CN107998140B - 化合物r1的用途 - Google Patents

Abstract

本方面公开了化合物R1的用途，其可以通过竞争性的与巨噬细胞表面的CD169相结合从而改变巨噬细胞代谢，减少了相关炎性因子的释放从而缓解类风湿性关节炎。

Description

化合物R1的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。

背景技术

CD169又称唾液酸黏附素，是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的一员，表达于特定的巨噬细胞亚群表面。CD169+巨噬细胞通过该受体与其他细胞表面的配体识别并结合，完成细胞间的“交流”，在抗原递呈、调节淋巴细胞增殖、诱导炎症反应和免疫耐受中发挥重要作用。CD169+巨噬细胞存在于正常人的脾脏、淋巴结、骨髓、肝脏、结肠、肺、神经系统中，而在外周血中很少表达。但在疾病状态下，如肿瘤疾病及自身免疫性疾病(类风湿性关节炎)，可在病变组织、淋巴结及外周血中检测到其数量的明显变化。

类风湿性关节炎是一个主要影响关节的长期持续的自身免疫性疾病。它通常导致关节发热、肿胀和疼痛。疼痛和僵硬往往于休息后更恶化。最常见的是手腕和手涉及到身体两侧相同的关节。在患有类风湿性关节炎的关节组织中发现大量CD169高表达的巨噬细胞。类风湿性关节炎的成因不明，但和基因与环境因素有关。作用机制包括了身体的免疫系统攻击关节，造成关节囊的发炎与增厚，通常也会影响到骨头和软骨。诊断方式大多根据病患的身体表征与症状。类风湿性关节炎的治疗主要针对改善疼痛、减少发炎以及改善全身机能。适当的休息及运动、使用夹板及背带等皆能帮助治疗改善。药物方面，常使用止痛剂、类固醇、非类固醇抗发炎药物来缓解症状；疾病调节抗风湿药物(DMARD，包括羟氯喹、氨甲蝶呤等)亦可用来控制减缓病程，通常是在其他疗程对病人无效时才会使用到此类药物，然而此类药物相较于其他疗程也可能对病人造成较大的副作用。

为了缓解类风湿性关节炎的发病进程，并且在治疗过程中减轻病人的痛苦，亟待寻求一种疗效更佳的新型疗法。

发明内容

本发明的主要目的之一，在于提供化合物R1在制备类风湿性关节炎药物中的用途，其中，所述的化合物R1结构如下：

本发明的另一目的，在于提供化合物R1在制备CD169+巨噬细胞的靶向药物/制剂的用途。

本发明的再一目的，在于提供类风湿性关节炎药物，其包括了有效量的化合物R1。

作为优选，前述的类风湿性关节炎药物优选为经皮吸收制剂。

本发明利用巨噬细胞的CD169作为疾病治疗的靶点，公开了一种针对CD169靶点的高亲和力化合物R1，其可通过多种方式有效的缓解类风湿性关节炎的发病进程。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1尾静脉注射方式的小鼠关节炎程度临床评分。

图2口服灌喂方式的小鼠关节炎程度临床评分。

图3关节处涂抹方式的小鼠关节炎程度临床评分。

图4尾静脉注射方式的小鼠关节病理切片(Day 14)。

图5尾静脉注射方式的小鼠后爪中相关细胞因子mRNA水平(Day 7)。

具体实施方式

实施例1化合物R1的制备

本发明提供一种新的小分子化合物R1，9位苯并吡喃并噻吩基N-乙酰神经氨酸单糖(TCC-Neu5Ac)，本发明提供的化合物R1，其化学式为：

本发明提供的化合物R1的化学式合成路线如下所示：

其制备方法，具体包括以下步骤：

1、制备TCC-COOH

1)、在0℃下，将6-氯-8-氟苯并二氢吡喃-4-酮1(5g，24.9mmol)溶解于15mL二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，简称DMF)中，并逐滴加入磷酰氯(2.3mL，24.9mmol)，得到混合物M51；

2)、将S410得到的混合物M51在0℃下搅拌30分钟后加热至80℃，保温 1.5小时后冷却至室温，得到混合物M52；

3)、将S420得到的混合物M52冷却至室温后，加入1NNaOAc溶液淬灭后，加入二氯甲烷(2×25mL)进行萃取，将萃取后的有机层进行真空浓缩，得到 4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛，不经进一步纯化即可进行下一步骤；

4)、在0℃下，于100ml圆底烧瓶中，将得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛(6.1g，24.9mmol)溶解在30mL乙醇溶液中，逐滴加入的巯基乙酸乙酯(2.73mL，24.9mmol)与乙醇钠(21wt％，在乙醇中，18.7mL，49.8mmol) 于溶液中，得到混合物M53；

