CN107998391B

CN107998391B - 一种微波增敏复合纳米颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107998391B
Application number: CN201711266470.2A
Authority: CN
Inventors: 梁萍; 于杰; 窦健萍; 孟宪伟; 周群芳; 张东云
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN107998391A

Abstract

本发明公开一种微波增敏复合纳米颗粒及其制备方法和应用，该微波增敏复合纳米颗粒为空心的PLGA纳米颗粒，内部包覆有NaCl和阿霉素，通过将mPEG‑PLGA溶于二氯甲烷，加入溶解有聚乙烯醇、NaCl和阿霉素混合水溶液乳化，磁力搅拌除去二氯甲烷，最后离心取沉淀清洗数次后即得。本发明微波增敏复合纳米颗粒可应用在肿瘤消融治疗过程中增加肿瘤细胞对微波和化疗作用的敏感性，实现对肿瘤的微波消融、非热效应及化疗作用三者协同作用效果。

Description

一种微波增敏复合纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种微波增敏剂，具体涉及一种微波增敏复合纳米颗粒及其制备方法和在肿瘤微波消融中的应用。

背景技术

目前随着微波消融设备的不断研发改进及影像引导技术的突破革新，微波消融治疗恶性肿瘤的疗效日益精进，尤其是在早期肝脏恶性肿瘤的根治性治疗上已取得突破性进展。然而由于微波设备制热功率的限制及消融过程中炭化隔热的影响，微波消融较大肿瘤往往需要多次进针，增加了穿刺风险及费用成本，且多针热场的空间分布较为复杂，缺乏科学规划的实时热场很难实现对肿瘤在三维空间上的完全覆盖，热量的不合理分布为日后肿瘤复发留下祸根。

微波增敏剂的研发，有望解决目前微波消融领域存在的单针热场局限及消融面积有限的难题。尤其是得益于近年来纳米医学的推动作用，微波增敏剂不断推陈出新，积极促进了微波消融向精准诊疗迈进的步伐。纳米级微波增敏剂主要通过纳米材料特殊结构来吸收微波能量，并将微波能量放大进而提高微波的转化效能，增加微波在单位面积上的产热效能；同时由于纳米颗粒自身的粒径优势，能够实现纳米颗粒在肿瘤内部特异性的聚集，在外界微波场作用时能够使更多的能量聚集在肿瘤内部，在实现微波增敏的同时提高微波热场的可控性及安全性。目前，已成功制备的微波增敏剂有铁氧化物、碳纳米材料、磁性颗粒及稀土复合物等无机材料，其具体的增敏机制尚不清楚。这些材料的微波增敏效能均较低，往往需要较高的微波功率(50-100W)才能产生明显的增敏效果，而高微波功率本身带来的过多热量可能对周边正常组织产生热损伤。此外，出于对此类纳米材料生物安全性的担忧，其临床转化前景非常有限。

离子液体在微波场中会产生持续的定向运动，而当将离子液体包裹在微球囊或纳米球的有限空间内时，离子运动时的碰撞加剧，摩擦产热增多，进而将纳米颗粒变成一个个高效产热体而起到增加微波致热效率的效果。纳米结构的限域效应可以显著提高微波的转化效能，达到提高温升速率，扩大消融面积的目的。已经报道的利用相似原理制备的纳米级微波增敏剂主要是二氧化锆包裹离子液体的纳米颗粒。该纳米颗粒采用重金属离子作为包裹材料，生物安全性较差，临床推广前景不佳。且此类微波增敏剂缺乏肿瘤细胞的特异性，在扩大热场的同时有可能对肿瘤周边的正常组织产生损伤。

对于安全部位的肿瘤，扩大消融面积以取得足够的安全区域是降低局部进展的有效措施，而对于临近胃肠道、大血管、胆管等危险部位的肿瘤，往往无法获取充足的安全边界，致死性微波热量在杀死肿瘤结节周边细胞的同时也可能损伤临近的正常组织，从而导致并发症的产生。虽然水隔离及测温技术可以辅助实现部分临近胃肠道、膈肌肿瘤的消融治疗，但是会增加穿刺风险，且对存在腹腔粘连的病例并不适用；对于临近大血管的肿瘤，由于受热沉降效应的影响，消融过程中往往难以实现对肿瘤细胞的完全灭活。在高危复杂肿瘤的消融中，精准、适形灭活肿瘤组织是取得根治性效果的可行措施。目前尚无利用肿瘤细胞和正常组织细胞在病理生理学上的差异，特异性提高肿瘤细胞对微波作用的敏感性的方法，即达到在非致死性温度条件下对肿瘤细胞产生杀伤效果。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能有效提高肿瘤细胞对微波作用敏感性的复合纳米颗粒及其制备方法，以及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种微波增敏复合纳米颗粒，该微波增敏复合纳米颗粒的外壳为PLGA，外壳内包裹NaCl和阿霉素。

