독화, 불활성화 바이러스 또는 재조합 바이러스 캡시드는 생리적으로 허용 가능한 담체 및/또는 애주번트와 함께 숙주로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 해당 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등을 포함한다. 생성된 수용액은 그대로 또는 동결건조되어 사용을 위해 포장될 수 있는데, 동결건조된 제제는 위에 언급된 바와 같이 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제 등과 같이 생리적 조건에 가깝게 하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등을 포함할 수 있다. 허용 가능한 애주번트는 불완전 프로인트 애주번트(incomplete Freund's adjuvant), 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 또는 명반을 포함한다.
조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 비강내, 비경구, 국소, 경구, 또는 국부적 투여가 의도된다. 전형적으로, 조성물은 비강내(예를 들어, 에어졸 흡입 또는 코 점적에 의해), 비경구(예를 들어, 근육내, 피하, 또는 정맥내 주사에 의해), 또는 경구 섭취에 의해, 또는 국소적 적용 또는 관절내 주사에 의해 투여된다. 추가적 투여 경로는 혈관내, 동맥-내, 종양내, 복막내, 심실내, 경막내뿐 아니라 안과용, 공막내, 안와내, 직장, 또는 국소적 투여를 포함한다. 데포(depot) 주사 또는 침식 가능한 임플란트 또는 요소와 같은 수단에 의한 지속적 방출 투여 역시 구체적으로 본 개시에 포함된다. 따라서, 본 개시는 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해 또는 현탁된, 위에 언급된 물질을 포함하는 점막 또는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제, 세제 등과 같이, 생리적 조건에 근사하도록 하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질을 포함할 수 있다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수성 용액은 그대로 또는 동결건조되어 사용을 위해 포장될 수 있는데, 동결건조 제제는 투여 전에 멸균된 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11 사이, 예를 들어, 5 내지 9 사이, 6 내지 8 사이, 또는 7 내지 8 사이, 예를 들어 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태의 생성된 조성물은, 각각 고정된 양의 위에 언급된 물질 또는 물질들을 포함하는 복수의 단일 용량 단위로, 예를 들어 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장으로, 포장될 수 있다. 조성물은 또한 투여시 재구성되는 동결건조 형태로 활성 성분(들)을 포함할 수 있다.
유효량의 백신을 포함하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 예방적 적용에서, 조성물은 HRV 감염에 대하여 증가된 감수성을 갖는 대상(예를 들어, 인간 대상)에 투여될 수 있다. 본 개시의 조성물은 임상적 또는 준임상적 질환의 개시를 지연, 감소, 또는 예방하기에 충분한 양으로 대상(예를 들어, 인간)에 투여될 것이다. 치료적 적용에서, 조성물은 이미 HRV 감염으로 고통받는 환자(예를 들어, 인간)에, 병태 및 이의 합병증의 증상을 치유 또는 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이 목적을 달성하기 위해 적절한 양은 "치료적으로 유효한 용량"으로서 정의된다. 적절한 투약 용량 및 요법의 결정은 해당 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이 용도를 위해 유효한 양은 질환 또는 병태의 중증도 및 환자의 체중 및 일반적 상태에 의존할 수 있지만, 일반적으로 환자 당 용량 당 약 0.5 mg 내지 약 3000 mg의 물질 또는 물질들의 범위일 수 있다.
백신은 단 1 회 또는 프라임/부스트 요법으로 투여될 수 있다. 초기 투여 및 부스터 투여를 위한 적절한 요법은 초기 투여에 이어지는 하나 이상의 매시간, 매일, 매주, 또는 매달 간격의 반복되는 용량의 차후 투여가 대표적이다. 본 개시의 조성물에 존재하는 물질의 총 유효량은 1 회분으로서 또는 비교적 짧은 시기에 걸친 주입에 의해 포유류에 단일 용량으로서 투여될 수 있거나, 분할 처치 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있는데, 여기에서는 복수의 용량이 보다 지연된 시기에 걸쳐(예를 들어, 매 4 내지 6, 8 내지 12, 14 내지 16, 또는 18 내지 24시간마다, 또는 매 2 내지 4일마다, 1 내지 2주마다, 1개월에 1회) 투여된다.
본 개시의 조성물에 존재하고 포유류(예를 들어, 인간)에 적용되는 본 개시의 방법에 사용되는 하나 이상의 물질의 치료적으로 유효한 양은 포유류의 연령, 체중, 면역 체계 온전성 및 병태의 개체 차이를 고려하여 해당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 개시의 물질은 대상(예를 들어, 인간, 마우스, 가축(예를 들어, 소, 양, 또는 돼지), 애완 동물(예를 들어, 고양이 또는 개)과 같은 포유류)에, 치료받는 대상에서 요망되는 결과(예를 들어, 감수성 개체에서 HRV 감염의 예방 또는 감염된 개체에서 증상의 약화)를 생성하는 양인 유효량으로 투여된다. 이러한 치료적으로 유효한 양은 해당 분야의 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
본 개시의 백신은 다른 백신접종 접근법뿐 아니라 치료를 위한 다른 접근법(예를 들어, 소분자-기반 접근법)과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 동일하거나 상이한 항원을 포함하는 다른 재조합 백신과 조합하여 투여될 수 있다. 본 개시의 조합 방법은 다른 형태의 항원과 본 개시의 백신의 공동-투여를 포함할 수 있다. 대안으로서, 본 개시의 백신은 다른 접근법(예를 들어, 서브유닛 또는 HBc 접근법(HBc-M2e; Fiers et al., Virus Res. 103:173-176, 2004; WO 2005/055957; US 2003/0138769 A1; US 2004/0146524A1; US 2007/0036826 A1))과 조합하여 프라임-부스트 전략으로 사용할 수 있는데, 본 개시의 백신 또는 다른 접근법을 프라임으로 사용한 다음 다른 접근법을 부스트로서 사용하거나, 그 반대로도 가능하다. 또한, 본 개시는 프라임 및 부스트 물질 둘 다로 본 개시의 백신을 이용하는 프라임-부스트 전략을 포함한다.
