CN107988287A - 一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法 - Google Patents

一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于低聚糖制备方法领域，具体涉及一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法。本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，包括将壳聚糖溶解于醋酸‑醋酸钠缓冲溶液中，配制壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中加入纤维素酶液酶解，酶解完成后采用透析法透析滤液后，将所得透析液进行浓缩后进行喷雾干燥等步骤。本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法条件温和，简便、快速，制备所需时间短，所用纤维素酶价廉易得，生产成本低，制备得到的壳寡糖分子量分布均匀、成色均匀一致。

Description

一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法
技术领域
本发明属于低聚糖制备方法领域，具体涉及一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法。
背景技术
壳聚糖是一种大量存在于自然界中的易生物降解和可再生的天然氨基多糖，是由2-氨基葡萄糖和2-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的，是目前为止发现的唯一天然碱性高聚物，被誉为除糖类、蛋白质、脂肪、矿物质和维生素之外的人体第六生命要素。壳聚糖的降解产物：壳寡糖，不但水溶性好，而且易被人体吸收，具有抑菌、调血脂、调血脂、调节免疫以及活化肠道双歧杆菌等多种生理功能，在食品、农产品保鲜、医药中都有很好的拓宽前景。壳寡糖具有糖类某些共同的特性，其中聚合度为5～7时活性最高。
目前，壳聚糖降解的方法主要包括化学降解法、酶降解法和物理降解法。其中，化学降解法需要用大量的化学试剂，对环境的污染较大，而且反应不容易控制。物理降解法的成本相对较高，目前仅限于实验室阶段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法。本发明提供的纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法条件温和，简便、快速，制备所需时间短，不需要加入大量的反应试剂，对环境污染较少，所用纤维素酶价廉易得，生产成本低，制备得到的壳寡糖分子量分布均匀、成色均匀一致。
本发明的技术方案是：
一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
S1将壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；
S2向步骤S1所得壳聚糖溶液中加入质量浓度为0.4％的纤维素酶液，纤维素酶的质量与壳聚糖的质量比为0.192，于55℃下反应4.5h，得酶解液；
S3搅拌下往步骤S2所得酶解液中滴加质量浓度为5％的NaOH溶液，调节 pH为7.0～8.0，过滤，分离水不溶性壳聚糖，滤液装入透析袋中，在蒸馏水中透析24h，得透析液；
S4将步骤S3所得透析液进行浓缩，浓缩至固形物质量浓度为10％的浓缩液，进行喷雾干燥。
进一步地，所述步骤S1所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液为pH值5.2的0.2mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
进一步地，所述步骤S2所述纤维素酶液由pH值5.2的0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制而成。
进一步地，所述步骤S3所述透析袋为再生纤维素透析袋，截留分子量1000Da。
进一步地，所述步骤S4所述喷雾干燥的工艺条件为：进风温度180℃，进料速度700mL/h。
本发明经过长期大量的实验结合创造性的分析和总结，综合考虑多种因素及因素之间的相互影响，对纤维素酶解法和喷雾干燥工艺条件进行优化，通过确定壳聚糖浓度、反应温度、酶底质量比、反应时间、固形物含量、进风温度、进料速度等，制备得到产品质量较佳、产量较高的壳聚糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，不会引起结构的破坏，有利于壳寡糖生理活性的保持。
(2)本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法条件温和，简便、快速，制备所需时间短。
