CN103435721A - 一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法 - Google Patents
一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及菊芋加工利用领域，具体为一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，解决现有从菊芋中提取菊粉的提取、纯化工艺分别存在诸多缺陷的问题，包括提取工序：将菊芋块茎切片、烘干、粉碎，加水溶解，然后再加入复合酶，放入超声波清洗机中超声提取；灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；纯化工序：将树脂D280与D151构成动态串联树脂层析柱；菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，收集流出液；将收集液分别经截留分子量为10KDa的超滤膜和截留分子量为500Da的纳滤膜，将截留液烘干、磨粉即可。菊糖得率大大提高，提取时间与温度明显缩短与降低，菊粉收率高，产品性能和质量稳定，实现了规模化生产，产率高、品质优的目的。
Description
技术领域
本发明涉及菊芋加工利用领域，具体为一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法。
背景技术
菊芋(Jerusalem Artichoke)俗名洋姜、鬼子姜，属多年生菊科向日葵属，为食用地下块茎的薯芋类蔬菜。菊糖在菊芋中占有很大比例，它是一种聚合度一般在2～60的混合物。菊糖有很多功能性作用，如可以预防糖尿病人的低血糖以及促进肠道双歧杆菌的生长，因此可以作为糖、脂肪替代物而大量用于低热量、低糖、低脂肪食品中，并能显著改善无脂或低脂食品的口感和质感。研究表明, 每日摄食2 g 菊芋多糖对控制人体的质量，改善肠道功能，防止机体失调以及老年性疾病很有帮助。由于菊粉独特的理化性质和生理功能，在食品、饮料、保健品、医药等领域具有广泛应用价值，已被世界上40多个国家批准作为食品的营养增补剂。
目前，从菊芋提取、纯化菊粉的方法，主要工艺包括提取、纯化和干燥，其中提取工艺有超声波提取、热水提取、微波提取、浸提法等，在提取过程中所得的粗提液中会含有大量的蛋白质、果胶、色素等杂质，使粗提液呈棕褐色。在生产菊粉时，为了得到纯的菊粉，还需要对菊粉粗提液进行脱色、脱蛋白等纯化过程。通常提取工艺采用单一的方法，提取效果不是很好，通常为热水浸提法，该方法耗时长并且长时间的高温加热容易破坏菊芋中其它的活性成分；脱除色素的方法主要是活性炭吸附法，活性炭能够较好的吸附色素，但因为其颗粒小难以除去，增加了多糖纯化的后处理的麻烦，并且解吸率较差，多糖损失率较高，也有采用离子交换树脂，但由于所选用离子交换树脂的型号、运行参数不恰当，一是会导致提取液中杂质含量高，对后序的膜分离污染严重；二是会导致提取液中的有色物质异味去除不彻底，最终产品在口感、气味等方面都会受到影响；脱蛋白主要是Sevage法、三氯乙酸法、Hcl法、石灰乳法等，脱蛋白的方法目前主要采取化学除蛋白方法，化学方法使多糖的损失率增加，而且会增加后续除盐负担。
发明内容
本发明为了解决现有从菊芋中提取菊粉的提取、纯化工艺分别存在上述诸多缺陷的问题，提供一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为45～55℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1:15～25，同时调PH值为5.3～5.7；（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为100～140μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波清洗机中，超声功率为200～250W，时间为22～28分钟，温度保持在48～53℃；（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa；（4）将分子量在500Da～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉。
所述提取工序中，最佳料液比为1:20，温度为51.0℃，每克菊芋粉末中的加酶量为120μg，超声功率为240W，时间为25分钟，在此工艺条件下，菊糖得率可达到72.2%。
为了得到上述工艺条件及最佳工艺参数，本发明进行了以下一系列优化实验：
一、提取工序
A、实验方法
1.1 可溶性总糖的测定
1.1.1 可溶性总糖标准曲线的制作
准确称量在105℃条件下干燥至恒重的葡萄糖100mg,加水溶解，配制得0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。