其中，所述阿霉素的包封率为20～35％，所述NaCl的包封质量百分浓度为2～5％。聚乳酸聚乙醇酸共聚物(Poly Lactic-co-Glycolic Acid，PLGA)是一种可生物降解聚合物，由于其良好的生物相容性及缓释性，美国FDA已批准其应用于临床作为吸收缝线及药物载体等。微波作为一种电磁波，会使暴露在场内的离子发生高速运动摩擦生热，而当离子被限制在有限的空间内时，离子之间的碰撞会加剧，摩擦产热增多。NaCl作为一种常见离子，当被包覆在纳米颗粒的有限空间内时，运动碰撞进一步加剧，摩擦产热增多，进而将纳米颗粒变成一个个高效产热体而起到增加微波致热效率的效果；同时阿霉素作为抗肿瘤的常用药物，可抑制RNA和DNA的合成，对肿瘤细胞可以起到很好的抑制作用；此外，在用阿霉素预处理肿瘤细胞后再给予低功率微波辐照，可以显著提高肿瘤细胞内的钙离子浓度，促进肿瘤细胞的凋亡，加强对肿瘤细胞的杀伤效果。细胞内Ca²⁺作为信号转导通路上重要的第二信使，在基因转录、细胞增殖迁移及凋亡过程中发挥重要作用，Ca²⁺浓度升高是打破细胞内Ca² ⁺稳态造成病理生理过程的重要机制。微波是一种电磁波，能干扰体内的离子代谢，使得细胞内的钙离子浓度升高，阿霉素同样具有升高细胞内钙里浓度的效果，但二者的单独作用效果均较弱，不会引起明显的细胞代谢的差异。而当低功率微波辐照(非热效应)联合阿霉素同时作用时，会显著提升细胞内钙离子的浓度，造成细胞的凋亡。基于此设计了PLGA包裹阿霉素和氯化钠的纳米颗粒，率先利用微波的非热效应，通过联合阿霉素，显著提高肿瘤细胞内钙离子的浓度，加强肿瘤细胞凋亡过程，增加肿瘤细胞对于微波和化疗作用的敏感程度，最终达到在非致死温度条件对肿瘤细胞的有效杀伤效果。此外，包覆的氯化钠可提高微波的制热效果，提高温升速率，进一步加强微波的杀伤效果，从而在提高微波制热效率的基础上，进一步提高肿瘤细胞对于微波和化疗联合作用的敏感性，实现微波与化疗联合增效的作用。通过包裹阿霉素的纳米颗粒与微波辐照联合应用，从而实现微波消融、非热效应及化疗作用三者协同作用效果。

该微波增敏复合纳米颗粒粒径为80～120nm，溶解于10倍质量水制备的悬浊液Zeta电位为-20～-8mv。

本发明还提供上述微波增敏复合纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：将mPEG-PLGA溶于二氯甲烷中，并加入到溶解有阿霉素、NaCl和聚乙烯醇的第一水溶液中，冰浴下超声乳化70～100s得乳化液，超声功率为170～200W；

步骤二：在步骤一所得乳化液中加入溶解有聚乙烯醇的第二水溶液，冰浴下继续超声乳化70～100s，超声功率为300～500W；

步骤三：将步骤二所得的乳化液转移到溶解有聚乙烯醇的第三水溶液中，磁力搅拌3～5h除去二氯甲烷；

步骤四：将步骤三所得液体进行离心，取沉淀，用去离子水清洗数次后即得。

其中，步骤一中，所述mPEG-PLGA与二氯甲烷的质量体积比为0.03～0.07g/mL；所述第一水溶液中，聚乙烯醇的浓度为0.2～1wt％，NaCl的浓度为20～30mg/mL，阿霉素的浓度为8～10mg/mL；所述mPEG-PLGA与第一水溶液的混合质量体积比为0.2～0.6g/mL。

步骤二中，所述第二水溶液中聚乙烯醇的浓度为2～10wt％；所述第二水溶液与mPEG-PLGA的体积质量比为30～70mL/g。

步骤三中，所述第三水溶液中聚乙烯醇的浓度为0.05～1wt％；所述第三水溶液与mPEG-PLGA的体积质量比为100～300mL/g。

其中，步骤一中冰浴的温度-10～-5℃，步骤二中冰浴的温度为-10～-5℃，采用冰浴，是因为二氯甲烷在高温下易挥发，分两次乳化是为了提高NaCl和阿霉素的包封率。