본 개시의 백신은 포유류(예를 들어, 인간 대상)와 같은 대상에 표준 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 비강내 투여의 경우, 조성물은 점비액의 형태로 또는 에어졸 또는 분무 제형의 흡입에 의해 투여될 수 있다.
본 개시의 조성물은 인간과 같은 대상에 생백신 또는 사멸된 백신 또는 집합 캡시드 단백질로서 투여될 수 있다. 생 약독화 백신은 해당 분야의 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 비강내 투여될 수 있다(예를 들어, Grunberg et al., Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 156:609-616, 1997 참조). 적절한 투약 용량 및 요법은 해당 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일례로서, 용량 범위는, 예를 들어 용량 당 104 내지 109 TCID50일 수 있다. 백신은 단일 용량으로 유리하게 투여될 수 있지만, 해당 분야의 당업자에 의해 필요한 것으로 결정될 경우 부스팅이 마찬가지로 실시될 수 있다. 불활성화 백신에 있어서는, 예를 들어 포르말린 또는 UV 또는 베타-프로피오락톤 처치로 바이러스를 사멸시킬 수 있고, 선택적으로 적절한 애주번트(예를 들어, 알루미늄)와 함께 용량 당 약 104-9 당량 TCID50로 비강내 또는 근육내 투여될 수 있다. 이러한 접근법에서, 하나보다 많은(예를 들어, 2 내지 3) 용량을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 재조합으로 생산된 캡시드 단백질은, 선택적으로 적절한 애주번트와 함께, 하나 이상의 용량을 사용하여 비강내 또는 근육내로 유사하게 투여될 수 있다.
애주번트
백신 적용을 위해 선택적으로, 해당 분야의 당업자에게 알려진 애주번트가 사용될 수 있다. 비강내 투여의 경우, 키틴 미세입자(CMP)가 사용될 수 있다 (Asahi-Ozaki et al., Microbes and Infection 8:2706-2714, 2006; Ozdemir et al., Clinical and Experimental Allergy 36:960-968, 2006; Strong et al., Clinical and Experimental Allergy 32:1794-1800, 2002). 점막 경로(예를 들어, 비강내 또는 구강 경로)를 통한 투여에 사용하기 적절한 다른 애주번트는 대장균 (E. coli)의 열-불안정 독소(LT) 또는 이의 돌연변이체 유도체를 포함한다. 불활성화 바이러스 및 캡시드 단백질의 경우, 예를 들어 알루미늄 화합물(예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 또는 수산화인산알루미늄 화합물), 리포솜 제형, 합성 애주번트, 예를 들어(예를 들어, QS21) 무라밀 디펩티드, 모노포스포릴 리피드 A, 또는 폴리포스파진을 포함하는 비경구 애주번트가 사용될 수 있다. 또한, 애주번트 활성을 갖는 사이토카인을 암호화하는 유전자가 벡터로 삽입될 수 있다. 따라서, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13, 또는 IL-5와 같은 사이토카인을 암호화하는 유전자가 외래 항원 유전자와 함께 삽입되어 증진된 면역 반응을 야기하는 백신을 생산하거나, 면역성을 세포성, 체액성, 또는 점막 반응을 향하여 더욱 특이적으로 지시되도록 조절할 수 있다. 대안으로서, 사이토카인은 잘 알려진 수단(예를 들어, 직접 접종, 노출 DNA(naked DNA), 바이러스 벡터 등)에 의해 재조합 백신 바이러스와 별개로, 동시 또는 순차적으로 전달될 수 있다.
도 1은 10개의 혼합된 불활성화 HRV 항원형으로의 백신접종 이후 마우스에서 유도된 10개의 HRV 항원형에 대한 바이러스-중화 항체에 대한 데이터를 보여준다. BALB/c 마우스(군 당 20 마리)를 불활성화 HRVV-10으로 근육내 경로에 의해 백신접종하였다. 혈청을 백신접종-이후 18일에 수집하고, (x-축의 좌에서 우로) HRV-A16, HRV-A36, HRV-A78, HRV-A38, HRV-A2, HRV-B14, HRV-A9, HRV-A13, HRV-A29, HRV-A76, 및 HRV-A49에 대한 혈청 nAb 역가(각 군에 대하여 모음)를 HeLa 세포에서 TCID50 환원 분석에 의해 정량화하였다. 백신에 포함된 항원형은 그래프에서 흑색 선으로 표시된다. HRVV-10은 10 개의 투입 항원형 중 9 개에 대하여 nAb를 유도하였고(HRV-A13은 아님), HRVV-10은 백신에 포함되지 않았지만 HRV-A2와 동일한 항원군의 항원형인 HRV-A49에 대하여 nAb를 유도하였다.
도 2는 감염성 HRV를 생산하는 HRV 핵산을 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC) 벡터를 보여준다. 다이어그램은 BAC 벡터로 클로닝되는 HRV-A16 구성체를 보여준다. 이 HRV-A16 핵산은 5' 및 3' 리보자임의 바로 측면에 있고, 발현은 5' T7 프로모터에 의해 구동된다. HRV-A16 BAC은 캡시드-키메라 HRV의 조작 및 구조를 가능하게 하도록, 캡시드 유전자 측면에 있는 Sac I 및 Cla I 제한 효소 부위를 조작하였다. 벡터는 시험관내 T7 전사를 위한 주형으로서 작용한다. 생산된 RNA는 HeLa 세포로 형질감염되고, 감염성 HRV가 용이하게 생산된다.