取标准液2、4、6、8、10、12mL稀释到100ml容量瓶中，得到所需浓度为20、40、60、80、100、120mg/l的工作液。取蒸馏水1ml及各系列工作液1ml，置于1-7号试管中，加入5ml蒽酮试剂，摇匀后，盖上塞子，置沸水中准确加热10min.取出放入冷水浴中冷却，避光20min,在波长620nm下测吸光度，重复3次，求平均值。以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，作可溶性总糖标准曲线。
1.1. 2 菊芋中可溶性总糖的测定
取1ml菊芋粗提液于试管中，同绘制标准曲线相同步骤，在波长620nm下测吸光值，多次测量，求平均值。
1. 2 还原糖的测定
1. 2.1 还原糖标准曲线的制作[5]
取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml葡萄糖标准液加入20mL的比色管中，分别加入蒸馏水使其体积为1.0ml，然后加入DNS 3ml，摇匀，沸水浴煮15min，冷却，用蒸馏水稀释至20ml，在波长520nm下测吸光度，重复3次，求平均值。以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，作还原糖标准曲线。
1. 2.2菊芋中还原糖的测定
取1mL菊芋粗提液于试管中，同绘制标准曲线相同步骤，在波长520nm下测吸光值，多次测量，求平均值。
1. 3 菊芋中菊糖含量
1.4复合酶比例的筛选
准确称取纤维素酶和果胶酶，使其质量比分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，配制成0.1mg/ml的复合酶酶解液，离心，取上清液放置4℃冰箱中备用。
分别称取一定量的菊粉，加入2ml上述配制好的复合酶酶解液，再加入等体积的蒸馏水，50℃下超声30min，计算菊粉得率。
1.5菊糖粗提液提取的单因素试验
1.5. 1 料液比：在超声功率为240w，温度为40℃，PH为5.5，酶加量为40μg/g样品，料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40和1:50条件下超声提取20min，90℃下灭酶10min,过滤，测定上清液中总糖和还原糖的含量，计算上清液菊糖含量。
1.5.2 PH值：在PH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5条件下超声提取20min，90℃下灭酶10min，过滤，计算上清液中菊糖的含量。
1.5.3 温度：在PH为5.5，酶加量为2mL，料液比为1:20，温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件下超声提取20min，90℃下灭酶10min，过滤，计算上清液中菊糖的含量。
1.5.4 超声时间：在温度为50℃，PH为5.5，酶加量为2mL，料液比1:20，超声时间分别为10、15、20、25和30min条件下提取，在90℃下灭酶10min，过滤，计算上清液中菊糖的含量。
1.5.5 加酶量：在温度为50℃，PH为5.5，料液比1:20，加酶量分别为0、40、80、120、160μg/g菊芋粉末条件下超声提取25min，在90℃下灭酶10min，过滤，计算上清液中菊糖的含量。
1.6 Plackett-Burman筛选试验设计
在单因素基础上，对五因素进行因子筛选试验，确定显著影响因子。表1为Plackett-Burman筛选试验设计表。
表1 PB试验因素水平表
1.7响应曲面试验设计
在单因素试验和Plackett-Burman筛选试验的基础上，对所确定的因子进行Box-Behnken中心组合试验，确定最佳菊糖提取工艺参数。表2为Box-Behnken响应曲面分析因素水平表。
表2 响应面分析因素水平表
B结果与分析
2.1 可溶性总糖标准曲线
以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图1，得回归方程y=0.0065x—0.0357，R2=0.9990，线性良好。
2.2 还原糖标准曲线
以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图2，得回归方程y=0.9305x—0.03873，R2=0.9992，线性良好。
2.3 复合酶比例的筛选
从图3可以看出，当m(果胶酶)：m(纤维素酶)=1:4时，菊糖得率最高，当其质量比例为1:5时，菊糖得率会减小，因为当纤维素酶浓度增大时，纤维素酶催化水解纤维素分子成为低聚纤维素和糖，使单糖的浓度增大，所以菊糖得率有减小的缘故。
2.4菊芋粗提液提取的单因素试验结果
2.4.1 料液比对菊糖得率的影响
从图4可以看出，料液比为1:10时，菊糖含量最低，当料液比为1:20时菊糖含量达到最高，随着料液比的增加，菊糖含量反而下降。因为随着料液比的增大，溶液中底物和酶的浓度也随之下降，有效反应碰撞减小，所以本发明选取料液比为1:15～25，最佳料液比为1:20。
