CN107982298B - 艾草精油的提取方法及在抑制植物病菌方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种艾草精油的提取方法：从盐碱地获取艾蒿植株，40℃干燥至质量恒定，取艾草地上部分，粉碎过筛，得到艾草粉末；将艾草粉末样品，装入超临界CO2萃取装置，打开水浴，使萃取温度达到35℃，萃取压力20MPa，CO2流速20g/min，分离釜温度30℃，运行90min；萃取完毕后，用无水乙醇洗出，离心，除去蜡质成分，用无水硫酸钠脱去水分；滤液经30℃减压，回收乙醇，得到脱蜡质的艾叶挥发油。本发明能够快速、高效地提取艾草精油，其组分多，并且可以较好的保持艾草精油的芳香成分；该方法提取的艾草精油对水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌具有较好的抑制作用。

Description

艾草精油的提取方法及在抑制植物病菌方面的应用
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，具体涉及艾草精油的提取方法及在抑制植物病菌方面的应用。
背景技术
农药对人类的贡献不言而喻，在我国，通过农药的使用，每年可减少因植物病害而引起的经济损失300亿元左右，然而，农药是化学品中毒性较高、环境释放率较高、影响面很广的物质，它们在保护作物的同时也进入了环境。在有机化学农药发展之初，人们忽视了化学农药不合理使用对人类和环境带来的不良影响，如农药使用对环境的污染、人畜中毒、对天敌和无害生物的伤害、农药残留、有害生物抗药性以及有害生物再猖獗等。环境保护者对农用农药使用的强烈批评甚至发出了“化学农药命当休矣”的呼声，虽然其片面夸大了化学农药的副作用，然而在21世纪的今天，我们看到农药并没有退出历史舞台，相反却蓬勃地发展着，并在农业生产和日常生活中发挥着更加重要的作用。在这种情况下人们开始积极寻找环境相容性好，高效安全的农药活性物质。生物农药尤其是植物源农药迅速发展起来，另一方面积极开展对农药制剂加工技术和农药使用技术的研究。
植物源农药，是指直接利用或提取植物的根、茎、叶、花、果、种子等或利用其次生代谢物质制成具有杀虫或杀菌作用的活性物质。与传统化学农药相比，植物源农药具有有效成分为天然物质，施用后较易分解，对环境无污染；组分多元化，使害虫较难产生抗药性；对有益生物(即害虫天敌)安全；可以大量种植，是新型高效、无残留、无公害的“绿色农药”。但是，目前我国对植物源农药的筛选范围尚不够广泛，部分农药的作用机理还没研究清楚或仍处于空白状态，及难以推广的现实，制约了植物源农药的开发。因此，急需扩大植物物源农药的筛选范围，以开发新的植物源农药。艾草(Artemisia argyi)又名艾蒿，为菊科多年生草本植物，分布广泛。艾草全草可提取精油，具有抑菌、抗氧化功效。目前关于艾草精油的应用主要用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等动物源病菌，在植物源病菌抑制方面的应用尚属空白。
发明内容
针对上述植物源农药筛选范围比较窄，尚未发现能够有效防治水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌的植物精油，特提出本发明。本发明旨在提供一种艾草精油的制备方法及其在抑制植物病菌方面的应用，通过超临界CO2萃取方法从盐碱地生长的艾草中提取艾草精油，通过抑菌实验证明该精油能够有效抑制水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌。
本发明一方面提供一种艾草精油的提取方法，包括以下步骤：从盐碱地获取艾蒿植株，40℃干燥至质量恒定，取艾草地上部分，粉碎过筛，得到艾草粉末；将艾草粉末样品装入超临界CO2萃取装置，打开水浴，使萃取温度达到35℃，萃取压力20MPa，CO2流速20g/min，分离釜温度30℃，运行90min；萃取完毕后，用无水乙醇洗出，离心，除去蜡质成分，用无水硫酸钠脱去水分；滤液经30℃减压，回收乙醇，得到脱蜡质的艾草精油。
本发明另一方面还提供上述艾草精油在抑制植物病害方面的应用。
进一步的，所述应用形式为将艾草精油作为活性成分制备植物源农药。
进一步的，所述植物病害为水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌。
进一步的，所述艾草精油对水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌和马铃薯立枯丝核菌的最小抑菌浓度均为0.0625mg/mL；对瓜类细菌性果斑病菌和大白菜软腐病菌的最小抑菌浓度均为0.125mg/mL。
进一步的，所述艾草精油对水稻白叶枯病菌、瓜类细菌性果斑病菌和马铃薯立枯丝核菌的最小杀菌浓度为0.5mg/mL；对青枯劳尔氏菌和马铃薯立枯丝核菌的最小杀菌浓度为0.5-0.25mg/mL；对和大白菜软腐病菌的最小杀菌浓度为0.25mg/mL。
