CN108018330A - 一种用人微血管内表皮细胞icam-1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法 - Google Patents

一种用人微血管内表皮细胞icam-1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用人微血管内表皮细胞ICAM‑1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法。发明点在于，不通过RNA提取，直接将HMEC‑1细胞表面ICAM‑1蛋白用荧光抗体标记后，通过流式细胞仪检测其表达量，具体为：将HMEC‑1细胞接种在细胞培养板中，待细胞长至单层，用凉茶检测液与细胞孵育，再用LPS处理细胞，诱导发生炎症，发生炎症细胞表面ICAM‑1蛋白表达量显著增加，将凉茶检测液孵育细胞后，ICAM‑1蛋白的表达量受到抑制。利用荧光标记ICAM‑1抗体标记细胞表面ICAM‑1蛋白，用流式细胞仪定量检测凉茶检测液对发炎细胞表面ICAM‑1蛋白的表达量，以蛋白的表达量作为衡量凉茶检测液抗炎效果的指标。

Description

一种用人微血管内表皮细胞ICAM-1蛋白表达量检测凉茶抗炎 活性的方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种用人微血管内表皮细胞(HMEC-1)表面细胞间粘附因子(ICAM-1)蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法。更具体地说是在细胞水平上，先将凉茶与HMEC-1细胞共同孵育，然后利用脂多糖(LPS)诱导HMEC-1细胞产生炎症反应，即LPS诱导HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白高表达，然而经过不同的凉茶测液预处理后，HMEC-1细胞的ICAM-1蛋白分子表达水平会受到不同程度的抑制，最终通过计算凉茶检测液对HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白分子表达水平的抑制率高低，定量分析凉茶的抗炎效果。
背景技术
炎症是机体应对病原感染、细胞应激以及组织损伤而产生的一种本能而又必要的反应。最初招募的先天免疫细胞又会产生一系列的趋化因子和粘附因子，这些炎症因子将在机体招募其它免疫细胞、杀死病原菌、清理死细胞以及刺激机体修复的过程中发挥重要作用(J.F.Foley,2003；Gabriel and Annalisa M.VanHook,2013；J.F.Foley,2015)。在发炎的组织中，脉管通透性往往在一定范围内增加，一方面内皮细胞开始表达多种类型的粘附因子(Adhesion molecular)：选择素、整合素以及免疫球蛋白，这些蛋白在调控机体招募白细胞到发炎部位过程中发挥着重要作用(Koning et al.,2002；Metselaarand Storm,2005；Ding et al.,2006)；另一方面，机体产生趋化因子，通过浓度依赖，定向诱导白细胞的迁移。白细胞响应趋化因子和粘附因子构成了外来病原入侵后的第一道防线(Murphy PM,1994；Gangur M and Oppenheim JJ.,2000；Chen Xin et al.,2002)。特别是在LPS诱导的急性炎症模型中，中性粒细胞需要粘附并迁移穿过血管内皮细胞从而到达炎症部位。一开始，借助于选择素家族基因(Selectin gene family)的表达，在白细胞表面表达L-selectin，在内皮细胞表面表达E-selectin以及P-selectin，两者相互作用产生初步粘附(Stoolman LM,1989；Springer TA,1990；Butcher EC,1991)。然而在流动的血液环境中初始的粘附是不够的，更牢固的结合需要中性粒细胞表面的FLA-1整合蛋白与血管内皮细胞表面的细胞间粘附因子(ICAM-1)相结合(Springer TA,1990；Butcher EC,1991)。本专利要求的方法在体外模拟了该炎症反应过程。
炎症带来的问题不在于它的顺利启动，而在于当威胁消除时往往不能及时有效的平息炎症(Carl Nathan and Aihao Ding,2010)。研究发现过度的天然免疫反应，伴随着过早地招募炎性白细胞，就是造成1918年流感大面积发病的关键原因(Kobasa et al.,2007)。后来研究表明，如果炎症反应没有被终止，或者如果组织遭受继续的炎症，这实际上导致组织损伤而不是促进愈合。慢性炎症可以导致多种疾病，哮喘和类风湿性关节炎到动脉粥样硬化，炎性肠病，甚至是癌症(J.F.Foley,2003；Rasch and Algul,2014；J.F.Foley,2015)。