2.4.2 PH对菊糖得率的影响
从图5可以看出，PH=5.5时，菊糖得率最高，因为pH为5.5时，是复合酶的最佳PH值，当PH增大后，菊糖得率下降，因为此后的PH值改变了酶的空间构象,从而使酶的活性下降，所以本发明选取PH值为5.3～5.7，最佳PH值为5.5。
2.4.3 温度对菊糖得率的影响
从图6可以看出，随着温度的升高，菊糖含量也随着增大，在温度为50℃时，菊糖含量最大，当温度进一步升高后，菊糖的含量却急剧下降。这是因为温度升高，使复合酶失活，从而导致菊糖的含量下降。所以本发明选取温度为48～53℃，最佳温度为50℃。
2.4.4 超声时间对菊糖得率的影响
从图7可以看出，超声提取时间为25min时菊糖含量最大，超声时间低于25min时，菊糖含量随着超声时间的增加而增大，当大于25min时，菊糖含量反而下降，因为多糖在较长超声时间下遭到破坏，分解成单糖。所以本发明选取超声时间为22～28分钟，最佳超声时间为25分钟。
2.4.5 加酶量对菊糖得率的影响
从图8可以看出，菊糖含量随着加酶量的增加而增大，当加酶量为120μg/g菊芋粉末时，菊糖的含量随着加酶量增大而变得缓慢，因为此时酶的用量在底物浓度一定的情况下已经达到饱和，所以当酶用量在增大时，菊糖的含量变化却很小，所以本发明选取加酶量为加酶量为100～140μg /g菊芋粉末，最佳为120μg/g菊芋粉末。
2.5 Plackett-Burman试验显著影响因子的确定
2.5.1 PB试验设计处理及相应值
在单因素试验的基础上，对5因素即（料液比、温度、加酶量、PH、时间）利用Minitab15.0软件进行PB试验设计和数据分析，以菊粉得率为响应值。 表3 PB试验设计及响应值
| 运行序 | 料液比 | 温度/℃ | 加酶量/(μg/g样品) | PH | 时间/min | 菊糖得率（g/g） |
| 1 | 1:40 | 40 | 160 | 5.0 | 20 | 0.648 |
| 2 | 1:20 | 55 | 160 | 5.0 | 30 | 0.781 |
| 3 | 1:20 | 55 | 160 | 6.5 | 20 | 0.701 |
| 4 | 1:40 | 55 | 40 | 6.5 | 20 | 0.608 |
| 5 | 1:20 | 55 | 40 | 5.0 | 20 | 0.604 |
| 6 | 1:20 | 40 | 40 | 6.5 | 30 | 0.552 |
| 7 | 1:40 | 55 | 160 | 5.0 | 30 | 0.804 |
| 8 | 1:20 | 40 | 160 | 6.5 | 30 | 0.644 |
| 9 | 1:40 | 40 | 40 | 5.0 | 30 | 0.564 |
| 10 | 1:40 | 55 | 40 | 6.5 | 30 | 0.668 |
| 11 | 1:20 | 40 | 40 | 5.0 | 20 | 0.576 |
| 12 | 1:40 | 40 | 160 | 6.5 | 20 | 0.586 |
2.5.2关键影响因素的确定
利用Minitab15.0软件对实验结果进行分析，得到回归模型方差分析，见表4。
表4 回归模型方差分析表
由表4可知，主效应的P=0.001<0.05，决定系数R2=94.40%，说明实验所得的拟合回归方程达到显著性（模型的）；校正决定系数Radj 2=89.73%，表明本实验89.73%的数据变异可以用此回归方程来解释，因此可以较好地确定关键印象因素。
表5 回归方程显著性检验表
| 项 | T值 | P值 | 显著性 |
| X1 料液比 | 0.22 | 0.833 | |
| X2 温度 | 6.55 | 0.001 | 显著 |
| X3 加酶量 | 6.50 | 0.001 | 显著 |
| X4 PH | -2.39 | 0.054 | |
| X5 时间 | 3.19 | 0.019 | 显著 |
由表5回归方程显著性检验表可知，X2、X3、X4三个因素的p值小于0.05，则说明其对实验有显著性影响，因此，在菊糖提取的实验中，显著影响因子为温度、加酶量、时间。故在下一步响应面分析中，重点考察温度、加酶量和时间的最优水平范围。回归得到的多元一次方程为Y=0.64467+0.00167X1+0.04967X2+0.04933X3-0.01817X4+0.02417X5 其中Y为菊糖得率(g/g)。
2.6 响应曲面试验设计对最佳工艺条件的确定
2.6.1 Box-Behnken实验设计与结果
利用Minitab15.0软件对菊芋中菊糖得率进行响应曲面设计，表6为响应曲面设计与结果，其中标准序1-12为析因试验，13-15为中心点重复试验。
表6 响应面实验设计与结果
对表6中数据进行回归分析，得到菊芋中菊糖得率对温度、加酶量、时间的三元二次回归方程如下：