有益效果：本发明从盐碱地获取艾蒿植株，利用超临界流体CO2萃取法，快速、高效地提取艾草精油，其组分多，并且该方法可以较好的保持艾草精油的芳香成分；该方法提取的艾草精油对水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌具有较好的抑制作用；为艾草精油在植物病害防治应用方面提供科学基础；艾蒿来源广泛，价格低廉，容易采集，与其他植物比较提取率较高，有利于植物源农药的推广应用。
附图说明
图1为艾草精油对6种供试菌的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
以下试验所用的部分材料和设备如下：
艾草(Artemisia argyiH.Lev.Vaniot)粉末：从盐碱地获取艾蒿植株，40℃干燥至质量恒定，取艾草地上部分，粉碎过40目筛，得到艾草样品粉，4℃贮藏备用。
受试菌株：水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)，青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringaepv.)，瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)，马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，和大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)。
培养基：细菌采用营养琼脂培养基。
仪器和设备：QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣)；水蒸馏蒸馏提取装置、微波辅助提取装置(上海新仪)；超临界CO2萃取装置(美国Waters)；SW-CJ-1FD型洁净工作台(江苏苏净)。
实施例1超临界CO2萃取法提取艾草精油
称取70g艾草粉末样品，装入超临界CO2萃取装置；打开水浴，使萃取温度达到35℃，萃取压力200bar(20MPa)，CO2流速20g/min，分离釜温度30℃，运行90min。萃取完毕后，用无水乙醇洗出，离心，除去蜡质成分，无水硫酸钠脱去水分。滤液经30℃减压，回收乙醇，得到脱蜡质的艾叶挥发油。
对比例1水蒸气蒸馏法提取艾草精油
称取40g艾草粉末样品置于1000mL圆底烧瓶中，按照料液比1:20(g：mL)加入蒸馏水，加热，保持微沸，蒸馏6h；经无水硫酸钠干燥，过滤得艾草挥发油，4℃保存备用。
对比例2微波辅助提取法提取艾草精油
称取40g艾草粉末样品加入1000mL圆底烧瓶中，按照料液比1:20(g：mL)加入蒸馏水，800W微波环境下处理30min；经无水硫酸钠干燥、过滤，得挥发油，4℃保存备用。
结果测定及分析
一、提取率及精油特性
艾草精油的提取率由公式计算：
艾草精油的萃取率＝(精油萃取质量/艾草质量)×100％
艾草精油提取率和精油特性见表1。对比例1水蒸气提取法提取温度高，提取时间相对长，得率较低，为0.517％；对比例2微波辅助水蒸气提取法与水蒸气提取法相比，明显缩短了提取时间，但得率仍较低0.458％；实施例1超临界流体萃取法相比前两种方法提取精油得率较高，提取得率为0.976％。
表1三种不同提取方法所得艾草精油的比较
Figure BDA0001515170570000031
二、组分的定性和定量分析
对实施例1和对比例1-2的方法提取的艾草精油进行GC-MS分析鉴定，GC-MS检测条件如下：
(1)色谱条件：
色谱柱：HP-5MS气相色谱柱(30m×0.250mm×0.25μm)；进样口温度为280℃；
升温程序：初始温度为80℃，保持4min，以7℃/min的速度升至160℃，保持4min，以2℃/min的速度生至170℃，保持4min，以15℃/min的速度升至270℃，保持5min。载气(He)流速为1.0mL/min；进样量为0.5μL；分流比为1:70；
(2)质谱条件：
电子轰击离子源(electron ionization,EI)；电子能量70eV；EM电压：1.4KV；离子源温度230℃，四级杆温度150℃；质量扫描范围：33-500amu。扫描方式：全扫描；溶剂延迟2min，调谐文件为标准调谐。
通过NIST05.L标准质谱图库进行检索，进行组分的定性；通过NIST05.L质谱图库对GC-MS分析鉴定的挥发性成分进行解析，以扣除溶剂峰的色谱图全部峰面积作为100％，采用峰面积归一化法对各鉴定组分含量进行计算。主要成分分析结果见表2。
表2不同方法提取艾草精油的主要成分及相对含量(单位：％)
Figure BDA0001515170570000041
Figure BDA0001515170570000051
Figure BDA0001515170570000061
Figure BDA0001515170570000071
实施例1超临界CO2萃取提取法挥发性物质共67种，主要包括酸、烷、醇和烯类，其种类和相对含量分别为35.42％、26.46％、醇15.49％和4.07％。相对含量较高的为十八碳二烯酸14.75％、硬脂酸12.32％、棕榈酸7.46％、植醇4.61％、龙脑莰醇2.49％。
对比例1水蒸气蒸馏法挥发性物质共45种，主要包括醇、烯、萜和酮类，其种类和相对含量分别为18.8％、37.29％、19.19％和9.6％。相对含量较高的有桉树精19.19％，环戊烯16.96％，庚酮8.01％和龙脑莰醇8.25％。