人微血管内表皮细胞(HMEC-1)在天然免疫中十分重要，其分泌的粘附因子是调控机体炎症反应的主要因素。针对细胞粘附模型国内外开发了一系列抗炎药物，美国康奈尔大学Moonsoo Jin等将其开发作为定点给药的细胞研究对象(Sungkwon Kang et al.,2011)。因而我们选用HMEC-1作为我们的筛选体系。我们选择ICAM-1细胞分子作为判断细胞炎症的评价标准。其依据在于，前人大量研究表明ICAM-1分子与各类炎症反应紧密相关。比如，急性胰腺炎早期中性粒细胞的ICAM-1表达急剧上升(Dabrowski et al.,2014)。哮喘病人嗜酸粒细胞依靠ICAM-1进行黏附，体内体外试验表明其内皮细胞表达水平亦升高(Wegneet al.,1990)。空气污染可致炎症反应，如柴油机尾气挥发物颗粒引起人肺支气管表皮细胞中ICAM-1转录和蛋白水平增加(Takizawa et al.,2000)。实验模型中T细胞透过血脑屏障是自身免疫疾病脑脊髓炎(Encephalomyelitis)和多发性硬化症(Multiple sclerosis)病程中至关重要，研究表明T细胞表面ICAM-1数量与其穿透血脑屏障能力直接对应(Abadier et al.，2015)。
炎症反应过程复杂，其伴随的细胞因子风暴往往是病原菌感染期间机体发病和致死的先兆。所以通过调节机体免疫反应，特别是抑制钝化细胞因子表达，不仅可以保护机体，也可以减轻药物对病原菌的选择压力，具有十分可观的应用前景(John R.Teijaro etal.,2015)，而抗炎凉茶具有调控机体免疫力功能，是目前最具开发价值的产品之一。
凉茶是我国岭南地区居民以中医理论为指导，以金银花、布渣叶、菊花、鸡蛋花等多种天然植物为原料熬制而成，有清热泻火、清源固本，解郁行气的功效(谭剑斌等，2013)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用人微血管内表皮细胞(HMEC-1)检测凉茶抗炎活性的方法，该方法是通过人微血管内表皮细胞(HMEC-1)中ICAM-1的基因表达量检测凉茶检测剂的抗炎活性的方法，其原理在于预先用具有抗炎活性的凉茶检测液孵育的HMEC-1细胞，当HMEC-1细胞再受到脂多糖(LPS)侵染时，其细胞间粘附因子ICAM-1蛋白分子的表达相比于直接接触等量LPS侵染的细胞，会受到不同程度的抑制。
本发明的总体技术思路是：将生长状态良好的人微血管内表皮细胞(HMEC-1)接种在24孔细胞培养板中，待HMEC-1细胞长至单层，用待测凉茶检测液与所述的HMEC-1细胞孵育3h，再用1μg/ml脂多糖(LPS)处理HMEC-1细胞12h，人工激发细胞炎症反应，将HMEC-1细胞和具有荧光标记的ICAM-1单克隆抗体孵育，HMEC-1细胞表面的ICAM-1蛋白和抗体特异性结合，最后细胞流式细胞术检测HMEC-1细胞表面细胞粘附因子ICAM-1蛋白分子的表达量，凉茶检测液预孵育后HMEC-1细胞ICAM-1的表达量可以作为衡量凉茶检测液的抗炎效果的标准。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
一种利用人微血管内表皮细胞(HMEC-1细胞)检测凉茶抗炎活性的方法，其发明点在于，不通过RNA提取，直接将HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白用荧光抗体标记后，通过流式细胞仪检测其表达量，包括下列步骤：
(1)凉茶检测液的配制：
以mg/L计：
(1)按干燥植物原料计，称取鸡蛋花10g，金银花10g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min后，插上电煎药壶在高火下(100℃，将电煎药壶调至功率450W)1h，温火下(85-95℃，将电煎药壶调至功率300W)1h，共计煎煮2h，重复前述方法煎煮一次，分别用定性滤纸(购自杭州沃华滤纸有限公司)过滤，合并两次滤液，减压抽滤后，收集滤液；
(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1MPa，65℃条件下旋转蒸发浓缩成浸膏，取出浸膏，于-20℃冻结，再用真空冷冻干燥机(丹麦，Labogene SCANVAC coolsafe 110-4，按照产品说明书操作)处理冻结后的浸膏，得到凉茶粉末，于-20℃下保存备用；
(3)称取步骤(2)所得的凉茶粉末100mg/样本，用10ml的MCDB131基础培养基(购自sigma公司)溶解，配成10mg/ml的凉茶母液，用0.22μm无菌滤膜(购自Salus公司)过滤后分装，于-20℃保存备用，保存时间不超过14d；