도 3a는 불활성화 HRV-A16의 면역원성이 1로부터 10까지 결합가 증가에 의해 영향을 받지 않는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 마우스를 명반 애주번트와 함께 또는 없이 1-가 불활성화 HRV-A16으로(군 당 5마리 마우스), 또는 명반과 함께 3-가, 5-가, 7-가, 또는 10-가 불활성화 HRV로(군 당 20마리 마우스) i.m. 백신접종하였다. HRV 유형 및 불활성화-TCID50 용량은 추가의 표 1에 명시된다. 혈청을 백신접종 18일 후에 수집하고 각 군에 대하여 모았다. 혈청 nAb 역가를 HRV-A16, HRV-A36, 및 HRV-A78에 대하여 측정하였다. 파선은 검출 한계(LOD)를 나타낸다.
도 3b는 HRV-A36에 대한 데이터를 보여준다.
도 3c는 HRV-A78의 데이터를 보여준다.
도 4a는 불활성화 다가 HRV의 면역원성이 용량과 관련되는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 마우스(2 군, 군 당 20마리)를, 1975 Hamory 등 연구 10과 유사하게 용량 당 낮은 불활성화-TCID50 투입 역가(x-축)로 구성되는 10-가 HRV 백신에 더하여 명반으로(회색 기호), 또는 용량 당 높은 불활성화-TCID50 투입 역가를 갖는 10-가 HRV 백신에 더하여 명반으로(흑색 기호) 백신접종하였다. 혈청을 프라이밍하고 18일 후 수집하여 각 군에 대하여 모으고, nAb 역가(y-축)를 백신에 표시된 유형에 대하여 측정하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하고, LOD 아래의 일부 기호는 가시화되도록 하였다.
도 4b는 부스팅하고 18일 이후 데이터를 보여준다.
도 5a는 마우스에서 10-가 및 25-가 불활성화 HRV에 대한 폭넓은 nAb 반응을 나타내는 데이터를 보여준다. 용량 당 불활성화-TCID50 투입 역가는 표 5에 명시된다. 20마리 마우스를 백신접종한 다음 50일에 10-가 HRV로 부스팅하였다. 혈청을 제18일(프라임) 및 제68일(부스트)에 수집하였다. 백신에 표시된 유형에 대한 nAb 수준을 모은 혈청에서 측정하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하였다.
도 5b는 30마리 마우스를 백신접종한 다음 50일에 25-가 HRV로 부스팅한 데이터를 보여준다.
도 6a는 프라이밍 및 부스팅 이후 히말라야 원숭이에서 25-가 불활성화 HRV에 대한 폭넓은 nAb 반응을 나타내는 데이터를 보여준다. 용량 당 불활성화-TCID50 투입 역가는 표 6에 명시된다. 두 마리의 히말라야 원숭이(RM A 및 RM B)를 25-가 HRV + 명반으로 i.m. 백신접종하였다. RM은 제28일에 동일한 부스트 백신접종을 받았고, 부스트 백신접종 이후 nAb 역가를 결정하기 위해 제46일에 혈청을 수집하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하였다.
도 6b는 두 마리의 히말라야 원숭이(RM C 및 RM D)를 프라이밍 및 부스팅 이후 50-가 HRV + 명반으로 i.m. 백신접종한 데이터를 보여준다.
도 2는 감염성 HRV를 생산하는 HRV 핵산을 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC) 벡터를 보여준다. 다이어그램은 BAC 벡터로 클로닝되는 HRV-A16 구성체를 보여준다. 이 HRV-A16 핵산은 5' 및 3' 리보자임의 바로 측면에 있고, 발현은 5' T7 프로모터에 의해 구동된다. HRV-A16 BAC은 캡시드-키메라 HRV의 조작 및 구조를 가능하게 하도록, 캡시드 유전자 측면에 있는 Sac I 및 Cla I 제한 효소 부위를 조작하였다. 벡터는 시험관내 T7 전사를 위한 주형으로서 작용한다. 생산된 RNA는 HeLa 세포로 형질감염되고, 감염성 HRV가 용이하게 생산된다.
도 3a는 불활성화 HRV-A16의 면역원성이 1로부터 10까지 결합가 증가에 의해 영향을 받지 않는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 마우스를 명반 애주번트와 함께 또는 없이 1-가 불활성화 HRV-A16으로(군 당 5마리 마우스), 또는 명반과 함께 3-가, 5-가, 7-가, 또는 10-가 불활성화 HRV로(군 당 20마리 마우스) i.m. 백신접종하였다. HRV 유형 및 불활성화-TCID50 용량은 추가의 표 1에 명시된다. 혈청을 백신접종 18일 후에 수집하고 각 군에 대하여 모았다. 혈청 nAb 역가를 HRV-A16, HRV-A36, 및 HRV-A78에 대하여 측정하였다. 파선은 검출 한계(LOD)를 나타낸다.
도 3b는 HRV-A36에 대한 데이터를 보여준다.
도 3c는 HRV-A78의 데이터를 보여준다.