对比例2微波辅助提取法挥发性物质共44种，主要包括醇、烯、烷、酮和萜类，其种类和相对含量分别为35.92％、39.49％、10.54％和2.41％。相对含量较高的石竹烯15.30％，乙二胺醇15.13％，龙脑莰醇7.78％，庚酮5.02％和桉树精2.41％。
比较三种不同提取方法精油所含化学成分，可知采用本发明的超临界CO2萃取法提取的挥发性物质较多，可以提取水蒸气蒸馏法和微波辅助提取法所提取不出来的挥发性物质，含有较多的高级烷烃，提取得率较高。
三、艾草精油的抑菌试验
(1)菌悬液的制备：将各种供试菌用接种环将菌株接种于装有液体培养基的三角瓶中，36℃恒温摇床中培养24h，震动频率为120r/min，加入无菌生理盐水，配置成浓度为108CFU/mL的菌液。
(2)抑菌试验：采用滤纸片法进行测定：在涂有供试菌的平板培养基上均匀地放置4片滤纸片。吸取25μL艾草精油滴加到滤纸片上，对照加入等量的DMSO(原液)和链霉素(1mg/ml)。平板于超净工作台内放置6h，使药液尽可能完全扩散到培养基中，然后将其置于36℃恒温培养箱中，48h后取出，通过抑菌圈的大小分析精油对供试菌的抑菌效果。由图1所示，实施例1提取的艾草精油对供试菌均有较好的抑菌效果，其抑菌能力接近链霉素。
(3)最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定：采用试管二倍稀释法，吸取制备的浓度为108CFU/mL菌悬液100μL，分别加入到不同浓度的精油稀释液中，精油稀释液起始浓度为0.5mg/mL，终末浓度为3.90625μg/mL。采用96孔板法，以第1孔至第8孔浓度由高到低。在600nm下用分光光度计测定稀释液初试吸光值，然后在振荡培养箱内进行震荡培养(细菌于36℃，培养24h，真菌于27℃，培养48h)。取出后用分光光度计在相同波长下再读数，吸光值与初始吸光值相同的试管浓度为精油的最低抑菌浓度(MIC，the minimuminhibitory concentration)，然后将各稀释液涂板，未见细菌生长者为最低杀菌浓度(MBC，the minimum bactericidal concentration)。
表3艾草精油对不同供试菌的MIC和MBC(单位：mg/mL)
Figure BDA0001515170570000081
注：XO为水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)，RS青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，PS为黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringaepv.)，AC为瓜类细菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)，Rt为马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和EC为大白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)。
由艾草精油对细菌的MIC和MBC测试结果(表3)可以看出，实施例1提取的艾草精油对各供试菌具有较好的抑制作用，其中对艾草精油较为敏感的为水稻白叶枯病菌，青枯劳尔氏菌和马铃薯立枯丝核菌，其最小抑菌浓度为0.0625mg/mL；艾草精油对大白菜软腐病菌的MBC为0.25mg/mL，说明艾草精油对大白菜软腐病菌具有较好的杀菌效果。

Claims (1)

1.一种艾草精油在抑制植物病菌方面的应用，其特征在于，所述艾草精油采用以下方法提取：从盐碱地获取艾蒿植株，40℃干燥至质量恒定，取艾草地上部分，粉碎过筛，得到艾草粉末；将艾草粉末样品装入超临界CO2萃取装置，萃取温度35℃，萃取压力20MPa，CO2流速20g/min，分离釜温度30℃，运行90min；萃取完毕后，用无水乙醇洗出，离心，除去蜡质成分，用无水硫酸钠脱去水分；滤液经30℃减压，回收乙醇，得到脱蜡质的艾草精油；
所述应用形式为将艾草精油作为活性成分制备植物源农药，所述植物病菌为水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌、黄瓜细菌性角斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌、马铃薯立枯丝核菌和大白菜软腐病菌；
所述艾草精油对水稻白叶枯病菌、青枯劳尔氏菌和马铃薯立枯丝核菌的最小抑菌浓度均为0.0625mg/mL；对瓜类细菌性果斑病菌和大白菜软腐病菌的最小抑菌浓度均为0.125mg/mL；
所述艾草精油对水稻白叶枯病菌、瓜类细菌性果斑病菌和马铃薯立枯丝核菌的最小杀菌浓度为0.5mg/mL；对青枯劳尔氏菌和马铃薯立枯丝核菌的最小杀菌浓度为0.5-0.25mg/mL；对大白菜软腐病菌的最小杀菌浓度为0.25mg/mL。
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