(4)配制1mg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharides，简称LPS，购自Sigma公司)溶液作为HMEC-1细胞的诱导剂；配制1mM的雷公藤红素(Celastrol)溶液，作为阳性对照药物；配制5mg/ml的噻唑蓝(MTT，购自Biosharp公司)，所有试剂需0.22μm无菌滤膜过滤后分装到无菌EP管里，于-20℃下保存备用，其中MTT需要避光保存；
(5)配制磷酸缓冲液(PBS)，氯化钠137mM,氯化钾2.7mM,磷酸氢二钠10mM,磷酸二氢钾2mM(均购自国药集团化学试剂有限公司),高压蒸汽灭菌后4℃保存备用；
(6)用步骤(5)配好的无菌PBS配制含0.02％乙二胺四乙酸的胰酶(Trypsin>250.N.F.u/mg，购自Biosharp公司)0.25mg/ml，0.22无菌μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用；
(7)将生长状态良好的HMEC-1细胞，用细胞计数板计数后，接入96孔细胞培养板(购自Corning公司)，MCDB131完全培养基为MCDB131基础培养基中继续添加10％的胎牛血清(购自阿根廷Natocor-Industria Biológica公司)，1μg/ml的氢化可的松(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)和10ng/ml的重组人表皮生长因子(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，在37℃，5％CO2条件下培养HMEC-1细胞；
(8)待HMEC-1细胞长至单层，更换如步骤(7)所述的MCDB131完全培养基0.1ml/孔，凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，使终浓度为1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml，每个浓度设6个重复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h后，每孔加入步骤(4)配制的MTT 10μl/孔，继续培养4h，取出培养板包上锡箔纸避光，4000rpm离心3min，小心弃掉上层培养基，再在通风环境中加入二甲基亚砜(DMSO，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)100μl/孔，避光震荡5-10min；酶标仪上检测各孔在490nm的吸光值(OD490)，计算评估药物对细胞的毒性；
(9)将步骤(7)中生长状态良好的HMEC-1细胞接到24孔细胞培养板中，培养基为步骤(7)所述的MCD131完全培养基，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至单层，弃掉旧培养基，更换新鲜的如步骤(7)所述的MCDB131完全培养基0.5ml/孔，设置空白对照组、单独脂多糖组、脂多糖+雷公藤红素组和脂多糖+凉茶检测组。脂多糖+凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，使终浓度控制在步骤(8)检测结果中对细胞没有毒性的浓度范围，即0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml；脂多糖+雷公藤红素组加入1μM步骤(4)配制好的雷公藤红素，凉茶检测液和雷公藤红素预先孵育细胞3h，除了空白对照组外，其余处理组都加入1μg/ml步骤(4)中配制的LPS，继续培养HMEC-1细胞12h；
(10)在步骤(9)结束前30min，用步骤(5)配制好的PBS配制细胞标记缓冲液(Labeling buffer)，包含0.5％(质量/体积，W/V)牛血清蛋白(BSA，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)、10mM MgCl2(购自国药集团化学试剂有限公司)，冰上孵育至少15min；