Y=-0.03150A2-0.05075B2-0.15650C2+0.01325AB+0.04450AC-0.01375BC+0.015375A-0.00625B+0.009625C+0.72500
表7 回归方程方差分析
由表7可知，本试验所选的三元二次回归模型具有较好的显著性（p<0.001），各因素对菊糖得率不是简单地线性关系（p>0.05),平方项和交互作用对该模型具有显著性（p<0.05）,说明这两项对响应值有极大地影响，决定系数R2=98.38%，校正决定系数 Radj 2=95.50%,说明该模型能解释95.50%响应值的变化，从失拟项在α=0.052>0.05（不显著），说明可以利用该回归方程确定最佳菊糖的提取工艺。
表8 回归系数显著性分析
| 项 | T值 | p值 | 显著性 |
| X2 | 2.300 | 0.070 | |
| X3 | -0.935 | 0.393 | |
| X5 | 1.440 | 0.393 | |
| X2 2 | -3.201 | 0.024 | 显著 |
| X3 2 | -5.158 | 0.004 | 显著 |
| X5 2 | -15.906 | <0.001 | 显著 |
| X2X3 | 1.402 | 0.220 | |
| X2X5 | 4.707 | 0.005 | 显著 |
| X3X5 | -1.455 | 0.206 |
从回归系数显著性分析（表8）可以看出，X2 2、X3 2、X5 2、X2X5 这几个因素对菊糖得率的影响显著，说明在该试验中，温度、加酶量、时间对菊糖的率有显著性影响，而从X2 2、X3 2、X5 2、X2X5 也可以看出，它们对菊糖得率的影响是非线性的。
2.6.2响应曲面分析与优化
根据上述二次多项回归方程做出的响应曲面图和等高线图，可以直观的看出温度，加酶量、时间对菊糖得率的影响，如图9-11。响应曲面图反映了该模型中菊糖得率的大小，等高线的形状则反映了因素之间交互作用的强弱，一般来说，圆形表示因素交互作用不显著，而椭圆形表示交互作用显著。
从图9可以直观看出，加酶量和温度的交互作用对菊糖得率的影响不显著，加酶量在110～130μg/g菊芋粉末之间，温度在48～53℃时，菊糖得率有最高点。图10可以看出时间和温度的交互作用对菊糖得率的影响显著，时间为23～27min之间，温度为43～55℃时，菊糖得率有最高点。图11可以看出，加酶量与时间的交互作用对菊糖得率的影响也显著，时间在22～28min之间，加酶量在100～140μg/g菊芋粉末之间，菊糖得率由最高点。
综合9-11图，温度、加酶量、时间三因素对菊糖的影响以及各因素的交互作用与上述回归分析一致。利用Minitab15.0中的相应优化器可以得出菊糖得率最大时温度、加酶量、时间的预测工艺，即温度48～53℃、加酶量100～140μg/g菊芋粉末、时间22～28分钟，菊糖达到最大得率72%以上。
2.6.3超声波辅助复合酶工艺条件的验证及确定
本发明在单因素的基础上，通过Plackett-Burman筛选试验、Box-Behnken中心组合设计以及响应曲面分析法对菊糖的提取工艺进行了优化，确定了加酶量、温度、时间为最佳菊糖提取的显著因素，即最佳工艺条件为温度51.0℃、加酶量120μg/g样品、时间25.0min，按此条件进行提取实验，实验重复3次。得到的菊糖得率为72.2%、72.1%、72.2%，平均菊糖得率为72.2%，与预测值较接近，说明该模型能较好的预测超声波辅助复合酶提取菊糖的实际提取效果，具有实际应用价值。
二、纯化工序
A 实验方法
1.1 树脂的预处理
大孔离子交换树脂：称取一定量大孔离子交换树脂，即D280，D900，D151，放于锥形瓶，先用10%的氯化钠溶液浸泡24h,蒸馏水洗至流出液澄清，再用2%的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，再加入5% 的HCl溶液浸泡4h,用蒸馏水洗至中性备用。
大孔吸附树脂：称一定量大孔吸附树脂，即D3250，HPD-300L，ADS-7，AB-8，放于锥形瓶，先用无水乙醇浸泡24h, 使其溶胀，用蒸馏水洗至流出液澄清且无乙醇味，再用2% 的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，再加入5% 的HCl浸泡4h,用蒸馏水洗至中性备用。
1.2 静态筛选吸附试验
分别准确称取3g经过预处理的上述七种吸附树脂，放入锥形瓶中，加入30mL的菊粉粗提液，在流速为160r/min的恒温水浴振荡器中振荡6h,真空抽滤，将树脂滤出，得到收集液，测定并计算其脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率。
表1 七种树脂的物理特性
1.2.1 树脂质量比例的确定