5)将S440得到的混合物M53升温至室温并搅拌过夜后，进行过滤，得到沉淀物后，用水洗涤并收集沉淀物；

6)将S450得到的沉淀物加入四氢呋喃(Tetrahydrofuran，简称THF)和 1N NaOH溶液中，并在50℃下搅拌24小时，得到混合物M54；

7)将S460得到的混合物M54冷却至室温，用CH₂Cl₂(2×50mL)洗涤，并加入1N HCl酸化，将所得固体产物过滤，用水洗涤并干燥，即得到TCC-COOH。

其中，TCC-COOH的化学结构式为：

该制备方法中，合成TCC-COOH的化学反应式为：

2、制备^TosSia methyl ester

1)、将唾液酸(15.0g，50mmol)、1ml三氟乙酸和300ml无水甲醇混合后在室温下搅拌至澄清，得到混合物M41；其中，该处表述的唾液酸的化学结构式如下所示：

2)、将得到的混合物M41采用蒸发的方式除去溶剂，得到唾液酸甲酯，为白色固体，无需进一步纯化；

3)、将得到的固体唾液酸甲酯和P₂O₅在真空干燥过夜，得到混合物M42；

4)、在得到的混合物M42与无水吡啶共蒸发两次以除去痕量水分，得到混合物M43；

5)、将得到的混合物M43溶于200ml无水吡啶中后，冷却至0℃，并加入对甲苯磺酰氯(10.0g，53mmol)，得到混合物M44；

6)、将得到的混合物M44加热至室温并搅拌过夜后，通过减压加热除去溶剂；

7)、将上一步除去溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到白色固体(18.0g，38mmol)，即为^TosSiamethyl ester，制得的^TosSia methyl ester化学式如下所示：

3、制备^N3Siamethyl ester

1)、将8.0g叠氮化钠和^TosSia methyl ester(14.0g，30mmol)加入150ml 二甲基甲酰胺(DMF)中得到混合物M31；

2)、将S210中得到的混合物M31加热至80℃过夜后，除去溶剂；

3)、将S220去除溶剂后的残余物通过柱层析(EtOAc:MeOH＝20:1)纯化，得到固体即为^N3Sia methyl ester，其化学结构式如下所示：

4、制备^TCCSia methyl ester

1)、将^N3Sia methyl ester(3.0g，8.6mmol)、300mgPd/C(钯碳)催化剂和100ml无水甲醇混合，得到混合物M21；

2)、在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯，调节pH为1～2，得到混合物M22；

3)、将S120得到的混合物M22置于H₂中搅拌，并通过薄层色谱监测(TCL 监测)至反应完全，约12小时，得到混合物M23；

4)、将S130得到的混合物M23通过过滤以除去Pd/C催化剂，并采用蒸发的方式去除溶剂，得到残留混合物M24；

5)、将S140中得到的残留混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC HCl)(2.0g，10.3mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT)(1.4g， 10.3mmol)、三乙胺(3.6ml，25.8mmol)、TCC-COOH(2.0g，8.6mmol)和150 ml二甲基甲酰胺(DMF)混合，并在黑暗中搅拌48小时，得到混合物M25；

6)、将S150中得到的混合物M25蒸发除去溶剂，并将去除溶剂后的残余物通过柱层析(CH₂Cl₂：MeOH＝10：1)进行纯化，得到固体(2.6g,4.8mmol) 即为^TCCSia methyl ester，其化学结构式如下所示：

5、制备CD169高亲和力抗肿瘤化合物(TCC-Neu5Ac)

1)、将^TCCSia methyl ester(536mg，1mmol)、5ml甲醇和5ml 2M NaOH 溶液混合，并在室温下搅拌20min得到混合物M11；

2)、在混合物M11中，加入2M HCl水溶液，调节混合物M11的pH为7，得到混合物M12；

3)、将混合物M12溶剂的溶剂完全去除，将去除溶剂后的残余物通过柱层析进行纯化，所述柱层析中采用的CH₂Cl₂：MeOH＝2：1，制得浅黄色固体(287mg, 0.55mmol)即为化合物R1。

实施例2

为了解决以上背景中提到的问题，本研究通过构建类风湿性关节炎小鼠模型，采用不同的给药方式测试了化合物R1对类风湿性关节炎的治疗效果。具体过程如下：

Day0:每只Balb/c小鼠腹腔注射1.5mg出自Chondrex公司的5-clone cocktailkit (

5-Clone Cocktail Kit)。

Day3:腹腔注射50μg LPS

Day4:出现关节炎的临床迹象，给小鼠关节炎程度进行临床评分，而后开始给药。将R1 的水溶液(100μM in PBS)通过不同的给药方式作用于小鼠，实验组1采用尾静脉注射100μL R1的水溶液(100μM in PBS)，对照组1注射100μL PBS；实验组2采用口服灌喂200μLR1 的水溶液(100μM in PBS)，对照组2口服灌喂200μL PBS；实验组3采用关节处涂抹300μL，对照组3关节处涂抹300μL PBS。

