CN108017687A - 一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法 - Google Patents

一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法 Download PDF

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侯喜林
张志硕
胡春梅
董慧杰
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Abstract

本发明属于植物营养成分提取领域，具体涉及一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法；该方法通过单因素试验和配置标准溶液并绘制标准曲线，在595nm波长测得吸光值，计算出回归方程；称取新鲜不结球白菜叶片1g放入研钵中，加2ml磷酸缓冲溶液研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6ml磷酸缓冲溶液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在25℃下放置45min以充分提取，离心处理弃去沉淀，上清液转入10ml容量瓶，并以磷酸缓冲溶液定容至刻度，得待测样品提取液；吸取0.1ml蛋白质提取液，加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min后测得595nm下的吸光值，计算得到待测样品提取液中蛋白质含量。本发明的实验准确性高和提取效果好。

Description

一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取 方法
技术领域
本发明属于植物营养成分提取领域，具体涉及一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法。
背景技术
不结球白菜是我国的大宗蔬菜，在日常生活中占有重要地位。可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等实验中作为重要指标。重金属离子进入植物体后，与其他化合物结合成金属络合物或螯合物，抑制植物各种代谢活动尤其是蛋白质的合成。因此，可溶性蛋白质含量也是衡量植物是否发生重金属胁迫的重要指标。
考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈棕红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。在实际应用中，缓冲液浓度、提取时间、液料比、提取温度等多个因素，均会影响其提取工艺。
发明内容
为解决现有技术存在的提取不充分问题，本发明提供一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，响应面分析法是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，进而能提高实验的准确性和提取效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，包括以下步骤：
(1)首先进行单因素试验，以可溶性蛋白含量为响应值，得到缓冲液浓度、提取时间、液料比和提取温度的数值；
(2)配置标准溶液并绘制标准曲线：先配制1mg/ml的牛血清蛋白母液，再往牛血清蛋白母液中加入磷酸缓冲溶液配制一组浓度分别为1.0mg/ml， 0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的牛血清蛋白溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml， 0.02mg/ml的牛血清蛋白溶液，在595nm波长测得吸光值，计算出回归方程；
(3)称取新鲜不结球白菜叶片1g放入研钵中，加2ml磷酸缓冲溶液研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6ml磷酸缓冲溶液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在25℃下放置45min以充分提取，离心处理弃去沉淀，上清液转入10ml容量瓶，并以磷酸缓冲溶液定容至刻度，得待测样品提取液，每次试验重复三次；
(4)吸取0.1ml蛋白质提取液，加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min 后测得595nm下的吸光值，计算得到待测样品提取液中蛋白质含量。
优选的，所述磷酸缓冲溶液的pH值为7。
优选的，所述步骤(2)中回归方程为Y＝0.034X+0.5088，R2＝0.9714；其中，其中，R为相关系数，Y为吸光值，X为蛋白质浓度。
优选的，所述步骤(2)中离心处理的转速为4000r/min离心处理时间为 20min。
优选的，所述步骤(3)提取时，缓冲液浓度为0.08mol/L、提取时间为65min、液料比为14：1、提取温度为26℃。
相对于现有技术，本发明的有益效果为通过响应面分析法对不结球白菜中的可溶性蛋白的提取工艺进行优化；首先利用单因素实验设计考察提取温度、提取时间、料液比和提取液浓度四个因素对可溶性蛋白提取量的影响。研究发现提取温度、提取时间、料液比和提取液浓度四个因素对可溶性蛋白提取量影响显著，再利用响应面实验设计考察上述四个因素，得到不结球白菜中可溶性蛋白的最佳提取条件，提高实验的准确性和提取效果。