在树脂总质量为3g的条件下，改变树脂D280与D151的质量比，使其质量比分别为1:1、1:2、2:1，加入30mL的菊粉粗提液，在流速为160r/min的恒温水浴振荡器中振荡6h,真空抽滤，将树脂滤出，得到收集液，测定并计算其脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率。
1.2.2 粗提液pH值对脱色、脱蛋白的影响
称取一定量树脂D280与D151使其质量比为2:1，调节粗提液pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，条件同上，测定并计算其脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率。
1.3 动态吸附实验
1.3.1 动态混床树脂实验
将经预处理的两种树脂总质量为6g使其质量比为2:1，利用湿法装入φ15mm×30cm的层析柱中，调节恒流泵的流速为3.19ml/min，调节粗提液pH=6.5上样，收集流出液，测定并计算其脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率。
1.3.2 串联树脂实验
将经预处理的D280与D151两种树脂质量分别为4g、2g，利用湿法分别装入φ15mm×50cm、φ15mm×30cm的层析柱中，调节恒流泵的流速为3.19ml/min，调节粗提液pH=6.5上样，使粗提液先经过树脂D280，在经过树脂D151，收集流出液，测定并计算其脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率。
1.4 相应指标测定方法及计算公式
1.4.1脱色率测定与计算 在420nm下，分别对菊粉粗提液的吸光度（A0）和菊粉收集液的吸光度（A1）进行测定，按以下公式计算菊粉的脱色率。
脱色率（%）=（A0-A1）/ A0 ×100%
1.4.2 脱蛋白率测定与计算 蛋白质含量以牛血清蛋白为标品，采用以考马斯亮蓝法在595nm下计算粗提液（B0）和收集液（B1）蛋白质的含量，按以下公式计算菊粉的脱蛋白率。
脱蛋白率（%）=（B0-B1）/B0×100%
1.4.3 菊粉保留率测定与计算 总糖含量采用蒽酮法在620nm下以葡萄糖为标品计算，还原糖含量采用3，5-二硝基水杨酸法在520nm下以葡萄糖为标品计算。
菊粉含量（%）=总糖含量（%）-还原糖含量（%）
菊粉保留率（ % ）=(C0- C1)/C0 ×100%
其中，C0、C1 分别为粗提液和收集液溶液中的菊粉含量。
B结果与分析
2.1 蛋白质标准曲线
以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图12，得回归方程y=0.00656+0.1116，R2=0.9995，线性良好。
2.2 不同树脂静态吸附脱色与脱蛋白比较
不同树脂对粗多糖中色素、蛋白质及多糖有不同的吸附功能，主要是由于树脂的物理结构，如树脂的极性、平均孔径、比表面积、离子等和被吸附物质的的物理和化学特性，大孔树脂的吸附主要是通过范德华力或其可以产生氢键进行相似相吸对被吸附物质，离子交换树脂主要是通过它本身的所带的离子与溶液中同号离子进行交换，进而起到吸附作用。从图13可知，在7种树脂中，对于菊粉粗提液中的色素，阴离子交换树脂比大孔树脂和阳离子交换树脂脱色能力强，由此可以说明菊粉粗提液中的色素主要是以阴离子存在，AB-8脱色能力也比较好，可以判断有一部分色素是以极性分子存在的。树脂D280的脱色率最高，脱色率达到97.1%；D151的脱蛋白率最高,脱蛋白率达到98.0%，两种树脂对菊糖的吸附最少，菊糖的保留率都在90%以上，这是因为色素分子和蛋白分子都是带电荷分子， 所以本发明选用上述两种树脂进行脱蛋白、脱色。
2.3 不同比例树脂对脱色和脱蛋白的影响
由图13可知，树脂D280与D151对菊粉脱色、脱蛋白分别最好，考虑到树脂使用量的大小和操作复杂程度，故将两种树脂以一定的比例混合，研究混合树脂对菊糖粗提液的脱色、脱蛋白效果。
从图14可以看出，树脂质量一定时，当树脂D280比例增高时，脱色率随之增大，当D151比例增大时，脱蛋白率增大。脱蛋白率、脱色率、菊糖保留率三者综合考虑，当D280与D151质量比为1：1时，菊糖的保留率小于90%，当比例为1:2与2:1时，脱蛋白率、脱色率、菊糖保留率都大于90%，为了减小菊糖的损失，所以选择混合树脂的质量比m(D280):m(D151)=2:1。
2.4 不同pH值对菊粉脱蛋白脱色的影响
溶液的pH值也是影响树脂吸附的重要因素，它主要通过改变溶液的酸碱性进而改变被吸附被物质的离子化程度来影响树脂对其的吸附能力。由图15可知，随着处理液pH值的升高，树脂对溶液的脱色率和脱蛋白率增大，但菊糖的保留率却减小，pH值在6.5-8.0时，脱色率和脱蛋白率增加的幅度缓慢，此时，菊糖的保留率下降的反而较快，说明色素和蛋白在酸性条件下易被吸附，但菊糖在碱性条件下易被吸附。因此，综合考虑脱蛋白率、脱色率、菊糖保留率，选择菊粉粗提液pH值为6.0～6..5进行下一步的实验。