步骤四中离心的转速为10000～12000r/min，时间为30～50min。

上述微波增敏复合纳米颗粒在增强肿瘤细胞对微波作用敏感性中的应用(非治疗目的)以及在制备治疗肿瘤药物中的应用也在本申请的保护范围中。

有益效果：

1、本申请微波增敏复合纳米颗粒能够增强肿瘤细胞对于微波消融联合化学治疗的敏感性，提高微波消融在低功率、短时间条件时的治疗效果，达到非致死温度条件下即可灭活肿瘤细胞，降低肿瘤局部进展率，延长肿瘤复发时间，实现热消融+化疗+非热效应协同精准、安全、有效的杀伤肿瘤细胞。

2、本申请研发的纳米颗粒，可以显著提升低功率微波消融的抗肿瘤效果，在无法取得安全边界的危险部位肿瘤消融过程中具有重要的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是该NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒体外升温实验结果图。

图2是MW+NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒对HepG2细胞内Ca²⁺浓度的影响图。

图3是MW+NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒对细胞内Ca²⁺荧光强度的定量分析结果图。

图4是对HepG2细胞进行JC-1染色，通过线粒体膜电位的变化趋势评估细胞发生早期凋亡的情况图。

图5是对图4的JC-1染色进行流式细胞仪定量分析结果图。

图6是流式细胞仪分析HepG2细胞凋亡或死亡情况图。

图7是NaCl-DOX@PLGA联合微波消融对肿瘤细胞体积影响变化曲线图。

图8是NaCl-DOX@PLGA联合微波消融提高对肿瘤细胞杀伤效果图。

具体实施方式

实施例1

(1)称取200mg mPEG-PLGA溶于4mL的二氯甲烷(DCM)中，加入到0.5mL溶解有阿霉素(DOX)、NaCl和聚乙烯醇(PVA)的第一水溶液中，(PVA质量浓度为0.5％，NaCl的质量浓度为30mg/mL，DOX的质量浓度为10mg/mL)，-10～-5℃冰浴下乳化90s得乳化液，超声功率为180W；

(2)在步骤(1)所得乳化液中加入10mL溶解有5wt％PVA的第二水溶液，-10～-5℃冰浴下乳化90s，超声功率为400W；

(3)将步骤(2)所得乳液转移到40mL溶解有0.1wt％PVA的第三水溶液中，磁力搅拌4h除去二氯甲烷(DCM)；

(4)12000r/min离心40min取沉淀，用去离子水清洗三次即得NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒。

制备得到的微波增敏复合纳米颗粒粒径约为83～110nm，阿霉素的包封率为25～35％，NaCl的包封浓度为3～4％，将纳米颗粒溶解于10倍质量水制备的悬浊液Zeta电位为-20～-8mv。

实施例2

(1)称取200mg mPEG-PLGA溶于6mL的二氯甲烷(DCM)中，加入到1mL溶解有阿霉素(DOX)、NaCl和聚乙烯醇(PVA)的第一水溶液中，(PVA质量浓度为1％，NaCl的质量浓度为30mg/mL，DOX的质量浓度为10mg/mL)，-10～-5℃冰浴下乳化100s得乳化液，超声功率为200W；

(2)在步骤(1)所得乳化液中加入14mL溶解有10wt％PVA的第二水溶液，-10～-5℃冰浴下乳化100s，超声功率为500W；

(3)将步骤(2)所得乳液转移到60mL溶解有1wt％PVA的第三水溶液中，磁力搅拌5h除去DCM；

(4)12000r/min离心50min取沉淀，用去离子水清洗三次即得NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒。

制备得到的微波增敏复合纳米颗粒粒径为80～100nm，阿霉素的包封率为25～35％，NaCl的包封浓度为3～5％，将纳米颗粒溶解于10倍质量水制备的悬浊液Zeta电位为-20～-8mv。

实施例3

(1)称取200mg mPEG-PLGA溶于3mL的二氯甲烷(DCM)中，加入到0.35mL溶解有阿霉素(DOX)、NaCl和聚乙烯醇(PVA)的第一水溶液中，(PVA质量浓度为0.2％，NaCl的质量浓度为20mg/mL，DOX的质量浓度为8mg/mL)，-10～-5℃冰浴下乳化70s得乳化液，超声功率为170W；