(11)将步骤(9)中处理后的细胞，弃去旧培养基，用步骤(5)配置好的无菌PBS洗涤3次，每孔加入50μl步骤(6)配置好的胰酶溶液，37℃孵育3-4min，每孔加入150μl步骤(7)所述的MCDB131完全培养基，中和胰酶的消化反应，收集各个孔的细胞转移至96孔尖底细胞培养板(购自Corning公司)中，3000rpm离心3min，弃去上清，每孔加入200μl步骤(10)提前配置的labeling buffer，室温下孵育30min，封闭多余位点；3000rpm离心3min弃去上清，加入鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(一抗，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)20μl每孔，室温下孵育30min，加入150μl labeling buffer洗涤一次，3000rpm离心3min，弃去上清，每孔加入20μl PE标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体(二抗，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)，避光孵育15min，每孔加入150μl labeling buffer洗涤一次，3000rpm离心3min，弃去上清液，立即用流式细胞仪(Guava，购自美国MILLIPORE公司)检测，或者4℃避光保存细胞，保存时间不得超过4h；
(12)用于流式细胞仪检测的每个样品至少收集5000个HMEC-1细胞，设定激发波长为576nm，吸收波长为488nm，检测细胞平均荧光强度，以细胞荧光强度的数值关联ICAM-1蛋白的表达量。。
本发明的优点在于：
1、RNA脆弱易降解，造成实验结果误差非常大，细胞表面蛋白更加稳定，检测结果更加真实可靠。
2、跳过生物分子的提取，操作简便，节省时间，实验中没有用到有毒的化学试剂，更加安全环保；
更详细的技术方案和试试效果请参见《具体实施方式》。
附图说明
图1：MTT检测单组份凉茶孵育HMEC-1细胞24h后细胞的存活率(显著性分析相比较于0mg/ml组，*p<0.05；0.001<**p<0.01；***P<0.001)。附图标记说明：甘草、菊花、布渣叶、金银花、鸡蛋花和夏枯草0mg/ml，即细胞正常生长24h后，MTT检测正常活细胞总数，再经过DMSO溶解后，通过酶标仪检测得到各组在490nm处的吸光值(OD 490nm)，并设为100％，经过药物处理后的各组经过相同的检测方法，得到OD 490nm值相对于0mg/ml组的OD 490nm值的百分比。甘草、金银花和鸡蛋花在0.1mg/ml到1.6mg/ml时，24h内都没有细胞毒性；然而菊花、布渣叶和夏枯草，随着浓度的增加表现出越来越强的毒性；但是六种凉茶检测液在0.1-0.4mg/ml时24h之内都没有显著性抑制细胞生长的性质；
图2：是本发明配制的单组份凉茶检测液孵育后，流式细胞术检测HMEC-1细胞表面与ICAM-1蛋白特异性结合的PE标记的ICAM-1抗体荧光值(显著性分析相比较于LPS组，*p<0.05；**p<0.01)。附图标记说明：PE标记的ICAM-1抗体可以与HMEC-1细胞表面的ICAM-1蛋白特异性结合，通过流式细胞术检测细胞荧光值，等价于相应的ICAM-1蛋白在HMEC-1细胞表面上的表达量。相对于空白对照组，LPS处理12h可以显著诱导HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白高表达，阳性对照药Celastrol相较于LPS提前孵育，阻断细胞信号传导通路，抑制LPS对于ICAM-1蛋白的诱导作用，维持在CK水平；甘草、金银花和鸡蛋花在0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml都没有表现出对ICAM-1蛋白表达的显著抑制作用；菊花和布渣叶在低浓度下0.01mg/ml时没有显著抑制作用，然而随着浓度的升高，均表现出显著的抑制LPS诱导HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白高表达的作用。实验结果显示出该方法检测凉茶抗炎活性的灵敏性。
具体实施方式
实施例1 LPS诱导不同浓度凉茶孵育后HMEC-1细胞ICAM-1蛋白的表达量
凉茶检测液的配制：
以重量/体积(mg/L)计：
(1)称取中药材鸡蛋花10g，金银花10g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min后，插上电煎药壶(购自广东奇巧贸易有限公司)煎煮时间共2h(高火，例如电煎药壶设置功率为450W，即100℃，煎煮1h；温火例如电煎药壶设置功率为300W，即85～95℃下煎煮1h)，重复煎煮一次，分别用定性滤纸(购自杭州沃华滤纸有限公司)过滤，合并两次滤液，减压抽滤后，收集滤液；
(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1MPa，65℃条件下旋转蒸发浓缩成凉茶检测液浸膏，取出浸膏，于-20℃冻结；
(3)将步骤(2)得到的凉茶检测液的浸膏冻结块，用真空冷冻干燥机(丹麦，Labogene SCANVAC coolsafe 110-4，按照产品说明书操作)冷冻干燥成粉末，确保水分完全蒸发，收集凉茶检测液的粉末，于-20℃保存备用；冷冻干燥机操作方法如下，首先清理机身中残留的水分避免堵塞抽气口，然后打开电源使机身预冷降温至-110℃，将冻结成块的凉茶检测液快速放入样品室，盖好样品室盖子并关闭换气阀，打开真空泵抽取样品室空气至真空状态，检测装置气密性，大约48h后凉茶检测液形成蜂窝状突起，达到完全干燥状态；