도 4a는 불활성화 다가 HRV의 면역원성이 용량과 관련되는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 마우스(2 군, 군 당 20마리)를, 1975 Hamory 등 연구 10과 유사하게 용량 당 낮은 불활성화-TCID50 투입 역가(x-축)로 구성되는 10-가 HRV 백신에 더하여 명반으로(회색 기호), 또는 용량 당 높은 불활성화-TCID50 투입 역가를 갖는 10-가 HRV 백신에 더하여 명반으로(흑색 기호) 백신접종하였다. 혈청을 프라이밍하고 18일 후 수집하여 각 군에 대하여 모으고, nAb 역가(y-축)를 백신에 표시된 유형에 대하여 측정하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하고, LOD 아래의 일부 기호는 가시화되도록 하였다.
도 4b는 부스팅하고 18일 이후 데이터를 보여준다.
도 5a는 마우스에서 10-가 및 25-가 불활성화 HRV에 대한 폭넓은 nAb 반응을 나타내는 데이터를 보여준다. 용량 당 불활성화-TCID50 투입 역가는 표 5에 명시된다. 20마리 마우스를 백신접종한 다음 50일에 10-가 HRV로 부스팅하였다. 혈청을 제18일(프라임) 및 제68일(부스트)에 수집하였다. 백신에 표시된 유형에 대한 nAb 수준을 모은 혈청에서 측정하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하였다.
도 5b는 30마리 마우스를 백신접종한 다음 50일에 25-가 HRV로 부스팅한 데이터를 보여준다.
도 6a는 프라이밍 및 부스팅 이후 히말라야 원숭이에서 25-가 불활성화 HRV에 대한 폭넓은 nAb 반응을 나타내는 데이터를 보여준다. 용량 당 불활성화-TCID50 투입 역가는 표 6에 명시된다. 두 마리의 히말라야 원숭이(RM A 및 RM B)를 25-가 HRV + 명반으로 i.m. 백신접종하였다. RM은 제28일에 동일한 부스트 백신접종을 받았고, 부스트 백신접종 이후 nAb 역가를 결정하기 위해 제46일에 혈청을 수집하였다. 파선은 LOD를 나타낸다. 검출 불가능한 nAb는 LOD/2로 정하였다.
도 6b는 두 마리의 히말라야 원숭이(RM C 및 RM D)를 프라이밍 및 부스팅 이후 50-가 HRV + 명반으로 i.m. 백신접종한 데이터를 보여준다.
실시예
HRV 백신 개발에 있어서 주요 장애물은 항원형의 수(>100)이다. HRV 항원형의 수는 본원에 개시되는 방법을 사용하여 일부 극복될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 백신을 조합하는 것(다가)에 관한 하나의 우려는 특유의 항원이 서로 경쟁하거나 간섭할 것이라는 점이다. 불활성화 HRV 항원형은 1가, 3가, 5가, 7가, 또는 10가 조성물로 주어질 때 마우스에서 동등하게 면역원성이었기 때문에 실제로 그렇지 않다는 것이 발견되었다(도 1 및 2). 또한, 10개의 HRV 고역가 참조 항원형 균주(표 2)를 공동-혼합하여 HRVV-10를 생성한다. HRVV-10은 마우스에서 10개의 HRV 항원형에 대하여 혈청 nAb를 이끌어낸다(도 3).
| 표 2. HRVV-10에 포함된 HRV 항원형 | |
| 항원형 | 불활성화 전 P2 바이러스 스톡의 TCID50/mL 역가 |
| HRV-A16 | 7.5 x 108 |
| HRV-A36 | 6.3 x 108 |
| HRV-A78 | 6.3 x 107 |
| HRV-A38 | 1.1 x 108 |
| HRV-A2 | 1.3 x 109 |
| HRV-B14 | 6.6 x 108 |
| HRV-A9 | 3.6 x 108 |
| HRV-A13 | 6.3 x 107 |
| HRV-A29 | 3.6 x 107 |
| HRV-A76 | 3.6 x 107 |
HRV 스톡(stock)
HRV 원형 균주는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구입하였고 H1-HeLa 세포(ATCC)에서 T-75 ㎠ 플라스크에 증식시켰다. 세포변성 효과 피크에서, 세포를 배지에서 긁어 초음파 처리하고, 세포 잔류물을 투명하게 하고, 50 mL 상등액을 분액하여 액체 질소에서 급속-동결하였다. 96-웰 플레이트에서 감염된 H1-HeLa 세포의 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 감염력을 적정하였다. 계대 #1(P1) 스톡의 TCID50 역가를 Reed 및 Muench 종말점 희석을 사용하여 계산하였다.
농축-역가 P2 스톡은 P1 스톡이 있는 10 T-182 ㎠ 플라스크에서 페놀 레드 없이 배지에 H1-HeLa 세포를 감염시키는 것에 의해 생성된다. 감염의 피크 전에, 45 mL의 배지를 각 플라스크로부터 버리고, 세포를 나머지 5 mL에서 긁어 초음파 처리하고, 잔류물을 투명하게 하고, 5 mL 상등액을 2 개의 25 mL 분액으로 모아 급속-동결하였다. 농축 HRV-A16 P2 스톡은 이 방법에 의해 생성되었고 P1 스톡보다 역가의 10-배 증가를 달성하였다.
1가 HRV 백신은 Abbott Labs에서 1964년에 생산되고 Chanock에 의해 시험되었는데, 이는 동종-균주 도전에 대하여 지원자에서 작업한 것으로, 불활성화 HRV-A13의 용량 당 대략 105.5 당량 TCID50을 포함하고, 이 백신은 인간 대상에서 nAb를 유도하였다[Buscho et al. (1972) J. Immunol. 108: 169]. 실패한 2 개의 10가 불활성화 HRV 백신은 10개 항원형의 용량 당 103.3 당량 TCID50의 평균 투입 역가를 가졌다[Hamory et al. J Infect Dis. 1975, 132(6):623-9]. 1가 또는 10가 인간 백신 어느 것도 애주번트를 사용하지 않았다.