(2)在步骤(1)所得乳化液中加入6mL溶解有2wt％PVA的第二水溶液，-10～-5℃冰浴下乳化70s，超声功率为300W；

(3)将步骤(2)所得乳液转移到20mL溶解有0.05wt％PVA的第三水溶液中，磁力搅拌3h除去DCM；

(4)11000r/min离心30min取沉淀，用去离子水清洗三次即得NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒。

制备得到的微波增敏复合纳米颗粒粒径为90～120nm，阿霉素的包封率为20～30％，NaCl的包封浓度为2～3％，将纳米颗粒溶解于10倍质量水制备的悬浊液Zeta电位为-17～-8mv。

实施例4

NaCl-DOX@PLGA增加微波制热功率的实验研究：

体外升温实验：取12孔板，选择5孔分别加入实施例1制备的浓度为11mg/mL、22mg/mL的NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒，另取PLGA、去离子水及0.9％的氯化钠溶液各2mL，每个孔设置三个副孔，给予各孔微波作用，功率为10W，时间为1min，作用过程中使用红外成像仪及测温针每隔10s实时监测微波作用过程中的温度变化情况，结果见图1。体外升温实验证实，高浓度NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒联合微波消融组具有更快的温升速率，作用末期温度约为66.5℃。低浓度NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒联合微波消融组温升速率稍低，作用末期温度约为63.6℃，去离子水组温升速率最慢，作用末期温度仅为49.4℃。

实施例5

NaCl-DOX@PLGA提高肿瘤细胞对微波作用敏感性的研究：

1、NaCl-DOX@PLGA+MW(微波)联合作用对于细胞内Ca²⁺浓度的影响

(1)将状态良好的HepG2细胞接种于6孔板中，种板密度约为2×10⁵个/mL，将6孔板放入37℃、5％的CO₂培养箱中孵育24h，细胞密度为80％左右；

(2)将各板孔随机分为5组：a.对照组，b.游离DOX组，c.NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒组，d.MW组，e.DOX+MW作用组，f.NaCl@PLGA纳米颗粒+MW组，e.NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒+MW作用组；每组各包含3个板孔；

(3)轻轻吸走各板孔内的培养液，对照组及微波组重新加入新鲜培养液2mL，游离DOX组及DOX+MW作用组加入浓度为3μmol/L的阿霉素2mL，NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒组及NaCl-DOX@PLGA+微波组加入浓度为186μg/ml(对应DOX浓度为3μmol/L)的NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒溶液各2mL；NaCl@PLGA纳米颗粒+微波组加入浓度为186μg/ml的NaCl@PLGA溶液2mL；继续孵育12h；

(4)吸走各组的液体，用HBSS(不含Ca²⁺)洗2遍，每孔各加入配置好的Fluo-3荧光染料600μL(Fluo-3的工作浓度为5μmol/L，配制过程中同时加入聚氧乙烯聚氧丙烯F-127以促进Fluo-3进入细胞，F-127工作浓度为0.05％)，避光孵育40min；

(5)MW组、DOX+MW作用组、NaCl@PLGA纳米颗粒+MW组及NaCl-DOX@PLGA+MW组均给予辐照式微波作用，功率为4W，时间为2min，操作过程中要注意避光，对照组、游离DOX组及NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒组不做处理；

(6)收集细胞，采用流式细胞仪检测各组荧光强度的大小。

2、细胞线粒体膜电位的相关检测

2.1荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位变化情况

(1)将HepG2细胞培养至对数期，加入PBS洗2次后加入胰酶，待细胞消化完全后加入DMEM终止胰酶作用，1000rmp/min离心3min，吸走上清液，加入适量的DMEM调节细胞浓度为1×10⁶个/mL，用枪头吹打混匀制成单细胞悬液，而后将细胞接种于12孔板，每孔1mL单细胞悬液，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；

(2)吸走培养液，用PBS洗细胞2次，随机选取12个板孔，分为4组：空白对照组，阳性对照组，单独MW组，NaCl-DOX@PLGA+MW联合作用组；向联合作用组加入186μg/L的NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒1mL，微波组及对照组各加入培养液1mL，放回培养箱继续培养12h；

(3)单独MW组辐照式微波作用频率为2450MHz，功率为4W，时间为2min，作用完毕后放回培养箱继续培养1h；

(4)将JC-1试剂盒中的CCCP按1:1000的比例加入到阳性对照组的各孔中，稀释浓度至10μmol/L，作用细胞30min；

(5)配置JC-1工作液：取50μL JC-1(200X)，加入8mL超纯水中，漩涡震荡充分溶解并混匀JC-1，然后加入2mL JC-1染色缓冲液(5X)，混匀即得JC-1工作液；