(4)称取步骤(3)得到的凉茶检测液的粉末100mg/样，用10ml的MCDB131基础培养基(购自sigma公司)溶解，配成10mg/ml凉茶检测液母液，用0.22μm无菌滤膜(购自Salus公司)过滤后分装，在-20℃保存备用，保存时间不超过14d；
(5)配制1mg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS,026B6,购自sigma公司)作为HMEC-1细胞诱导剂和1mM的雷公藤红素(Celastrol)，作为阳性对照，于-20℃下保存备用；
(5)配制磷酸盐缓冲液(PBS)，氯化钠137mM，氯化钾2.7mM，磷酸氢二钠10mM，磷酸二氢钾2mM(均购自国药集团化学试剂有限公司)，具体方法是：用800ml蒸馏水溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4调节PH值至7.4，加水定容至1L，分装后高压蒸汽灭菌后4℃保存备用；
(6)用步骤(5)配好的无菌磷酸盐缓冲液配制0.25mg/ml胰酶(Trypsin>250.N.F.u/mg，购自Biosharp公司)，并继续添加0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)，0.22无菌μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用；
(7)将生长状态良好的HMEC-1细胞，用细胞计数板计数后，接入96孔细胞培养板(购自Corning公司)的孔中，MCDB131完全培养基为MCDB131基础培养基并继续添加10％的胎牛血清(购自阿根廷Natocor-Industria Biológica公司)，1μg/ml的氢化可的松(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)和10ng/ml的重组人表皮生长因子(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，在37℃，5％CO2条件下培养HMEC-1细胞；
(8)待HMEC-1细胞长至单层，更换如步骤(7)所述的MCDB131完全培养基0.1ml/孔，凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，使终浓度为1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml五个梯度浓度，每个浓度设6个重复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24-72h后，每孔加入步骤(4)配制的MTT 10μl/孔，继续培养4h，取出培养板包上锡箔纸避光，4000rpm离心3min，小心弃去上层培养基，在通风环境中每孔加入100μl的二甲基亚砜(DMSO，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，避光震荡5-10min；使用酶标仪(购自美国BIO-RAD Laboratories公司)检测各孔在490nm的吸光值(OD490)，计算评估药物对细胞的毒性；酶标仪的使用参照使用说明书，首先检测前需要开机预热10min，保持光路系统的稳定，将震荡混匀后的细胞板放入酶标仪的检测台，注意放置方向，设定490nm波长，检测每孔吸光值V490；将不加药物处理的孔设为100％，经过药物孵育后的孔的吸光值换算成不加药物孔吸光值的百分数，即：药物处理后细胞相对存活率％＝(药物V490)*100/(不加药物V490)，要求药物孵育细胞后相对存活率不得低于85％；
(9)将步骤(7)中生长状态良好的HMEC-1细胞接到24孔细胞培养板中，培养基为步骤(7)所述的MCD131完全培养基，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至单层，弃去旧培养基，更换新鲜的如步骤(7)所述的MCDB131完全培养基0.5ml/孔，设置空白对照组、单独脂多糖组、脂多糖+雷公藤红素组和脂多糖+凉茶检测组。脂多糖+凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，终浓度控制在步骤(8)检测结果中对细胞没有毒性的浓度范围，即0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml；脂多糖+雷公藤红素组加入1μM步骤(4)配制好的雷公藤红素，凉茶检测液和雷公藤红素细胞预先孵育3h，除了阴性对照组外，其余组都加入1μg/ml步骤(4)中配制的脂多糖，继续培养细胞12h；