2.5 动态串联树脂对脱色脱蛋白的影响
由图16可知，动态串联树脂也是随着收集液的增加，脱蛋白率和脱色率明显减小，菊糖的保留率反而增加，因为在吸附过程中，动态吸附更有利于物质通过树脂孔径到达内表面，而且在持续上样过程中部分树脂吸附的多糖被解析。当菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集液体积为28.3ml/g树脂时（此处树脂为D280与D151树脂质量之和），在此条件下重复3次，最后为处理液的脱色率为90.1%，脱蛋白率为88.9%,菊糖的保留率为96.8%。
采用本发明的方法，因为植物细胞壁主要是由纤维素、果胶、半纤维素等组成,利用合适的酶，可以使提取条件温和，不易破坏其他活性成分。所以本发明主要采用纤维素酶和果胶酶破坏细胞壁成分，使糖类物质易于溶出，同时结合超声波，利用超声波的机械作用进而加速细胞壁的破裂，促进菊芋中菊糖的快速溶出，缩短了提取时间，超声波辅助复合酶提取多糖的方法，在菊糖提取方面还没有涉及，与传统方法相比，本发明在菊糖得率上大大提高，最高可达到72.2%，同时在提取时间与温度上也有了明显的缩短与降低，此外，本发明选用动态串联树脂对菊粉粗提液先经过树脂D280进行脱色，脱色率达到97.1%，然后经过树脂D151脱蛋白，脱蛋白率达到98.0%，菊糖的保留率达到96.8%，而且本发明所选用的树脂对粗提液中蛋白质及无机盐类等物质的吸收率较大，1g树脂可得到28.3ml的收集液，最后经截留分子量为10KDa的超滤膜除去剩下的蛋白质，再经500Da的纳滤膜除去小分子单糖、双糖和无机盐，当料液比为1：20时，电导率由原来的5.3×103μs/cm经除盐后减小为2.3×103μs/cm。最后将得到的截留液50℃烘干、磨粉，得到高纯度菊粉，其中总糖含量为95.37%，还原糖为3.57%，蛋白质为0，菊粉含量为90.8%。总之，本发明所得到的菊粉收率高，产品性能和质量稳定，实现了规模化生产，产率高、品质优的目的。
附图说明
图1 为可溶性总糖标准曲线；
图2为还原糖标准曲线；
图3为复合酶酶解效果比较柱状图；
图4为料液比对菊糖得率的影响曲线图；
图5 为PH对菊糖得率的影响曲线图；
图6 为温度对菊糖得率的影响曲线图；
图7 为超声时间对菊糖得率的影响曲线图；
图8 为加酶量对菊糖得率的影响曲线图；
图9 为加酶量和温度交互影响菊糖得率的响应面图和等高线图；
图10为时间和温度交互影响菊糖得率的响应面图和等高线图；
图11 为加酶量和时间交互影响菊糖得率的响应面图和等高线图；
图12为 蛋白质标准曲线；
图13为不同树脂的脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率比较柱状图；
图14为不同树脂质量比对脱色率、脱蛋白率、菊糖保留率的影响柱状图；
图15为溶液PH对脱色率、脱蛋白率、菊粉保留率的影响柱状图；
图16 为动态串联树脂处理量与脱色率、脱蛋白率、菊粉保留率的关系曲线图。
具体实施方式
一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为45℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1:15，同时调PH值为5.3；（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为100μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波清洗机中，超声功率为200W，时间为22分钟，温度保持在48℃；（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa；（4）将分子量在500Da ～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉，经检测，为白色粉末，无异味，总糖含量为96.2%，还原糖为3.25%，蛋白质为0，菊粉含量为92.5%。
实施例2：
一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为55℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1: 25，同时调PH值为5.7；（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为140μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波清洗机中，超声功率为250W，时间为28分钟，温度保持在53℃；（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa；（4）将分子量在500Da ～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉，经检测，为白色粉末，无异味，总糖含量为94.57%，还原糖为3.45%，蛋白质为0，菊粉含量为91.2%。