附图说明
图1是提取液浓度和可溶性蛋白提取量的关系图；
图2是提取温度和可溶性蛋白提取量的关系图；
图3是液料比和可溶性蛋白提取量的关系图；
图4是提取时间和可溶性蛋白提取量的关系图；
图5提取温度及缓冲液浓度交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图b；
图6提取时间及缓冲液浓度交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图b；
图7提取时间及液料比交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图 b；
图8缓冲液浓度及液料比交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图b；
图9提取时间及提取温度交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图b；
图10提取温度及液料比交互影响可溶性蛋白提取量的响应面图a及等高线图b。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件按照说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，包括以下步骤：
(1)首先进行单因素试验，以可溶性蛋白含量为响应值，得到缓冲液浓度、提取时间、液料比和提取温度的数值；
(2)配置标准溶液并绘制标准曲线：先配制1mg/ml的牛血清蛋白母液，再往牛血清蛋白母液中加入磷酸缓冲溶液配制一组浓度分别为1.0mg/ml， 0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的牛血清蛋白溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml， 0.02mg/ml的牛血清蛋白溶液，在595nm波长测得吸光值，计算出回归方程；回归方程为Y＝0.034X+0.5088，R2＝0.9714；其中，其中，R为相关系数，Y为吸光值，X为蛋白质浓度(μg/ml)；结果计算：样品中可溶性蛋白含量(mg/g鲜质量)＝X·VT·N/(W·VS·1000)式中：X为根据样品的吸光值所查得的标准曲线值，VT为提取液总体积(mL)；W为样品鲜质量(g)；VS为测定时加样量(mL)； N为稀释倍数。
(3)称取新鲜不结球白菜叶片1g放入研钵中，加2ml磷酸缓冲溶液研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6ml磷酸缓冲溶液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在25℃下放置45min以充分提取，离心处理弃去沉淀，上清液转入10ml容量瓶，并以磷酸缓冲溶液定容至刻度，得待测样品提取液，每次试验重复三次；
(4)吸取0.1ml蛋白质提取液，加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min 后测得595nm下的吸光值，计算得到待测样品提取液中蛋白质含量。
所述磷酸缓冲溶液的pH值为7。
所述步骤(2)中离心处理的转速为4000r/min离心处理时间为20min。
所述步骤(3)提取时，缓冲液浓度为0.08mol/L、提取时间为65min、液料比为14：1、提取温度为26℃。
实验设计
首先进行单因素试验，以可溶性蛋白含量为响应值，当提取温度选取15℃、 25℃、35℃、45℃、55℃，液料比选取10、15、20、25、30、35，提取时间选取15min、30min、45min、60min、75min、90min，提取液浓度选取0.02mol/L、 0.05mol/L、0.08mol/L、0.11mol/L、0.14mol/L、0.17mol/L时对可溶性蛋白提取量的影响，单因素试验中，对其中一个进行探讨时，其余各因素的取值分别为时间为45min，温度为25℃，提取液浓度为0.09mol/L，液料比10：1。
提取液浓度对可溶性蛋白提取量的影响
如图1所示，在提取温度为25℃，提取时间为45min，液料比为10：1时，随着提取液浓度增大，可溶性蛋白提取量先升高后降低，在浓度为0.08mol/L 时，提取量达到最大值9.03mg/g。
提取温度对可溶性蛋白提取量的影响
如图2所示，在提取时间为45min，液料比为10：1，提取液浓度为0.09mol/L 时，随着提取温度升高，可溶性蛋白提取量先升高后降低，在25℃时，提取量达到最大值9.16mg/g。
液料比对可溶性蛋白提取量的影响
如图3所示，在提取液浓度为0.09mol/L，提取时间为45min，提取温度为25℃时，随着液料比增大，可溶性蛋白提取量先升高后降低，在液料比为15： 1时，提取量达到最大值9.15mg/g。
提取时间对可溶性蛋白提取量的影响
如图4所示，在提取温度为25℃，液料比为10：1，提取液浓度为0.09mol/L 时，随着提取时间增加，可溶性蛋白提取量先升高后降低，在提取时间为60min 时，提取量达到最大值9.19mg/g.
响应面法分析可溶性蛋白提取量的影响因素
在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件，根据Box-behnken 中心组合试验设计原理，设置对不结球白菜叶片可溶性蛋白提取量影响显著的4 个因素即提取时间(A)提取液浓度(B)液料比(C)提取温度(D)作为自变量，以可溶性蛋白提取量为响应值设计四因素三水平响应面试验，见表一。
表一响应面实验因素水平
可溶性蛋白提取量回归方程的建立与方差分析
