CN108002998A

CN108002998A - 一种萘类化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN108002998A
Application number: CN201711067094.4A
Authority: CN
Inventors: 杜刚; 杨海英; 胡秋芬; 詹梦涛; 胡秋月; 刘赟
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN108002998B

Abstract

本发明公开了一种萘类化合物及其制备方法和应用。所述的萘类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₅H₁₆O₆，结构式为：该化合物命名为：naphthalde C；所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M 2017632，保藏日期为2017年10月23日。所述的制备方法是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。所述的应用为所述的萘类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明化合物结构新颖，化合物活性好，有较好的应用前景。

Description

一种萘类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种萘类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

伴随着抗生素的长期不规范的使用，耐药细菌已成为全球性的问题；其中最严重的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），MRSA感染在医院内日趋流行；Klevens 等报道2005年来预计每年美国有超过9万人感染这种致命的超级病菌，其中有近1.9万人死亡，这个数据比2001年美国疾病控制与预防中心（CDC）的报道增加了2倍。MRSA治疗难度大，病死率高，已与乙型肝炎、艾滋病并列为世界三大感染性疾病，成为全球性公共卫生问题之一。1978年，医务人员在上海抽检了200株金黄色葡萄球菌，分离出的MRSA还不到5%。2009年对住院病人的抽样调查显示对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）超过60%，同比2000年增长了40%。中国医科大学微生物学院的朱宝丽及其同事曾对中国、丹麦、西班牙人肠道菌群的DNA进行测序，研究显示：中国人肠道菌群具有更多的耐药基因。因此研发能有效控制耐药细菌感染的新策略和新药物，成为抗菌素研究的热点。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种萘类化合物；第二目的在于提供所述的萘类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的萘类化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的萘类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₅H₁₆O₆，结构式为：

该化合物命名为：naphthalde C ；

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、固体发酵：将菌株福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含10~100ml液体种子培养基的50~500ml的三角瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下震荡培养5~10天得到含菌营养基，将其接种到大米固体培养基中培养得到发酵产物；

B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂超声提取2~4次，每次2~6h，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；

C、硅胶柱层析：浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~300目，用量为浸膏重量6~8倍量；用体积比为20:1~1:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、高压液相色谱分离纯化：将以6:4配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经硅胶柱色谱和制备高效液相色谱分离纯化即得目标物萘类化合物，即naphthalde C。

本发明的萘类化合物的结构通过以下方法测定：

本发明化合物为黄色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max(log ε): 332 (3.65),268 (3.18), 215 (3.87)nm；红外光谱（溴化钾压片）ν _max: 3415, 3062, 2958, 2752,1687, 1624, 1530, 1442, 1351, 1179, 1287, 1142, 1065, 1014cm^-1；HRESIMS显示本发明化合物加钠的分子离子峰m/z 315.0852 [M+Na]⁺（C₁₅H₁₆NaO₆计算值为315.0845），结合¹H和¹³C NMR谱（图2和图3，数据归属见表1）给出其分子式C₁₅H₁₆O₆。