HRV BAC
HRV-A16(도 1)의 cDNA 클론을 상업적 cDNA 합성 및 분자 조립에 의해 생성하였다. HRV 게놈 및 폴리(A) 꼬리는 7199 bp cDNA에 의해 암호화된다. 전사는 T7 프로모터(5' T7 프로모터-리보자임-HRV-A16-리보자임--T7 종결부위-3')에 의해 지시된다. 시험관내 T7 전사는 리보자임 절단으로 인해 예상되는 내인성 말단을 갖는 7.2 kb RNA를 얻는다. HRV 캡시드 단백질(VP4, VP2, VP3, VP1)은 구성체에서 SacI 및 ClaI 제한 부위를 측면으로 한다(도 1). 임의의 HRV 유형에 대한 이 캡시드 영역을 나타내는 cDNA를 합성할 수 있다. 재조합 캡시드-키메라 HRV, 예를 들어 HRV-A2의 VP4, VP2, VP3, VP4, 및 2A 단백질 및 HRV-A16 또는 HRV-A80의 2B, 2C, 3A, 3C, 및 3D 단백질을 암호화하는 HRV-cap2/16을 생성하고 구조할 수 있다.
생체내 시험
4개 군의 마우스에 1 HRV 항원형 + 명반, 3 HRV 항원형 + 명반, 5 HRV 항원형 + 명반, 또는 7 HRV 항원형 + 명반 중 하나를 주었다(표 4). 명반과 혼합 전, HRV 균주를 포름알데히드(1:4000 비율)를 사용하여 72시간 동안 37℃에서 완전히 불활성화시켰다. 100 마이크로리터의 백신을 마우스 당 근육내 주사하였다. 각 용량의 HRVV-10은 불활성화된 각각의 바이러스 스톡(표 2) 9 마이크로리터와 10 마이크로리터의 알하이드로겔, 2% 수산화알루미늄 콜로이드 애주번트로 구성되었다.
| 실험군 | 군 당 HRV 항원형 |
| 1 군 (HRVV-1) | HRV-A16 |
| 2 군 (HRVV-3) | HRV-A16 |
| HRV-A36 | |
| HRV-A78 | |
| 3 군 (HRVV-5) | HRV-A16 |
| HRV-A36 | |
| HRV-A78 | |
| HRV-A38 | |
| HRV-A13 | |
| 4 군 (HRVV-7) | HRV-A16 |
| HRV-A36 | |
| HRV-A78 | |
| HRV-A38 | |
| HRV-A13 | |
| HRV-A29 | |
| HRV-B14 |
모든 마우스를 불활성화된 HRV + 명반으로 근육내 경로에 의해 제0일에 백신접종하고 혈청을 제18일에 수집하였다. 다음에, 종말점 중화 항체 역가를 혈청에서 HRV를 사용하여 nAb 분석으로 측정하였다. 모든 면역화된 HRV 균주(HRV-A13 제외)에 대한 중화 항체 역가가 관찰되었다.
50가 불활성화 리노바이러스 백신은 히말라야 원숭이에서 대체로 면역원성이다
BALB/c 마우스를 사용하여 면역원성을 시험하였다. HRV를 H1-HeLa 세포에서 증식시키고 포르말린을 사용하여 감염력을 불활성화시켰다. 미처리 마우스로부터의 혈청은 HRV-A16에 대하여 검출 가능한 nAb를 갖지 않았다. 명반 애주번트는 i.m. 불활성화 HRV-A16에 의해 유도되는 nAb 반응을 증진시켰다(도 3). 불활성화 HRV-A16에 의해 유도되는 nAb 반응에 대한, 또는 3가 백신의 3 유형(HRV-A16, HRV-A36, 및 HRV-A78)에 대한 결합가(1-, 3-, 5-, 7-, 및 10-가를 비교하여)의 영향은 없었다(도 3). 불활성화 전 투입 바이러스의 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 역가(불활성화-TCID50)가 제공된다.
Hamory 등은 2 개의 상이한 10가 불활성화 HRV 제제가 수용자 대상에서 투입 바이러스 유형의 단지 30 내지 40%에 대하여 nAb 역가를 유도하였음을 보고하였다. J Infect Dis 132, 623-629 (1975). 그러나, 불활성화 전 바이러스의 투입 역가는 mL 당 101.5 내지 105.5 TCID50 범위였고, 이들은 다음에 10배 희석되어 10가의 1.0 mL 용량을 생성하였고 애주번트 없이 프라임 및 부스트로서 i.m.으로 주어졌다. 낮은 투입 항원 용량이 10가 불활성화 HRV에 대한 저조한 nAb 반응에 책임이 있을 수 있다. Harmony에서의 10가 백신은, 백신 용량 당 101 내지 105 불활성화-TCID50에 걸쳐, 이용 가능한 HRV 유형과 가능한 한 가깝게 재구성되었고 용량 당 > 105 내지 > 107 불활성화-TCID50 범위의 투입 역가를 갖는 동일 유형의 10가 백신과 비교되었다. Hamory 백신은 프라임 백신접종 후 검출 가능한 nAb를 야기하지 않았다. 부스트 백신접종 이후, 최고 투입 역가를 갖는 5개 유형에 대하여 nAb가 검출되었다(도 3). 고역가 백신은 프라임 백신접종 후 10개 중 5개 유형에서, 그리고 부스팅 이후 10개 유형 모두에서 nAb를 야기하였다(도 4).