实施例3：
一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为51℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1:20，同时调PH值为5.5；（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为120μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波清洗机中，超声功率为240W，时间为25分钟，温度保持在51℃；（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa；（4）将分子量在500Da ～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉，经检测，为白色粉末，无异味，总糖含量为95.8%，还原糖为3.25%，蛋白质为0，菊粉含量为92.8%。
实施例4：
一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为48℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1:18，同时调PH值为5.4；（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为130μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波，超声功率为220W，时间为27分钟，温度保持在50℃；（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa；（4）将分子量在500Da ～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉，经检测，为白色粉末，无异味，总糖含量为95.15%，还原糖为3.25%，蛋白质为0，菊粉含量为92.9%。
Claims (2)
1.一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，其特征是包括以下步骤：
步骤一：提取工序
（1）将菊芋块茎切片，在温度为45～55℃的条件下烘干，然后粉碎，过80目筛，得到菊芋粉末；
（2）将菊芋粉末加水溶解，料液比为1:15～25，同时调PH值为5.3～5.7；
（3）然后再加入复合酶，搅拌均匀，每克菊芋粉末中的加酶量为100～140μg，复合酶是由纤维素酶和果胶酶以1:4的重量比混合而成；
（4）将步骤（3）得到的混合物放入超声波清洗机中，超声功率为200～250W，时间为22～28分钟，温度保持在48～53℃；
（5）灭酶、过滤，得到菊粉粗提液；
步骤二：纯化工序
（1）将经预处理的树脂D280与D151按照质量比2:1分别装入层析柱中，构成动态串联树脂层析柱；
（2）调节菊粉粗提液的PH值为6.0～6.5，使菊粉粗提液先经过树脂D280，再经过树脂D151，菊粉粗提液经过层析柱时的流速为3.19ml/min，收集流出液，当收集液的脱色率和脱蛋白率都不大于90%时，停止收集；
（3）将得到的菊粉收集液先经截留分子量为10 KDa的超滤膜，操作压力为0.1～0.16MPa，再经截留分子量为500Da的纳滤膜，操作压力为0.22～0.25MPa； （4）将分子量在500Da ～10KDa的截留液，50℃下烘干、磨粉，即得到本发明所述的高纯度菊粉。
2.根据权利要求1所述的一种超声波协同复合酶法从菊芋中提取高纯度菊糖的方法，其特征是提取工序中，料液比为1:20，温度51.0℃，每克菊芋粉末中的加酶量为120μg，超声功率为240W，时间为25分钟。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059158A (zh) * | 2014-06-17 | 2014-09-24 | 熊鹏 | 菊粉的浸提方法 |
| CN105859916A (zh) * | 2016-05-22 | 2016-08-17 | 江苏碧青园海洋生物科技有限公司 | 一种南菊芋9号菊芋菊粉的制备方法 |
| CN105942513A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-21 | 河南洛阳红牡丹产业研发有限公司 | 一种牡丹植物食用胶的制备方法 |
| CN106632738A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-10 | 晨光生物科技集团股份有限公司 | 一种从菊芋中提取菊粉的工业化生产方法 |