(6)待各组作用时间结束后，轻轻吸走各孔液体，用JC-1缓冲液洗细胞2次，每孔各加入配置好的JC-1染色工作液300μL，放入培养箱孵育20min；

(7)孵育结束后，吸走上清，用JC-1缓冲液洗涤细胞2次，荧光显微镜观察各组荧光情况。

2.2流式细胞仪定量分析细胞线粒体膜电位的变化情况

(1)将HepG2细胞培养及制备单细胞悬液方法同2.1(1)中方法，而后将细胞悬液接种于6孔板，每孔2mL单细胞悬液，细胞密度为1×10⁶个/mL，将6孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h；

(2)吸走培养液，用PBS洗细胞2次，随机选取12个板孔，分为4组：空白对照组、MW作用组、MW+DOX联合作用组及MW+NaCl-DOX@PLGA联合作用组；游离DOX的浓度为3μmol/ml，NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒的浓度为186μg/mL，微波组及对照组更换新鲜培养液2mL，放回培养箱继续培养12h；

(3)MW作用频率为2450MHz，功率为4W，时间为2min，作用完毕后放回培养箱继续培养1h；

(4)待各组作用时间结束后，轻轻吸走各孔液体，加入胰酶消化细胞，将离心后的细胞弃上清，加入0.5mL的DMEM，而后分别加入0.5mL的JC-1工作液，混匀细胞，放回培养箱孵育20min；用JC-1缓冲液洗细胞2次，每孔各加入配置好的JC-1缓冲液500μL；

(5)孵育结束后，600rmp/min离心3min，弃上清，用预冷的JC-1缓冲液洗涤细胞2次后，最后用500μL预冷的JC-1缓冲液混匀细胞，流式细胞仪测量各组荧光强度。

3、不同处理组间细胞活性状态的相关检测

(1)将HepG2细胞培养至对数期，加入PBS洗2次后加入胰酶，待细胞消化完全后加入DMEM终止胰酶作用，1000rmp/min离心3min，吸走上清液，加入适量的DMEM调节细胞浓度为1×10⁶个/mL，用枪头吹打混匀制成单细胞悬液，而后将细胞接种于12孔板，每孔1mL单细胞悬液，放入37℃、5％CO²培养箱中培养24h；

(2)吸走培养液，用PBS洗细胞2次，随机选取15个板孔，分为5组：空白对照组、NaCl-DOX@PLGA组、MW作用组、MW+DOX联合作用组及MW+NaCl-DOX@PLGA联合作用组；游离DOX的浓度为3μmol/ml,NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒的浓度为186μg/mL，微波组及对照组更换新鲜培养液2mL，放回培养箱继续培养12h；

(3)MW作用组、MW+DOX组及MW+NaCl-DOX@PLGA组给予辐照式微波作用，功率为4W，时间为2min，对照组及NaCl-DOX@PLGA组不做特殊处理；微波作用完毕后将各组细胞放回培养箱继续培养4h；

(4)吸取6孔板中的上清液，分别转移至离心管中，每孔细胞均用PBS洗2遍，收集清洗液至各离心管中；

(5)用不含EDTA的胰酶消化细胞，将细胞悬液收集入各离心管中，1000r/min离心3min，收集上清液入离心管中；用PBS重新混匀细胞，1000r/min离心3min，重复1次；

(6)加入Annexin V Binding Solution 500μL，混匀细胞，向细胞悬液中各加入Annexin V,FITC结合物4μL，再加入5μL的PI Solution；

(7)室温下避光培养15min，加样到流式细胞仪检测。

流式检测时，注意设置补偿组(a.未染色细胞，b.单独Annexin V，FITC染色细胞；c.单独PI染色细胞)以进行校正补偿，保证测量的准确性。

实验结果分析：

在对照组细胞内，Ca²⁺平均荧光强度的基线值为99.7±4.7，低功率微波作用后细胞内Ca²⁺的平均荧光强度上升为194±8.9，DOX作用后的细胞内Ca²⁺平均荧光强度为146±11.7，而在MW联合DOX组细胞内Ca²⁺平均荧光强度为271±7.9，对照组与以上三组间的荧光强度值间均有统计学差异，提示微波辐照联合DOX作用肿瘤细胞后，可以显著提升肿瘤细胞内的Ca²⁺表达水平。