부스트 백신접종 이후, 이 모델에서 nAb의 유도에 대한 백신 용량 당 104 불활성화-TCID50 역치가 나타났다(도 4b). 이 역가 위로, 투입 부하와 nAb 유도 사이에 상관관계가 없었다.
사람에게 사용되는 주사 가능한 백신은 보통 0.5 mL 용량으로 주어진다. i.m. 백신 용적은 마우스에서 0.1 mL였다. 0.1 mL 당 25가 HRV 백신을 마우스에서 측정 가능한 원형으로서 시험하였다. 25가 불활성화 HRV 백신은 용적 조정을 수용하도록 10가 조성물보다 유형 당 용량 당 7.4배 더 낮은 평균 불활성화-TCID50을 가졌다.
1프라임 백신접종에 사용.
2부스트 백신접종에 사용. 프라임 및 부스트 백신접종 사이의 중간에, 본 발명자들은 11개 투입 유형의 더 높은 역가 바이러스 스톡을 얻었다(굵은 글씨체). 이들 11개의 더 높은 역가는 부스트 백신접종에 사용되었다.
10가 불활성화 HRV 백신은 프라이밍 및 부스팅 이후 투입 유형의 100%에 대하여 nAb를 유도하였다(도 5a). 10가 불활성화 HRV에 의해 유도된 nAb는 부스팅-이후 203일에 지속중이었다. 25가 불활성화 HRV 프라임 백신접종은 nAb를 25개 중 18개(72%) 바이러스 유형에서 유도하였고, 25가 부스팅은 25개 중 24개 유형(96%)에 대하여 nAb를 야기하였다(도 8b). 프라임 + 부스트로부터 야기된 평균 nAb 역가는 10가에서 27이고 25가에서 26.8였다. 이 데이터는 간단한 백신 접근법으로 다양한 HRV 유형의 광범위한 중화를 보여준다.
백신 결합가를 증가시키기 위해, 히말라야 원숭이(RM) 및 1.0 mL i.m. 백신 용적을 선택하였다. 2마리의 RM을 25가 불활성화 HRV로 백신접종하고, 2마리의 RM을 50가 불활성화 HRV로 백신접종하였다. RM A 및 RM B에서 면역-전 혈청은 25가 백신에 포함된 25개 HRV 유형에 대하여 검출 가능한 nAb를 갖지 않았다. 용량 당 불활성화-TCID50 역가는 마우스보다 RM에서 더 높았다.
25가 백신은 프라임 백신접종 이후 투입 바이러스의 96%(RM A) 및 100%(RM B)에 대하여 nAb를 유도하였다. 50가 백신은 프라임 백신접종 이후 투입 바이러스의 90%(RM C) 및 82%(RM D)에 대하여 nAb를 유도하였다. RM에서 프라임 백신접종에 따른 nAb의 폭은 마우스에서 관찰된 것보다 우수하였는데, 이는 동물 종 차이 및/또는 RM 백신에서의 더 높은 불활성화-TCID50 투입 역가에 기인할 수 있다. 부스트 백신접종 이후, 25가 HRV-백신접종된 RM(도 6a)에서 유형의 100%, 그리고 50가 HRV-백신접종된 RM(도 6b)에서 바이러스 유형의 98%(50개 중 49개)에 대하여 혈청 nAb 역가가 존재하였다. RM에서 프라임 + 부스트로부터 야기된 평균 nAb 역가는 25가에서 29.3이고 50가에서 28.6이었다. nAb 반응은 유형-특이적이고 교차-중화가 아니었는데, 10개의 비-백신 유형에 대하여 25가 백신에 의해 유도된 최소 nAb가 있었기 때문이다. 50가 불활성화 HRV 백신에 대한 nAb 반응은 RM에서 폭넓고 강력하였다.
이들 실험을 기반으로, 유형 당 용량 당 104-5 불활성화-TCID50이 유용할 것으로 추정된다. 따라서, HRV 스톡 역가 ≥ mL 당 107 TCID50이 명반 애주번트를 함유하는 0.5 mL 용량으로 강력한 83가 HRV A 제형에 유용할 것이다. 본 발명자들의 백신접종에 사용된 HRV 스톡은 H1-HeLa 세포에서 생산되었다.
10개의 HRV 유형의 감염성 수율이 백신 생산에 적격일 수 있는 WI-38 및 H1-HeLa에서 비교되었다. 적절한 수율이 또한 WI-38 세포로부터 얻어졌다.