化合物的¹H 和¹³C NMR谱显示化合物中有15个碳信号和15个氢信号，包括1,2,3,6,8-5元取代的萘环信号[C-1（d _C 166.3 s），C-2（d _C 108.3 s），C-3（d _C 153.8 s），C-4（d _C98.3 d），C-4a（d _C 138.0 s），C-5（d _C 98.5 d），C-6（d _C 164.4 s），C-7（d _C 103.1 d），C-8（d _C158.6 s），C-8a（d _C 104.6 s）; H-4（d _H6.43 s）， H-5（d _H 6.59 d，J=2.2），H-7（d _H 6.29 d，J=2.2）]，两个甲氧基信号[OMe-3（d _C 55.8 q; d _H 3.81 s)，OMe-6（d _C 56.0 q; d _H 3.84 s)]，两个酚羟基信号[Ar-OH-1（d _H12.77 s），Ar-OH-8（d _H11.63 s）]，一个3-羟基丙酰基[C-1'（d _C205.6 s），C-2'（d _C42.5 t），C-3'（d _C 61.7 t）；H₂-2'（d _H 3.36 tJ=6.2），H₂-3'（d _H4.39 tJ=8.8）]。红外光谱显示有羟基（3415 cm^-1）、羰基（1687 cm^-1）和苯基（1624,1530,1442cm^-1）的吸收峰。紫外光谱在332， 268和215 nm有吸收显示有扩展的生色团和芳香环的存在。HMBC谱中H-4（6.43 s)与C-2（d _C 108.3 s）/ C-3（d _C 153.8 s）/C-5（d _C 98.5 d）/C-4a（d _C138.0 s）/C-8a（d _C 104.6 s），H-5（6.59 d，J=2.2）和C-4（d _C 98.3 d）/C-6（d _C 164.4 s）/C-7（d _C 103.1 d）/C-4a（d _C 138.0 s）, H-7（6.29 d，J=2.2）和C-5（d _C 98.5 d）/C-6（d _C 164.4s）/C-8（d _C 158.6 s）/C-8a（d _C 104.6 s）相关，证实了化合物中5元取代的萘环的结构。H₂-2′(δ _H 3.36) 和 C-2 (δ _C 108.3)相关，证实3-羟基丙酰基连接在C-2位，OMe(δ _H 3.81) 和C-3 (δ _C 153.8)，OMe(δ _H 3.84) 和 C-6 (δ _C 164.4)相关，证实甲氧基分别连接在C-3和C-6位，Ar-OH质子 (δ _H 12.77)和C-1 (δ _C 166.3)/C-2 (δ _C 108.3)/ C-8a (δ _C 104.6)相关，Ar-OH质子 (δ _H 11.63)和C-7 (δ _C 103.1)/C-8 (δ _C 158.6)/ C-8a (δ _C 104.6)相关，证实酚羟基连接在C-1和C-8位。此外，特征质子信号 H-4 (δ_H 6.43 s), H-5 (δ_H 6.59, d, J=2.2)和H-7 (δ_H 6.29, d, J=2.2) 也证明以上取代基的位置，因此化合物的结构得以确认。

表1 化合物的¹H和¹³C NMR数据（溶剂为CDCl₃）

本发明的第三目的是这样实现的，所述的萘类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

近年来，研究的重点重新转向了从微生物中寻找具有不同抗菌机理的新骨架次生代谢产物，而植物内生真菌代谢产物是该领域最引人注目的热点，其中最常产生抗菌活性化合物的类群为拟茎点霉属（Phomopsis）、茎点霉属（Phoma）和镰刀菌属（Fusarium）。拟茎点霉属是半知菌亚门、腔孢纲真菌中的一个大属，该类菌株可产生丰富的次生代谢产物，Weber等从鸡冠刺桐分离出的Phomopsis sp.中获得的一个新的抗菌活性内酯类化合物phomol，该化合物对 24种细菌和真菌进行生物学试验都显示出很好的抗菌活性。Horn 等从细柱柳中分离出Phomopsis sp.菌株，分离到的细胞松弛素类生物碱 phomopsichalasin可抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、藤黄球菌、大肠杆菌。

本发明的化合物是首次被分离出来，通过核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱数据确定其分子式及结构。以微量肉汤稀释法测试其抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，测得化合物的MIC为8μg/ml，说明该化合物有较好的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，可作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的先导化合物。

附图说明

图1为化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）；

图2为化合物的核磁共振碳谱（¹³C NMR）；

图3为化合物的相关谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的萘类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₅H₁₆O₆，结构式为：

该化合物命名为：naphthalde C ；

所述福士拟茎点霉（Phomopsis fukushii）菌株，菌株保藏编号为CCTCC M 2017632，保藏日期为2017年10月23日。

本发明所述萘类化合物的制备方法，包括以下步骤：

A步骤中所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒斜面制备得到。

A步骤中所述的液体种子培养基为NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L， pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌得到。

A步骤中所述的大米固体培养基为大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌制备得到。

B步骤中所述的有机溶剂为体积浓度60~80%的丙酮、乙醇或甲醇。

C步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析前，还包括将浸膏用重量比1.5~3倍量的甲醇溶解，然后用浸膏重1~3倍的80~200目硅胶拌样。

C步骤中所述的混合有机溶剂为氯仿-甲醇。

所述的混合有机溶剂体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。

本发明所述的萘类化合物的应用为所述的萘类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

（1）将保藏于斜面固体培养基中福士拟茎点霉菌CCTCC M 2017632接种于斜面固体培养基的平板中活化，验纯后接种于斜面固体培养基中保存备用。所述斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒平板和斜面备用；