响应面设计方案与实验结果见表二。采用Design Expert8.0.6软件对表二数据进行多元回归拟合，获得对响应值可溶性蛋白提取量的影响因子即提取时间 (A)提取液浓度(B)液料比(C)提取温度(D)值的多项式回归模型，得到可溶性蛋白提取量的回归方程：
Y＝9.56+0.39A-0.10B+0.061C+0.081D+0.35AB-0.19AC-0.092AD+0.12 BC-0.53BD-0.025CD-0.56A2-0.68B2-0.26C2-0.7D2
表二响应面分析方案与实验结果
试验的各因素方差分析见表三。由方差分析结果可知，该模型比较显著，失拟项不显著(P＝0.9691>0.05)决定系数R2＝0.8911，校正系数R2 Adj＝0.9231，表明响应值的变化有89.11％是由所考察的四个因素引起的，即此模型对于不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取量实际值与预测值之间具有较好的拟合度，可运用该模型对不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取工艺进行优化，由显著性检验结果可知，一次项A，AB，BD与二次项A2，B2，C2和D2均存在极显著差异(极显著)，一次项B，AC在0.01水平内显著。在提取条件中，对可溶性蛋白提取量响因素中，提取时间(A)>提取液浓度(B)>提取温度(D)>液料比(C)，交互项BD>AB>AC，其他交互项对提取率无显著影响。
表三各因素方差分析表
响应面分析和优化结果
图5到图10是基于多元回归模型所绘制的各因素之间两两交互作用对不结球白菜叶可溶性蛋白提取量的影响响应面a及等高线图b；响应曲面三维图和等高线二维图从一定程度上可以直观反映两因素对响应值的交互影响强弱。响应曲面越陡峭，说明响应值受所考察因素的交互影响越大，反之，则影响越小。等高线越趋于椭圆形，说明响应值受所考察因素的交互影响越大，越趋于圆形，则影响越小，由图5到图10可以看出，响应曲面陡峭程度依次减小，交互项 BD>AB>AC>BC>AD>CD，与表三中的显著性检验结果相吻合。
最佳提取工艺的确定及验证
利用Design Expert 8.0.6软件的optimization功能，对可溶性蛋白提取量最大值进行工艺预测，得出最佳提取工艺条件为：提取温度为25.99℃、提取时间为64.81min、料液比14.04：1，缓冲液浓度0.08mol/L。可溶性蛋白提取量预测值为9.62mg/g.考虑实际操作过程的方便性，选择提取温度为26℃、提取时间为65min、料液比14：1，缓冲液浓度0.08mol/L。
在该工艺下进行五次平行实验所得的可溶性蛋白提取量平均值为9.51mg/g，与预测值相差仅0.11mg/g，拟合率良好，表明用响应面法对不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取的各因素进行优化研究合理可行的，用该方法提取的不结球白菜可溶性蛋白，可用于分子生物学试验的后续验证，研究酶活以及了解植物体总代谢，也可以衡量植物在某种条件下是否会发生重金属胁迫，是非常理想的一种精细提取方法。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先进行单因素试验，以可溶性蛋白含量为响应值，得到缓冲液浓度、提取时间、液料比和提取温度的数值；
(2)配置标准溶液并绘制标准曲线：先配制1mg/ml的牛血清蛋白母液，再往牛血清蛋白母液中加入磷酸缓冲溶液配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的牛血清蛋白溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的牛血清蛋白溶液，在595nm波长测得吸光值，计算出回归方程；
(3)称取新鲜不结球白菜叶片1g放入研钵中，加2ml磷酸缓冲溶液研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6ml磷酸缓冲溶液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在25℃下放置45min以充分提取，离心处理弃去沉淀，上清液转入10ml容量瓶，并以磷酸缓冲溶液定容至刻度，得待测样品提取液，每次试验重复三次；
(4)吸取0.1ml蛋白质提取液，加入5ml考马斯亮蓝G250试剂，放置2min后测得595nm下的吸光值，计算得到待测样品提取液中蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，其特征在于，所述磷酸缓冲溶液的pH值为7。
3.根据权利要求1所述的一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中回归方程为Y＝0.034X+0.5088，R2＝0.9714；其中，R为相关系数，Y为吸光值，X为蛋白质浓度。
4.根据权利要求1所述的一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心处理的转速为4000r/min离心处理时间为20min。
5.根据权利要求1所述一种基于响应面分析的不结球白菜叶片中可溶性蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(3)提取时，缓冲液浓度为0.08mol/L、提取时间为65min、液料比为14：1、提取温度为26℃。
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