将DOX包裹在PLGA内制备成NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒，且按相同DOX浓度孵育细胞相同时间后，经流式细胞仪测定HepG2细胞内Ca²⁺平均荧光强度为123±13.6，与游离DOX孵育后HepG2细胞内Ca²⁺平均荧光强度相比无统计学差异；NaCl@PLGA联合微波(MW+NP)作用后细胞内Ca²⁺平均荧光强度上升至233±18.5，而NaCl-DOX@PLGA联合微波(MW+NP*)作用后细胞内Ca²⁺平均荧光强度升高至316±8.2，二者之间及与单独微波作用组相比均有统计学差异(图2～3)，提示NaCl-DOX@PLGA联合微波作用具有更强的提高细胞内Ca²⁺浓度的作用。

对细胞进行JC-1染色，通过线粒体膜电位的变化趋势评估细胞发生早期凋亡的情况，如图4所示，A.对照组细胞呈红色荧光，基质内可见红色颗粒；B.单独MW作用后细胞的红色荧光强度减弱；C.MW+NaCl-DOX@PLGA作用后，细胞红色荧光强度进一步减弱，细胞主要表现为绿色荧光；D.CCCP阳性对照，细胞呈现绿色荧光表现。荧光显微镜观察提示在经低功率MW辐照后，线粒体膜电位出现下降，表现为细胞呈现绿色荧光增多，经低功率MW+NaCl-DOX@PLGA共同作用后，细胞绿色荧光强度进一步加强，提示线粒体膜电位进一步下降，后续发生早期凋亡的细胞比例会进一步增多。流式细胞仪定量分析结果与荧光显微镜观察结果相似，见图5，A.对照组细胞与NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒孵育后的细胞群基本重叠，未出现明显的线粒体膜电位下降；B.单独MW作用后细胞出现分群，较对照组细胞而言分群细胞(表达绿色荧光细胞数目)比例约为23.1％；C.MW+NaCl@PLGA联合作用后细胞呈现绿色荧光的比例约为37.4％；D.MW+NaCl-DOX@PLGA联合作用后，绿色荧光细胞比例进一步升高，约为52.6％。JC-1激发绿色荧光比例在低功率MW组、MW+NaCl@PLGA组、MW+NaCl-DOX@PLGA组呈现上升趋势(依次为23.1％，37.4％，52.6％)，提示线粒体膜电位逐步降低，后期细胞发生早期凋亡比例呈现逐步增多趋势。

图6是流式细胞仪分析HepG2细胞凋亡或死亡情况，A.游离DOX作用后细胞凋亡/死亡百分比约为10.1％，B.微波作用后细胞凋亡/死亡百分比约为28.6％，C.MW+DOX联合作用后凋亡/死亡细胞百分比约为40.7％，D.MW+NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒作用后凋亡/死亡细胞百分比约为56.2％。NaCl-DOX@PLGA孵育细胞后未引起明显的细胞凋亡/死亡，低功率MW辐照后引起约四分之一的细胞凋亡/死亡，而MW+DOX联合作用后细胞凋亡/死亡比例约为40％左右，而NaCl-DOX@PLGA联合微波作用后细胞凋亡/死亡比例进一步增多，上升为56％左右，不同处理条件下细胞发生凋亡/死亡的比例与细胞内Ca²⁺浓度升高具有一致趋势。NaCl-DOX@PLGA联合微波作用所诱发的细胞凋亡/死亡比例要高于游离DOX联合微波作用后的凋亡/死亡比例。

实施例6

NaCl-DOX@PLGA联合微波消融提高对肿瘤细胞杀伤效果的研究

实验方法和步骤:

1、NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒的毒性评价

取4-5周龄裸鼠20只，随机分为4组：对照组、DOX组、NaCl@PLGA组，NaCl-DOX@PLGA组，DOX组经尾静脉注入游离阿霉素0.1mL，浓度为90μg/mL，NaCl@PLGA组经尾静脉注入NaCl@PLGA纳米颗粒0.1mL，浓度为22mg/mL，NaCl-DOX@PLGA组经尾静脉注入NaCl+DOX@PLGA纳米颗粒0.1mL，浓度为22mg/mL，对照组经尾静脉注入PBS缓冲液0.1mL，观察并记录裸鼠的活动状态及健康情况，7天后经眼球取血，进行生化(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、直接胆红素、总胆红素、肌酐、尿素)及血常规(血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板)检查。

2、裸鼠皮下移植瘤模型的建立

(1)肝HepG2细胞的培养方法同前。待细胞长到对数期且状态良好时收集细胞，离心完毕后吸走上清液，用预冷的PBS将细胞稀释成1x10⁷个/mL；

(2)抓稳裸鼠，用碘伏棉球消毒其右侧后退外上方皮肤，用1mL注射器吸取预冷的细胞悬液0.1mL，在消毒后的皮肤处进针至皮下组织并平行进针约5mm后注入细胞悬液，而后慢慢退出针尖，酒精棉球擦拭针眼处，注意防止注入的细胞液渗出。注射器抽取细胞前要将细胞吹打混匀，保证接种细胞密度的均一性；