(3)本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，所用纤维素酶价廉易得，生产成本低，适合产业化生产。
(4)本发明提供的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，不需要加入大量的反应试剂，对环境污染较少。
(5)采用本发明纤维素酶喷雾干燥法制备得到的壳寡糖分子量分布均匀、成色均匀一致。
附图说明
图1氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线；
图2壳聚糖浓度对还原糖含量的影响；
图3反应温度对还原糖含量的影响；
图4反应时间对还原糖含量的影响；
图5酶量对还原糖含量的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
壳聚糖(批号：121211A，脱乙酰度＞95％，山东奥康生物科技有限公司)，再生纤维素透析袋(货号：QABO-SP132592-1m，截留分子量1000Da，上海安谱实验科技股份有限公司)。
实施例1、壳寡糖的制备和还原糖含量的测定实验
1.纤维素酶酶解制备壳寡糖
称取1.0g壳聚糖溶解于pH值5.2的0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；称取0.4g纤维素酶溶解于pH值5.2的 0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.4％的纤维素酶液；取5mL 壳聚糖溶液，加入2mL纤维素酶液，于55℃下反应4.5h，得酶解液，取1mL酶解液加入1mLDNS试剂，沸水浴5分钟后，加入蒸馏水定容至10mL。后使用离心机离心10分钟，取上层溶液，用紫外分光光度计在540nm的波长下，以蒸馏水为空白，测量吸光度值，对照氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线得出还原糖含量。 2.还原糖含量的测定实验
(1)DNS试剂的配制
准确称取7.5g 3,5-二硝基水杨酸和14.0g氢氧化钠充分溶解于1000mL水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6mL预先在50℃水中溶化的苯酚和6.0g偏重亚硫酸钾钠，充分溶解后，盛于棕色瓶中，放置5天稳定后，即可使用。
(2)氨基葡萄糖标准液的配制
准确称取0.1g氨基葡萄糖盐酸盐溶于100mL蒸馏水中，配制成0.1％的氨基葡萄糖盐酸盐溶液。
(3)氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线的制作
分别取0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.6mL、2.0mL、2.4mL氨基葡萄糖盐酸盐标准液，用蒸馏水定容至10mL。取定容后1mL溶液，1mLDNS试剂，沸水浴5 分钟，加入蒸馏水定容至10mL。在波长540nm处，测量吸光度值，并以吸光度值为纵坐标，氨基葡萄糖盐酸盐质量为横坐标，绘制标准曲线。图1为氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线。由图1知，数据回归方程为y＝0.5069x-0.0176，回归方程相关系数R2＝0.9985。反应液吸光度值与氨基葡萄糖盐酸盐质量之间呈良好的线性关系，还原糖含量越高，吸光度值越高。
(4)还原糖含量的测定
取1mL待测样品加入1mLDNS试剂，沸水浴5分钟后，加入蒸馏水定容至 10mL。后使用离心机离心10分钟，取上层溶液，用紫外分光光度计在540nm 的波长下，以蒸馏水为空白，测量吸光度值，对照氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线得出还原糖含量。
实施例2、纤维素酶酶解制备壳寡糖条件优化实验
1.壳聚糖浓度单因素实验
在固定反应温度50℃，反应时间4.5h，加入pH值为5.2的纤维素酶液2mL，壳聚糖溶液5mL的条件下，选取壳聚糖质量浓度分别为0.5％、0.8％、1.0％、1.2％、 1.6％、2.0％，通过测定反应还原糖含量为评价指标，考察壳聚糖浓度对还原糖含量的影响。壳聚糖浓度对还原糖含量的影响的实验结果如图2所示。由图2 可见，随着壳聚糖浓度的增加，还原糖含量先增加后减小，在壳聚糖浓度为1％时，还原糖含量最高，超过这一浓度，还原糖含量也随之下降，说明壳聚糖质量浓度为1％时反应的最佳浓度。此因素不纳入正交考察因素范围。
2.反应温度单因素实验