재료 및 방법
H1-HeLa(CRL-1958) 및 WI38(CCL-75) 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수하였고, 10% 우태혈청이 보충되고 페놀 레드가 없는 리히터(Richter) 변형 최소 필수 배지(MEM)(ThermoFisher)에서 배양하였다. HeLa-H1 세포는 LookOut 마이코플라스마 검출 키트(Sigma)를 사용하여 시험하였고, 이들은 마이코플라스마 음성이었다. HRV-A7 (VR-1601), HRV-A9 (VR-1745), HRV-A11 (VR-1567), HRV-A13 (VR-286), HRV-B14 (VR-284), HRV-A16 (VR-283), HRV-A19 (V4-1129), HRV-A24 (VR-1134), HRV-A29 (VR-1809), HRV-A30 (VR-1140), HRV-A31 (VR-1795), HRV-A32 (VR-329), HRV-A36 (VR-509), HRV-A38 (VR-511), HRV-A40 (VR-341), HRV-A41 (VR-1151), HRV-A49 (VR-1644), HRV-A53 (VR-1163), HRV-A56 (VR-1166), HRV-A58 (VR-1168), HRV-A59 (VR-1169), HRV-A60 (VR-1473), HRV-A64 (VR-1174), HRV-A66 (VR-1176), HRV-A68 (VR-1178), HRV-A75 (VR-1185), HRV-A76 (VR-1186), HRV-A77 (VR-1187), HRV-A78 (VR-1188), HRV-A80 (VR-1190), HRV-A81 (VR-1191), HRV-A85 (VR-1195), HRV-A88 (VR-1198), HRV-A89 (VR-1199), HRV-A96 (VR-1296), 및 HRV-A100 (VR-1300) 원형 균주는 ATCC로부터 구입하였다. HRV-A1B, HRV-A10, HRV-A21, HRV-B26, HRV-A33, HRV-A34, HRV-A39, HRV-A45, HRV-A50, HRV-A51, HRV-A54, HRV-A55, HRV-A94 균주는 질병 관리 및 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention)로부터 입수하였다. 이 연구에서 HRV는 HRV-B14를 제외하고는 종 A이고, A 종으로 나타낸다.
HRV 스톡을 H1-HeLa 세포에서 생성하였다. 대략 0.5 mL의 HRV를 T-182 플라스크에서 부분융합된 H1-HeLa 단층 세포로 접종하였다. 진동시키면서 실온에서 1시간 동안 흡착 후, 50 mL의 HRV 감염 배지(2% FBS, 20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 1X 비-필수 아미노산[Gibco 카탈로그 11140-050]으로 보충된 MEM)를 첨가하고, 단층이 완전히 세포변성 효과(CPE)와 연관되는 것으로 보일 때까지 감염-후 1 내지 3일 동안 5% CO2 가습 배양기에서 32℃로 감염이 진행되도록 하였다. 세포를 긁어, 세포와 배지(대략 50 mL)를 두 개의 미리 냉각된 50 mL 원뿔형 폴리프로필렌관으로 옮기고, 링 스탠드에 고정된 ½인치 직경의 혼(horn) 파쇄기 및 ¼인치 직경의 끝이 가늘어지는 마이크로팁이 구비된 Sonic Dismembrator Model 500(Fisher Scientific)을 사용하여 각 현탁액을 초음파 처리하는 동안 얼음 위에 유지하였다. 초음파 처리는 방음 보호된 폐쇄된 방에서 운전자에 의해 10% 진폭, 1초 온/1초 오프 간격으로, 그리고 재료 1 mL 당 1 펄스로 수행하였다. 초음파 처리는 동결-해동보다 더 높은 역가를 얻었다. 현탁액을 931×g에서 10분 동안 원심분리로 투명하게 하였다. 상등액을 저온바이알로 옮기고 액체 질소에서 급속 냉동하여 -80℃에서 저장하였다. H1-HeLa 및 WI-38 세포에서 HRV 수율을 비교하기 위해, T-75 플라스크의 부분융합 세포를 0.1 TCID50/세포의 감염다중도(MOI)로 감염시키고, 20 mL의 배양 배지를 버린 후 남은 5 mL에서 세포를 긁어 초음파 처리하였다. 스톡에 대하여, 부분융합된 H1-HeLa 세포를 96-웰 플레이트에서 연속 희석된 샘플로 감염시키고, 세포를 감염-후 6일에 0.1% 크리스탈 바이올렛/20% 메탄올로 염색하고, 웰에서 CPE 점수를 매기고, 그리고 "A simple method of estimating fifty percent endpoints" Am J Hyg 27, 493-497 (1938)에 보고된 Reed 및 Muench 방법 a를 사용하여 종말점 역가를 계산하는 것에 의해, TCID50/mL 역가를 결정하였다.
HRV 스톡을 위에 기술한 것과 같이 H1-HeLa 세포 단층으로부터 수확하고 저속에서 짧은 원심분리로 투명하게 하여 대형 세포 잔류물을 제거하였다(931×g, 10분, 4℃). 친화성 크로마토그래피로 조 바이러스 스톡으로부터 과잉 알부민을 제거하기 위해, 제조자의 설명서에 따라 AKTAPurifier 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 상등액을 HiTrap Blue HP 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 통과액을 다음에 HiTrap Capto Core 700 컬럼(GE Healthcare)을 통해 로딩하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 바이러스 제제를 정제하였다. HiTrap Blue HP 및 HiTrap Capto Core 700으로부터의 통과액을 AKTAPurifier 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 포집하였다. SEC로부터의 통과액을 0.1 M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 밤새 투석한 다음, HiTrap Q XL 컬럼(GE Healthcare)으로 로딩하고 이온 교환 크로마토그래피로 분획하였다. 바이러스-함유 분획을 AKTAPurifier 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 0.1 M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0) 및 염화나트륨 구배로 용출시켰다. 280 nM에서 높은 흡수 피크를 보이는 분획을 수집하여 TCID50 종말점 희석 분석에 의해 바이러스 역가를 분석하고, 분획 순도를 10% SDS-PAGE 겔에서 실버 염색으로 가시화하였다(Thermo Fisher Scientific). 높은 바이러스 역가 및 순도의 HRV-A16, HRV-A36, 및 HRV-A78의 분획을 모아서 아래 기술하는 것과 같이 포르말린-불활성화하였다.