（2）将保存备用的福士拟茎点霉菌CCTCC M 2017632转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24 h，转速为180r/min，得拟茎点霉菌种子液。所述的液体种子培养基为：NaNO₃2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；

（3）取步骤（2）所得福士拟茎点霉菌种子液，按培养基质量比2％接入大米固体培养基中进行固体发酵，发酵温度为25°C，35天发酵完成。所述的大米培养基为：大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌备用。

（4）取福士拟茎点霉菌CCTCC M 2017632发酵产物10kg,用80%的乙醇超声提取3次，每次1h，提取液合并、过滤，减压浓缩成浸膏A1120g；在浸膏A加入等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成141g浸膏B。

（5）浸膏B用甲醇溶解后，用80目的硅胶200g拌样，然后用160目硅胶柱1500g装柱进行层析分离，采用体积配比为20:1, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5的氯仿-甲醇溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分。

（6）取（5）中氯仿-甲醇6:4洗脱浓缩部分10.1g用高效液相色谱进一步分离，以47%的甲醇流动相，C18制备色谱柱（20×250mm,20mL/min）半制备柱为固定相，紫外检测波长为254nm，收集11.3min的色谱峰，多次累加后蒸干，得黄色胶状物。

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：

（1）用70%的乙醇超声提取3次，每次2h；减压浓缩的浸膏A为1020g；减压浓缩的浸膏B122g。

（2）浸膏B用160目的硅胶200g拌样。

（3）氯仿-甲醇6:4洗脱部分为9.2g，以49%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离，收集10.6min的色谱峰。

实施例3

重复实施例1，有以下不同点：

（1）用75%的乙醇超声提取3次；减压浓缩的浸膏A为1090g；减压浓缩的浸膏B 为132g。

（2）氯仿-甲醇6:4洗脱部分为10.3g，以52%的甲醇为流动相，收集9.8min的色谱峰。

实施例4

重复实施例1，有以下不同点：

（1）浸膏B用100目的硅胶200g拌样。

（2）氯仿-甲醇6:4洗脱部分为11.6g，以55%的甲醇为流动相进行高效液相色谱分离，收集8.7min的色谱峰。

实施例5

取实施例1制备的化合物，为黄色胶状物，测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max(log ε): 332 (3.65), 268 (3.18), 215(3.87)nm；

（2）红外光谱（溴化钾压片）ν _max: 3415, 3062, 2958, 2752, 1687, 1624, 1530,1442, 1351, 1179, 1287, 1142, 1065, 1014cm^-1；

HRESIMS显示本发明化合物加钠的分子离子峰m/z 315.0852 [M+Na]⁺（C₁₅H₁₆NaO₆计算值为315.0845），结合¹H 和¹³C NMR谱（图2和图3，数据归属见表1）给出其分子式C₁₅H₁₆O₆。