从Day4开始每天固定时间观察小鼠关节炎程度，给出临床评分，连续观测至Day14。结果如图所示。(临床评分标准：0-正常；1-轻微的，但是踝关节明显发红、肿胀，或者接近发红、肿胀，波及到指端；2-踝关节中度发红、肿胀；3-整个脚掌包括指端严重发红、肿胀； 4-四肢最大程度的发炎，波及到多节点)

在Day14时对小鼠实施安乐死，切下小鼠左后爪后用10％的福尔马林固定，脱钙处理后进行H&E染色，切片观察。

对于相关细胞因子mRAN水平的检测，在Day7时收集小鼠后爪，放入液氮中速冻，保存在-80℃冰箱中，使用RNA提取试剂盒(Qiagen，Valencia CA)提取组织总RNA，使用 DNaseI(Qiagen)处理样品，根据Invitrogen产品说明使用随机引物和逆转录酶合成cDNA，最后根据Applied Biosystems产品使用说明使用ABI PRISM 7900仪器进行RT-PCR，细胞因子的mRNA水平采用β-actin作参比。相关细胞因子的引物设计序列如下：

β-actin

Sense:5’GTG GGC CGC TCT AGG CAC CAA3’

Antisense:5’CTC TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC3’

TNF-a

Sense:5’ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC CGC 3’

Antisense:5’CC AAA GTA GAC CTG CCC GGA CTC 3’

IL-1β

Sense:5’TCA TGG GAT GAT GAT GAT AAC CTG CT 3’

Antisense:5’CCC ATA CTT TAG GAA GAC ACG GAT T 3’

IL-6

Sense:5’ATG AAG TTC CTC TCT GCA AGA GAC T 3’

Antisense:5’CA CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT C 3’

结果分析：

本研究通过初步数据显示R1对于类风湿性关节炎发病进程的缓解具有良好的作用。从图 1-3可以看出，与造模后不用R1治疗的空白对照组相比，用R1治疗后可有效缓解类风湿性关节炎的发病程度，其中尾静脉注射给药的方式效果最好。这可能是因为通过尾静脉注射方式后R1直接经血液循环到达作用部位从而发挥作用，采用口服灌喂的方式，虽然加大了剂量，但是由于吸收有限，药效不能完全发挥出来。实验中发现，通过一次透皮给药也能减缓类风湿性关节炎的发病进程，说明R1可以被皮肤吸收而发挥药效，这种给药方式相对于注射或者口服灌喂有更高的安全性。

研究中进一步对比了用药组与空白组小鼠关节在疗程结束后的染色切片，从图4中可以看出，类风湿性关节炎造模后不用R1治疗的空白组在疗程结束后关节侵蚀明显，而经R1治疗后的小鼠关节炎程度明显较轻，关节各部分结构完整，染色清晰，无明显侵蚀现象。

为了探究R1能治疗类风湿性关节炎的机理，在第7天时对关键炎性因子TNF-α、IL-1 β和IL-6的mRNA水平进行了检测，结果发现造模后经R1治疗后的小鼠关节处各炎症因子水平明显低于没有经过治疗的小鼠，表明R1可能是与巨噬细胞CD169靶点相互作用，减少了相关炎性因子的释放，从而缓解了类风湿性关节炎的发病进程。

以上这些实验结果都说明R1可以通过与巨噬细胞CD169靶点相互作用，减少相关炎性因子的释放，减缓小鼠关节炎的发展。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.化合物R1在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其中，所述的化合物R1结构如下：

2.化合物R1在制备CD169+巨噬细胞的靶向药物/制剂的应用，其中，所述的化合物R1结构如下：

3.治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其包括了有效量的化合物R1，其中，所述的化合物R1结构如下：

4.根据权利要求3所述的治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于：该药物组合物为经皮吸收制剂。

5.化合物R1的可用盐在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其中，所述的化合物R1结构如下：

6.如权利要求5所述的化合物R1的可药用盐在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述的可药用盐是钠盐或盐酸盐。

7.化合物R1的可药用盐在制备CD169+巨噬细胞的靶向药物/制剂的应用，其中，所述的化合物R1结构如下：

8.如权利要求7所述的化合物R1的可药用盐在制备CD169+巨噬细胞的靶向药物/制剂的应用，其特征在于，所述的可药用盐是钠盐或盐酸盐。

9.治疗类风湿性关节炎的药物，其包括了有效量的化合物R1的可药用盐，其中，所述的化合物R1结构如下：

10.根据权利要求9所述的治疗类风湿性关节炎的药物，其特征在于：该药物为经皮吸收制剂。

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