在固定壳聚糖质量浓度为1％，反应时间4.5h，加入pH值为5.2的纤维素酶液2mL，壳聚糖溶液5mL的条件下，选取反应温度分别为45℃、50℃、55℃、 60℃、65℃，通过测定反应还原糖含量为评价指标，考察反应温度对还原糖含量的影响。反应温度对还原糖含量的影响的实验结果如图3所示。由图3可见，在 55℃时，还原糖含量最高，超过这一温度，还原糖含量就随之下降，说明在55℃时酶活性最高。在综合分析的基础上，经过不断实验，确定了反应温度45℃、 50℃和55℃作为正交实验的三个水平。
3.反应时间单因素实验
在固定壳聚糖质量浓度为1％，反应温度50℃，加入pH值为5.2的纤维素酶液2mL，壳聚糖溶液5mL的条件下，选取反应时间分别为2.5h、3.5h、4.5h、 5.5h、6.5h，通过测定反应还原糖含量为评价指标，考察反应时间对还原糖含量的影响。反应时间对还原糖含量的影响的实验结果如图4所示。由图4可以看出，反应前4.5h还原糖含量增长迅速；4.5h以后反应逐渐降低。因此选择反应时间为4.5h较为合适。根据单因素实验结果分析后，选择反应时间3.5h、4.5h和5.5h 作为正交实验的三个水平来考察反应时间对还原糖含量的影响。
4.酶量单因素实验
在固定壳聚糖质量浓度为1％，壳聚糖溶液5mL，反应温度50℃，反应时间 4.5h的条件下，分别添加pH为5.2的1.6mL、2.0mL、2.4mL、2.8mL、3.2mL 的酶液，通过测定反应还原糖含量为评价指标，考察酶底质量比对还原糖含量的影响。酶量与酶液浓度4mg/mL相乘得到酶的质量，再与加入反应壳聚糖质量 50mg的比值即为酶底质量比。酶量对还原糖含量的影响的实验结果如图5所示。由图5可知，随着酶量的增加，反应速度加快，但当酶量增加到2.8mL时，继续加酶，应速度并没有增大。所以酶量为2.8mL时，即酶底质量比要达到0.224，才能达到最大反应速度。根据单因素实验结果分析后，选择酶量2.0mL、2.4mL 和2.8mL作为正交实验的三个水平来考察酶量对壳寡糖含量的影响。
5.正交试验优选处方
根据单因素实验，在综合分析的基础上，选取对壳寡糖含量影响较大的因素进行正交实验，以壳寡糖含量作为指标优化处方，正交试验结果如表1所示。
表1：正交试验结果
注：K1、K2、K3分别为每次实验各因素的水平的实验结果之和；R1、R2、 R3分别为各因素各水平结果的平均值；R极为各因素各水平结果的平均值的差值 (也叫极差)。
由表1可以看出，根据极差的大小，酶量对实验结果的影响最大，是主要因素。次要因素是反应温度，最后是反应时间。最佳方案是A3B2C2，即反应温度 55℃，反应时间4.5h，酶底质量比为0.192。所以，正交试验中得出的最优条件为，酶底质量比为0.192，反应温度为55℃，反应时间为4.5h。
实施例3、喷雾干燥工艺优化实验
1.固形物含量的选择
在进风温度180℃，进料速度700mL/h条件下，将浓缩液浓缩至固形物浓度分别为5％、10％、15％、20％、25％进行单因素对比实验，实验结果以喷干的壳寡糖产品水分、回收率以及喷干效果为评价指标，考察不同固形物含量的实验效果，选择合适的固形物含量范围。综合考察和分析固形物含量对产品水分、回收率以及喷干效果的影响，实验结果见表2。
表2：固形物含量对喷雾干燥效果及产品质量的影响
固形物浓度(％) 粘度(mpa.s) 回收率(％) 水分(％) 干燥效果
5 1.25 0.44 0.41 略粘壁
10 1.57 5.94 0.25 无粘壁
15 1.95 5.62 0.26 无粘壁
20 2.48 0.60 0.33 无粘壁
25 2.85 0.49 0.91 无粘壁
由表2可知，固形物浓度对产品粘度、回收率、分水均有影响，对干燥效果影响相对较小。经综合分析，控制物料的固形物含量在10％—15％比较适宜。
2.进风温度的选择
将固形物含量10％的浓缩液在进风温度180℃，进料速度700mL/h条件下，将进风温度分别设定在160℃、170℃、180℃、190℃、200℃进行单因素对比实验，实验结果以喷干的壳寡糖产品水分、回收率以及喷干效果为评价指标，考察不同进风温度的实验效果，选择合适的进风温度。综合考察和分析进风温度对产品水分、回收率以及喷干效果的影响，实验结果见表3。
表3：进风温度对产品收率、水分含量及干燥效果的影响
进风温度(℃) 回收率(％) 水分(％) 干燥效果
160 2.59 0.09 略粘壁
170 5.60 0.73 无粘壁
180 5.94 0.25 无粘壁
190 5.93 0.28 无粘壁
200 5.82 0.31 无粘壁
由表3可知，提高进风温度能降低产品中的水分含量，粘壁现象也逐渐减轻，产品得率提高，但在进风温度超过180℃后，则对改善产品的湿含量没有显著作用，所以喷雾干燥的进风温度不宜过高。综合考虑，确定以180℃作为最佳进风温度。
3.进料速度的选择
将固形物含量10％的浓缩液在进风温度180℃的条件下，将进料速度分别控制在600mL/h、700mL/h、800mL/h、900mL/h、1000mL/h进行单因素对比实验，实验结果以喷干的壳寡糖产品水分、回收率以及喷干效果为评价指标，考察不同进料速度的实验效果，选择合适的进料速度。综合考察和分析进料速度对产品水分、回收率以及喷干效果的影响，实验结果见表4。
