CN108018295A - 一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法，以黄孢原毛平革菌为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680；根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点，将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体，连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序，最终得到重组产漆酶工程菌。本发明构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高，提高了近39%。
Description
技术领域
本发明属于高产漆酶基因工程菌的构建技术领域，具体涉及一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法。
背景技术
漆酶（laccase）是一种多铜氧化酶，能够对木质素进行有效的降解，氧化分解木质素中的酚类物质，近年来，对漆酶的研究也越来越多，并已经取得了显著的结果，在环境保护、造纸、食品等行业中也表现出极大的研究价值和应用潜力。尽管漆酶的研究已经取得一定的进展，但自然界中漆酶的产量较少，目前国内对产漆酶的菌种培养研究还处于起步阶段，因此利用分子生物学方法研究漆酶基因并制备表达漆酶的工程菌，对实现漆酶的大规模生产和漆酶在各行业应用具有重要的意义。漆酶在造纸、环保、能源及食品等领域极富利用价值，目前漆酶的发酵主要来自于真菌，但工业化生产却较难实现，究其原因主要是易污染、酶活性不稳定且活力相对较低所致。此外，大部分真菌漆酶只有在中温且弱酸条件下才能表现出较高的催化活性，这极大的限制了真菌漆酶在某些工业领域的应用。因此，通过克隆性质优良的新型漆酶基因，构建高效异源表达载体及蛋白质改造等，是解决漆酶资源短缺、增强酶在较高温度下的稳定性及在碱性条件下的高催化活性的重要途径。
黄孢原毛平革菌（phanerochaetechrysosporium）属于担子菌纲（Basidiomycetes），同担子菌亚纲（Homobasediomucetidas），非褶菌目（Aphyllophorales），丝核菌科（Corticiaceae）。由河南师范大学生命科学学院从菌肥中分离获得，该菌株具有高产漆酶的生化性质和生产性能。该菌株与报道过的其他菌株相比，酶活力高，降解性能较好，同时产酶的条件也好控制，为本研究漆酶基因的克隆表达、漆酶的纯化奠定了基础，对构建好的工程菌产生的漆酶进行了分离纯化和酶学性质研究，为后续运用蛋白质工程的方法改造酶的催化活力和稳定性奠定了基础。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法，该方法利用同源克隆技术，将黄孢原毛平革菌的漆酶基因在工程菌中诱导表达，并对产生的漆酶进行纯化，通过对比重组基因工程菌与黄孢原毛平革菌野生株不通过培养时间产酶活力，构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于具体步骤为：
（1）以黄孢原毛平革菌phanerochaetechrysosporium为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680，该漆酶基因lac1680的基因序列如SEQ IDNo:1所示；
（2）根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点，设计以下两条特异性引物：Lac-F1：5’ CATATCCATATGCTGTTTGCCCTGCTGGCCCTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:2所示，Lac-R1：5’ AATCACCTCGAGTGCGGCGCTG CACATATTTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:3所示，其中F1中含有Nde I酶切位点，R1中含有Xho I酶切位点，以漆酶基因lac1680为模板，F1、R1为引物进行PCR扩增，扩增产物回收后，与对应表达载体经双酶切、回收、连接，最终将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体。
进一步优选，步骤（2）中PCR扩增条件优选为：94℃，5min预变性；94℃，1min，58℃，30s，72℃，2min；29个循环；72℃延伸10min。
本发明所述的重组产漆酶工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤为：将上述步骤（2）连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序，最终得到重组产漆酶工程菌，该重组产漆酶工程菌产酶活力明显高于黄孢原毛平革菌野生株产酶活力。
进一步优选，制得的重组产漆酶基因工程菌漆酶诱导表达的最佳条件为：使用0.4-0.6mmol/L IPTG，25℃ 200-250rpm诱导≥5h，经对重组产漆酶工程菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测，获得75KDa目的条带，表明诱导表达成功。
本发明通过对比重组基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生株不同培养时间产酶活力，构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高，提高了近39%，本研究为今后进一步研究和改造漆酶，并进行工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1是黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的结构示意图。
图2是pET24a-mco1重组表达质粒双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳，图中Lane1：pET24a-mco1重组质粒；Lane2：pET24a-mco1重组质粒XbaI-XhoI双酶切验证；Lane M：DNAMarker。