| CN107087740A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-08-25 | 邢夺伟 | 一种从菊芋中获得速溶性菊糖的方法 |
| CN110922505A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-27 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种滴眼剂用透明质酸的制备方法 |
| CN110981992A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种注射剂用透明质酸的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101402984A (zh) * | 2008-11-12 | 2009-04-08 | 南京泛成生物化工有限公司 | 生物酶辅助提取菊粉的方法 |
| CN101955553A (zh) * | 2010-10-08 | 2011-01-26 | 九环菊芋生物产业股份有限公司 | 一种高纯度菊粉的生产方法 |
| CN102504048A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-06-20 | 赛普特环保技术(厦门)有限公司 | 一种菊芋/菊苣综合利用方法 |
-
2013
- 2013-09-12 CN CN201310413180.1A patent/CN103435721B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101402984A (zh) * | 2008-11-12 | 2009-04-08 | 南京泛成生物化工有限公司 | 生物酶辅助提取菊粉的方法 |
| CN101955553A (zh) * | 2010-10-08 | 2011-01-26 | 九环菊芋生物产业股份有限公司 | 一种高纯度菊粉的生产方法 |
| CN102504048A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-06-20 | 赛普特环保技术(厦门)有限公司 | 一种菊芋/菊苣综合利用方法 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104059158A (zh) * | 2014-06-17 | 2014-09-24 | 熊鹏 | 菊粉的浸提方法 |
| CN105859916A (zh) * | 2016-05-22 | 2016-08-17 | 江苏碧青园海洋生物科技有限公司 | 一种南菊芋9号菊芋菊粉的制备方法 |
| CN105859916B (zh) * | 2016-05-22 | 2019-03-29 | 江苏碧青园海洋生物科技有限公司 | 一种南菊芋9号菊芋菊粉的制备方法 |
| CN105942513A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-21 | 河南洛阳红牡丹产业研发有限公司 | 一种牡丹植物食用胶的制备方法 |
| CN106632738A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-10 | 晨光生物科技集团股份有限公司 | 一种从菊芋中提取菊粉的工业化生产方法 |
| CN107087740A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-08-25 | 邢夺伟 | 一种从菊芋中获得速溶性菊糖的方法 |
| CN110922505A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-27 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种滴眼剂用透明质酸的制备方法 |
| CN110981992A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-10 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种注射剂用透明质酸的制备方法 |
| CN110981992B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-08-13 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种注射剂用透明质酸的制备方法 |
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