表4：进料速度对干燥效果和产品质量的影响
进料速度(mL/h) 回收率(％) 水分(％) 干燥效果
600 4.53 0.31 略粘壁
700 5.94 0.25 无粘壁
800 5.18 0.30 无粘壁
900 4.75 0.77 略粘壁
1000 4.91 1.50 略粘壁
由表4可知，进料速度对产品最终的水分含量影响较大，随着进料速度的提高，最终产品水分含量也逐渐增加。因此，要将产品的水分含量控制在安全的范围下，需要通过调低进料速度提高出风温度，但是较高的出风温度会使产品的褐变反应加深，影响产品的色泽。经过不断调整工艺，并对大量实验结果的总结和分析，综合考虑选择进料速度控制在700mL/h。
实施例4、按照优化的处方和工艺制备得到的壳寡糖的产率计算及定性鉴别 1.采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
S1将壳聚糖溶解于pH值5.2的0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；
S2向步骤S1所得壳聚糖溶液中加入质量浓度为0.4％的纤维素酶液，纤维素酶的质量与壳聚糖的质量比为0.192，于55℃下反应4.5h，得酶解液；
S3搅拌下往步骤S2所得酶解液中滴加质量浓度为5％的NaOH溶液，调节 pH为7.0～8.0，过滤，分离水不溶性壳聚糖，滤液装入截留分子量为1000Da的再生纤维素透析袋中，在蒸馏水中透析24h，得透析液；
S4将步骤S3所得透析液进行浓缩，浓缩至固形物质量浓度为10％的浓缩液，进行喷雾干燥，S4所述喷雾干燥的工艺条件为：进风温度180℃，进料速度 700mL/h。
所述纤维素酶液由pH值5.2的0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制而成。
2.壳寡糖的产率计算
按照优化的处方和工艺制备壳寡糖，平行制备出5个样品并测定壳寡糖产率，结果如表5所示。
壳寡糖得率的计算公式为：
其中：m1是喷雾干燥得到壳寡糖粉的质量；m2是壳寡糖样品的质量；ω1是喷雾干燥所得壳寡糖粉水分；ω2壳寡糖样品水分。
表5：壳寡糖质量
由表5可知，壳寡糖的产率为30.67％。
3.定性鉴别
物料粘度的测定，主要与其浓度、温度因素密切相关。在其他条件一定时，浓度越高，粘度越大；温度越高，粘度越小。因此，准确称量制备得到的产品质量，同时称取同样质量的分子量1000Da壳寡糖样品。在恒温条件下，分别测量产品和壳寡糖样品的粘度，进而对产品进行定性鉴别，结果如表6所示。
表6：壳寡糖的定性鉴别
由表6可知，在浓度为0.44g/mL的浓度下得到的产品的水解液的粘度为 1.12/mPa·s，1000分子量的壳寡糖粘度为1.20/mPa·s，壳聚糖样品的粘度为 37.31/mPa·s。由此可知，壳寡糖的平均分子量在1000左右。

Claims (5)

1.一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；
S2向步骤S1所得壳聚糖溶液中加入质量浓度为0.4％的纤维素酶液，纤维素酶的质量与壳聚糖的质量比为0.192，于55℃下反应4.5h，得酶解液；
S3搅拌下往步骤S2所得酶解液中滴加质量浓度为5％的NaOH溶液，调节pH为7.0～8.0，过滤，分离水不溶性壳聚糖，滤液装入透析袋中，在蒸馏水中透析24h，得透析液；
S4将步骤S3所得透析液进行浓缩，浓缩至固形物质量浓度为10％的浓缩液，进行喷雾干燥。
2.如权利要求1所述的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S1所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液为pH值5.2的0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3.如权利要求1所述的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S2所述纤维素酶液由pH值5.2的0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制而成。
4.如权利要求1所述的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S3所述透析袋为再生纤维素透析袋，截留分子量1000Da。
5.如权利要求1所述的采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤S4所述喷雾干燥的工艺条件为：进风温度180℃，进料速度700mL/h。
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