(3)每隔3～5天观察皮下肿瘤的生长情况，但肿瘤最大径长到0.9～1cm左右时，定义为成熟肿瘤模型。肿瘤的体积(V)按以下公式计算：

V＝(a×b²)/2

a:肿瘤的最大长径，

b:肿瘤的短径。

3、NaCl-DOX@PLGA对微波消融效果的影响

(1)选取成熟荷瘤裸鼠48只，随机分为6组：A组为空白对照组，B组为游离DOX组，C组为NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒注射组，D组为单独MW作用组，E组为MW+NaCl@PLGA纳米颗粒联合作用组，F组为MW+NaCl-DOX@PLGA联合作用组；

(2)A组裸鼠经尾静脉给予0.3mL的PBS；B组经尾静脉注射游离DOX(90μg/mL，0.3mL)；C组经尾静脉注入NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒(22mg/mL,0.3mL)；E组经尾静脉注入NaCl@PLGA纳米颗粒(22mg/mL,0.3mL)；F组经尾静脉注入NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒(22mg/mL,0.3mL)；

(3)注射完毕6h后，采用异氟烷气体麻醉，将麻醉好的裸鼠固定在实验台上；

(4)A、B及C组裸鼠不做特殊处理，D、E、F组裸鼠在超声实时引导下置入微波电极，使微波电极位于肿瘤中心，而后开始微波消融治疗，功率为2W，时间为1min，作用过程中应用红外成像仪实时记录肿瘤区温度变化情况，处理完毕后每隔三天监测并记录各组裸鼠体重及肿瘤体积变化情况；

(5)消融后第三天，各组分别取三只裸鼠，将动物处死后取肿瘤组织浸泡于福尔马林溶液中，并对肿瘤组织进行凋亡及PCNA表达检测。a.采用TUNEL法检测各组肿瘤组织的凋亡情况，取肿瘤组织(消融后的肿瘤组织取针道中心纵断面，非消融肿瘤组织取长轴纵断面)，按照“石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→TUNEL反应液→加转化POD→与底物DAB反应并显色→显微镜计数并拍照”流程作凋亡的相关检测。计数时先用低倍镜观察肿瘤组织内阳性细胞(细胞内出现棕黄色颗粒)表达情况，并定位至肿瘤被膜下视野，然后用高倍光镜(×400)观察，选择三个阳性细胞较多的视野，由3人分别计算三个视野内阳性细胞的数目并取平均值，与细胞总数相比进而得到不同组的凋亡指数。b.肿瘤组织取样及石蜡制片方法同TUNEL法，将Anti-PCNA单克隆抗体进行按1:600进行稀释并对肿瘤组织染色，同样先用低倍镜观察阳性细胞(细胞内出现棕黄色颗粒)表达情况并定位至肿瘤被膜下视野，之后在高倍镜(×400)下进行观察，选择三个阳性细胞数目较多的视野，由3人分别计算三个视野内阳性细胞的数目并取平均值，与细胞总数相比进而得到得到不同组间PCNA表达率。

(6)剩余裸鼠继续每隔3d记录体重及肿瘤体积变化情况，当肿瘤的最大径达到20mm时，定义为动物“死亡”。待对照组所有裸鼠的肿瘤体积均达到20mm时，定义为实验的终点，处死各组裸鼠，取各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织浸泡在福尔马林溶液中，进行苏木精－伊红染色观察肿瘤细胞的坏死情况及各重要脏器的病变情况。实验结果分析：

通过尾静脉注射游离DOX、NaCl@PLGA及NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒，评价其对裸鼠的毒性反应。结果显示谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)、血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)及血小板(PLT)均在正常范围内，未发现明显指标异常，提示游离DOX、NaCl@PLGA及NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒对裸鼠无明显的急性毒性反应。

常规病理显示，MW组、MW+NaCl-DOX@PLGA组及MW+NaCl-DOX@PLGA组的肿瘤中心细胞呈现凝固性坏死表现，表现为核固缩、碎裂、溶解，胞质呈嗜酸性染色，组织结构的轮廓尚可见。各组肿瘤周边细胞的活性状态进一步采用TUNEL法检测。TUNEL染色结果提示微波消融治疗后3d，单独MW组、MW+NaCl@PLGA纳米颗粒组及MW+NaCl-DOX@PLGA组的周边凋亡细胞均明显增多，且显著高于对照组、游离DOX组及NaCl-DOX@PLGA注射组的凋亡细胞数目。微波消融后3d，三组消融区内未见明显PCNA染色阳性的细胞，坏死周边组织的PCNA表达率均出现不同程度的减低，但对照组、游离DOX组及NaCl-DOX@PLGA注射组肿瘤组织的PCNA表达率明显高于三组微波消融组的PCNA表达率。