化合物的¹H 和¹³C NMR谱显示化合物中有15个碳信号和15个氢信号，包括1,2,3,6,8-5元取代的萘环信号[C-1（d _C 166.3 s），C-2（d _C 108.3 s），C-3（d _C 153.8 s），C-4（d _C98.3 d），C-4a（d _C 138.0 s），C-5（d _C 98.5 d），C-6（d _C 164.4 s），C-7（d _C 103.1 d），C-8（d _C158.6 s），C-8a（d _C 104.6 s）; H-4（d _H6.43 s）， H-5（d _H 6.59 d，J=2.2），H-7（d _H 6.29 d，J=2.2）]，两个甲氧基信号[OMe-3（d _C 55.8 q; d _H 3.81 s)，OMe-6（d _C 56.0 q; d _H 3.84 s)]，两个酚羟基信号[Ar-OH-1（d _H12.77 s），Ar-OH-8（d _H11.63 s）]，一个3-羟基丙酰基[C-1'（d _C205.6 s），C-2'（d _C42.5 t），C-3'（d _C 61.7 t）；H₂-2'（d _H 3.36 t J=6.2），H₂-3'（d _H4.39t J=8.8）]。红外光谱显示有羟基（3415 cm^-1）、羰基（1687 cm^-1）和苯基（1624,1530,1442cm^-1）的吸收峰。紫外光谱在332， 268和215 nm有吸收显示有扩展的生色团和芳香环的存在。HMBC谱中H-4（6.43 s)与C-2（d _C 108.3 s）/ C-3（d _C 153.8 s）/C-5（d _C 98.5 d）/C-4a（d _C138.0 s）/C-8a（d _C 104.6 s），H-5（6.59 d，J=2.2）和C-4（d _C 98.3 d）/C-6（d _C 164.4 s）/C-7（d _C 103.1 d）/C-4a（d _C 138.0 s）, H-7（6.29 d，J=2.2）和C-5（d _C 98.5 d）/C-6（d _C 164.4s）/C-8（d _C 158.6 s）/C-8a（d _C 104.6 s）相关，证实了化合物中5元取代的萘环的结构。H₂-2′(δ _H 3.36) 和 C-2 (δ _C 108.3)相关，证实3-羟基丙酰基连接在C-2位，OMe(δ _H 3.81) 和C-3 (δ _C 153.8)，OMe(δ _H 3.84) 和 C-6 (δ _C 164.4)相关，证实甲氧基分别连接在C-3和C-6位，Ar-OH质子 (δ _H 12.77)和C-1 (δ _C 166.3)/C-2 (δ _C 108.3)/ C-8a (δ _C 104.6)相关，Ar-OH质子 (δ _H 11.63)和C-7 (δ _C 103.1)/C-8 (δ _C 158.6)/ C-8a (δ _C 104.6)相关，证实酚羟基连接在C-1和C-8位。此外，特征质子信号 H-4 (δ_H 6.43 s), H-5 (δ_H 6.59, d, J=2.2)和H-7 (δ_H 6.29, d, J=2.2) 也证明以上取代基的位置，因此化合物的结构得以确认。

实施例6

取实施例2、3、4制备的化合物，均为黄色胶状物，测定方法与实施例5相同，均确定实施例2、3、4制备的化合物为C₁₅H₁₆O₆。

实施例7

取实施例1~4所制备的任一化合物进行活性检测试验，试验情况如下：

应用微量肉汤稀释法测定naphthalde C的MIC（ug/mL）值。

（1）抗菌药物和培养基制备：将待测萘类化合物溶于DMSO，配制成浓度(2560μg/ml)母液，过滤除菌备用。配制好的MH肉汤培养基121℃灭菌30min备用。

（2）培养24h的MRSA菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释，得到约含菌1×106CFU/mL的菌液备用。

（3）稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml，将稀释管中的培养物转入96孔板，每个样品做三个平行，DMSO为溶剂对照，万古霉素为阳性对照。

（4）孵育将接种好的96孔板置37℃恒温培养箱中孵育24h。

（5）结果判断：以小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，同时溶剂对照内细菌无明显抑制。

微量肉汤稀释法中使用的菌株包括金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300。结果表明， naphthalde C能抑制ATCC25923和ATCC43300，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的MIC为8μg/ml，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300的MIC为8μg/ml，阳性对照万古霉素对ATCC25923和ATCC43300的MIC匀为1μg/ml，naphthalde C可作为研制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物的先导化合物。

Claims

1.一种萘类化合物，其特征在于所述的萘类化合物是以福士拟茎点霉（Phomopsisfukushii）菌株经发酵、提取、层析、纯化后得到，其分子式为C₁₅H₁₆O₆，结构式为：

该化合物命名为： naphthalde C ；

2.一种权利要求1所述萘类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的有机溶剂超声提取2~4次，每次4~8h，合并提取液，过滤，减压浓缩至1/4~1/2体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏；

D、高压液相色谱分离纯化：将以7:3配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经硅胶柱色谱和制备高效液相色谱分离纯化即得目标物萘类化合物，即naphthalde C。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒斜面制备得到。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的液体种子培养基为NaNO₃2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌得到。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的大米固体培养基为大米100g，珍珠岩20g，蒸馏水100ml,装入600mL组培瓶，121℃，25min灭菌制备得到。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的有机溶剂为体积浓度60~80%的丙酮、乙醇或甲醇。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析前，还包括将浸膏用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重1~3倍的200~300目硅胶拌样。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的混合有机溶剂为氯仿-丙酮。

9.根据权利要求2或8所述的制备方法，其特征在于所述的混合有机溶剂体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。

10.一种权利要求1所述的萘类化合物的应用，其特征在于所述的萘类化合物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。