(10)在步骤(9)结束前30min，用步骤(5)配制好的磷酸盐缓冲液配制细胞标记缓冲液(Labeling buffer)，即无菌的磷酸盐缓冲液中继续添加0.5％(质量/体积，W/V)牛血清蛋白(BSA，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)和10mM MgCl2(购自国药集团化学试剂有限公司)，冰上孵育至少15min；
(11)将步骤(9)中处理后的细胞，弃去旧培养基，用步骤(5)配置好的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每孔加入50μl步骤(6)配置好的胰酶溶液，37℃孵育3-4min，每孔加入150μl步骤(7)所述的MCDB131完全培养基，中和胰酶的消化反应，收集各个孔的细胞转移至96孔尖底细胞培养板(购自Corning公司)，3000rpm离心3min，弃去上清，每孔加入200μl步骤(10)提前配置细胞标记缓冲液，室温下孵育30min，封闭多余位点；3000rpm离心3min弃去上清，每孔加入20μl鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(一抗，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)，室温下孵育30min，每孔加入150μl细胞标记缓冲液洗涤一次，3000rpm离心3min，弃去上清，每孔加入20μl PE标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体(二抗，购自美国Santa CruzBiotechnology公司)，避光孵育15min，每孔加入150μl细胞标记缓冲液，3000rpm离心3min，弃去上清液，然后立即上流式细胞仪(Guava购自美国Millipore公司)检测，或者4℃避光保存细胞，保存时间不得超过4h；
(12)流式细胞仪上机检测，每个样品收集至少5000个细胞，激发波长为576nm，吸收波长为488nm，检测细胞平均荧光强度，细胞荧光强度的强弱代表了ICAM-1蛋白的表达量的高低。HMEC-1细胞ICAM-1蛋白表达量的高低在一定程度上可以代表药物对LPS诱导的细胞炎症的抑制效果；Guava流式细胞仪的操作方法参照使用说明书，具体为：首先细胞上机检测前打开机器，校准光路，然后清洗仪器，清洗液Guava ICF cleaning Fluid(购自美国Millipore公司)清洗第一遍，按照电脑提示，用蒸馏水清洗第二遍，即可上机检测；第二步为参数的调节，FSC,SSC,Yellow的电压调节，保证细胞分散在在以FSC为纵坐标，以SSC为横坐标的坐标轴的45°线上，同时保证LPS诱导组的细胞其荧光值不会超过坐标轴最大值；第三步就是上机检测，吸取200μl/孔的标记缓冲液轻轻吹打细胞使其混匀，放入检测孔，收集5000-10000个细胞，导出总荧光强度，换算成细胞平均荧光强度；第四步清洗仪器，方法同第一步，并处理数据作图；用SPSS statistic20进行平均数单因素方差分析，标记出各组相对于LPS组的显著性，*P<0.05,0.001<**P<0.01,***P<0.001。

Claims (1)

1.一种利用人微血管内表皮细胞ICAM-1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法，其特征在于，不通过RNA提取，直接将HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白用荧光抗体标记后，通过流式细胞仪检测其表达量，包括下列步骤：
(1)凉茶检测液的配制：
以mg/L计
(1)以干燥的植物原料计，称取鸡蛋花10g，金银花10g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min，插上电煎药壶在100℃下煎煮1h，85-95℃下煎煮1h，重复前述方法煎煮一次，分别用定性滤纸过滤，合并两次滤液，减压抽滤并收集滤液；
(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1MPa，65℃下旋转蒸发浓缩成浸膏，取出浸膏，于-20℃下冻结，再用真空冷冻干燥机处理冻结后的浸膏，得到凉茶粉末，保存于-20℃下；
(3)称取步骤(2)所得的凉茶粉末100mg/样本，用10ml的MCDB131基础培养基溶解，配成10mg/ml的凉茶母液，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用，保存时间不超过14d；