空白对照组、游离DOX组及NaCl-DOX@PLGA组中肿瘤体积均逐步增大，未观察到明显抑制肿瘤生长的效果；而单独MW作用组、MW+NaCl@PLGA纳米颗粒组及MW+NaCl-DOX@PLGA纳米颗粒组均观察到不同程度的抑制肿瘤生长的效果(图7),以MW+NaCl-DOX@PLGA联合作用组抑制肿瘤效果最明显。单独微波作用组60％的肿瘤在消融后三天即发现肿瘤局部残留，剩余40％的肿瘤均在观察期的第18天出现肿瘤局部进展；NaCl@PLGA纳米颗粒联合微波消融组80％的肿瘤在消融后早期观察中未发现明显肿瘤残存，而在第9～33天内所有裸鼠均出现肿瘤局部进展；NaCl-DOX@PLGA联合微波消融组5只裸鼠在消融初期均未发现明显的肿瘤残存，而在第24天及第30天各发现一只裸鼠出现肿瘤的局部进展，肿瘤局部进展出现时间晚于NaCl@PLGA纳米颗粒联合微波消融组，生长速度慢于NaCl@PLGA纳米颗粒联合微波消融组，剩余3只裸鼠实现肿瘤的完全灭活，表现为局部皮肤的瘢痕，病理证实未见肿瘤细胞残存。实验末期剥离各组裸鼠肿瘤进行观察，结果见图8，其中：A.对照组，B.游离DOX组，C.NaCl-DOX@PLGA注射组，D.MW组，E.NaCl@PLGA+MW组F.NaCl-DOX@PLGA+MW组；各组裸鼠的心、肺、肾、肝、脾组织病理学切片，通过对比观察各组裸鼠重要脏器的组织形态，未观察到明显组织损伤或结构异常，提示NaCl-DOX@PLGA纳米材料未引起明显的远期毒副反应。

本发明提供了一种微波增敏复合纳米颗粒及其制备方法和应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种微波增敏复合纳米颗粒，其特征在于，该微波增敏复合纳米颗粒的外壳为PLGA，外壳内包裹NaCl和阿霉素；

所述阿霉素的包封率为20~35%，所述NaCl的包封质量百分浓度为2~5%；

所述微波增敏复合纳米颗粒粒径为80~120 nm，溶解于10倍质量水制备的悬浊液Zeta电位为-20~-8 mv；

所述的微波增敏复合纳米颗粒具体通过如下步骤制备：

步骤一：将mPEG-PLGA溶于二氯甲烷中，加入到溶解有阿霉素、NaCl和聚乙烯醇的第一水溶液中，冰浴下超声乳化得乳化液；

步骤二：在步骤一所得乳化液中加入溶解有聚乙烯醇的第二水溶液，冰浴下继续超声乳化；

步骤三：将步骤二所得的乳化液转移到溶解有聚乙烯醇的第三水溶液中，搅拌除去二氯甲烷；

步骤四：将步骤三所得液体进行离心，取沉淀，用去离子水清洗后即得；

步骤一中，所述mPEG-PLGA与二氯甲烷的质量体积比为0.03~0.07 g/mL；所述第一水溶液中，聚乙烯醇的浓度为0.2~1wt%，NaCl的浓度为20~30 mg/mL，阿霉素的浓度为8~10mg/mL；所述mPEG-PLGA与第一水溶液的质量体积比为0.2~0.6 g/mL。

2.根据权利要求1所述的微波增敏复合纳米颗粒，其特征在于，步骤二中，所述第二水溶液中聚乙烯醇的浓度为2~10wt%；所述第二水溶液与mPEG-PLGA的体积质量比为30~70mL/g。

3.根据权利要求1所述的微波增敏复合纳米颗粒，其特征在于，步骤一中冰浴的温度-10~-5℃，步骤二中冰浴的温度为-10~-5℃。

4.根据权利要求1所述的微波增敏复合纳米颗粒，其特征在于，步骤三中，所述第三水溶液中聚乙烯醇的浓度为0.05~1wt%；所述第三水溶液与mPEG-PLGA的体积质量比为100~300 mL/g。

5.权利要求1所述的微波增敏复合纳米颗粒在制备增强肿瘤细胞对微波作用敏感性的药物中的应用。

6.权利要求1所述的微波增敏复合纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。