图3是pET24a-lac-BL21（DE3）重组基因工程菌预表达的全菌裂解物SDS-PAGE检测，其中1：pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌未诱导对照；2：pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌经IPTG诱导后；M：预染蛋白分子量标准。
图4是SDS-PAGE检测纯化的lac-c-His6蛋白，其中1、pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌放大诱导后全菌；2、pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌放大诱导破碎后上清；3、上样流出液；4、纯化洗脱下来的lac-c-His6蛋白；M：预染蛋白分子量标准。
图5是WB验证lac-c-His6蛋白（用His的抗体），其中1、pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌放大诱导破碎后上清；2、浓缩的lac-c-His6蛋白；3、纯化洗脱下来的lac-c-His6蛋白；4、阴性对照（未诱导的pET24a-lac-BL21（DE3）重组菌）；M：预染蛋白分子量标准。
图6是黄孢原毛平革菌产漆酶能力折线图。
图7是重组产漆酶基因工程菌产漆酶能力折线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
1、漆酶基因克隆及表达载体的构建
根据Gengbank中已登录的漆酶基因的核苷酸序列（登录号为AY225437.1）设计特异引物为上游Lac-F1（5’ CATATCCATATGCTGTTTGCCCTGCTGGCCCTG 3’，含有Nde I酶切位点）和下游引物Lac-R1（5’ AATCACCTCGAGTGCGGCGCTG CACATATTTG 3’，含有Xho I酶切位点）。提取黄孢原毛平革菌总DNA为模板，PCR扩增条件为94℃，5min 预变性；94℃，1min，58℃，30s，72℃，2min；29个循环；72℃延伸10min。所得片段胶回收后与克隆载体pET24a载体连接，转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3），挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序。
将克隆好的漆酶基因用Nde I 和Xho I进行双酶切，胶回收漆酶基因片段，将其与经相同酶切线性化的pET24a（+）载体连接，并将其转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3），筛选出阳性转化子。酶切验证正确后，挑选阳性转化子接种于含50μg/mL Kan的4mL LB培养液的试管中，37℃ 220rpm振摇过夜并冻存；次日按1:100接种于50μg/mL Kan的30mL LB培养液中，37℃ 220rpm振摇至菌体OD600为0.4（约2h）；取出1mL培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，25℃ 220rpm振摇5h，诱导CPE融合蛋白表达；取出1mL培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4℃ 4000g离心12min，弃上清，沉淀置-20℃冻存。
2、漆酶的纯化及表达产物的Western Blotting鉴定
将过夜诱导表达的菌液于12000r/min，4℃离心15min，收集菌体，采用超声波细胞破碎法，用pH7.4 PBS缓冲液悬浮菌体，经0.45μm滤膜过滤后上柱，经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化得到纯化后的漆酶蛋白，收集流出液，进行12wt% SDS-PAGE分析。收集不同诱导表达时间的表达产物100μL，加入100μL 2×Sample Buffer重悬，开水煮沸5min。各取10μL上样进行10wt% SDS-PAGE电泳。然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上，取下硝酸纤维素膜利用TBST缓冲液短暂漂洗后经5wt%光明脱脂奶粉室温封闭lh，再用TBST漂洗3次后，与His-Tag单抗孵育过夜，次日TBST漂洗3次后，与IRDye800标记的羊抗鼠IgG孵育lh，最后TBST 3次洗膜经Odyssey红外激光成像系统扫描实验结果。
3、重组基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生型菌株不同培养时间产酶活力比较
通过对不同时间培养的菌株通过细胞破碎后，应用ABTS法测得其漆酶活性，从而作图分析。
使用0.4-0.6mmol/L IPTG，25℃ 200-250rpm诱导≥5h，经对重组产漆酶工程菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测，获得75KDa目的条带，表明诱导表达成功。随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化，纯化回收后，漆酶纯度可达98%以上。为了更进一步验证lac1680漆酶蛋白的可靠性，经WesternBlot杂交分析表明，洗脱纯化后和浓缩后的溶液中在目的位置都出现了75KDa的目的条带，进一步证明漆酶诱导表达成功。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> 一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgtttgccctgctggccctgggcgcagccattggtgttggtgccgcaccgagcagt 60
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<212> DNA
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序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法
<130> 2018
<141> 2018-01-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aatcacctcg agtgcggcgc tgcacatatt tg 32
Claims (4)
1.一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于具体步骤为：