(4)配制1mg/ml的脂多糖溶液作为HMEC-1细胞的诱导剂；配制1mM的雷公藤红素溶液，作为阳性对照药物；配制5mg/ml的噻唑蓝溶液，配制后的溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后分装到无菌EP管，-20℃下保存备用；
(5)配制磷酸盐缓冲液,在121℃高压蒸汽灭菌后于4℃下保存备用；
(6)用步骤(5)配制的无菌磷酸盐缓冲液配制0.25mg/ml的胰酶，并添加0.02％的EDTA，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用；
(7)将生长状态良好的HMEC-1细胞，用细胞计数板计数后，接入96孔细胞培养板上，细胞培养板按0.1ml/孔的量添加MCDB131培养基，附加10％的胎牛血清，1μg/ml的氢化可的松和10ng/ml的重组人表皮生长因子，在37℃，5％CO2条件下培养HMEC-1细胞；
(8)待HMEC-1细胞长至单层，弃去旧的MCDB131培养基，更换如步骤(7)所述的新鲜MCDB131培养基，在凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，使终浓度分别为1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml的梯度浓度，每个浓度设6个重复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h后，每孔加入步骤(4)配制的噻唑蓝10μl，继续培养4h，然后取出培养板包上锡箔纸避光，在4000rpm离心3min，小心弃去上层培养基，再在通风环境中加入二甲基亚砜100μl/孔，避光震荡5-10min；在酶标仪上检测各孔在OD490的吸光值，计算评估药物对细胞的毒性；
(9)将步骤(7)中生长状态良好的HMEC-1细胞接到24孔细胞培养板中，按步骤(7)添加MCD131培养基，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至单层，弃去旧的MCD131培养基，每孔更换新鲜的如步骤(7)所述的MCD131培养基0.5ml，设置空白对照组,单独脂多糖组，脂多糖+雷公藤红素组和脂多糖+凉茶检测组，脂多糖+凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配制的凉茶检测液，使终浓度控制在步骤(8)检测结果中且对细胞没有毒性的浓度范围，即0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml；在脂多糖+雷公藤红素组加入步骤(4)配制的终浓度为1μM的雷公藤红素；将凉茶检测液和雷公藤红素预先孵育HMEC-1细胞3h，除空白对照组外，其余组均加入步骤(4)中配制的终浓度为1μg/ml的脂多糖，继续培养HMEC-1细胞至12h；
(10)在步骤(9)结束前30min，用步骤(5)配制好的磷酸盐缓冲液配制细胞标记缓冲液，即磷酸盐缓冲液中继续添加0.5％质量体积的牛血清蛋白和10mM MgCl2，在冰上孵育至少15min；
(11)将步骤(9)中处理后的HMEC-1细胞，弃去旧培养基，用步骤(5)配制的无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，每孔加入50μl步骤(6)配制的胰酶溶液，37℃孵育3-4min，然后每孔加入150μl步骤(7)所述的MCDB131培养基，中和胰酶的消化反应，收集各个孔的HMEC-1细胞转移至96孔尖底细胞培养板中，3000rpm离心3min，弃去上清，按200μl/孔的量加入步骤(10)配制并预冷的细胞标记缓冲液，在室温下孵育30min，封闭多余位点；在3000rpm离心3min，弃去上清，每孔按20μl的量加入鼠抗人ICAM-1单克隆抗体，在室温下孵育30min，再加入150μl细胞标记缓冲液，在3000rpm离心3min，弃上清，按20μl/孔加入PE标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体，避光孵育15min，每孔加入150μl细胞标记缓冲液，在3000rpm离心3min，弃去上清液，立即用流式细胞仪检测，或在4℃下避光保存HMEC-1细胞，保存时间不得超过4h；
(12)用于流式细胞仪检测的每个样品至少收集5000个HMEC-1细胞，设定激发波长为576nm，吸收波长为488nm，检测细胞平均荧光强度，以细胞荧光强度的数值关联ICAM-1蛋白的表达量。
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