젊은 성체(3 내지 5 kg, 2 내지 4세, 2 암컷 및 2 수컷) 인도 히말라야 원숭이(Macaca mulatta; RM)를 비-맹검 방식으로, 군 당 수컷 1마리 및 암컷 1마리의 2개의 백신군(25가 및 50가)으로 할당하였다. 면역화 전에, 모든 HRV 유형을 0.025% 포르말린 첨가에 이어서 72시간 동안 37℃에서 교반 배양하는 것에 의해 불활성화하였다. 감염력의 완전 불활성화는 H1-HeLa 세포에서 종말점 TCID50 적정에 의해 확인하였다. 이 방법에 의한 포르말린 불활성화는 마우스에서 베타-프로피오락톤에 의한 대안적인 불활성화보다 더 높은 면역원성을 야기하여, 포르말린 불활성화가 항원 결정기를 보존하는 것을 제안한다. 마우스를 제조자의 지침에 따라 100 ㎍의 알하이드로겔 애주번트 2%(수산화알루미늄 습식 겔 현탁액, 명반)(Sigma 카탈로그 A8222 또는 Invivogen 카탈로그 vac-alu)와 혼합된 불활성화 HRV 균주로 i.m. 백신접종하였다. 마우스 당 총 용적은 100 μL로, 대퇴부 당 50 μL로 투여하였다. 이때 마우스에 제2의 동일 백신접종(부스트)을 주었다. RM을 500 ㎍의 알하이드로겔 애주번트 2%와 혼합된 불활성화 HRV 균주로 i.m. 백신접종하였다. RM 당 총 용적은 1 mL로, 한쪽 다리에 투여하였다. RM은 4 주에 동일한 백신접종으로 부스팅하였다.
마우스에서, 말초 혈액을 악하 정맥으로부터 미량원심분리관으로 수집하였다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양하여 응고시켰다. 관을 7500×g로 10분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 샘플을 각 군의 마우스로부터 모아 -80℃에서 사용시까지 저장하였다. RM에 대한 정맥절개술을 공복의 동물에서 케타민(10 mg/kg) 또는 텔라졸(4 mg/kg) 마취 하에 시행하였다. 케타민 또는 텔라졸 마취 후, 동물을 대퇴 정맥으로부터 실혈시켰다. 혈청 분리관(SST)에 혈액을 모은 후, 샘플을 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 관을 2500×g로 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 각 RM으로부터의 혈청 샘플을 -80℃에서 사용 시까지 저장하였다.
H1-HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 접종하여 24시간에 80 내지 90% 융합을 얻었다. 열-불활성화(56℃, 30분) 혈청 샘플을 MEM으로 2배 연속 희석하고 시험하는 각 유형의 HRV 500 TCID50/mL에 동일 용적으로 첨가하였다. 바이러스 및 혈청 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음에 50 μL의 혈청-바이러스 혼합물을 96-웰 플레이트에서 H1-HeLa 세포 단층으로 3회 옮기고, 플레이트를 2,095×g로 30분 동안 4℃에서 스핀접종하였다. 각 유형에서, 투입 500 TCID50를 시험하기 위해 무-혈청 대조를 첨가하였다. 본 발명자들은 모아진 HRV-A16에 대한 HRV-A16 항-혈청을 각 분석에서 표준으로 시험하였다. 스핀접종 후, 150 μL의 HRV 감염 배지를 각 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 6일 동안 32℃ 및 5% CO2에서 배양한 다음 위에 기술한 것과 같이 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 웰을 CPE의 존재 또는 부재에 대하여 점수를 매겼다. 중화 항체 종말점 역가 및 95% 신뢰 구간을 Reed 및 Muench의 방법으로 결정하였다. 95% 신뢰 구간은 단일 nAb 실험 내에서 세 번의 기술적 복제의 변동성을 나타낸다.
Claims (12)
- 엔테로바이러스의 10개보다 많은 항원형의 불활성화 바이러스 및 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 명반(황산알루미늄칼륨), 또는 이의 혼합물을 포함하는 애주번트를 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 각 항원형은 mL 당 1×103 TCID50보다 큰 농도인 액체 형태의 조성물.
- 제1항에 있어서, HRV-A16, HRV-A36, HRV-A78, HRV-A38, HRV-A2, HRV-B14, HRV-A9, HRV-A13, HRV-A29, HRV-A76, HRV-A60, HRV-A49, HRV-A41, HRV-A32, HRV-A58, 및 HRV-A11의 항원형을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 리노바이러스는 포르말린-불활성화되고
바이러스가 세포에서 복제하는 조건 하에 항원형을 세포와 혼합하고; 세포를 배지에서 배양하고, 선택적으로 정제하고/하거나 최종 농도가 mL 당 1×106 TCID50와 같거나 이보다 크게 되도록 바이러스를 농축하고; 그리고
불활성화 바이러스를 야기하는 조건 하에 바이러스를 포름알데히드와 혼합하는 공정에 의해 생산되는 것인 조성물. - 제4항에 있어서, 세포는 인간 불멸 세포 또는 다른 세포주인 조성물.
- 제4항에 있어서, 생산 공정은 복제된 바이러스를 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제6항의 면역 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 리노바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제7항에 있어서, 인간 리노바이러스는 불활성화되고 용량 당 1×103 TCID50 위의 농도로 투여되는 방법.
- 제8항에 있어서, 1 용량의 백신이 투여되고 제2 용량은 제1 용량 이후 3일보다 긴 시간 이후 투여되는 방법.
- 제7항에 있어서, 대상은 5세 미만인 방법.
- 제7항에 있어서, 대상은 60세보다 나이가 많은 방법.
- 제7항에 있어서, 대상은 천식, COPD, 기종, 만성 기관지염, 낭포성 섬유증으로 진단받은 방법.
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