（1）以黄孢原毛平革菌phanerochaetechrysosporium为模板，利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因，核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性，将其命名为漆酶基因lac1680，该漆酶基因lac1680的基因序列如SEQ IDNo:1所示；
（2）根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点，设计以下两条特异性引物：Lac-F1：5’ CATATCCATATGCTGTTTGCCCTGCTGGCCCTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:2所示，Lac-R1：5’ AATCACCTCGAGTGCGGCGCTG CACATATTTG 3’，其基因序列如SEQ IDNo:3所示，其中F1中含有Nde I酶切位点，R1中含有Xho I酶切位点，以漆酶基因lac1680为模板，F1、R1为引物进行PCR扩增，扩增产物回收后，与对应表达载体经双酶切、回收、连接，最终将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体。
2.根据权利要求1所述的黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体的构建方法，其特征在于步骤（2）中PCR扩增条件优选为：94℃，5min预变性；94℃，1min，58℃，30s，72℃，2min；29个循环；72℃延伸10min。
3. 一种重组产漆酶工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤为：将权利要求1中步骤（2）连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21，挑取阳性转化子，提取质粒酶切鉴定后测序，最终得到重组产漆酶工程菌，该重组产漆酶工程菌产酶活力明显高于黄孢原毛平革菌野生株产酶活力。
4. 根据权利要求3所述的重组产漆酶工程菌的构建方法，其特征在于：所制得的重组产漆酶基因工程菌漆酶诱导表达的最佳条件为：使用0.4-0.6mmol/L IPTG，25℃ 200-250rpm诱导≥5h，经对重组产漆酶工程菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测，获得75KDa目的条带，表明诱导表达成功。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1880416A (zh) * | 2005-06-14 | 2006-12-20 | 河南农业大学 | 秸秆类纤维原料生产燃料乙醇的方法 |
| CN101532261A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-09-16 | 无锡益达生物技术有限公司 | 一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法 |
| CN102994524A (zh) * | 2012-11-16 | 2013-03-27 | 南京农业大学 | 一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用 |
| CN107140748A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-09-08 | 湖南大学 | 一种去除水中2，2，4，4‑四溴联苯醚的方法 |
| WO2017220551A1 (en) * | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Metgen Oy | Method for obtaining active insoluble xylose isomerase |
-
2018
- 2018-01-15 CN CN201810037232.2A patent/CN108018295A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1880416A (zh) * | 2005-06-14 | 2006-12-20 | 河南农业大学 | 秸秆类纤维原料生产燃料乙醇的方法 |
| CN101532261A (zh) * | 2009-04-13 | 2009-09-16 | 无锡益达生物技术有限公司 | 一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法 |
| CN102994524A (zh) * | 2012-11-16 | 2013-03-27 | 南京农业大学 | 一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用 |
| WO2017220551A1 (en) * | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Metgen Oy | Method for obtaining active insoluble xylose isomerase |
| CN107140748A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-09-08 | 湖南大学 | 一种去除水中2，2，4，4‑四溴联苯醚的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LARRONDO,L.F.等: "Phanerochaete chrysosporium extracellular multicopper oxidase (mco1) mRNA, mco1-B allele, complete cds", 《GENBANK: AY225437.1》 * |
| LUIS F. LARRONDO等: "A Novel Extracellular Multicopper Oxidase from Phanerochaete chrysosporium with Ferroxidase Activity", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 陈建军等: "黄孢原毛平革菌漆酶基因lac1680的克隆、表达及产酶研究", 《生物技术通报》 * |
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